KR20160032248A - 딸기속 식물의 탄저병 저항성 관련 마커와 그 이용 - Google Patents
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Abstract
딸기속 식물에 대하여 다수의 DNA 마커를 개발하고, 이들 다수의 DNA 마커를 사용함으로써 탄저병 저항성을 고정밀도로 판정한다. 딸기속 식물의 염색체에 있어서의 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 및 배열 번호 10 으로 나타내는 염기 배열 사이에 위치하는 연속되는 핵산 영역으로 이루어지는, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커.
Description
본 발명은, 딸기 탄저병에 대한 저항성을 나타내는 딸기속 식물 계통을 선발할 수 있는 탄저병 저항성 관련 마커 및 그 이용 방법에 관한 것이다.
DNA 마커 (유전 마커나 유전자 마커라고도 일컬어진다) 의 개발에 의해, 식물의 품종 개량에 있어서, 유용 형질이나 불량 형질의 유무를 신속하고 또한 효율적으로 판별하는 것이 가능해졌다. DNA 마커의 개발은, 애기장대나 벼와 같은 모델 식물뿐만 아니라, 여러 가지 실용 식물에 있어서도 진척되고 있어, 품종 개량에 있어서 많이 도움되고 있다.
비특허문헌 1 에는, 재배 딸기에 있어서 통합형 고밀도 연쇄 지도를 개발했다는 보고가 있다. 비특허문헌 1 에 의하면, 이전보다 약 300 개의 증폭 산물 길이 다형성 (amplified fragment length polymorphism, AFLP) 마커로 이루어지는 연쇄 지도에 관한 보고가 있기는 하지만, 8 배체로 복잡한 게놈을 갖기 때문에, 재배 딸기에 대해서는 보다 고밀도의 연쇄 지도의 개발이 요망되고 있다고 기재되어 있다. 또, 비특허문헌 1 에서는, F.베스카 (F.vesca) 및 F.×아나나사 (F.×ananassa) 에 대하여 단순 반복 배열 (simple sequence repeat) 마커를 개발하고, 통합형 고밀도 연쇄 지도를 구축하고 있다. 구체적으로는, 02-19, 사치노카 (Sachinoka), 카오리노 (Kaorino), 아키히메 (Akihime) 및 0212921 의 5 품종ㆍ계통을 사용하여 연쇄 지도를 제작하고, 이것을 통합해서 1 개의 통합형 고밀도 연쇄 지도를 작성하고 있다. 비특허문헌 1 에서는, 02-19 에 대해서는 575 개의 마커, 사치노카 (Sachinoka) 에 대해서는 556 개의 마커, 카오리노 (Kaorino) 에 대해서는 294 개의 마커, 아키히메 (Akihime) 에 대해서는 318 개의 마커 및 0212921 에 대해서는 822 개의 마커를 개발하고 있다. 그러나, 비특허문헌 1 에 개시된 통합형 고밀도 연쇄 지도에서는, 좌상 (座上) 하는 마커수가 없는 연쇄군이 존재하고 있으며, 특히 마커수가 적은 카오리노 (Kaorino) 나 아키히메 (Akihime) 에서는 그 경향은 현저하다. 또한, 비특허문헌 1 에 개시된 통합형 고밀도 연쇄 지도는, 모든 연쇄 지도가 커버되고 있지 않다고 고찰하고 있다.
또, 비특허문헌 2 에는, 딸기 탄저병 저항성 품종의 개발을 효율적으로 진행하기 위해, 딸기 탄저병 내병성과 연쇄되는 DNA 마커를 개발했다고 기재되어 있다. 비특허문헌 2 에는, 무작위 증폭 다형성 (Random Amplified Polymorphic) DNA 법 (RAPD 법), AFLP 법 및 SSR 법에 의해 마커를 사용하여 연쇄 지도를 제작하고, 내병성 연쇄 마커를 해석했다고 기재되어 있다. 그 결과, 비특허문헌 2 에 의하면, 딸기 중간 모본 (中間母本) 농2호를 교배한 집단에 이용함으로써, 육종 집단을 1/8 로 줄일 수 있어, 약 70 ％ 의 확률로 내병성 계통을 판별할 수 있는 마커를 개발할 수 있었다고 기재되어 있다.
또한, 딸기 탄저병에 대해서는, 비특허문헌 3 에 기재되어 있는 바와 같이, 글로메렐라 신굴레이트 (Glomerella cingulate) 및 콜레토트리춤 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum) 이 그 원인균으로서 알려져 있다.
한편, 예를 들어, 특허문헌 1 에는 사탕무 검은뿌리썩음병 저항성 품종 선발 마커를 개발한 것이 개시되어 있으며, 특허문헌 2 에는 옥수수에 대해서 목적으로 하는 형질에 연쇄된 마커를 이용하는 선발 기술이 개시되어 있다.
DNA Research 20, 79-92, (2013)
토치기현 농업시험장 연구성과집 제29호, 제 51 ∼ 52 페이지
Microbiol. Cult. Coll., 25(1) : 27-32, 2009
그런데, 상기 서술한 사탕무나 옥수수에서 개발되어 온 DNA 마커 기술은, 딸기속 식물에서 거의 진행되고 있지 않은 것이 현 상황이었다. 비특허문헌 1 에는 SSR 마커를 개발하고, 통합형 고밀도 연쇄 지도를 구축한 것이 기재되어 있기는 하지만, 다배수성이고 복잡한 게놈 구조의 딸기속 식물에 있어서 목적으로 하는 형질에 연쇄되는 DNA 마커를 선발하기에는 충분하다고는 할 수 없었다. 또, 비특허문헌 2 에는, 딸기 탄저병 내병성과 연쇄되는 DNA 마커를 개발했다고 기재되어 있기는 하지만, QTL 해석의 결과로는 LOD (logarithym of odds) 값이나 기여율이 높다고는 할 수 없어, 우수한 마커라고는 평가할 수 없었다.
그래서, 본 발명은, 상기 서술한 실정을 감안하여, 다배수성이고 복잡한 게놈 구조의 딸기속 식물에 대하여 다수의 DNA 마커를 개발하고, 이들 다수의 DNA 마커를 사용함으로써 탄저병 저항성을 고정밀도로 판정할 수 있는 탄저병 저항성 관련 마커 및 그 이용 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 딸기속 식물에 있어서의 다수의 마커를 준비하고, 교잡 후대 계통에 있어서의 양적 형질과 마커의 연쇄 해석에 의해, 탄저병 저항성과 같은 양적 형질에 연쇄되는 마커를 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 이하를 포함한다.
(1) 딸기속 식물의 염색체에 있어서의 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 및 배열 번호 10 으로 나타내는 염기 배열 사이에 위치하는 연속되는 핵산 영역으로 이루어지는, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커.
(2) 상기 핵산 영역은, 배열 번호 1 ∼ 10 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 배열 또는 당해 염기 배열의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커.
(3) 상기 핵산 영역은, 딸기속 식물의 염색체에 있어서의 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열과 배열 번호 8 로 나타내는 염기 배열 사이에 위치하는 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커.
(4) 적어도 일방의 모체가 딸기속 식물인 후대 식물의 염색체 및/또는 당해 모체의 딸기속 식물의 염색체를 추출하는 공정과,
상기에서 얻어진 염색체에 있어서의 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존재ㆍ비존재를 측정하는 공정을 포함하는, 탄저병 저항성이 향상된 딸기속 식물 계통의 제조 방법.
(5) 상기 측정하는 공정에서는, 상기 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용한 핵산 증폭 반응에 의해 당해 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존재ㆍ비존재를 측정하는 것을 특징으로 하는 (4) 에 기재된 딸기속 식물 계통의 제조 방법.
(6) 상기 측정하는 공정에서는, 상기 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커에 대응하는 프로브를 구비하는 DNA 칩을 사용하는 것을 특징으로 하는 (4) 에 기재된 딸기속 식물 계통의 제조 방법.
(7) 상기 후대 식물은 종자 또는 유묘이고, 당해 종자 또는 유묘로부터 염색체를 추출하는 것을 특징으로 하는 (4) 에 기재된 딸기속 식물 계통의 제조 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원 2013-186688호, 2014-165405호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명에 의하면, 딸기속 식물에 있어서의 양적 형질 중에서도 탄저병 저항성에 연쇄되는 신규 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 제공할 수 있다. 본 발명에 관련된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 이용함으로써, 딸기속 식물의 교배 계통에 있어서의 탄저병 저항성을 검정할 수 있다. 이로써, 탄저병 저항성이 향상된 특성을 갖는 딸기속 식물 계통을 매우 저비용으로 식별할 수 있다.
도 1 은 딸기속 식물 염색체의 마커를 얻을 때에 사용한 DNA 마이크로어레이의 제조 플로를 나타내는 모식도이다.
도 2 는 DNA 마이크로어레이를 사용한 시그널 검출의 공정을 나타내는 모식도이다.
도 3 은 실시예에서 사용한 딸기속 식물 품종ㆍ계통군에 대하여 2012년 10월 19일에 조사한 탄저병 저항성 데이터를 나타내는 특성도이다.
도 4 는 탄저병 저항성에 관한 QTL 해석의 결과 (딸기 중간 모본 농2호에 있어서의 제 23 연쇄군) 를 나타내는 특성도이다.
도 5 는 각 계통에 있어서의 IA204069 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 6 은 각 계통에 있어서의 IA204291 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 7 은 각 계통에 있어서의 IA202531 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 8 은 각 계통에 있어서의 IA200064 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 9 는 각 계통에 있어서의 IA205184 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 10 은 각 계통에 있어서의 IA202854 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 11 은 각 계통에 있어서의 IA200826 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 12 는 각 계통에 있어서의 IA202631 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 13 은 각 계통에 있어서의 IA202517R 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 14 는 각 계통에 있어서의 IA201502 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 15 는 마커 IA200826 을 PCR 증폭시킨 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 16 은 마커 IA202631 을 PCR 증폭시킨 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 17 은 도 3 에 나타낸 탄저병 저항성 데이터와 마커 IA200826 의 유전자형 데이터를 비교하여 나타내는 특성도이다.
도 18 은 딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호 및 교잡 후대 2 계통 (A 및 B) 에 있어서, 마커 IA202631 및 마커 IA200826 을 PCR 증폭시킨 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 19 는 딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호 및 교잡 후대 2 계통 (A 및 B) 에 있어서, 마커 IA202631 및 마커 IA200826 을 포함하는 영역을 PCR 증폭시킨 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 20 은 마커 IA202531 을 PCR 증폭시킨 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 21 은 마커 IA200064 를 PCR 증폭시키고, 제한 효소 처리한 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 2 는 DNA 마이크로어레이를 사용한 시그널 검출의 공정을 나타내는 모식도이다.
도 3 은 실시예에서 사용한 딸기속 식물 품종ㆍ계통군에 대하여 2012년 10월 19일에 조사한 탄저병 저항성 데이터를 나타내는 특성도이다.
도 4 는 탄저병 저항성에 관한 QTL 해석의 결과 (딸기 중간 모본 농2호에 있어서의 제 23 연쇄군) 를 나타내는 특성도이다.
도 5 는 각 계통에 있어서의 IA204069 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 6 은 각 계통에 있어서의 IA204291 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 7 은 각 계통에 있어서의 IA202531 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 8 은 각 계통에 있어서의 IA200064 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 9 는 각 계통에 있어서의 IA205184 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 10 은 각 계통에 있어서의 IA202854 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 11 은 각 계통에 있어서의 IA200826 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 12 는 각 계통에 있어서의 IA202631 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 13 은 각 계통에 있어서의 IA202517R 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 14 는 각 계통에 있어서의 IA201502 의 시그널값을 나타내는 특성도이다.
도 15 는 마커 IA200826 을 PCR 증폭시킨 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 16 은 마커 IA202631 을 PCR 증폭시킨 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 17 은 도 3 에 나타낸 탄저병 저항성 데이터와 마커 IA200826 의 유전자형 데이터를 비교하여 나타내는 특성도이다.
도 18 은 딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호 및 교잡 후대 2 계통 (A 및 B) 에 있어서, 마커 IA202631 및 마커 IA200826 을 PCR 증폭시킨 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 19 는 딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호 및 교잡 후대 2 계통 (A 및 B) 에 있어서, 마커 IA202631 및 마커 IA200826 을 포함하는 영역을 PCR 증폭시킨 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 20 은 마커 IA202531 을 PCR 증폭시킨 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 21 은 마커 IA200064 를 PCR 증폭시키고, 제한 효소 처리한 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.
이하, 본 발명에 관련된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커 및 그 이용 방법, 특히 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 사용한 딸기속 식물 계통의 제조 방법에 대해서 설명한다.
＜딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커＞
본 발명에 관련된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커란, 딸기속 식물의 염색체 상에 존재하는 특정 영역으로서, 딸기속 식물 탄저병 저항성이라고 하는 형질을 판별할 수 있는 기능을 갖는다. 즉, 이미 알려진 딸기속 식물을 사용하여 얻어진 후대 계통에 있어서, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존재ㆍ비존재를 확인함으로써 탄저병 저항성의 향상이라고 하는 형질을 갖는 계통이라고 판단할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 딸기 탄저병이란, Microbiol. Cult. Coll., 25(1) : 27-32, 2009 에 기재되는 바와 같이, 글로메렐라 신굴레이트 (Glomerella cingulate) 및/또는 콜레토트리춤 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum) 이 감염되는 것에서 기인하여 병반이 형성되는 병을 의미하고 있다. 특히, 본 발명에 있어서, 딸기 탄저병이란, 글로메렐라 신굴라타 (Glomerella cingulata) 의 감염을 원인으로 하는 병이라고 해도 된다.
또, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커란, 탄저병 저항성이 향상되는 형질에 연쇄되는 마커와, 탄저병 저항성이 저하되는 형질에 연쇄되는 마커의 양자를 포함하는 의미이다. 예를 들어, 특정 딸기속 식물에 있어서, 전자의 마커가 존재하고 있으면 탄저병 저항성이 향상된 품종이라고 판단할 수 있다. 또, 특정 딸기속 식물에 있어서, 전자의 마커가 존재하고, 또한 후자의 마커가 비존재인 경우에는 탄저병 저항성이 향상된 품종이라고 보다 고정밀도로 판단할 수 있다. 또한, 특정 딸기속 식물에 있어서, 후자의 마커가 비존재인 것만을 가지고 탄저병 저항성이 향상된 품종이라고 판단해도 된다.
특히, 전자의 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커는, 딸기속 식물의 탄저병 저항성과 같은 형질의 원인 유전자(군)에 연쇄된 영역이라고 생각된다.
여기에서, 딸기속 식물이란, 장미과 딸기속 (Fragaria L.) 에 속하는 식물 전부를 포함하는 의미이다. 즉, 딸기속 식물로는, 일반적인 재배 딸기인 양딸기 (Fragaria×ananassa) 등의 교잡종을 들 수 있다. 또, 딸기속 식물로는, 재배 딸기의 조상종이 되는 버지니아 딸기 (F.virginiana) 그리고 칠레 딸기 (F.chiloensis), 흰땃딸기 (F.vesca), 노우고우이치고 (F.iinumae), 흰땃딸기 (F.nipponica), 프라가리아 누비콜라 (F.nubicola), 프라가리아 부차리카 (F.bucharica), 프라가리아 달토니아나 (F.daltoniana), 프라가리아 오리엔탈리스 (F.orientalis), 프라가리아 코림보사 (F.corimbosa), 모스카타 딸기 (F.moschata) 및 프라가리아 이투루펜시스 (F.iturupensis) 등의 야생종을 들 수 있다. 또한, 딸기속 식물로는, 재배 딸기 (F.×ananassa) 에 있어서의 이미 알려진 품종ㆍ계통도 포함하는 의미이다. 재배 딸기에 있어서의 이미 알려진 품종ㆍ계통으로는 특별히 한정되지 않고, 일본국 내에서 사용 가능한 모든 품종ㆍ계통, 일본국 외에서 사용되고 있는 품종ㆍ계통 등을 포함하는 의미이다. 예를 들어, 재배 딸기의 일본국 내 육성 품종으로는 특별히 한정되지 않지만, 토요노카, 산치고, 쥰베리, 뇨호우 (女峰), 피스트로, 린다몰, 토치오토메, 아이스토로, 토치노미네, 아키히메, 베니홋페, 토치히메, 사치노카, 케이키와세, 사가호노카, 아이베리, 카렌베리, 레드펄, 사츠마오토메, 후쿠오카 S6 (아마오우), 노우히메, 히노미네 및 호우코우와세 등을 들 수 있다. 또, 재배 딸기의 품종으로는, 소정의 특성의 획득을 목적으로 한 품종 개량에 이용하는 육종 소재인 중간 모본인, 딸기 중간 모본 농1호 및 딸기 중간 모본 농2호를 들 수 있다. 딸기 중간 모본 농2호는 탄저병 저항성의 육성 계통인 83118-41 과 저항성 품종 Dover 의 교배로부터 육성된 육종 소재이다. 또한, 딸기 중간 모본 농2호의 탄저병 저항성은, 저항성 품종 호우코우와세나 Dover 와 동일한 정도 이상이고, 또 이병성 (罹病性) 품종과의 교배 실생 집단에 있어서 고도 저항성 개체의 출현율이 높아, 딸기 탄저병 저항성을 갖는 신품종 육성에 이용되고 있다.
딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존재ㆍ비존재를 확인하는 대상의 식물로는, 상기 서술한 딸기속 식물, 상기 서술한 딸기속 식물을 이용한 후대 계통으로 할 수 있다. 후대 계통은, 모본 및 부본 (父本) 중 어느 일방이 상기 서술한 딸기속 식물이면 되어, 이른바 동종 교배에 의한 계통이어도 되고, 교잡 계통이어도 된다. 또, 후대 계통은, 이른바 여교배에 의해 얻어진 것이어도 된다.
특히, 재배 딸기 (F.×ananassa) 를 대상으로 하여, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존재ㆍ비존재를 확인하는 것이 바람직하다. 또한, 재배 딸기 중에서도 상기 서술한 각종의 품종ㆍ계통을 사용한 품종 개량에 있어서, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존재ㆍ비존재를 확인하는 것이 바람직하다. 즉, 이 경우, 만들어 낸 신품종에 대하여 딸기 탄저병 저항성을 판별할 수 있다. 따라서, 신품종으로는, 딸기 탄저병 저항성을 갖는 품종을 적어도 일방의 모체로 하여 얻은 품종인 것이 바람직하다. 보다 상세하게는, 예를 들어, 딸기 중간 모본 농2호를 일방의 모체로 하여 만들어 낸 신품종에 대하여, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존재ㆍ비존재를 확인하여, 딸기 탄저병 저항성을 평가할 수 있다.
본 발명에 관련된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커는, 재배 딸기 : 사치노카로부터 취득한 1,502 개의 마커 및 딸기 중간 모본 농2호로부터 취득한 2,162 개의 마커를 포함하는 유전자 연쇄 지도와, 딸기 탄저병 저항성 데이터를 사용한 QTL (Quantitative Trait Loci) 해석에 의해 새로 동정된 것이다. 또한, 딸기 탄저병 저항성은, 다수의 유전자가 관여하고 있다고 생각되며, 연속 분포를 취하는 양적 형질이다. 즉, 딸기 탄저병 저항성은, 연속 분포를 취하는 딸기 탄저병에 대한 이환율 (罹患率) 에 기초하여 평가된다. QTL 해석에는, 유전 해석 소프트 QTL Cartographer (Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC) 를 사용하고, 비교 간격 맵핑 (Composite interval mapping, CIM) 법을 적용하고 있다.
구체적으로, 상기 서술한 QTL 해석에 의해, 로드 스코어 (LOD score) 가 소정의 임계값 (예를 들어, 2.5) 이상이 되는 영역을 상기 유전자 연쇄 지도에서 발견하였다. 이 영역은 약 29.0 cM (센티 모르간) 으로, 딸기 중간 모본 농2호의 제 23 연쇄군에 포함되는 영역이었다. 여기에서, 「모르간 (M)」은, 염색체 상의 유전자 간의 거리를 상대적으로 나타낸 단위로서, 교차값을 퍼센트로 한 값이다. 딸기속 식물의 염색체에 있어서, 1 cM 은, 약 400 kb 에 상당한다. 또한, 이 영역에는, 로드 스코어가 약 18.3 인 피크가 존재하고 있어, 당해 피크 위치 또는 그 근방에 딸기속 식물 탄저병 저항성을 향상시키는 형질의 원인 유전자(군)이 존재하는 것이 시사된다.
이 29.0 cM 의 영역에는, 표 1 에 나타내는 10 종류의 마커가 이 순서로 포함되어 있다. 또한, 표 1 에 있어서, 마커명이란, 본 발명에서 독자적으로 취득한 마커에 붙여진 명칭이다.
즉, 본 발명에 관련된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커는, 딸기속 식물의 염색체에 있어서의 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 및 배열 번호 10 으로 나타내는 염기 배열 사이에 위치하는 연속되는 핵산 영역이다. 여기에서, 상기 29.0 cM 의 영역에 포함되는 피크는, 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 마커 (IA200064) 및 배열 번호 8 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 마커 (IA202631) 사이에 위치하는 영역에 존재하고 있다.
또, 이 29.0 cM 의 영역에는, 탄저병 저항성이 향상되는 형질에 연쇄되는 마커와, 탄저병 저항성이 저하되는 형질에 연쇄되는 마커의 양자를 포함하고 있다. 표 1 에 나타내는 10 종류의 마커 중, 배열 번호 9 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 마커 (IA202517R) 는, 탄저병 저항성이 저하되는 형질에 연쇄되는 마커 (상반 메이커) 이고, 그 밖은 모두 탄저병 저항성이 향상되는 형질에 연쇄되는 마커이다.
표 1 에 나타낸 29.0 cM 의 영역에 포함되는 연속된 핵산 영역을, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로서 사용할 수 있다. 여기에서, 핵산 영역이란, 딸기속 식물의 염색체에 존재하는 다른 영역과의 동일성이 95 ％ 이하, 바람직하게는 90 ％ 이하, 보다 바람직하게는 80 ％ 이하, 가장 바람직하게는 70 ％ 이하가 되는 염기 배열로 이루어지는 영역을 의미한다. 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커가 되는 핵산 영역과 다른 영역의 동일성이 상기 범위이면, 정법 (定法) 에 따라 당해 핵산 영역을 특이적으로 검출할 수 있다. 여기에서, 동일성의 값은, 예를 들어 BLAST 를 사용하여 디폴트 파라미터를 사용하여 산출할 수 있다.
또, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커가 되는 핵산 영역의 염기 길이는, 적어도 8 염기 길이 이상, 바람직하게는 15 염기 길이 이상, 보다 바람직하게는 20 염기 길이 이상, 가장 바람직하게는 30 염기 길이로 할 수 있다. 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커가 되는 핵산 영역의 염기 길이가 상기 범위이면, 정법에 따라 당해 핵산 영역을 특이적으로 검출할 수 있다.
특히, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로는, 상기 29.0 cM 의 영역에 포함되는 10 종류의 마커 중, 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열과 배열 번호 8 로 나타내는 염기 배열 사이에 위치하는 영역에서 선택되는 것이 바람직하다. 상기 피크가 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열과 배열 번호 8 로 나타내는 염기 배열 사이에 위치하는 영역에 존재하기 때문이다.
또, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로는, 상기 표 1 에 나타낸 10 종류의 마커에서 선택되는 1 종류의 마커를 포함하는 핵산 영역으로 할 수도 있다. 예를 들어, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로는, 피크의 위치에 가장 가까운 배열 번호 8 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 마커 (IA202631) 를 포함하는 핵산 영역을 사용하는 것이 바람직하다. 이 때, 마커를 포함하는 핵산 영역의 염기 배열은, 당해 마커의 염기 배열에 기초하여 설계한 프라이머를 사용한 인버스 PCR 등의 인접 배열 취득법에 의해 특정할 수 있다.
또한, 딸기속 식물의 염색체에 있어서의 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 및 배열 번호 10 으로 나타내는 염기 배열 사이에 위치하는 핵산 영역으로부터, 복수의 영역을 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로 할 수도 있다.
게다가 또한, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로는, 상기 10 종류의 마커 그 자체를 사용할 수 있다. 즉, 배열 번호 1 ∼ 10 의 염기 배열로 이루어지는 10 개의 영역에서 선택되는 하나 또는 복수의 영역을 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로 할 수 있다. 예를 들어, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로는, 피크의 위치에 가장 가까운 배열 번호 8 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 마커 (IA202631) 를 사용하는 것이 바람직하다. 혹은, 예를 들어, 배열 번호 7 의 염기 배열로 이루어지는 마커 (IA200826) 와 배열 번호 8 의 염기 배열로 이루어지는 마커 (IA202631) 사이에 위치하는 영역을 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로 할 수도 있다.
＜딸기속 식물에 있어서의 마커의 동정＞
본 발명에서는, 상기 서술한 바와 같이, 사치노카로부터 취득한 1,502 개의 마커 및 딸기 중간 모본 농2호로부터 취득한 2,162 개의 마커로부터 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 특정하였다. 여기에서는, 이들 1,502 개와 2,162 개의 마커에 대해서 설명한다. 이 마커를 동정할 때에는, 일본 공개특허공보 2011-120558호나 국제 공개공보 2011/074510호에 개시된 방법을 적용한 DNA 마이크로어레이를 사용할 수 있다.
구체적으로, 당해 DNA 마이크로어레이에 사용하는 프로브의 설계 방법은, 도 1 에 나타내는 바와 같이, 먼저, 사치노카 혹은 딸기 중간 모본 농2호로부터 게놈 DNA 를 추출한다 (공정 1a). 다음으로, 추출한 게놈 DNA 를 하나 또는 복수의 제한 효소에 의해 소화시킨다 (공정 1b). 또한, 도 1 에 나타낸 예에서는, 제한 효소 A 및 제한 효소 B 의 2 종류의 제한 효소를 이 순서로 사용하여 게놈 DNA 를 소화시키고 있다. 여기에서, 제한 효소로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, PstI, EcoRI, HindIII, BstNI, HpaII, HaeIII 등을 사용할 수 있다. 특히 제한 효소로는, 게놈 DNA 를 완전히 소화시켰을 때에 20 ∼ 10000 염기 길이의 게놈 DNA 단편이 되도록, 인식 배열의 출현 빈도 등을 고려하여 적절히 선택할 수 있다. 또, 복수의 제한 효소를 사용하는 경우, 모든 제한 효소를 사용한 후의 게놈 DNA 단편이 200 ∼ 6000 염기 길이로 되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 복수의 제한 효소를 사용하는 경우, 처리에 제공하는 제한 효소의 순서는 특별히 한정되지 않고, 또 처리 조건 (용액 조성이나 온도 등) 이 공통되는 경우에는, 복수의 제한 효소를 동일한 반응계에서 사용해도 된다. 즉, 도 1 에 나타낸 예에 있어서는, 제한 효소 A 및 제한 효소 B 를 이 순서로 사용하여 게놈 DNA 를 소화시키고 있는데, 제한 효소 A 및 제한 효소 B 를 동일한 반응계에서 동시에 사용하여 게놈 DNA 를 소화시켜도 되고, 제한 효소 B 및 제한 효소 A 를 이 순서로 사용하여 게놈 DNA 를 소화시켜도 된다. 또한, 사용하는 제한 효소의 수는 3 이상이어도 된다.
다음으로, 제한 효소 처리 후의 게놈 DNA 단편에 대해 어댑터를 결합한다 (공정 1c). 여기에서, 어댑터란, 상기 서술한 제한 효소 처리에 의해 얻어진 게놈 DNA 단편의 양단에 결합할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 어댑터로는, 예를 들어, 제한 효소 처리에 의해 게놈 DNA 의 양 말단에 형성되는 돌출 말단 (점착 말단) 에 대해 상보적인 1 개 사슬을 갖고, 상세를 후술하는 증폭 처리시에 사용하는 프라이머가 하이브리다이즈할 수 있는 프라이머 결합 배열을 갖는 것을 사용할 수 있다. 또, 어댑터로는, 상기 돌출 말단 (점착 말단) 에 대해 상보적인 1 개 사슬을 갖고, 클로닝할 때의 벡터에 넣기 위한 제한 효소 인식 부위를 갖는 것을 사용할 수도 있다.
또, 복수의 제한 효소를 사용하여 게놈 DNA 를 소화시킨 경우에는, 각 제한 효소에 대응하는 복수의 어댑터를 준비하여 사용할 수 있다. 즉, 복수의 제한 효소로 게놈 DNA 를 소화시킨 경우에 발생하는 복수 종류의 돌출 말단의 각각에 대해, 상보적인 1 개 사슬을 갖는 복수의 어댑터를 사용할 수 있다. 이 때, 복수의 제한 효소에 대응하는 복수의 어댑터는, 공통되는 프라이머를 하이브리다이즈할 수 있도록 공통되는 프라이머 결합 배열을 가지고 있는 것이어도 되고, 각각 상이한 프라이머를 하이브리다이즈할 수 있도록 상이한 프라이머 결합 배열을 갖는 것이어도 된다.
또한, 복수의 제한 효소를 사용하여 게놈 DNA 를 소화시킨 경우, 어댑터로는, 사용한 복수의 제한 효소 중에서 선택되는 1 개의 제한 효소, 혹은 사용한 제한 효소 중 일부의 제한 효소에 대응하는 어댑터를 준비하여 사용할 수도 있다.
다음으로, 양 말단에 어댑터가 부가된 게놈 DNA 단편을 증폭시킨다 (공정 1d). 프라이머 결합 배열을 갖는 어댑터를 사용한 경우에는, 당해 프라이머 결합 배열에 하이브리다이즈할 수 있는 프라이머를 사용함으로써 상기 게놈 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 혹은, 어댑터를 부가한 게놈 DNA 단편을, 어댑터 배열을 이용하여 벡터에 클로닝하고, 당해 벡터에 있어서의 소정 영역에 하이브리다이즈할 수 있는 프라이머를 사용하여 게놈 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 또한, 프라이머를 사용한 게놈 DNA 단편의 증폭 반응으로는, 일례로서 PCR 을 사용할 수 있다.
또, 복수의 제한 효소를 사용하여 게놈 DNA 를 소화시킴과 함께, 각 제한 효소에 대응하는 복수의 어댑터를 게놈 DNA 단편에 연결한 경우, 복수의 제한 효소를 사용한 처리에 의해 얻어진 게놈 DNA 단편 전부에 어댑터가 연결되게 된다. 이 경우, 어댑터에 포함되는 프라이머 결합 배열을 사용하여 핵산 증폭 반응을 실시함으로써, 얻어진 모든 게놈 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다.
혹은, 복수의 제한 효소를 사용하여 게놈 DNA 를 소화시킴과 함께, 사용한 복수의 제한 효소 중에서 선택되는 1 개의 제한 효소, 혹은 사용한 제한 효소 중 일부의 제한 효소에 대응하는 어댑터를 게놈 DNA 단편에 연결한 경우, 얻어진 게놈 DNA 단편 중, 선택된 제한 효소의 인식 배열을 양 말단에 갖는 게놈 DNA 단편만을 증폭시킬 수 있다.
다음으로, 증폭된 게놈 DNA 단편의 염기 배열을 결정하고 (공정 1e), 당해 게놈 DNA 단편보다 짧은 염기 길이를 갖고, 게놈 DNA 단편 내의 적어도 일부를 커버하는 하나 또는 복수의 영역을 특정하고, 특정한 하나 또는 복수의 영역을, 재배 딸기에 있어서의 프로브로서 설계한다 (공정 1f). 게놈 DNA 단편의 염기 배열을 결정하는 방법은 특별히 한정되지 않아, 생거법 등을 적용한 DNA 시퀀서를 이용한 종래 공지된 방법을 사용할 수 있다. 여기에서, 설계하는 영역으로는, 상기 서술한 바와 같이, 예를 들어 20 ∼ 100 염기 길이, 바람직하게는 30 ∼ 90 염기 길이, 보다 바람직하게는 50 ∼ 75 염기 길이로 한다.
이상과 같이, 재배 딸기로부터 추출한 게놈 DNA 를 사용하여 다수의 프로브를 설계하고, 설계한 프로브의 염기 배열에 기초하여, 담체 상에서 목적으로 하는 염기 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 DNA 마이크로어레이를 제작할 수 있다. 이와 같이 제작한 DNA 마이크로어레이를 사용함으로써, 상기 서술한 배열 번호 1 ∼ 10 에 나타낸 10 종류의 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 포함하는 1,502 개와 2,162 개의 마커를 동정할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은, 이미 알려진 재배 딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호 및 이들의 교배 후대 계통 (133 계통) 에 대하여, 상기 서술한 DNA 마이크로어레이를 사용하여 시그널 데이터를 취득하였다. 그리고, 얻어진 시그널 데이터로부터 유전자형 데이터를 취득하고, 이 유전자형 데이터를 기초로 하여, 유전 지도 작성 소프트웨어 AntMap (Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap : constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56 : 371-378) 을 사용하여, 유전 거리 계산식 Kosambi 에 의해 염색체에 있어서의 마커의 위치 정보를 산출하였다. 또한, 취득한 마커의 위치 정보를 기초로, Mapmaker/EXP ver.3.0 (A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report, Third Edition, January, 1993) 에 의해 유전 지도 데이터 시트를 작성하였다. 그 결과, 상기 서술한 배열 번호 1 ∼ 10 으로 나타낸 10 종류의 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 포함하는 1,502 개와 2,162 개의 마커를 동정하고 있다.
＜딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 이용＞
딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 이용함으로써, 탄저병 저항성이 미지인 딸기속 식물 (예를 들어, 후대 계통) 에 대하여 탄저병 저항성을 나타내는 계통인지 판단할 수 있다. 여기에서, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 이용한다는 것은, 당해 마커를 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 증폭시키는 방법을 이용하는 형태, 당해 마커에 대응하는 프로브를 갖는 DNA 마이크로어레이를 이용하는 형태를 포함하는 의미이다.
딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 증폭시키는 방법이란, 이른바 핵산 증폭법을 이용하는 것을 의미한다. 핵산 증폭법으로는, 목적으로 하는 핵산 단편을 특이적으로 증폭시키도록 설계한 프라이머를 사용하는 방법, 프라이머를 사용하지 않고 목적으로 하는 핵산 단편을 특이적으로 증폭시키는 방법을 들 수 있다.
목적으로 하는 핵산 단편을 특이적으로 증폭시키는 프라이머란, 핵산 증폭법에 의해, 상기 서술한 바와 같이 정의된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 포함하는 핵산 단편을 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머를 사용하는 핵산 증폭법으로는 특별히 한정되지 않아, PCR (Polymerase Chain Reaction) 법으로 대표되는 핵산 단편을 증폭시키는 것이면 어떠한 것이어도 상관없다. 예를 들어, PCR 법 이외에, RCA (Rolling Circle Amplification) 법, CPT (Cycling Probe Technology) 법, ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids) 법, LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA) 법, SDA (Strand Displacement Amplification) 법, NASBA (Nucleic acid Sequence-based Amplification method) 법 및 TMA (Transcription mediated amplification method) 법 등의 공지된 방법을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이들 핵산 증폭 반응 중에서, 예를 들어 PCR 법을 이용하는 경우, 딸기속 식물의 염색체에 있어서의 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 사이에 두도록 1 쌍의 프라이머를 설계한다. 또, LAMP 법을 이용하는 경우, 딸기속 식물의 염색체에 있어서의 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 사이에 두도록 4 종류의 프라이머를 설계한다.
프라이머를 사용하지 않는 핵산 증폭법으로는 특별히 한정되지 않지만, LCR (Ligase Chain Reaction) 법을 들 수 있다. 단, LCR 법에 있어서도, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 포함하는 핵산 단편에 하이브리다이즈하는 복수의 올리고뉴클레오티드를 설계한다.
이상과 같이, 핵산 증폭법에 의하면, 검사 대상인 딸기속 식물에 상기 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커가 존재하고 있는 경우, 당해 마커를 포함하는 핵산 단편을 증폭 산물로서 얻을 수 있다. 바꾸어 말하면, 검사 대상인 딸기속 식물로부터 추출한 염색체를 주형으로 한 핵산 증폭법에 의해 소기의 핵산 단편을 증폭시킨 경우에는, 당해 검사 대상인 딸기속 식물이 탄저병 저항성을 갖는다고 판단할 수 있다.
증폭시킨 핵산 단편을 검출하려면, 특별히 한정되지 않지만, 증폭 반응 후의 용액을 아가로오스 전기 영동에 걸어, 에티듐 브로마이드 (Ethidium Bromide) 나 SYBR Green 등의 형광성 인터칼레이터를 결합시켜 특이적 형광을 관찰하는 방법, 핵산 증폭 반응의 용액에 형광성 인터칼레이터를 첨가하여, 증폭 반응 후의 형광 검출을 실시하는 방법, 형광 표지된 프라이머를 사용하여 핵산 증폭 반응을 실시하여, 증폭 반응 후의 형광 검출을 실시하는 방법 등을 들 수 있다.
또한, 핵산 증폭법을 이용하여 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 검출하는 경우, 당해 마커를 포함하는 증폭 단편의 염기 길이는, 핵산 증폭 방법의 원리 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들어 30 ∼ 10000 염기 길이로 할 수 있고, 50 ∼ 5000 염기 길이로 하는 것이 바람직하고, 70 ∼ 2000 염기 길이로 하는 것이 보다 바람직하다.
또, 딸기속 식물에 있어서의 탄저병 저항성을 판정할 때, 복수의 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 검출해도 된다. 즉, 딸기속 식물의 염색체에 있어서의 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 및 배열 번호 10 으로 나타내는 염기 배열 사이에 위치하는 핵산 영역에서 선택되는 복수의 영역을 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로 하고, 이들 복수의 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 검출해도 된다. 예를 들어, 배열 번호 1 ∼ 10 의 염기 배열로 이루어지는 10 개의 영역에서 선택되는 복수의 영역을 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로 하고, 이들 복수의 영역을 검출해도 된다.
일례로는, 배열 번호 7 의 염기 배열로 이루어지는 영역 (IA200826) 과 배열 번호 8 의 염기 배열로 이루어지는 영역 (IA202631) 을 각각 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로 하고, 이들 각 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭시켜 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존부를 확인할 수 있다. 혹은, 일례로서 배열 번호 7 의 염기 배열로 이루어지는 영역 (IA200826) 과 배열 번호 8 의 염기 배열로 이루어지는 영역 (IA202631) 사이에 위치하는 영역을 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로 하고, 이 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭시켜 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존부를 확인할 수 있다.
한편, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커에 대응하는 프로브를 갖는 DNA 마이크로어레이를 이용하는 형태에 있어서, 당해 프로브란, 상기 서술한 바와 같이 정의된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커에 대해, 스트린젠트한 조건하에서 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 상기 서술한 바와 같이 정의된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 염기 배열 또는 그 상보 사슬이 적어도 연속되는 10 염기, 15 염기, 20 염기, 25 염기, 30 염기, 35 염기, 40 염기, 45 염기, 50 염기 또는 그 이상의 염기 길이의 부분 영역 혹은 전체 영역으로서 설계할 수 있다. 또한, 이 프로브를 갖는 DNA 마이크로어레이로는, 유리나 실리콘 등의 평면 기판을 담체로 하는 마이크로어레이나, 마이크로비즈를 담체로 하는 비즈 어레이, 혹은 중공 섬유의 내벽에 프로브를 고정시키는 3 차원 마이크로어레이 등의 어떠한 타입의 마이크로어레이여도 된다.
이상과 같이 제작된 DNA 마이크로어레이를 사용함으로써, 후대 계통 등으로 대표되는 탄저병 저항성의 표현형이 미지인 딸기속 식물에 대하여, 탄저병 저항성이 우수하다고 하는 표현형을 나타내는 계통인지 판단할 수 있다. 또한, 상기 서술한 DNA 마이크로어레이를 사용하는 방법 이외라 하더라도, 종래 공지된 수법을 사용하여 상기 서술한 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 검출하여, 공시 딸기속 식물에 대하여 탄저병 저항성이 우수하다고 하는 형질을 갖는 계통인지 판단해도 된다. DNA 마이크로어레이를 사용하는 방법 이외의 방법으로는, 예를 들어, 상기 서술한 프로브를 사용한, 이른바 FISH (fluorescence in situ hybridization) 법을 적용할 수 있다.
DNA 마이크로어레이를 사용하는 방법을 보다 상세하게 설명한다. 도 2 에 나타내는 바와 같이, 먼저 공시 딸기속 식물로부터 게놈 DNA 를 추출한다. 이 공시 딸기속 식물이란, 후대 계통 등의 탄저병 저항성의 표현형이 미지인 딸기속 식물 및/또는 후대 계통을 제작할 때에 사용한 모체의 딸기속 식물인 것을 말하고, 탄저병 저항성이 우수하다고 하는 형질을 갖는지 판정하는 대상이 되는 딸기속 식물이다.
다음으로, 추출한 게놈 DNA 를, 상기 ＜딸기속 식물에 있어서의 마커의 동정＞ 의 란에서 설명한 DNA 마이크로어레이를 제작할 때에 사용한 제한 효소로 소화시켜 복수의 게놈 DNA 단편을 조정한다. 다음으로, 얻어진 게놈 DNA 단편과, DNA 마이크로어레이를 제작할 때에 사용한 어댑터를 연결한다. 다음으로, 양 말단에 어댑터가 부가된 게놈 DNA 단편을, DNA 마이크로어레이를 제작할 때에 사용한 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 이로써, DNA 마이크로어레이를 제작할 때의 공정 1d 에서 증폭시킨 게놈 DNA 단편에 대응하는, 공시 딸기속 식물 유래의 게놈 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다.
이 공정에 있어서는, 어댑터가 부가된 게놈 DNA 단편 중, 소정의 게놈 DNA 단편을 선택적으로 증폭시켜도 된다. 예를 들어, 복수의 제한 효소에 대응하는 복수의 어댑터를 사용한 경우에는, 특정 어댑터가 부가된 게놈 DNA 단편을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또, 복수의 제한 효소로 게놈 DNA 를 소화시킨 경우, 얻어진 게놈 DNA 단편 중, 소정의 제한 효소에 대응하는 돌출 말단을 갖는 게놈 DNA 단편에만 어댑터를 부가함으로써, 어댑터가 부가된 게놈 DNA 단편을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 이와 같이, 소정의 게놈 DNA 단편을 선택적으로 증폭시킴으로써 농축시킬 수 있다.
다음으로, 증폭시킨 게놈 DNA 단편에 표지를 부가한다. 표지로는, 종래 공지된 어떠한 물질을 사용해도 된다. 표지로는, 예를 들어 형광 분자, 색소 분자, 방사성 분자 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 공정은, 게놈 DNA 단편을 증폭시키는 공정에 있어서 표지를 갖는 뉴클레오티드를 사용함으로써 생략할 수 있다. 상기 공정에 있어서 표지를 갖는 뉴클레오티드를 사용하여 게놈 DNA 단편을 증폭시킴으로써, 증폭된 DNA 단편이 표지화되기 때문이다.
다음으로, 표지를 갖는 게놈 DNA 단편을 소정의 조건하에서 DNA 마이크로어레이에 접촉시켜, DNA 마이크로어레이에 고정된 프로브와 표지를 갖는 게놈 DNA 단편을 하이브리다이즈시킨다. 이 때, 하이브리다이즈시킬 때에는 높은 스트린젠시 조건으로 하는 것이 바람직하다. 이와 같은 높은 스트린젠시 조건으로 함으로써, 공시 딸기속 식물에 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커가 존재하고 있는지 여부를 보다 고정밀도로 판정할 수 있다. 또한, 스트린젠시 조건은, 반응 온도 및 염 농도로 조절할 수 있다. 즉, 보다 고온으로 함으로써 보다 높은 스트린젠시 조건이 되고, 또 보다 낮은 염 농도에서 보다 높은 스트린젠시 조건이 된다. 예를 들어, 50 ∼ 75 염기 길이의 프로브를 사용하는 경우, 하이브리다이제이션 조건으로는, 40 ∼ 44 ℃, 0.2 ％ SDS, 6 × SSC 의 조건으로 함으로써 보다 높은 스트린젠시 조건으로 할 수 있다.
또, 프로브와 표지를 갖는 게놈 DNA 단편과의 하이브리다이즈는, 표지에 기초하여 검출할 수 있다. 즉, 상기 서술한 표지를 갖는 게놈 DNA 단편과 프로브의 하이브리다이즈 반응 후, 미반응의 게놈 DNA 단편 등을 세정하고, 그 후, 프로브에 대해 특이적으로 하이브리다이즈한 게놈 DNA 단편의 표지를 관찰한다. 예를 들어, 표지가 형광 물질인 경우에는 그 형광 파장을 검출하고, 표지가 색소 분자이면 그 색소 파장을 검출한다. 보다 구체적으로는, 통상의 DNA 마이크로어레이 해석에 사용하고 있는, 형광 검출 장치나 이미지 애널라이저 등의 장치를 사용할 수 있다.
이상과 같이, 핵산 증폭법을 이용하는 방법 혹은 DNA 마이크로어레이를 사용하는 방법에 의해, 공시 딸기속 식물이 상기 서술한 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 갖는지 여부를 판단할 수 있다. 여기에서, 상기 서술한 바와 같이, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커 중, 탄저병 저항성이 우수하다고 하는 형질에 연쇄되는 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커가 존재하고 있으면, 탄저병 저항성이 우수한 계통ㆍ품종이라고 판단할 수 있다. 또, 상기 서술한 바와 같이, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커 중, 탄저병 저항성이 저하되는 형질에 연쇄되는 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커가 비존재이면, 탄저병 저항성이 우수한 계통ㆍ품종이라고 판단할 수 있다.
특히, 상기 서술한 방법에서는, 공시 딸기속 식물을 실제의 탄저병 저항성 시험을 실시할 수 있는 정도까지 성장시킬 필요는 없고, 예를 들어 후대 계통의 종자나 당해 종자를 발아시킨 유묘를 사용할 수 있다. 따라서, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 이용함으로써, 공시 딸기속 식물을 생육시키기 위한 포장 (圃場) 이나 기타, 생육을 위한 비용을 대폭 삭감할 수 있다. 또, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 이용함으로써, 실제로 탄저균의 원인 미생물 (글로메렐라 신굴레이트 (Glomerella cingulate) 및/또는 콜레토트리춤 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum)) 을 감염시킬 필요가 없어, 대규모 전용 온실이나 전용 포장, 외부와의 격리 시설 등 설비 등에 드는 비용을 삭감할 수 있다.
특히, 딸기속 식물의 신품종을 만들어낼 때에, 먼저, 교배에 의해 수만 종류의 교배종을 제작한 후, 실생 선발에 앞서 혹은 실생 선발 대신에, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 이용한 판단을 실시하는 것이 바람직하다. 이로써, 실제의 포장에 있어서, 우량한 계통을 재배하는 수를 대폭 삭감할 수 있어, 딸기속 식물의 신품종을 만들어내는 것과 관련된 수고나 비용을 대폭 억제할 수 있다.
혹은, 딸기속 식물의 신품종을 만들어낼 때에, 먼저, 교배에 사용하는 모체 품종에 있어서의 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존재의 유무를 판정하여, 탄저병 저항성이 우수한 모체 품종을 선발할 수도 있다. 탄저병 저항성이 우수한 모체 품종을 우선적으로 사용하여 후대 계통을 만들어냄으로써, 탄저병 저항성이 우수한 후대 계통이 고빈도로 출현할 것으로 기대할 수 있다. 이로써, 우량한 계통을 재배하는 수를 대폭 삭감할 수 있어, 딸기속 식물의 신품종을 만들어내는 것과 관련된 수고나 비용을 대폭 억제할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. DNA 마이크로어레이용 프로브의 제작
(1) 재료
재배 딸기 품종 : 사치노카 및 딸기 중간 모본 농2호를 사용하였다.
(2) 제한 효소 처리
이들 재배 딸기 품종으로부터 각각 게놈 DNA 를 CTAB 법 (세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (Cetyl trimethyl ammonium bromide) 법) 에 의해 추출하였다. 추출한 게놈 DNA (180 ng) 를 제한 효소 PstI (NEB 사, 6 유닛 (unit)) 로 37 ℃ 에서 1 시간 처리하였다. 그 후, PstI 처리 후의 게놈 DNA (150 ng) 를 제한 효소 BstNI (NEB 사, 5 유닛) 를 첨가하고, 60 ℃ 에서 1 시간 처리하였다.
(3) 어댑터 라이게이션
(2) 에서 처리한 게놈 DNA 단편 (120 ng) 에 PstI 배열 어댑터 (5'-CACGATGGATCCAGTGCA-3' (배열 번호 11), 5'-CTGGATCCATCGTGCA-3' (배열 번호 12)) 와 T4 DNA 리가아제 (NEB 사, 800 유닛) 를 첨가하고, 16 ℃ 에서 4 시간 이상의 조건에서 라이게이션 반응을 실시하였다. 이로써, (2) 에서 처리한 게놈 DNA 단편 중, 양 말단에 PstI 인식 배열을 갖는 게놈 DNA 단편에 대해 선택적으로 어댑터를 부가하였다.
(4) PCR 증폭
(3) 에서 얻어진 어댑터를 갖는 게놈 DNA 단편 (15 ng) 에 PstI 배열 어댑터 인식 프라이머 (5'-GATGGATCCAGTGCAG-3' (배열 번호 13)) 와 Taq 중합효소 (타카라 바이오사 PrimeSTAR, 1.25 유닛) 를 첨가하고, PCR (98 ℃ 를 10 초간, 55 ℃ 를 15 초간, 72 ℃ 를 1 분간을 1 사이클로 하여 30 사이클 실시 후, 72 ℃ 에서 3 분간 처리 후, 4 ℃ 에서 보존) 로 게놈 DNA 단편을 증폭시켰다.
(5) 게놈 시퀀스 취득
(4) 에 있어서 PCR 증폭시킨 게놈 DNA 단편에 대하여 GAII (Illumina 사) 를 사용하여 염기 배열을 결정하였다.
(6) 프로브 설계 및 DNA 마이크로어레이의 제작
(5) 의 게놈 시퀀스 정보를 기초로 50 ∼ 75 bp 의 프로브를 설계하였다. 설계한 프로브의 염기 배열 정보를 기초로, 이들 프로브를 갖는 DNA 마이크로어레이를 제작하였다.
2. DNA 마이크로어레이를 사용한 시그널 데이터의 취득
(1) 재료
재배 딸기 품종 : 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호 및 이들의 교잡 후대 133 계통을 사용하였다.
(2) 제한 효소 처리
이들 재배 딸기 품종 및 교잡 후대로부터 각각 게놈 DNA 를 CTAB 법에 의해 추출하였다. 추출한 게놈 DNA (180 ng) 를 제한 효소 PstI (NEB 사, 6 유닛) 로 37 ℃ 에서 1 시간 처리하였다. 그 후, PstI 처리 후의 게놈 DNA (150 ng) 를 제한 효소 BstNI (NEB 사, 5 유닛) 를 첨가하고, 60 ℃ 에서 1 시간 처리하였다.
(3) 어댑터 라이게이션
(2) 에서 처리한 게놈 DNA 단편 (120 ng) 에 PstI 배열 어댑터 (5'-CACGATGGATCCAGTGCA-3' (배열 번호 11), 5'-CTGGATCCATCGTGCA-3' (배열 번호 12)) 와 T4 DNA 리가아제 (NEB 사, 800 유닛) 를 첨가하고, 16 ℃ 에서 4 시간 이상의 조건에서 라이게이션 반응을 실시하였다. 이로써, (2) 에서 처리한 게놈 DNA 단편 중, 양 말단에 PstI 인식 배열을 갖는 게놈 DNA 단편에 대해 선택적으로 어댑터를 부가하였다.
(4) PCR 증폭
(3) 에서 얻어진 어댑터를 갖는 게놈 DNA 단편 (15 ng) 에 PstI 배열 어댑터 인식 프라이머 (5'-GATGGATCCAGTGCAG-3' (배열 번호 13)) 와 Taq 중합효소 (타카라 바이오사 PrimeSTAR, 1.25 유닛) 를 첨가하고, PCR (98 ℃ 를 10 초간, 55 ℃ 를 15 초간, 72 ℃ 를 1 분간을 1 사이클로 하여 30 사이클 실시 후, 72 ℃ 에서 3 분간 처리 후, 4 ℃ 에서 보존) 로 게놈 DNA 단편을 증폭시켰다.
(5) 라벨화
상기 서술한 (4) 에서 얻어진 PCR 증폭 단편을 칼럼 (Qiagen 사) 으로 정제 후, NimbleGen Arrays User's Guide 에 따라 NimbleGen One-Color DNA Labeling 을 사용하여 라벨화 샘플을 조정하였다.
(6) 하이브리ㆍ시그널 검출
(5) 의 라벨화 샘플을 사용하고, NimbleGen Array User's Guide 에 따라, 상기 1. 에서 제작한 DNA 마이크로어레이를 사용하여 하이브리다이즈를 실시하고, 라벨에 기초하는 시그널을 검출하였다.
3. 딸기속 식물 탄저병 저항성의 QTL 의 동정 및 마커의 개발
(1) 유전 지도 데이터 작성
사치노카, 딸기 중간 모본 농2호, 교잡 후대 133 계통의 시그널 데이터로부터, 사치노카형의 1,502 개의 마커 및 딸기 중간 모본 농2호형의 2,162 개의 마커가 될 수 있는 유전자형 데이터를 취득하였다. 유전자형 데이터를 기초로, 유전 지도 작성 소프트웨어 AntMap (Iwata H, Ninomiya S (2006) AntMap : constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56 : 371-378) 을 사용하고, 유전 거리 계산식 Kosambi 에 의해 염색체에 있어서의 마커의 위치 정보를 산출하여 마커의 유전 지도 데이터를 취득하였다.
(2) 딸기 탄저병 검정 시험 데이터의 취득
사치노카, 딸기 중간 모본 농2호, 교잡 후대 103 계통의 러너 증식한 클론주를 검정주로 하였다. 각 검정주에 대하여 1 구 5 주 × 3 반복으로 재배하였다. 접종 2 일 전까지 전개잎이 3 ∼ 4 매가 되도록 하엽 (下葉) 을 제거하여 잎의 수를 동일하게 하였다.
그리고, 독립행정법인 농업ㆍ식품산업기술 종합연구기구의 야사이챠교 연구소가 보유하고 있는 딸기 탄저병 균주 (글로메렐라 신굴레이트 (Glomerella cingulate)) 를 PS 액체 배지 (1000 ㎖ 에 대해 매시드 포테이토 20 g, 자당 2 ％) 중에서 5 일간 진탕 배양 (120 rpm) 하였다. 배양액을 거즈로 여과한 후, 분생 (分生) 포자를 105 개/㎖ 의 농도로 조정한 것을 접종원 (분생 포자 현탁액) 으로 하였다. 2012년 9월 19일, 기온이 저하되기 시작하는 오후 3 시부터, 조정한 접종원 (분생 포자 현탁액) 을 전지식 어깨에 매는 동력 분무기로, 전착제 등은 첨가하지 않고, 식물체가 전체적으로 젖을 정도까지 분무하였다.
그 후, 한랭사 (寒冷紗) 로 내장 차광을 한 유리실 내에서 발병시켰다. 접종 당일부터 다음날 낮까지 유리실을 꼭 닫고, 다습하게 유지하였다. 그 후, 천창 (天窓)ㆍ측창 (側窓) 을 자동 개폐 (25 ℃) 로 하고, 온도는 있는 그대로의 온도로 관리하였다. 딸기 탄저병 이병주의 조사는, 10월 19일에 각 품종ㆍ계통에 대하여 위조 (萎凋) 혹은 고사한 주 (株) 의 비율로서 조사하였다. 조사 결과를 도 3 에 나타냈다.
(3) 양적 형질 (Quantitative trait loci : QTL) 의 해석
상기 (1) 에서 얻어진 유전 지도 데이터 및 상기 (2) 에서 얻어진 딸기 탄저병 검정 시험 데이터 (위조ㆍ고사주율) 를 기초로, 유전 해석 소프트 QTL Cartographer (Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC) 를 사용하여, 비교 간격 맵핑 (Composite interval mapping, CIM) 법에 의해 QTL 해석을 실시하였다. LOD 의 임계값은 2.5 를 사용하였다. 그 결과, 도 4 에 나타내는 바와 같이, 딸기 중간 모본 농2호의 제 23 연쇄군의 마커 IA204069 내지 IA201502 의 구간 내에 LOD 값이 18.3 인 딸기의 탄저병 저항성에 관한 유전자의 존재를 시사하는 피크를 확인할 수 있었다. 얻어진 피크는 표 2 에 나타내는 바와 같이 특정할 수 있어, 당해 피크의 위치에 탄저병 저항성을 향상시키는 기능을 갖는 원인 유전자(군)이 존재하는 것이 시사되었다.
또한, 표 2 에 있어서 효과 (％) 의 란은, 탄저병 위조ㆍ고사주율을 나타내고 있다. 따라서, 효과 (％) 의 수치가 부 (負) 인 경우, 당해 QTL 은 탄저병 저항성이 향상되는 형질에 연쇄되는 것을 의미하고 있다.
그리고, 도 4 에 나타내는 바와 같이, 당해 피크의 근방에 위치하는 마커는, 탄저병 저항성을 향상시키는 기능을 갖는 원인 유전자(군)과 연쇄하여 유전되기 때문에, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로서 사용할 수 있는 것이 나타났다. 즉, 도 4 에 나타낸 10 종류의 마커는, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커로서 사용할 수 있는 것이 분명해졌다.
또, 본 실시예에서 제작한 프로브의 염기 배열 및 시그널값의 임계값을 표 3 에 나타냈다.
표 3 에 나타낸 프로브를 이용하여, 사치노카 및 딸기 중간 모본 농2호, 그리고 후대 계통에 대하여, 마커 IA204069 내지 IA201502 의 시그널을 검출한 결과를 각각 도 5 내지 도 14 에 나타냈다 (또한, 도 5 내지 도 14 에 있어서 중모 2호* 는 딸기 중간 모본 농2호를 의미하고 있다). 또, 검출 결과를 표 4 에 정리하여 나타냈다.
표 4 및 도 5 ∼ 14 에 나타내는 바와 같이, 딸기 중간 모본 농2호의 제 23 연쇄군의 마커 IA204069 내지 IA201502 의 영역은, 딸기속값에 있어서의 탄저병 위조ㆍ고사주율 (％) 과 높은 관련성을 나타내는 것이 분명해졌다.
4. PCR 베이스 마커의 개발
또, 본 실시예에서는, 딸기 중간 모본 농2호의 제 23 연쇄군의 마커 IA204069 내지 IA201502 의 영역 중에서 마커 IA202631 및 IA200826 을 PCR 에 의해 증폭시키는 프라이머를 설계하였다.
(1) 프라이머 제작
시퀀스 어셈블리 소프트웨어 ATGC ver.6 을 사용하여, 마커 IA202631 및 IA200826 의 배열 정보로부터, 각각의 배열을 식별하는 프라이머를 제작하였다. 즉, IA202631 에 대해서는 CGGTTAACCCCTCCTAGAAAATC (IA202631F_2A : 배열 번호 24) 와 TGCAGCTGTGAGGTTGTCTTTAT (IA202631R_111A : 배열 번호 25) 를 설계하고, IA200826 에 대해서는 CTGCAGAAAAGGGAGAAGAAGTTC (IA200826F_1A : 배열 번호 26) 와 GCCAGATGAAATAGAAGATTAGCACC (IA200826R_259A : 배열 번호 27) 를 설계하였다.
또, 마찬가지로, 시퀀스 어셈블리 소프트웨어 ATGC ver.6 을 사용하여, 마커 IA202531 및 IA200064 의 배열 정보로부터, 각각의 배열을 식별하는 프라이머를 제작하였다. 즉, IA202531 에 대해서는 GCTACTCATAGTAGGTCGATTGGAAG : 배열 번호 28 과 CTGCAGTTTACATGCAGCAGA : 배열 번호 29 를 설계하고, IA200064 에 대해서는 AAGTTCAACATTATCAAGGAAAATGAA : 배열 번호 30 과 AATTGATAACTATTAACAGCAGTCAGG : 배열 번호 31 을 설계하였다.
(2) PCR 증폭
딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호 및 교잡 후대 12 계통의 게놈 DNA (15 ng) 에, 상기 프라이머 페어와 Taq 중합효소 (타카라 바이오사, PrimeSTAR, 0.5 유닛) 를 첨가하고, PCR (98 ℃ 를 10 초간, 55 ℃ 를 5 초간, 72 ℃ 를 1 분간, 30 사이클 후, 72 ℃ 에서 3 분간 처리 후, 4 ℃ 에서 보존) 로 증폭시켰다. PCR 증폭시킨 DNA 단편은, 전기 영동 (2.0 ％ 아가로오스 겔, TAE, 100 V 30 분) 에 의해 확인하였다. 마커 IA200826 을 PCR 증폭시킨 결과를 도 15 에 나타내고, 마커 IA202631 을 PCR 증폭시킨 결과를 도 16 에 나타냈다. 도 15 및 도 16 에 나타내는 바와 같이, 표 4 에 나타낸 시그널 데이터와 일치하여, 어느 프라이머 페어도 목적으로 하는 밴드 패턴을 증폭시킬 수 있는 것이 나타났다.
또, 마커 IA202531 을 PCR 증폭시킨 결과를 도 20 에 나타냈다. 도 20 에 나타내는 바와 같이, 마커 IA202531 에 대해서도, 표 4 에 나타낸 시그널 데이터와 일치하여, 상기 서술한 바와 같이 설계한 프라이머 페어에 의해 목적으로 하는 밴드 패턴을 증폭시킬 수 있는 것이 나타났다.
그런데, 마커 IA200064 에 대해서는, 딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호의 게놈 DNA 를 주형으로 한 PCR 후, PCR 증폭시킨 DNA 단편을 생거법으로 시퀀스하였다. 그 결과, 사치노카 게놈으로부터는 배열 번호 32 로 나타내는 배열 정보가 얻어지고, 중간 모본 농2호 게놈으로부터는 배열 번호 32 로 나타내는 배열 정보와 배열 번호 4 로 나타내는 배열 정보가 얻어졌다. 배열 번호 32 와 배열 번호 4 에 있어서의 257 번째는, SNP (배열 번호 32 에서는 A, 배열 번호 4 에서는 T) 인 것이 판명되었다. 배열 번호 32 에 있어서, 257 번째의 A 부터 6 염기 (ATGCAT) 는, 제한 효소 Nsi I 의 인식 배열 (ATGCAT) 과 일치하고 있었다.
그리고, 마커 IA200064 를 상기 다른 마커와 마찬가지로 PCR 증폭시키고, PCR 증폭시킨 DNA 단편에 Nsi I (NEB 사, 2 유닛) 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 처리하였다. 제한 효소 처리한 DNA 단편은, 전기 영동 (2.0 ％ 아가로오스 겔, TAE, 100 V 30 분) 에 의해 확인하였다. 마커 IA200064 를 PCR 증폭시키고, 제한 효소 처리한 결과를 도 21 에 나타냈다. 제한 효소 인식 부위를 갖는 사치노카에서는 247 염기와 261 염기 근방에 밴드가 나타났지만, 한편 중간 모본 농2호에서는, 247 염기와 261 염기 근방의 밴드에 더하여 500 염기 근방에 밴드가 나타났다. 도 21 에 나타내는 바와 같이, 500 염기 근방의 밴드는, 표 4 에 나타낸 시그널 데이터와 일치하여, 상기 서술한 바와 같이 설계한 프라이머 페어에 의해 목적으로 하는 밴드 패턴을 증폭시킬 수 있는 것이 나타났다.
5. 탄저병 저항성 계통의 선발
(1) 유전자형 데이터와 탄저병 위조ㆍ고사주율
딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호 및 교잡 후대 133 계통의 선발 마커 IA200826 의 유전자형 데이터와 탄저병 위조ㆍ고사주율을 비교하였다 (도 17). 딸기 탄저병에 대한 저항성이 우수한 계통의 상당수는, 선발 마커 IA200826 을 가지고 있었다 (평균 10.6 ％). 한편, 딸기 탄저병에 대한 이병성을 나타내는 계통의 상당수는, 선발 마커 IA200826 을 가지고 있지 않았다 (평균 49.8 ％). T 검정의 결과, 유의 수준 1 ％ 로 양 평균값에 유의한 차가 인정되었다.
(2) 미지 계통의 선발
Ⅰ. 게놈 DNA 의 추출
새로, 딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호의 교잡 후대 2 계통 (A 및 B) 에 대하여, CTAB 법에 의해 게놈 DNA 를 추출하였다.
Ⅱ. 선발 마커에 의한 검정
딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호 및 교잡 후대 2 계통 (A 및 B) 의 게놈 DNA (15 ng) 에, 상기 4. 에서 설계한 IA202631 프라이머 페어 (IA202631F_2A 및 IA202631R_111A) 혹은 IA200826 프라이머 페어 (IA200826F_1A 및 IA200826R_259A) 와 Taq 중합효소 (타카라 바이오사, PrimeSTAR, 0.5 유닛) 를 첨가하고, PCR (98 ℃ 를 10 초간, 55 ℃ 를 5 초간, 72 ℃ 를 1 분간, 30 사이클 후, 72 ℃ 에서 3 분간 처리 후, 4 ℃ 에서 보존) 로 증폭시켰다. PCR 증폭시킨 DNA 단편은, 전기 영동 (2.0 ％ 아가로오스 겔, TAE, 100 V 30 분) 에 의해 확인하였다. 그 결과를 도 18 에 나타냈다. 도 18 에 나타내는 바와 같이, 교잡 후대 A 계통은, IA202631 및 IA200826 의 어느 마커도 보유하고 있지 않았다. 한편, 교잡 후대 B 계통은, IA202631 및 IA200826 의 양방의 마커를 보유하고 있었다.
Ⅲ. 탄저병 검정 시험 데이터와의 비교
탄저병 검정 시험의 결과, 교잡 후대 A 계통 및 교잡 후대 B 계통의 탄저병 위조ㆍ고사주율은, 각각 80.0 ％ 와 13.3 ％ 였다. T 검정의 결과, 유의 수준 1 ％ 로 계통 A 및 계통 B 의 탄저병 위조ㆍ고사주율에 유의한 차가 인정되었다. IA202631 및 IA200826 마커를 보유하고 있었던 교잡 후대 B 계통은, 탄저병 위조ㆍ고사주율이 낮아, 딸기 탄저병의 저항성이 우수하였다. 한편, IA202631 및 IA200826 의 마커를 모두 보유하고 있지 않았던 교잡 후대 A 계통은, 탄저병 위조ㆍ고사주율이 높아, 딸기 탄저병의 저항성이 떨어졌다. 이상의 결과로부터, 이들 마커를 이용함으로써, 탄저병 저항성이 우수한 계통, 탄저병 저항성이 떨어지는 계통을 판별할 수 있는 것이 분명해졌다.
Ⅳ. 마커 간 영역에서의 PCR 증폭
딸기 품종 사치노카, 딸기 중간 모본 농2호의 게놈 DNA (15 ng) 에, 프라이머 페어 (IA200826F_1A 및 IA202631R_111A) 와 Taq 중합효소 (타카라 바이오사, PrimeSTAR, 0.5 유닛) 를 첨가하고, PCR (98 ℃ 를 10 초간, 55 ℃ 를 5 초간, 72 ℃ 를 2 분간, 25 사이클 후, 72 ℃ 에서 3 분간 처리 후, 4 ℃ 에서 보존) 로 증폭시켰다. PCR 증폭시킨 DNA 단편은, 전기 영동 (2.0 ％ 아가로오스 겔, TAE, 100 V 30 분) 에 의해 확인하였다. 그 결과를 도 19 에 나타냈다. 도 19 에 나타내는 바와 같이, 딸기 중간 모본 농2호에서는, 1.4 kbp 의 PCR 증폭시킨 DNA 단편이 확인되었다. 즉, 딸기 중간 모본 농2호의 제 23 연쇄군의 마커 IA204069 내지 IA201502 의 영역 중에서 마커 IA202631 및 IA200826 을 포함하는 영역을 PCR에 의해 증폭시킬 수 있었다.
이 결과로부터, 딸기 중간 모본 농2호의 제 23 연쇄군의 마커 IA204069 내지 IA201502 의 영역 중에서 복수의 마커를 1 쌍의 프라이머 페어로 증폭시켜, 딸기속 식물 탄저병을 판별할 수 있는 것이 분명해졌다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> TOYOTA JIDOSHA KABUSHIKI KAISHA
<120> A marker related to anthracnose resistance in Fragaria L plant
and the use thereof
<130> PH-5865-PCT
<150> JP 2013-186688
<151> 2013-09-09
<150> JP 2014-165405
<151> 2014-08-15
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 220
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 1
gcgttactaa ttgatattgg gtttacaata agtatcaatt tgctaaagct agctacaaca 60
gcactacagc agttgtagta ttagttgtta catgattcgt cggactttgt gactctgttt 120
ttctttgctg tttcttgctt tgtgcttgct attacaaggg ttatcttgtg caattagagt 180
tttggggatt ggatcggatg attatcggat tcaactgcag 220
<210> 2
<211> 136
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 2
gcttttttag cttttggtat cagaacaata gttcaggcat gtcaacagga aaatgaagta 60
aaccaatgga aaagggcaga agaaatgaga ctagaagagg caaaagtagc cgaagaagtt 120
gcaatggaag ctgcag 136
<210> 3
<211> 190
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 3
aacaaatata gtgtaattaa gctactcata gtaggtcgat tggaagaggt gatccagagt 60
tctaaactat atagcatcac tgttcattta aatcgtcacg cagcgcacag taggcttcat 120
tgtgtgagcc aaattgagag tggttggttt tgccaatgtt ttgagcacgt ctgctgcatg 180
taaactgcag 190
<210> 4
<211> 508
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 4
ctgcagaata agttcaacat tatcaaggaa aatgaagcaa tttatctctg caaggtttta 60
gaggtaacaa atttgtagag atctgtggag catgaagaac ttcttaaagt tgcaagtgaa 120
tgaagtggtg caaaggatgt atagcgctat caaccattgc tgaatgtaat cttctcctcg 180
agttcaaaag gaatagcaag tggcaaatta ctaatattgg ccatatggtc tgtaacccaa 240
acatcttcat cagaaattgc atgatgagag gaacgcctct tgagtacttt ctgaagtttg 300
agtagtcatt gcagtaaggg cacatttact aacttggaat gaaaaatatc atgaatcggt 360
atcaacaaga attggtatga gaatatttca ttccattcta ccaaattttt atccaacaca 420
agagtttccg tcatagtgta accagcagag gtgttgttgg ggtctcctga gtcctgactg 480
ctgttaatag ttatcaattt atcataat 508
<210> 5
<211> 117
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 5
gacggtattc taatctataa ttaaagagct cagtgatttc attgttgtct aaatagctga 60
atgagtaatt gaggctatgg gccaatgagc ccagcaattt gcacgtactt gctgcag 117
<210> 6
<211> 114
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 6
tctaaacatg acaagctatc tttcatttta aacagaagtt ttcatttttc tttatacgcc 60
taagctaaaa acttttataa tctcatcact aactactagc tactactact gcag 114
<210> 7
<211> 281
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 7
ctgcagaaaa gggagaagaa gttcttggaa agttttgtga tcaaatatca agagcaagta 60
ccgaattatt gagcatattt aaaggtaaaa cgggtctggc ggaactgggc ttaggatttg 120
tgaaaagata tgaagtgaaa caacagtgtg atgattagaa gggtcgtaga accatttcat 180
gtttttgagt gctgttgtca gtctcattaa tacaactgta tatagtgatg actggtgcta 240
atcttctatt tcatctggca ttacaatctt ctattatgag t 281
<210> 8
<211> 112
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 8
acggttaacc cctcctagaa aatccatatc aatttatata tgtatgtatc tgtatctgta 60
tctatctctc atatctctat gtaactatat aaagacaacc tcacagctgc ag 112
<210> 9
<211> 123
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 9
atcttcaata gccgaccagt cgctatgttt ttattttgtt caaattgtac gtgtgtgtcc 60
tcaatagttt cttttcaaat atgaaggatg gtgccgctgt agctggtctt gctattgctg 120
cag 123
<210> 10
<211> 301
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 10
ctgcagcgga ggcgcctgcc gactccaacc ctgatgttga gattgataaa aatatgggga 60
ataatatggt catagttgga cactgaccga gccagccatg ggcctagtgc tagctgatgc 120
ttttatatag ggaaaattgt ccaaacagtg tctcaccttt tagaaaaact aacttttggt 180
atctcaactt ttaaaaactt caaaacggta tctcacgttt ctacttcaac cgaaatatgg 240
tacctgcaac tgttaatttt gttaaaacaa ctgacagatt aagggtattt tcgtcctttc 300
a 301
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 11
cacgatggat ccagtgca 18
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 12
ctggatccat cgtgca 16
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 13
gatggatcca gtgcag 16
<210> 14
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 14
gcgttactaa ttgatattgg gtttacaata agtatcaatt tgctaaagct agctacaaca 60
gcactacagc a 71
<210> 15
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 15
tgaagtaaac caatggaaaa gggcagaaga aatgagacta gaagaggcaa aagtagc 57
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 16
tggaagaggt gatccagagt tctaaactat atagcatcac tgttcattta aatcgtcacg 60
<210> 17
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 17
gaataagttc aacattatca aggaaaatga agcaatttat ctctgcaagg ttttagaggt 60
aacaaatt 68
<210> 18
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 18
attgttgtct aaatagctga atgagtaatt gaggctatgg gccaatgagc cca 53
<210> 19
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 19
tttcatttta aacagaagtt ttcatttttc tttatacgcc taagctaaaa acttttataa 60
tc 62
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 20
gtgctgttgt cagtctcatt aatacaactg tatatagtga tgactggtgc taatcttcta 60
tttcatctg 69
<210> 21
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 21
tgtatgtatc tgtatctgta tctatctctc atatctctat gtaactatat aaagacaacc 60
tcacagctgc act 73
<210> 22
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 22
gccgaccagt cgctatgttt ttattttgtt caaattgtac gtgtgtgtcc tcaatagttt 60
cttttcaa 68
<210> 23
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 23
cgtttctact tcaaccgaaa tatggtacct gcaactgtta attttgttaa aacaactgac 60
agatta 66
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 24
cggttaaccc ctcctagaaa atc 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
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<400> 25
tgcagctgtg aggttgtctt tat 23
<210> 26
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<400> 26
ctgcagaaaa gggagaagaa gttc 24
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 27
gccagatgaa atagaagatt agcacc 26
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<400> 28
gctactcata gtaggtcgat tggaag 26
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 29
ctgcagttta catgcagcag a 21
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 30
aagttcaaca ttatcaagga aaatgaa 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 31
aattgataac tattaacagc agtcagg 27
<210> 32
<211> 508
<212> DNA
<213> Fragaria x ananassa
<400> 32
ctgcagaata agttcaacat tatcaaggaa aatgaagcaa tttatctctg caaggtttta 60
gaggtaacaa atttgtagag atctgtggag catgaagaac ttcttaaagt tgcaagtgaa 120
tgaagtggtg caaaggatgt atagcgctat caaccattgc tgaatgtaat cttctcctcg 180
agttcaaaag gaatagcaag tggcaaatta ctaatattgg ccatatggtc tgtaacccaa 240
acatcttcat cagaaaatgc atgatgagag gaacgcctct tgagtacttt ctgaagtttg 300
agtagtcatt gcagtaaggg cacatttact aacttggaat gaaaaatatc atgaatcggt 360
atcaacaaga attggtatga gaatatttca ttccattcta ccaaattttt atccaacaca 420
agagtttccg tcatagtgta accagcagag gtgttgttgg ggtctcctga gtcctgactg 480
ctgttaatag ttatcaattt atcataat 508
Claims (7)
- 딸기속 식물의 염색체에 있어서의 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 및 배열 번호 10 으로 나타내는 염기 배열 사이에 위치하는 연속되는 핵산 영역으로 이루어지는, 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커.
- 제 1 항에 있어서,
상기 핵산 영역은, 배열 번호 1 ∼ 10 으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 배열 또는 당해 염기 배열의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커. - 제 1 항에 있어서,
상기 핵산 영역은, 딸기속 식물의 염색체에 있어서의 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열과 배열 번호 8 로 나타내는 염기 배열 사이에 위치하는 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커. - 적어도 일방의 모체가 딸기속 식물인 후대 식물의 염색체 및/또는 당해 모체의 딸기속 식물의 염색체를 추출하는 공정과,
상기에서 얻어진 염색체에 있어서의 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존재ㆍ비존재를 측정하는 공정을 포함하는, 탄저병 저항성이 향상된 딸기속 식물 계통의 제조 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 측정하는 공정에서는, 상기 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용한 핵산 증폭 반응에 의해 당해 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커의 존재ㆍ비존재를 측정하는 것을 특징으로 하는 딸기속 식물 계통의 제조 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 측정하는 공정에서는, 상기 딸기속 식물 탄저병 저항성 관련 마커에 대응하는 프로브를 구비하는 DNA 칩을 사용하는 것을 특징으로 하는 딸기속 식물 계통의 제조 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 후대 식물은 종자 또는 유묘이고, 당해 종자 또는 유묘로부터 염색체를 추출하는 것을 특징으로 하는 딸기속 식물 계통의 제조 방법.
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