CN103667427B - 用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法 - Google Patents

用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法。该方法以甜查理、达赛莱克特为杂交亲本进行常规杂交获得的杂交后代等250份材料的基因组DNA为模板，通过对覆盖全基因组146对SSR引物和64对AFLP引物进行PCR扩增并结合PAGE胶电泳分析，建立了草莓炭疽病抗性的特异遗传图谱，成功获得10对特异性高、在杂交后代显性强的SSR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1~20所示。应用本发明方法获得的引物序列进行草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定，其鉴定结果与田间抗病吻合率高达88.4%，该方法具有简单、快速、高效，提高育种效率，缩短育种周期等优点，在草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定上具有很大的应用价值。

Description

用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法
技术领域
本发明涉及一类用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法。
背景技术
由炭疽病病菌（Colletotrichumn spp.）引起的草莓炭疽病是一种世界毁灭性病害，截至目前仍有许多国家的草莓生产上存在着该病的大面积危害。炭疽病可以危害草莓的茎、叶柄、叶片、果实、花、花芽、萼片等器官，不仅可造成严重的经济产量的损失，而且有的病残体含有较多的真菌毒素，严重地威胁着人们的食品安全。
草莓炭疽病于1832年在法国首次发现，距今已180年。有关草莓炭疽病病菌抗性鉴定的研究已经有一些报道。种质资源的抗逆性鉴定对于水果科研育种和生产都非常重要，单一根据田间表型性状来区分种质资源的抗逆性在多数情况下都很困难。DNA分子标记提供了物种根本的遗传特征，是不同物种遗传变异的直接反映，因此成为种质资源鉴定最有效途径。目前，有5种常见分子标记技术应用于品种抗逆性鉴定，包括RAPD、RFLP、AFLP、SSR、SCAR标记。
建立在PCR基础上的分子鉴定技术是鉴定草莓炭疽病快速和准确的方法。Xiao等（2004）通过提取病原菌的DNA并利用病菌ITS的RAPD分子标记进行病原菌遗传分析，以感病的草莓和非栽培寄主为材料鉴定了C.gloeosporioides和C.acutatum的遗传关系。Denoyes-Rothan等（2005）设计了8×8因子试验研究草莓炭疽病C.acutatum种的遗传特性，认为尽管微效多基因会影响草莓的抗性水平，但高水平抗性仍然被认为单基因控制，属于质量性状遗传。作者分析了26个不同品种（基因型），结果发现栽培草莓的炭疽病抗性遗传为显性基因，草莓属其它种类的遗传特性相似，对草莓炭疽病抗性育种有指导意义。
随着红颜、章姬、丰香等品质好易感病草莓品种栽培面积的不断扩大，炭疽病侵害范围也在蔓延，如今已经成为草莓生产的第一大病害。因此创制与红颜果实品质媲美的抗病草莓新种质已成为迫在眉睫的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法。
自1990年以来，上海农科院草莓课题组一直进行着草莓种质资源收集、评价与种质创制工作，并取得了440余份具有潜在应用价值的种质。抗病性品种大都是通过传统杂交育种获得，对炭疽病病原菌免疫的种质在杂交后代中不会轻易产生；更重要的是抗病杂交后代携带有其它不良性状基因，特别是多基因控制的抗病性的遗传，常常造成育种效率较低。抗病性鉴定是抗病育种的重要环节，建立准确可靠的抗病性鉴定方法是提高抗病育种效率的重要途径。有关草莓炭疽病抗性鉴定方法迄今已经有许多报道，大都是将炭疽病病菌接种在发育植株上，然后依据一定的分级标准统计感病情况进行鉴定。在培育抗病品种时，要正确判断杂交亲本的抗病性，必须有正确的抗性评价鉴定方法。因此，基于上海农科院草莓课题组特异抗性种质的特异分子标记对高抗和高感亲本及其杂交后代群体的抗病性分子鉴定，对于育种科学家和草莓的生产管理均具有重要应用价值。
本发明在对覆盖栽培草莓全基因组210对标记引物（146对SSR引物和64对AFLP引物）筛选的基础上获得65份材料中可产生特异、稳定多态性、带型组合易识别、在其后代显性好的10对SSR引物，应用这10对引物以宝交早生、甜查理、达赛莱克特等为杂交亲本及其常规杂交获得的245份随机后代群体为材料，成功鉴定出炭疽病抗性后代。
本发明利用与抗性基因连锁的分子标记进行基因型验证，使受鉴定材料成为可以用于草莓炭疽病抗性育种的种质材料。为了进行宝交早生、甜查理、达赛莱克特及其杂交后代群体材料中炭疽病抗性的快速鉴定评价，本发明致力于全基因组范围筛选特异SSR标记指纹和AFLP分子标记，成功获得了能够鉴别亲本及其杂交后代群体的高度特异、稳定遗传的SSR、AFLP分子标记图谱。依据这些图谱，仅需应用散布于全基因组的10对特异SSR引物，针对样品DNA进行PCR扩增，后经PAGE电泳分析，即可快速鉴别是否亲本及其杂交后代品系的炭疽病抗性。利用获得的这10对特异SSR引物对亲本及其杂交群体共245份随机材料进行草莓炭疽病抗性的分子鉴定，结合田间抗感遗传表型的一致性，结果发现获得的这10对特异SSR引物可将供试材料中抗病品种或优系与感病品种或优系区分开来，与室内接种鉴定、田间遗传表型的一致性可达到88.4%。
本发明所述的草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定方法的工艺流程如图1所示，具体包括以下步骤：
1）首先，从草莓基因组数据库网站GDR（Genome Database for Rosaceae,http://www.rosaceae.org/）与全基因组范围、遵循平均分布原则设计分子标记引物，共设计并合成了210对标记引物，包括64个AFLP标记，146个SSR标记，具体参看表1。
表1草莓炭疽病抗性筛选SSR和AFLP分子标记引物及序列
  序号   编号   引物序列(备注：F-上游引物，R-指下游引物)
  1   FSS1   F-ACGTTTACGCTGCACTTTGAA；R-CAGTAGCAGCAAAAGCAACA
  2   FSS2   F-AGAACCATCATCGTCTCTCGT；R-GCAATCTCTTCCGGCTTAAACT
  3   FSS3   F-GACGAGTTAACATCAACGACAC；R-TACTTAGGCTGCTGCTCTATCTG
  4   FSS4   F-CATTTTGGAGACAGGCAGT；R-TGCTTGCCCTGAGCTTGGT
  5   FSS5   F-TCAGAAAACCAGAGTGATCGA；R-TGAAATAAGAAGCAGTAGAGTC
  6   FSS6   F-CCCCATCTTCTTCAAATC；R-ACAAGGCCAGAGCTAGAG
  7   FSS7   F-GGGAGCTTGCTAGCTAGATTT；R-AGATCCAAGTGTGGAAGATGC
  8   FSS8   F-ACTCAACCACCACATTTCACAC；R-GAGAAGTTGTCAATAGTCCAGG
  9   FSS9   F-ATTTCTGTTGTCTCCCTCCTTC；R-GCTCGATCTCTAGCTTTCTCTCT
  10   FSS10   F-CGAGGAAGTAACCTCACAGAAA；R-GGTGATGGAGAGTGCTGTTAGA
  11   FSS11   F-CTTGGGAGAGAACCAGAAAAAC；R-CAGAACCAACTCCAGAGAAGC
  12   FSS12   F-GGACGTCCCCTTCTTTATTTCT；R-CCCACATTCCATACCACTAC
  13   FSS13   F-ACGAGGTAGCTTTCTCTCTCATC；R-CTCATAAAGCGTATCAGGAGGTC
  14   FSS14 F-TTAGTAGTAGACCTGC CACAA；R-GGCTTATCTGTAGAGCTTCAA
  15   FSS15   F-CGGTTCAGCAGGAGAATAAAAC；R-GCCCCATACTACCATTATGAC
  16   FSS16   F-CTCTACCACCATTCAAAACCT；R-ACTGGAGACATCTAGCTCAAAC
  17   FSS17   F-TCCTTTCGCTTTTCTCTACAG；R-CGTGGACTAACCATTGCAGCA
  18   FSS18   F-CTCTACCACCATTCAAAACCT；R-CCCACATTCCATACCACTAC
  19   FSS19   F-TCGGAGCAAGGAAGCAAGGT；R-AAAGAGAGAGCAATCATGTCA
  20   FSS20   F-GCTCTCTCTCTGATTTTCTTG；R-AAATAAAGATGTCCTGATGGG
  21   FSS21   F-AACCCACCAAAGCGCGCCTCA；R-TGCTTTCAGAACCAACGCCAC
  22   FSS22   F-ACGCCTTCGATCCTTTTCTTC；R-CATAGTCAACAGACAAACGCT
  23   FSS23   F-CTAGGAAGATGCGGTGTG；R-GTATGGTACGATCCAAGCT
  24   FSS24   F-TCTCTGTGCCAATTCCAATGA；R-CTGACGATCTGATCGGAAGG
  25   FSS25   F-CCAGCAAGTTTGTTACAGATA；R-TGCACAACATGATAGATGAGG
  26   FSS26   F-GCGATTTCTCAGACCAAC；R-TTTCCAGGGGTGCCAATGTA
  27   FSS27 F-TTAGGTC CAACGCAGGGG；R-GAGACTTACTTGGAGTCGGCT
  28   FSS28   F-GAACCATCATCGTCTCTCGT；R-TCTCTTCCGGCTTAAACTG
  29   FSS29   F-TAACCCTCTTCTCCCCTCAT；R-CAGAGTGTATATAATTCCC
  30   FSS30   F-CTCTTCTCTCTTCTGTCTCTC；R-CCTCGCAACCATCTCAATGTC
  31   FSS31   F-CAGTACCACCGATCCCA；R-TGAGGCCGGAGCTGTTGA
  32   FSS32   F-GAGGACCCGAATACCCGAGAG；R-GACCCATTCTGGCGATGAAG
  33   FSS33   F-GAGTGAGAGATTAGAGAGAG；R-AGAGGGAGGAGATTTCCAAG
  34   FSS34   F-TCTTCACTCTTCAGCTCATC；R-CTTCAACTGGTGCAACTGGA
  35   FSS35   F-ATGTCTCCTCACTAGCCA；R-ATGCTCCATATACTGTTG
  36   FSS36   F-TGTACAACCACTCACCTCTG；R-AGGTAAATCCTCTGTGAGAAG
  37   FSS37   F-GGCTCTCTTTTCTTCCATTG；R-TTCCCACTGCCTAGTGTTG
  38   FSS38   F-CTACCTTATCTCTCCTCTCTC；R-ACTCGGTTTTGGTGGATTTTG
  39   FSS39   F-GGGTTTGTATTGAATTGTCG；R-TTGCGTTTTCAAGCTCACTCC
  40   FSS40   F-GATAGAGTTATGTAAAAACCA；R-TACTCTCTCCTCGTCCT
  41   FSS41   F-AGGGAGTTGGTAATGAGTGGG；R-ATCAATCTCGGAAACATCTGCT
  42   FSS42   F-CCGACACCGCAGGAGCAA；R-CGAGAGAGACAGAGCAAAG
  43   FSS43   F-GCCAAACATTACAAGAACCC；R-ACTTGTGTTTGCCACCAGACC
  44   FSS44   F-GTGATCATAGGTGGTGCAGAG；R-GAACCGAAGTTGAGCCAGCA
  45   FSS45   F-GAAACCCTAGGTGAGCGAGA；R-TGGAGATGAGCTTGGCCTTGA
  46   FSS46   F-TGAGTATCTTGCATGTGTGTG；R-TAGAGCGAGGTGGTAAT
  47   FSS47   F-CAAGTCTCTCTCGGTGTTTC；R-AACCTGTGTGGACAAGATC
  48   FSS48   F-ATCGGATCAACAAGCAAAGCA；R-AGAGGGTTAGGGAGTGAAGAG
  49   FSS49   F-CCAAATTCAAATTCCTCT；R-GAAAAACTCAAACTACCC
  50   FSS50   F-GTAACGACGGCTGCTTCTCCT；R-CGCTCGCTCTTATAAACTTCC
  51   FSS51   F-ATTTCGGGCACACTTCCCAT；R-AGACGGCAAAGAGACTCACCT
  52   FSS52   F-TCTCTTTTGCTCCATAGTTC；R-TTCATCAGGATCCAGAAGT
  53   FSS53   F-TACTACAGAGCTGAAGCTACCC；R-GAAGAAGCCCATTATCAGAAG
  54   FSS54   F-CGTCAAAGGAACCCTATTTCG；R-ACGGAGGCATCTTGGAGGA
  55   FSS55   F-CAGGCGCCAACGGCGTGC；R-CCGCCAGCTCATCCCTAGG
  56   FSS56   F-CGCTTGGGGATGAGGGAGGAGAT；R-ACCCGGACAGGCCCAACCCAAAA
  57   FSS57   F-GGCCAAGCACCGCCTTCC；R-ACGACCGCGACCCGTTTGA
  58   FSS58   F-TCTGCGCTCCCACCGCCCTCCATT；R-CTGCCGGACGCGGTCGAGGTGCT
  59   FSS59   F-TGCGTGCATACACGCTCTG；R-CTGGTGAGAGGAGGTGCTAG
  60   FSS60   F-TCATTTTTCAGGGCCACGGGTAGA；R-GTGGTGGTTGAGGCAGTGGAGGAT
  61   FSS61   F-CCGACGAAACCAAGCACCTCCTAC；R-TGCATGATCAGCTACGACCTCCT
  62   FSS62   F-CTATTGAAGAAACTCCTAC；R-TCTTTGATCTGCTTCCACCT
  63   FSS63   F-GCGCTTTAAACAACTTTCACAC；R-ATTTAGCCACACGACCATTTTC
  64   FSS64   F-CAAAACGGCTTGATGATCTTC；R-GGCAAGGTTCAGGGTCTAAAT
  65   FSS65   F-AGATCGACGGCCGAGGATAAG；R-AATTAATCCGGACCCGGACAG
  66   FSS66   F-ATGCAGCTCAGAGAAAGGGTAG；R-AGTTGGGAAGAGGGAAGAAAAG
  67   FSS67   F-GCTTCACTCCATCACTGTC；R-GATAAGGAAGAGTGCTGCTGC
  68   FSS68   F-GCTATCCACACACCCCAT；R-TACAAATCATTCTGAGAACAA
  69   FSS69   F-TTCTGAGCGCTCACCTCGTA；R-GAGTCTAGCTCTCTGCATGT
  70   FSS70   F-GCAGTTGGTAGGAGAACTCAC；R-GGACGACGAAATCCCAGAAG
  71   FSS71   F-TGCCTTCTCTCTCTTTGC；R-TAGGCCACAAGCTCGATATG
  72   FSS72   F-CTCACGCTATTTCTCGGTC；R-ATTCAATCAAGGCGATGGC
  73   FSS73   F-CTAGTTCTGCACACTCACG；R-GTCGCAGGAACAGTAAGCC
  74   FSS74   F-CGATCTCTCTTCTCTTCGCTT；R-CCACCCAAACCTCTCAAACCT
  75   FSS75   F-CCTTCGAATTGTTCTGAGCC；R-GACGGAGAAGAAGCGCTAG
  76   FSS76   F-GAGAGAGGAGGAGAGTGGAG；R-ACAAAAACGGCAGGCACGGCT
  7   FSS77   F-AGGAGAAGGCCTGAAAGATC；R-CGGAGCTAATATGGAGGAAAC
  78   FSS78   F-TAGTGATGGTGGTGGTGGT；R-CACTATCTTCACCCTCAAT
  79   FSS79   F-GGACGACGACGACGAGGA；R-ACAGAGAGAGTTACACAGAAG
  80   FSS80   F-GGCGGCATGTTCAATTCAGA；R-GTAGAGCATGATGAGGGGAT
  81   FSS81   F-CAGTTGGTGGTGCACTTGC；R-GAGCTCCTACTCTGAGTCT
  82   FSS82   F-AGAGTTGTGCCAAATCCG；R-TGTGTCTCTTCTCTGTCT
  83   FSS83   F-ACAGTGACCCATGAACCC；R-GTATATAACACTGAAACCCCA
  84   FSS84   F-GACAGGGTGTCACCTCATCAG；R-CAGCGCTAGCTATCACCTAC
  85   FSS85   F-TAACCGAACTTGATGGATTG；R-TATTCTCTCTCCATCTCTCTG
  86   FSS86   F-CAGAGCAAGCAAGCAAGCAA；R-CGAACTTTACAAACTCCGC
  87   FSS87   F-ACCCACCGTATCAAGTCA；R-CATTGTTGTCTTGTGGAAA
  88   FSS88   F-GCATATCCCACACAAGATCAC；R-CTCCATTGTTGTACCATCCAG
  89   FSS89   F-AAGGATGAAAAAAGGATGATG；R-AAAGTTTGCCACGGCTGG
  90   FSS90   F-CTAGAGAGAGAAAGAGAGTA；R-ATTCAGCATTCAACAGCCT
  91   FSS91   F-CACGAGGCGCCATTTCTAC；R-ATAGACGCCACGACTTGAAC
  92   FSS92   F-TGGTCCTCCTAGTCAACCTCC；R-TCTTAGCTAGCTAGAGCCGA
  93   FSS93   F-CTGAAACAACGAGAGAGAG；R-TCAAAGATGCTGGGCCGC
  94   FSS94   F-CCGAAACCCTAGGTGAGCGA；R-GACCTTGAAGAAGCCGTACTG
  95   FSS95   F-ACACAGAGCAGCTAACATC；R-TAGAGTGCTGTCTGCTTGC
  96   FSS96   F-CCTGTTTCCTACACTCACATA；R-ACAAGACGAGTGAGAGTGCAT
  97   FSS97   F-CAGTTTTTCCAGAGACCCCCA；R-GTCGGCGGATAACTCAACAGG
  98   FSS98   F-AGGATGATAGCCAGCCACC；R-GTCTTTCAGTTGACGCACA
  99   FSS99   F-CAATCCTCAAAACCCAAACTC；R-CTGGTTGACACTTGACCGT
  100   FSS100   F-GGTCTTGCACCGCAGTAT；R-CAGTTTCTCTTGTACCATG
  101   FSS101   F-AGCCAGCGAACTCAAATCTC；R-TCACTCGCAGTCCCACTAGA
  102   FSS102   F-TGGTTAGCAGTTGATCTCCT；R-TACCAGTTTGCTGCTTGCTT
  103   FSS103   F-GCAGAGCAAGAGAGAATG；R-AATCACCTACCCAAGCCA
  104   FSS104   F-CTCCGCGAGTACATGGTT；R-CGTTTCCATCGGAGCCTC
  105   FSS105   F-CCACCAAAGCGCGCCTCA；R-CTTTCAGAACCAACGCCAC
  106   FSS106   F-GTGTTCGTGAAGCTCAAGTG；R-TGCTTTCAGAACCAACGCC
  107   FSS107   F-TTCTCATAACCCACCAAAGC；R-TGTATTCCATTCCCCACTT
  108   FSS108   F-TAACTCAAGGATGGGACGA；R-CTTTGCTGTGAAGTGGGAA
  109   FSS109   F-CGAGAAACTCTGCACAGA；R-CTTGAGACGCTGGTTACGA
  110   FSS110   F-AACAGGTAGGGAATTACTCTC；R-CCTTCTCCATCATCTCTT
  111   FSS111   F-AGACCACTGAAAGTGCTGA；R-CCCCACAAACAAACTTCTCTG
  112   FSS112   F-CGACAACACACCCAAAGCT；R-CGTCTGAGATCTGATCACA
  113   FSS113   F-GAGCTTGAAGAGATGATGC；R-CCAACTGGGCTTGAACCT
  114   FSS114   F-ATTCCTTGGCCTGCCTCGTAT；R-TCCAGTAAGGTGGAAGAGCTA
  115   FSS115   F-GCCTCCAAAAGTTCCTCAGTT；R-GAAGAAGCTAGCTCTTGGTGT
  116   FSS116   F-GACAGTGAGAGAAGAACAGC；R-TTCCCCTCCCACTCAGATC
  117   FSS117   F-CTCAAGTTAGCTGAGGATCGC；R-AGAGAAGAGCTGAGCTTGCC
  118   FSS118   F-GCCTTTTCAGACTTATAC；R-CAATCCAGAATGAGAGTG
  119   FSS119   F-CAAGAGCACAGGCCTAAACAAC；R-CAGCAGCTGCCTTAGTCTTAGT
  120   FSS120   F-TCATCCTGCTAGGCACTGG；R-TGGAACACGCAAGAGAACC
  121   FSS121   F-AGTTTCAAGATCTCCTCAG；R-CCTCTCCAATAGCTTCCT
  122   FSS122   F-CGATTCAAGAATAGAGAG；R-AGCTACACTGATGATCCT
  123   FSS123   F-AACATCAACGACACCCGAAGT；R-AGAAGGTCCGATTCCAGAAGC
  124   FSS124   F-TCCTTGGGAAATTAATGCGA；R-TTGGGAAGGATCATAAAAACC
  125   FSS125   F-AGGCTCGTCATTTCCTCGTG；R-GAGAGATGGGTGTTGGAGACT
  126   FSS126   F-TATTTCTGGATAGAAGGAGGC；R-TACGGATTTTCCGAGTTTGG
  127   FSS127   F-GAAAACGCTCCAAATCAATG；R-ATCCCAATACAGTCACCCC
  128   FSS128   F-TTAGACACAGAAAACAACCCC；R-GTGAGGACACAGCCTTTGAG
  129   FSS129   F-GACTCTCTCAAGTCTCAG；R-CAGCAAAGAAGTAGCAGC
  130   FSS130   F-TTGTAGATTTCCGAGTGGT；R-TAGAGGAAGCAGAGAAGAC
  131   FSS131   F-TTCATATCGCCTACGATTCAT；R-GCTTTCAGCTAAGATCCGC
  132   FSS132 F-AGTGTCATTGTTCTTGCTAGG；R-ACTGTCTAC GTACTTTAAGGC
  133   FSS133   F-ATACCACATTCGTACAGTCCC；R-GATGATCCAATTCCCGTCCAG
  134   FSS134   F-ATCTTTGACAATGACAATCCA；R-TCCCTCCTCTAAATGATAC
  135   FSS135   F-CTCAGCCGGTTTCATTTCATA；R-TTAGCTCTTCCTCGATTTGAT
  136   FSS136   F-ATTAGGGCACTTACTGATTGA；R-TGCTATACTGACCTAGGATTC
  137   FSS137   F-CGAAGAGTTGGAAGATGAAAT；R-CTCAAGCCCCACTCAGAT
  138   FSS138   F-ATGCTAAGTAGCCGCACCT；R-TGAAAGATGGACCTTTTTGGG
  139   FSS139   F-AGGTGCATGCAAGCACACTAT；R-GACTGAGCAAACAGATGAC
  140   FSS140   F-GACGACATCACTCTCTTCAAC；R-CACCTCCTCCCTCGCAAC
  141   FSS141   F-TGGGCGTACTCTGTATGGT；R-CAGATCAAAGATGGGTCGAAG
  142   FSS142   F-GCCCACAGCATCTGATACCT；R-ACGTCGTTCCCAACCACGCTT
  143   FSS143   F-AGAGTGGGGGAGAGTGTG；R-CATTTGCAGGTAGTGAGAAGA
  144   FSS144   F-ACCAAAGGAGAGGCAACCAAT；R-AGCGTTTGGGGTTGAGGAAGA
  145   FSS145   F-GAGCAGAGTATCACTAATTCA；R-TATCCGGTCTTCCAAAAGTCA
  146   FSS146   F-GAAAAGGCGAAACCGAAA；R-CGCTTCTTCTCTACTATC
  147   E1M1   F-TAGACTGCGTACCAATTCAACG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAA
  148   E1M2   F-TAGACTGCGTACCAATTCAACG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAT
  149   E1M3   F-TAGACTGCGTACCAATTCAACG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAC
  150   E1M4   F-TAGACTGCGTACCAATTCAACG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAG
  151   E1M5   F-TAGACTGCGTACCAATTCAACG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTA
  152   E1M6   F-TAGACTGCGTACCAATTCAACG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTT
  153   E1M7   F-TAGACTGCGTACCAATTCAACG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTC
  154   E1M8   F-TAGACTGCGTACCAATTCAACG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTG
  155   E2M1   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAAG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAA
  156   E2M2   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAAG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAT
  157   E2M3   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAAG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAC
  158   E2M4   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAAG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAG
  159   E2M5   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAAG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTA
  160   E2M6   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAAG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTT
  161   E2M7   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAAG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTC
  162   E2M8   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAAG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTG
  163   E3M1   F-TAGACTGCGTACCAATTCAATG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAA
  164   E3M2   F-TAGACTGCGTACCAATTCAATG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAT
  165   E3M3   F-TAGACTGCGTACCAATTCAATG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAC
  166   E3M4   F-TAGACTGCGTACCAATTCAATG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAG
  167   E3M5   F-TAGACTGCGTACCAATTCAATG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTA
  168   E3M6   F-TAGACTGCGTACCAATTCAATG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTT
  169   E3M7   F-TAGACTGCGTACCAATTCAATG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTC
  170   E3M8   F-TAGACTGCGTACCAATTCAATG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTG
  171   E4M1   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAA
  172   E4M2   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAT
  173   E4M3   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAC
  174   E4M4   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAG
  175   E4M5   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTA
  176   E4M6   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTT
  177   E4M7   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTC
  178   E4M8   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTG
  179   E5M1   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGA；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAA
  180   E5M2   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGA；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAT
  181   E5M3   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGA；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAC
  182   E5M4   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGA；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAG
  183   E5M5   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGA；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTA
  184   E5M6   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGA；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTT
  185   E5M7   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGA；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTC
  186   E5M8   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGA；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTG
  187   E6M1   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGT；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAA
  188   E6M2   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGT；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAT
  189   E6M3   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGT；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAC
  190   E6M4   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGT；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAG
  191   E6M5   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGT；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTA
  192   E6M6   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGT；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTT
  1936   E6M7   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGT；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTC
  194   E6M8   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGT；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTG
  195   E7M1   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGC；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAA
  196   E7M2   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGC；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAT
  197   E7M3   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGC；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAC
  198   E7M4   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGC；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAG
  199   E7M5   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGC；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTA
  200   E7M6   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGC；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTT
  201   E7M7   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGC；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTC
  202   E7M8   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGC；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTG
  203   E8M1   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAA
  204   E8M2   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAT
  205   E8M3   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAC
  206   E8M4   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACAG
  207   E8M5   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTA
  208   E8M6   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTT
  209   E8M7   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTC
  210   E8M8   F-TAGACTGCGTACCAATTCAAGG；R-CGATGAGTCCTGAGTAACACTG
同时还确定了筛选草莓样品群体245个并提取了这些自交系草莓基因组的DNA，包括宝交早生、甜查理、达赛莱克特以及杂种F1代和F1代自交系，草莓种质DNA样品编号参看表2。
表2草莓杂交亲本及其杂交群体编号
  草莓资源   编号
  达赛莱克特/宝交早生   P1
  甜查理   P2
  F1代   1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15
  F2代   1,2,3,4,5,6,7,8,9,10，……243,244,245
2）筛选实验第一步：确定210对SSR/AFLP引物的最优PCR条件、电泳展示差异时间及染色显色方法。
选取甜查理、达赛莱克特及其杂种F1代合计12份材料的DNA作为PCR模板，确定每一个分子标记引物扩增的最优PCR条件，以及根据扩增产物大小范围确定PAGE电泳时所需时间。其它条件如PCR体系、DNA模板浓度、电泳染色显色方法一致。
3）筛选实验第二步：对210对引物进行预筛选。选取甜查理、达赛莱克特、杂种F1代、F2自交系共245份DNA样品，对全部210对SSR引物和AFLP引物分别进行PCR扩增电泳分析，每对引物针对这245个样品的扩增分析重复三次。
最后剔除了在达赛莱克特、甜查理及其杂交群体后的中没有特异性、区分能力弱的标记引物，余下14个SSR标记引物[FSS6（由SEQ ID No.1和2组成）、FSS36（由SEQ ID No.21和22组成）、FSS40（由SEQ ID No.3和4组成）、FSS50（由SEQ ID No.5和6组成）、FSS60（由SEQ ID No.7和8组成）、FSS65（由SEQ ID No.9和10组成）、FSS79（由SEQ ID No.23和24组成）、FSS92（由SEQ ID No.25和26组成）、FSS 105（由SEQ ID No.11和12组成）、FSS106（由SEQ ID No.27和28组成）、FSS118（由SEQ IDNo.13和14组成）、FSS121（由SEQ ID No.15和16组成）、FSS127（由SEQ ID No.17和18组成）、FSS128（由SEQ ID No.19和20组成）]均能将245份样品区分开来。
4）筛选实验第三步：对预筛选获得的14对SSR引物进行全面筛选。
针对甜查理、达赛莱克特、杂种F1代、杂种F2代的样品基因组DNA，进行以上第二步筛选得到的14个宝交早生、甜查理、达赛莱克特及其杂交后代有一定特异性的SSR标记引物的PCR扩增并结合PAGE电泳分析。每个SSR引物对针对245个样品的扩增分析重复三次，最后得到10对甜查理、达赛莱克特及杂种后代高度特异的SSR标记引物对（参看表3）。
表3草莓亲本及其杂交后代炭疽病抗性鉴定分子标记引物及序列
5）重复筛选实验第四步：对预筛选获得的14对SSR标记引物进行PCR扩增电泳分析进行重复筛选以验证遗传稳定性。
针对甜查理、达赛莱克特和部分杂交后代共150份样品DNA，对以上全面筛选得到的14对SSR标记引物进行PCR扩增电泳分析，剔除了在杂交后代不能稳定遗传、带型组合过于复杂不易识别、或区分能力冗余的占50%的SSR标记引物对，最后获得10对标记引物（参看表3）。这些引物扩增产物电泳的遗传图谱对甜查理、达赛莱克特及其杂交后代都高度特异，因此属于特异而又稳定遗传、在杂交后代的双亲组合图谱中易于识别的炭疽病抗性遗传标记。
实验结果表明，这10对标记引物标记的PCR扩增产物电泳图谱对杂交亲本甜查理、达赛莱克特及其杂交后代均高度特异，属于特异而又稳定遗传、易于识别的炭疽病抗性遗传标记。对未知样品进行炭疽病抗性鉴别时，综合运用这10对SSR标记引物进行扩增分析，可以使分子鉴定结果更准确可靠。
6）对全面筛选获得的10对SSR标记引物进行草莓田间炭疽病抗性的鉴定。
应用这10对SSR引物，根据草莓炭疽病抗性特异遗传标记进行草莓田间杂交后代群体炭疽病抗性的分子鉴定。通过对以宝交早生、甜查理、达赛莱克特等为杂交亲本通过常规杂交手段获得的245份随机后代群体进行分子水平的抗性鉴定，鉴定结果与田间鉴定、室内接种鉴定基本一致。结合室内接种试验和田间表现，获得一致性的抗性种质65份，其中8份种质可作为中间育种材料或直接发展为优质抗性草莓优系。
有益效果：
大量实验结果表明，本发明的分子标记引物在草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定结果与田间抗病吻合率高达88.4%，而且该方法具有简单、快速、高效，提高育种效率，缩短育种周期等优点，在草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定上具有很大的应用价值。
附图说明
图1为本发明草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定方法的工艺流程图。
图2为引物FSS105在部分F2代的扩增结果，箭头为多态性片段的特征带，M为标准Marker，F1为F1代单株，P1为杂交亲本达赛莱克特，P2为杂交亲本甜查理，1~21：分别为F2代单株。
图3为引物FSS127在部分F2代的扩增结果，箭头为多态性片段的特征带，M为标准Marker，F1为F1代单株，P1为杂交亲本达赛莱克特，P2为杂交亲本甜查理，1~21：分别为F2代单株。
图4为草莓特异SSR标记引物FSS6扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理，3,4为杂种F1代单株，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图5为草莓特异SSR标记引物FSS6扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理，其余为杂种F2代，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图6为草莓特异SSR标记引物FSS40扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理；其余为杂种F2代，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图7为草莓特异SSR标记引物FSS50扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理，其余为杂种F2代，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图8为草莓特异SSR标记引物FSS60扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理，其余为杂种F2代，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图9为草莓特异SSR标记引物FSS65扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理，其余为杂种F2代，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图10为草莓特异SSR标记引物FSS105扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理，其余为杂种F2代，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图11为草莓特异SSR标记引物FSS118扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理，其余为杂种F2代，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图12为草莓特异SSR标记引物FSS121扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理，其余为杂种F2代，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图13为草莓特异SSR标记引物FSS127扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理，其余为杂种F2代，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图14为草莓特异SSR标记引物FSS128扩增产物PAGE电泳图谱，样品编号参看表1，P1为达赛莱克特，P2为甜查理，其余为杂种F2代，M为DL2000marker（从上向下依次为500-250bp）。
图15为草莓特异SSR标记引物FSS105扩增产物的PAGE电泳图谱，箭头表示多态性片段的特征带，M为标准Marker（从上向下依次为500-250bp-100bp），P1为易感性亲本达赛莱克特，P2为抗性亲本甜查理，1~21分别为抗感性未知的杂交单株待验证材料，由此可鉴定抗性。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。
实施例1
利用自行设计的210对SSR引物和AFLP引物（参看表1），对杂交亲本（达赛莱克特和甜查理）、杂种F1代、F2代自交系共245份DNA样品材料（参看表2）进行草莓炭疽病抗性的AP-PCR分子标记筛选鉴定。
1、DNA提取
鉴定单株草莓（6号单株，达赛莱克特与甜查理杂种F1代自交系），取样时剪1.5厘米长叶片。用改良的CTAB提取液（2%CTAB，2%PVP，pH=8.0100mM Tris-Cl，pH=8.050mM EDTA，1.4M KCl，2%BME）快速提取DNA，具体操作流程如下：
①液氮预冷研钵，迅速取适量-70℃保存草莓叶片于研钵，加液氮充分研磨成粉末，转移到预装1.4ml STE核分离液的2.0ml离心管，上下颠倒混匀，室温静置5-10分钟。
②于5000rpm室温离心10分钟，弃上清。加入700ul 65℃预热CTAB裂解液，上下颠倒混匀，置于65℃水浴锅中裂解约10分钟。
③12000rpm室温离心10分钟，弃上清。加入900ul 65℃预热CTAB裂解液，上下颠倒混匀，置于65℃水浴锅中裂解约50分钟，期间混匀几次。
④取出，预冷（约5-10分钟），于12000rpm离心10分钟，转移上清900ul至新离心管。
⑤加入与上清液等体积（900ul）的氯仿:异戊醇（24:1）混合液，上下颠倒混匀，12000rpm离心10分钟（可视两相界面蛋白情况重复此步骤1-2次）。
⑥取上清于1.5ml离心管，加入1/10体积预冷的5M NaCl，等体积预冷异丙醇，混匀，于室温放置30分钟。
⑦12000rpm离心10分钟。
⑧弃上清，用1000ul 70%预冷的乙醇洗涤沉淀，静置10分钟。8500rpm离心5分钟，小心去除上清（倒上清后可微离心，以移液器吸尽残留液体）；重复1-2次，室温晾干（约20分钟），用适量的ddH2O溶解，保存备用。
利用1.0%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察照相，检测DNA质量。
从以上方法获得的DNA提取液中取2ul直接用于AP-PCR分子标记鉴定。
对210对引物在高抗亲本甜查理和高感达赛莱克特及其杂交群体共245份DNA样品中，每对引物针对这245个样品的扩增重复三次，进行PCR扩增、特异条带多态性筛选分析。最后剔除了在亲本及其杂交群体中没有特异性、区分能力弱的标记引物。筛选出在亲本中存在差异且在杂交后代中具有共显性的引物对，获得14个SSR标记引物（FSS6、FSS36、FSS40、FSS50、FSS60、FSS65、FSS79、FSS92、FSS105、FSS106、FSS118、FSS121、FSS127、FSS 128）均能将所有样品区分开来。
针对筛选得到的14个SSR标记引物对宝交早生、甜查理、达赛莱克特及其杂交后代群体的样品基因组DNA进行进一步筛选试验，每个SSR标记引物针对245个样品的扩增分析重复三次。最后结合PAGE电泳分析得到在高抗亲本中存在目标条带的SSR标记引物10对（参看表3）。这10对在杂交亲本及其后代群体中高度特异的SSR标记引物可以将抗病样品或感病样品完全区分开来。
2、PCR扩增筛选
应用表3中的10对引物进行PCR扩增，PCR反应扩增的模板为杂交亲本（达赛莱克特和甜查理）、杂种F1代、F2代自交系共245份样品材料的基因组DNA（参看表2）。具体步骤如下：
1）准备大体积的反应混合物（参看表4），其中包括表4中所有成分、但DNA或引物除外。
表4PCR反应体系组成
2）将反应混合物分装到96孔板内，然后补加对应量的引物或DNA样品。
3）用液体石蜡油封顶。
4）置于PCR仪中。
5）扩增程序参看表5。
表5Touchdown PCR扩增程序
6）反应结束后，每管加入3-4μl的5×SGB（参看表6）混匀备用，如果不能立即使用可先放置于4℃保存。
表6 5×SGB上样缓冲液配方
部分扩增结果参看图2和图3。
从图2可见，抗性亲本P2（甜查理）SSR引物扩增结果有特异带型，在杂交群体后代F1代、F2代中稳定遗传。通过该分子标记可鉴定杂交群体后代的炭疽病抗性，其中出现抗性亲本特异带型的F2代抗性单株代号为3、5、6、7、8、10、11、13、15、16；而无特异带型的F2代感性单株代号为1、2、4、9、12、14、17、18、19、20、21。
从图3可见，抗性亲本P2（甜查理）SSR引物扩增结果有特异带型，在杂交群体后代F1代、F2代中稳定遗传。通过该分子标记可鉴定杂交群体后代的炭疽病抗性，其中出现抗性亲本特异带型的F2代抗性单株代号为2、6、9、11、12、15、17、18；而无特异带型的F2代感性单株代号为1、3、4、5、7、8、10、13、14、16、19、20、21。
3、PCR扩增产物的PAGE胶电泳分析
1）组装垂直板电泳槽：先将封底用的塑料槽条放进电泳槽下部靠内；取两块洗净晾干的玻璃板[其一两边有毛玻璃（有上下内外之分），另一顶部有凹口]，合并后（有凹口的玻璃板应将凹口朝上紧贴电泳槽，有毛玻璃边一侧紧贴凹口玻璃即可）将其置于封底用塑料槽内；用四枚铁夹将玻璃板固定在电泳仪上，齐下沿夹住，水平向内不可超过毛玻璃条，纵向两枚夹子排在一起，下边紧上边略松。一侧组装好后再组装另一侧。
2）灌胶前封底：用1%琼脂（可用1×TBE配制，也可用自来水配制）封底。即溶解煮沸凉至50-60℃后，倾斜电泳槽、并沿玻璃板下端灌进封底槽中，至其高度的一半左右即可。待完全凝固后便可准备灌制聚丙烯酰胺凝胶。
3）制胶（两块）：用30%Acr/Bis配制8%的非变性胶，具体配方见表7、表8。
表7  30%Acr/Bis贮存液（29:1）配方
表8  8%Acr凝胶溶液（用于非变性胶）配方
10%过硫酸铵：称取1g的过硫酸铵，溶解于10ml超纯水即可，贮存于4℃。
4）上样：在电泳槽的两极添加同一批次的1×TBE电泳缓冲液（参看表9），然后拔出梳子；用注射器清理加样孔，然后用微量进样器上样，每孔加入4-5μl样品即可。在凝胶边上至少留出1-2个加样孔加入DNA Marker（将试剂公司提供的Marker稀释20倍后加入5μl即可）。上样操作应尽可能地迅速。
表9  5×TBE电泳缓冲液配制方法
5）电泳：稳压电泳（100V-150V）。溴酚蓝指示条带泳动至距离底边约1厘米时，即可终止电泳。
6）银染：取下电泳槽两侧的架子将凝胶玻璃板从电泳槽上取下，然后将塑料封底槽卸下；将凝胶玻璃板水平放置（有凹口玻璃板的一侧向上），用有韧性的塑料薄片小心地翘起凹口玻璃板，用刀片切去底边地琼脂封底胶；而后将具毛边的玻璃板翻转（使有聚丙烯酰胺凝胶的一侧向下）置于盛有适量超纯水的塑料盘中，小心地晃动玻璃板使聚丙烯酰胺凝胶与玻璃板分离；用超纯水略漂后，将水倒掉开始染色。向塑料盘中加入适量0.1%AgNO3染色液（将1gAgNO3溶解于1L超纯水中，棕色瓶存放）使其没过胶体，在水平脱色摇床上缓慢摇动染色5min（染色液可反复使用，但需要适当地延长染色时间）。
7）显色：银染后，再用超纯水小心而迅速漂洗聚丙烯酰胺凝胶。然后加入适量显色液（将150g NaOH和1.9g十水合硼酸钠溶解于10L纯水中。用前添加适量甲醛（每200ml加入37%的甲醛1ml）），缓慢摇动直至核酸条带显现，倒掉显色液加入自来水稍加漂洗以终止显色。
8）拍照：将显色后的聚丙烯酰胺凝胶小心的转移到X光软片观察灯箱的白板上（注意排出聚丙烯酰胺凝胶与白板之间的气泡），然后打开背景荧光灯进行拍照。
4、结果判定
根据10对引物扩增的电泳结果，比较分析特定样品中是否含有与抗性亲本甜查理一致的带型，如是则为抗性表型；反之，则为感病性表型。10对引物扩增结果详见图5-14。
结果发现：该10对引物扩增产物电泳的遗传图谱对甜查理、达赛莱克特及其杂交后代都高度特异，因此属于特异而又稳定遗传、在杂交后代的双亲组合图谱中易于识别的炭疽病抗性遗传标记。
5、田间验证与应用
通过对抗病性未知的150份草莓品种材料进行田间验证与应用。通过炭疽病病原菌菌株进行人工培养、分生孢子诱导、分生孢子悬浮液制备以及定量、接种叶柄部位对参试草莓材料的抗病性进行了室内接种评价筛选试验和田间表型鉴定。同时，利用本发明获得的10对分子标记引物分别对参试的草莓材料进行草莓炭疽病抗性的分子鉴定，图15为标记引物FSS 105扩增产物的PAGE电泳图谱。
从图15可见，抗性亲本P2（甜查理）SSR引物扩增结果有特异带型，在杂交群体后代F2代中稳定遗传。通过该分子标记可鉴定杂交群体后代的炭疽病抗性，其中出现抗性亲本特异带型的F2代抗性单株代号为3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、24、25；而无特异带型的F2代感性单株代号为7、8、9、18、22、23。
结合田间抗感遗传表型与室内接种病原菌评价筛选鉴定的一致性，因而确定本发明的10对分子标记可将参试的草莓材料中抗病性与感病性区分开来，与室内接种鉴定、田间遗传表型的一致性可达到88.4%。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (2)

1.用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列，由上游引物和下游引物组成，其特征在于，上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、2所示，SEQ ID No.3、4所示，SEQ ID No.5、6所示，SEQ ID No.7、8所示，SEQ IDNo.9、10所示，SEQ ID No.11、12所示，SEQ ID No.13、14所示，SEQ ID No.15、16所示，SEQ ID No.17、18所示和SEQ ID No.19、20所示。
2.一种草莓种质资源炭疽病抗性的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)草莓全基因组SSR/AFLP引物的设计与合成以及草莓基因组DNA提取；
2)确定SSR/AFLP引物的最优PCR条件、电泳展示差异时间及染色显色方法并进行预筛选；
3)针对预筛选获得的14对SSR标记引物进行PCR扩增并结合PAGE电泳分析进行全面筛选；
所述的14对SSR标记引物分别由上游引物和下游引物组成，上下游引物的核苷酸序列分别如⑴SEQ ID No.1、2所示，⑵SEQ ID No.3、4所示，⑶SEQID No.5、6所示，⑷SEQ ID No.7、8所示，⑸SEQ ID No.9、10所示，⑹SEQID No.11、12所示，⑺SEQ ID No.13、14所示，⑻SEQ ID No.15、16所示，⑼SEQ ID No.17、18所示，⑽SEQ ID No.19、20所示，⑾SEQ ID No.21、22所示，⑿SEQ ID No.23、24所示，⒀SEQ ID No.25、26所示，⒁SEQ ID No.27、28所示；
4)对预筛选获得的14对SSR标记引物进行PCR扩增电泳分析进行重复筛选以验证遗传稳定性；
5)将全面筛选获得的10对SSR标记引物分别进行草莓炭疽病抗性的鉴定；
所述的10对SSR标记引物分别由上游引物和下游引物组成，上下游引物的核苷酸序列分别如⑴SEQ ID No.1、2所示，⑵SEQ ID No.3、4所示，⑶SEQID No.5、6所示，⑷SEQ ID No.7、8所示，⑸SEQ ID No.9、10所示，⑹SEQID No.11、12所示，⑺SEQ ID No.13、14所示，⑻SEQ ID No.15、16所示，⑼SEQ ID No.17、18所示，⑽SEQ ID No.19、20所示。
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