CN105713971B

CN105713971B - 鉴定西瓜籽粒大小的InDel分子标记及其引物和应用

Info

Publication number: CN105713971B
Application number: CN201610148861.3A
Authority: CN
Inventors: 李娜; 王吉明; 马双武; 尚建立; 李楠楠; 杨雪
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2016-03-16
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2036-03-16
Also published as: CN105713971A

Abstract

本发明涉及一种鉴定西瓜籽粒大小的InDel分子标记及其引物和在西瓜籽粒大小育种中的应用。该InDel分子标记的核苷酸序列为：TAGCAAGAGCGTTACTACTTCAACTAAAAATATCCATTTCATTTTA，其引物序列：InDel14_S6F：TGGTTGTTTCTTTTAGGTGGTA；InDel14_S6R：AGCGATTATGAGCAATTTTA。本发明通过QTL初定位在6号连锁群定位到了千粒重的主效QTL，并结合亲本重测序制备到与西瓜籽粒大小紧密连锁的InDel分子标记及其引物和在西瓜籽粒大小育种中的应用，可为西瓜籽粒大小选育提供新手段，加速西瓜籽粒大小性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

Description

鉴定西瓜籽粒大小的InDel分子标记及其引物和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鉴定西瓜籽粒大小的InDel分子标记及其引物和应用。

背景技术

西瓜的第一用途是鲜食，果肉是食用部分，籽粒偏大影响食用，消费者喜欢无籽或是籽粒较小的西瓜，因此小粒品种是栽培西瓜的育种目标之一。西瓜的另一用途是籽用，种子是籽用西瓜主要的产品。研究表明，籽用西瓜种子是优质的蛋白质和植物油资源，并含有丰富的维生素D，因此，大粒品种是籽用西瓜的主要育种目标。在资源搜集和数据采集的过程中，本发明人发现大粒的通常是野生西瓜、黏籽西瓜和地方品种，品质较差；小粒多为普通栽培西瓜，品质较好，不同品种间种子籽粒大小差异明显，因此籽粒大小也是西瓜的一个主要分类性状。

国内外西瓜籽粒大小的研究主要集中在对控制种子大小、千粒重的基因进行传统的遗传分析。Weetman (1937)和尚建立等（2015）的研究表明粒重倾向于单基因控制的质量性状。张杨（2013）和周延峰（2014）的研究均表明粒重都是受一对主基因控制。Pool 等（1941）发现了l和s这一对控制种子长短的等位基因，Kensler等（1958）和Shimotsuma等（1963）的研究也证实了这一结果。然而，Tanaka等（1995）发现了控制小粒的基因Ti，与l和s为非等位基因。Zhang等（1996）的研究表明tomato西瓜种子由单隐性基因ts控制。虽然采用的试验材料与方法不同，所得结论也不完全一致，但这些研究有一些共同点，都认为种子大小属于质量性状，小粒种子显性于大粒种子，且由单基因控制。另一方面，翟文强等（1995）以粒重具有显著差异的两个西瓜高代自交系为亲本研究杂交后代的粒重，西瓜种子千粒重表现为数量性状遗传的特点。Prothro等（2012）利用重组自交系和F₂群体研究籽粒大小，表明粒重是典型的数量性状。

传统的遗传学采用数理统计的方法，只能将控制质量/数量性状的一个或多个基因作为一个整体进行研究，不能确定单个质量/数量性状基因在染色体上位置及效应(徐云碧, 1992)。随着分子标记技术发展和分子数量遗传学的完善，使得鉴定复杂数量性状的遗传位点（QTL）成为可能。但是由于西瓜基础研究的相对滞后，西瓜QTL定位研究较少，而涉及籽粒大小的则更少。范敏等（2000）利用F₂群体定位了影响种子千粒重的6个QTL，与之连锁的多为同工酶等生化标记。Hawkins等（2001）利用单因素分析的方法检测到与粒长和粒宽连锁的RAPD分子标记。易克（2002）利用重组自交系群体（RILs）定位了一个效应较低的千粒重QTL，其侧翼的分子标记是AFLP标记。随着西瓜基因组测序的完成，Prothro 等（2012）利用两个西瓜群体在6号染色体上都检测到了一个籽粒大小主效QTL，其侧翼的分子标记皆为SNP标记，分别为NW0251236(5.80Mb)、NW0250242(6.44Mb)和NW0248118(5.04Mb)、NW0248583(6.41)。利用不同的遗传背景（egusi西瓜），Meru 和 McGregor（2013）在6号染色体也检测到了籽粒大小主效QTL（最近的遗传标记为NW0250854，对应的物理位置为4.58Mb）。这些基于测序产生的SNP标记不能直接用于分子标记辅助选择，即使可以转化为可用的标记（比如CAPS/dCAPS），检测过程需要酶切，成本较高，步骤繁琐。而基于全基因组重测序的插入/缺失（InDel）标记为共显性标记，检测容易，成本低廉，但尚存在一些不如意之处，如变异较少、稳定性不够等。

发明内容

针对以上问题，本发明通过QTL初定位在6号连锁群定位到了千粒重的主效QTL，并结合亲本重测序制备到与西瓜籽粒大小紧密连锁的InDel分子标记，并设计了其引物，在西瓜籽粒大小育种中进行了应用，可为鉴定西瓜籽粒大小提供新手段，加速西瓜籽粒大小性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

设计一种鉴定西瓜籽粒大小的InDel分子标记InDel14_S6，其核苷酸长度为46bp，序列为：

TAGCAAGAGCGTTACTACTTCAACTAAAAATATCCATTTCATTTTA。

上述InDel分子标记的引物，包括以下的核苷酸序列：

InDel14_S6F：TGGTTGTTTCTTTTAGGTGGTA；

InDel14_S6R：AGCGATTATGAGCAATTTTA。

上述InDel分子标记的筛选方法，包括以下步骤：

（1）利用母本“ZXG01478”（大粒）和父本“14CB11”（小粒）杂交的F₂群体构建高密度的遗传连锁图谱，并对父母本、F₁和F₂群体的单株进行千粒重表型鉴定；

（2）结合遗传连锁图谱和粒重表型鉴定结果，利用WinQTL cartographer 2.5software (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)进行QTL初定位，在LG6鉴定到一个千粒重的主效QTL（TSW6），其LOD峰值为46.94，解释26.16%的表型变异，置信区间（2-LOD）为3.68～31.67 cM，对应的物理位置为6号染色体的1.57～6.46Mb。

（3）结合两个亲本的重测序，在QTL置信区间发现23个插入缺失片段大于35bp的InDels，共设计了18对InDel引物。

（4）利用对应的InDel引物在父母本、F₁进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel引物在F₂群体中进行基因型鉴定；

（5）把F₂群体的93个单株按千粒重进行大粒和小粒的分类，把千粒重性状归为一个形态学标记TSW6，加上InDel分子标记的基因型鉴定结果与LG6上的其它SNP标记利用JoinMap4.0进行图谱构建，发现千粒重形态学标记TSW6位于主效QTL TSW6的置信区间，并且是QTL峰值的位置，其中一对新开发的引物，InDel14_S6与TSW6的连锁程度最为紧密，两者的遗传距离仅为1.0 cM。

利用上述技术措施，最终获得了与西瓜籽粒大小紧密连锁的插入缺失标记InDel14_S6，其对应的西瓜参考基因组物理图谱的位置为6号染色体的5478024bp，序列为：

TAGCAAGAGCGTTACTACTTCAACTAAAAATATCCATTTCATTTTA，其引物序列为，

InDel14_S6F：TGGTTGTTTCTTTTAGGTGGTA；

InDel14_S6R：AGCGATTATGAGCAATTTTA。

上述鉴定西瓜籽粒大小的InDel分子标记在西瓜籽粒大小育种中的应用方法，包括如下步骤：

（1）对F₂和RIL群体利用所述分子标记InDel14_S6进行基因型鉴定。

（2）利用上述（1）中RIL和F₂群体的基因型鉴定结果，根据分子标记InDel14_S6的基因型对不同单株进行分类，并利用千粒重表型数据进行鉴定和验证。

本发明具有以下积极有益效果：

1.本发明InDel分子标记变异稳定、检测容易，不需要酶切等繁琐的步骤，并且成本低廉，提高了西瓜籽粒大小育种的选择效率和准确率，从而加快育种进程。

2.本发明标记与目标QTL紧密连锁，遗传距离仅为1.0cM，加快了西瓜籽粒大小基因的克隆和功能验证。

3.本发明在综合考量DNA序列的保守区、二级结构形成、G+C含量、碱基随机分布、长度等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，最终设计并筛选出了特异性和高灵敏性的InDel标记的引物，其具有高度特异性、敏感性好等特点。

附图说明

图1 F₂群体高密度的遗传连锁图谱。

图2 F₂群体的千粒重频率分布图。

图3 开发InDel标记加入图谱前后分析；

A：千粒重QTL扫描；B：千粒重作为形态学标记（TSW6）的连锁分析；C：分子标记InDel14_S6的连锁分析。

图4 利用分子标记InDel14_S6的引物在部分F₂群体基因组DNA中的扩增结果；父母本方框中条带为目的条带；名称皆为品种名称\代号的后两/三位。

图5 利用分子标记InDel14_S6的引物在部分RIL群体基因组DNA中的扩增结果；父母本方框中条带为目的条带；名称皆为品种名称\代号的后两/三位。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所涉及的原料，如无特别说明均为市售，所涉及检测方法如无特别说明，则均为常规方法。

实施例1

鉴定西瓜籽粒大小InDel分子标记的开发方法，具体步骤如下：

（1）西瓜千粒重全基因组QTL初定位

利用母本“ZXG01478”（大粒）和父本“14CB11”（小粒）杂交获得的F₂群体已经构建了高密度的遗传连锁图谱（见图1），并对父母本、F₁和F₂群体的93个单株进行千粒重表型鉴定；结合遗传连锁图谱和F₂群体表型鉴定结果（图2），利用WinQTL cartographer 2.5software (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)进行QTL初定位，在LG6连锁群鉴定到一个千粒重主效QTL（TSW6），其LOD峰值为46.94，解释26.16%的表型变异，置信区间（2-LOD）为3.68～31.67 cM, 对应的物理位置为6号染色体的1.57～6.46Mb （图3A）。

（2）父母本的重测序

利用母本“ZXG01478”（大粒）和父本“14CB11”（小粒）进行了22x深度的高通量重测序。两个亲本共检测到45134个小的InDel。

（3）QTL区域InDel标记的开发

在QTL定位的置信区间发现23个插入缺失片段大于35bp的InDels。利用Perl自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，共设计18对对应的InDel引物。

实施例2

西瓜F₂和RILs群体分子标记分析，包括以下步骤：

（1）利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：

取1 g新鲜叶片放入研钵，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1ml CTAB 抽取液的离心管中，使二者充分混匀，然后置于65℃恒温水浴60 min，其间颠倒混合2～3次；

从水浴锅取出后，8000 rpm离心1 min；

取上清液置于另一离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇（24：1，V/ V），轻轻颠倒使其充分混匀；

10000 rpm离心5 min，取上清液（尽量不取到中层沉淀）；

加入0.7倍体积的异丙醇（需提前预冷30min），混匀后置于-20°C冷冻不超过30min让DNA析出；取出后10000 rpm离心5 min，留沉淀弃上清液；

用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开离心管盖子晾干；

加入200 μl的蒸馏水溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20°C冰箱中保存备用。

（2） PCR反应体系和程序

反应体系如下：西瓜叶片总DNA (100ng/μl) 1μl、Forward primer (10μmol) 1 μl、Reverse primer (10μmol) 1 μl、2 ×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μl、ddH₂O 9.5μl。

PCR反应程序为：94℃ 5分钟，35个循环的94℃ 20秒钟、55℃ 1分钟、72℃ 30秒、72℃ 5分钟。

（3）对PCR产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。

试剂配制：

A．5×TBE ：

Tris-base 53.9g

EDTA　 3.72g

硼酸 27.5g

用蒸馏水定容至1L。

B. 40%聚丙烯酰胺溶液：

聚丙烯酰胺 193.34g

甲叉双丙烯酰胺 6.66g

用蒸馏水定容至500 ml。

C. 8%聚丙烯酰胺凝胶（现配现用）：

40%聚丙烯酰胺溶液 10 ml

5 × TBE 5 ml

10% 过硫酸铵（APS） 200μl

四甲基乙二胺（TEMED） 80μl

蒸馏水 22 ml

D. 银染液：

硝酸银 1g

冰醋酸 5 ml

无水乙醇 50 ml

用去离子水定容至500g。

E. 显影液：

氢氧化钠 15g

甲醛（37%） 2.5g

用去离子水定容至500g。

凝胶板准备：

玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子（一个制胶器可制作两板凝胶）。在洗瓶内配置8%聚丙烯酰胺凝胶溶液（两份），混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入有齿的梳子（不要让梳子齿的下方产生气泡）；若此时液面有所下降，可用移液器吸取未凝固的溶液来补充。等待溶液充分凝固。

电泳：

将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×TBE缓冲液。在PCR产物中加入0.2倍体积的6×DNA LoadingBuffer，混匀后取0.8μl 加入点样孔内，260伏电泳35分钟。

染色和显影：

电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15分钟，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10秒；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上肉眼观察条带的位置差异，并拍照保存。

带型判读：

将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。

实施例3

F₂群体遗传连锁图谱重新构建，其步骤如下：首先利用千粒重形态标记（TSW6）和LG6上其它的SNP标记利用Joinmap4.0进行连锁分析，发现TSW6位于主效QTL TSW6置信区间，并基本处于峰值的位置，其中与TSW6最近标记的遗传距离为6.8 cM （图3 B）。加上新开发的标记InDel14_S6重新进行连锁分析，发现InDel14_S6与TSW6的遗传距离很近，仅为1.0cM（图3 C）。至此，我们开发了与千粒重QTL（TSW6）紧密连锁的分子标记InDel14_S6，对应于6号染色体5478024bp的一个46bp的插入缺失，其序列为TAGCAAGAGCGTTACTACTTCAACTAAAAATATCCATTTCATTTTA，其引物序列为，InDel14_S6F：TGGTTGTTTCTTTTAGGTGGTA；InDel14_S6R：AGCGATTATGAGCAATTTTA。该引物在母本（大粒）中的扩增产物为238bp，在父本（小粒）中的扩增产物为192bp，该标记与TSW6的遗传距离仅为1.0cM，与千粒重QTL（TSW6）的连锁程度很紧密。

实施例4

一种实施例3所筛选InDel分子标记在育种中的应用，其应用步骤如下：

（１）如实施例2进行InDel14_S6分子标记在F₂群体（图4）和RIL群体（图5）中的基因型鉴定。

（２）检查InDel14_S6分子标记的两种基因型（A代表母本带型，B代表父本带型，H代表杂合基因型）在93个F₂群体中的分布情况（表1）。

表1 InDel14_S6在F₂群体中的鉴定和验证

表1续 InDel14_S6在F₂群体中的鉴定和验证

结果表明，分子标记InDel14_S6的基因型在69份小粒（千粒重<37g）株系中1份为A（238bp），25份为B（192bp），43份为H。而在24份大粒株系中全部为A（238bp）。

分子标记InDel14_S6的基因型为A的25个株系24个是大粒株系，1个是小粒株系，而在基因型为B的25个株系都是小粒株系。其基因型鉴定的准确率达到98%。

（3）对RIL群体中的每个株系进行千粒重的考种。然后检查InDel14_S6分子标记的两种基因型在RIL群体中的分布情况（表2）。

表2 InDel14_S6在RIL群体中的鉴定和验证

表2续1 InDel14_S6在RIL群体中的鉴定和验证

表2续2 InDel14_S6在RIL群体中的鉴定和验证

结果表明，分子标记InDel14_S6的基因型在60份小粒（千粒重<37g）株系中5份为A（238bp），46份为B（192bp），9份为H。而在44份大粒株系中43份为A（238bp），1份为H。

分子标记InDel14_S6的基因型为A的48个株系43个是大粒株系，5个是小粒株系，而在基因型为B的46个株系都是小粒株系。其基因型鉴定的准确率达到95%。

通过分子标记InDel14_S6在F₂和RIL群体中来预测西瓜枯籽粒大小，其准确率高达95%以上，可以大大提高西瓜籽粒大小育种的选择效率，从而加速育种进程。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 鉴定西瓜籽粒大小的InDel分子标记及其引物和应用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagcaagagc gttactactt caactaaaaa tatccatttc atttta 46

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggttgtttc ttttaggtgg ta 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcgattatg agcaatttta 20

Claims

1.一种鉴定西瓜籽粒大小的InDel分子标记，其核苷酸序列为：TAGCAAGAGCGTTACTACTTCAACTAAAAATATCCATTTCATTTTA。

2.一种权利要求1所述InDel分子标记的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

InDel14_S6F：TGGTTGTTTCTTTTAGGTGGTA；

InDel14_S6R：AGCGATTATGAGCAATTTTA。

3.一种权利要求1所述InDel分子标记的筛选方法，包括以下步骤：

（1）利用大粒母本和小粒父本杂交的F₂群体构建高密度的遗传连锁图谱，并对父母本、F₁和F₂群体的单株进行千粒重表型鉴定；

（2）结合遗传连锁图谱和表型鉴定结果，进行QTL初定位，在6号连锁群鉴定到一个千粒重主效QTL位点；

（3）结合两个亲本的重测序，在QTL区间查找插入缺失片段大于35bp的InDels，为了缩小候选基因的区域，将QTL区域划分为2段，根据位于端点位置的插入缺失开发InDel分子标记，设计对应的InDel引物；

（4）利用对应的InDel引物在父母本、F₁筛选多态性，利用多态性引物对F₂群体进行基因型鉴定；

（5）把所鉴定的千粒重主效QTL位点视为一个形态学标记，加上InDel分子标记的基因型鉴定结果和鉴定到QTL位点的连锁群上其它SNP标记，利用JoinMap4.0进行图谱构建，分析所鉴定的千粒重主效QTL位点与新开发标记的连锁程度。

4.权利要求1所述InDel分子标记或权利要求2所述引物在西瓜籽粒大小的分子标记辅助选择中的应用。

5.权利要求1所述InDel分子标记在西瓜籽粒大小的分子标记辅助选择中的应用方法，包括如下步骤：

（1）对F₂群体和重组自交系群体每个株系利用所述分子标记进行基因型鉴定；

（2）利用上述（1）中重组自交系群体和F₂群体的基因型鉴定结果，根据分子标记的基因型对不同单株进行分类，并利用千粒重表型数据进行鉴定和验证。

6.权利要求1所述InDel分子标记或权利要求2所述引物在西瓜籽粒大小基因图位克隆中的应用。