CN110453008A - 一个与芝麻叶片长和宽主效基因位点紧密连锁的分子标记zmm6206及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一个与芝麻叶片长和宽主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM6206其应用。该分子标记为ZMM6206，其引物序列为：ZMM6206F：5’‑ACGATGAATGCAAGATTGGG‑3’ZMM6206R：5’‑GGTTTCCCAAGAGGGAGTTC‑3’与上述芝麻主效基因位点紧密连锁的分子标记可以预测芝麻叶片长和宽，进而可以快速筛选较小叶片长和宽的材料或株系，用于芝麻育种后代叶片长和宽的筛选，辅助叶片大小选择目标明确，成本较低。

Description

一个与芝麻叶片长和宽主效基因位点紧密连锁的分子标记 ZMM6206及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种芝麻叶片长和宽主效基因位点紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
芝麻(Sesamum indicum L.)是世界七大油料作物之一，也是我国传统特色油料作物，各地均有种植，我国是芝麻主产国，总产量仅次于印度。芝麻种子富含不饱和脂肪酸、维生素及钙、铁、锌等微量元素，味香质优，有益于人体健康，深受人们喜爱。随着生活水平提高，我国芝麻消费持续快速增长，从2003年的59万吨到2017年的164万吨，增加了近两倍，占世界消费总量的近30％，我国已成为世界上最大的芝麻消费国。因此，提高芝麻单产，对促进我国芝麻生产发展、解决总量自给不足问题十分迫切。
叶片是协调群体与个体结构，提高产量的关键株型要素之一。叶片是光合器官，叶片大小(长度，宽度和面积)和叶夹角是植物株型结构的主要决定因素之一，影响群体与个体叶片光合有效辐射的分布，从而影响植物产量。水稻、玉米、小麦等单子叶植物已在叶部性状研究方面取得突出进展。在水稻中，旗叶是在穗(花序)出现前的最后一片叶子，通常被认为是穗光合产物的主要来源，并且与千粒重、穗重和其他产量性状相关，研究认为大约90％的水稻籽粒产量取决于开花后的光合速率，其积累的碳水化合物超过50％是由旗叶产生的。在玉米上，过去的100年内，其产量增加不是依靠单纯的单株产量或单株籽粒数的提高，而是很大程度上得益于株型改良带来的群体密度增加。以美国为例，对叶夹角的不断改良，使玉米种植密度从十九世纪30年代的2000株/亩增加到目前的5300株/亩以上。
鉴于弄清叶片性状遗传基础对进行株型改良、提高单产水平的重要性，水稻、玉米等等主要农作物及模式植物拟南芥已进行了大量研究，发现作物不同品种的叶片大小具有较大差异，这种差异一般是由多基因或数量性状基因(QTL)控制的连续分布的表型，并且受环境的影响很大[8,10]。在水稻中，Cai等(2015)利用DH群体，定位到30个与水稻旗叶长度、宽度和叶夹角有关的QTL，贡献率变化在在4.5～26.3％。Lu等(2015)用523个材料进行全基因组关联分析，获得172个与12个性状相关的基因位点，并筛选出4个与叶夹角性状相关的候选基因和一个与叶片形状密切相关的基因区域。
当前芝麻主栽品种属高大类型，叶片较大、植株较高，群体与个体间的产量要素难以协调，个体产量要素难以发挥，导致我国芝麻产量长期处于低而不稳。进行芝麻株型改良，适度降低株高、减小叶夹角、使叶片由宽变窄，由长变短、缩短叶柄等，在保证单株蒴果数基础上，构建合理群体结构，依靠增加群体密度从而大幅度提高单产，是打破当前芝麻品种产量“瓶颈”，实现机械化的必由之路。解析芝麻叶片长和宽等性状的分子遗传基础，鉴定关键基因位点，发掘优异等位基因资源可为株型改良提供相关理论和技术支持，进而为培育适应我国现代农业生产需求的耐密植、适合机械化、高产芝麻新品种奠定重要理论和基因资源基础，意义重大。
国内外对芝麻株型的研究起步较晚，对叶片长和宽等性状的遗传研究和QTL定位鲜有报道。本发明在精细定位芝麻叶片长和宽主效基因位点的基础上，开发获得与其紧密连锁的分子标记，用于芝麻育种后代叶片长和宽表型的分子辅助选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种芝麻叶片长和宽的主效基因位点qLS9-1。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种与芝麻叶片长和宽主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM6206及其引物。
本发明所要解决的技术问题之三是提供一种上述芝麻叶片长和宽主效基因位点的分子标记鉴定方法。
本发明所要解决的技术问题之四是提供一种上述所述的分子标记ZMM6206的引物在芝麻育种后代叶片长和宽筛选及早期预测中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
提供一种与芝麻叶片长和宽主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM6206引物，引物序列为：
ZMM6206F：5’-ACGATGAATGCAAGATTGGG-3’
ZMM6206R：5’-GGTTTCCCAAGAGGGAGTTC-3’
上述与芝麻叶片长和宽主效基因位点紧密连锁的分子标记的鉴定方法，用ZMM6206F和ZMM6206R扩增芝麻叶片或其他组织总DNA，只扩增获得264bp的扩增片段时，则表明存在本发明所述的调控芝麻叶片长和宽主效基因位点，预测该芝麻叶片长度和宽度较小，说明叶片较小。
上述与芝麻叶片长和宽的主效基因位点qLS9-1紧密连锁的分子标记引物ZMM6206在芝麻育种后代叶片长和宽筛选及早期预测中的应用。
按上述方案，所述与芝麻叶片长和宽的主效基因位点qLS9-1紧密连锁的分子标记ZMM6206在芝麻育种后代叶片长和宽筛选及早期预测中的应用，具体应用方法为：用所述的分子标记ZMM6206的引物扩增芝麻育种后代叶片或其他组织总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得264bp的扩增片段，则预测该芝麻叶片长度和宽度较小，说明叶片较小。
本发明所述的芝麻叶片长和宽的主效基因位点是通过以下步骤筛选的：
(1)利用芝麻大叶品种中芝13(植株最大叶片部位1/3处叶长23.0cm，叶宽11.7cm)和小叶种质ZZM2289(植株最大叶片部位1/3处叶长15.0cm，叶宽6.7cm)进行杂交，获得F1种子，F1植株自交产生F2代种子，F2植株自交产生F3代种子，F3代开始按株行种植并自交产生种子，每个株行只收获1个单株的种子，种植成为下一代的1个株行，以此类推，最终获得F8代分离群体，即重组自交系(RIL)群体；
(2)提取亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA；
(3)利用自主设计开发的SSR标记引物对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色及带型统计，筛选亲本间有多态性的引物；
(4)将筛选得到的多态性引物对重组自交系(RIL)群体进行基因型分析，构建遗传连锁图谱，结合其叶片长和宽数据进行QTL定位，检测到芝麻第9号连锁群具有一个主效基因位点qLS9-1，可解释叶片长表型15.7％的变异，解释叶片宽表型18.1％的变异，与其紧密连锁(遗传距离0.37cM)的分子标记为SSR标记ZMM6206，其引物序列为：
ZMM6206F：5’-ACGATGAATGCAAGATTGGG-3’
ZMM6206R：5’-GGTTTCCCAAGAGGGAGTTC-3’
本发明的优点在于：
本发明首次定位了1个调控芝麻叶片长和宽的主效基因位点qLS9-1，可解释叶片长表型15.7％的变异，解释叶片宽表型18.1％的变异，同时发现了一个与芝麻叶片长和宽主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM6206，使得芝麻叶片长和宽主效基因位点的定位工作居于同领域前列。
本发明提供的芝麻叶片长和宽主效基因位点的分子标记鉴定方法，可以预测芝麻叶片的长和宽，进而可以快速筛选小叶片材料或株系，用于芝麻育种后代叶片长和宽筛选，辅助叶片大小选择，目标明确，成本较低。传统育种方法中，芝麻叶片长和宽受环境和群体密度影响较大，准确性低。本发明中叶片长和宽主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响，可以在苗期前或对种子进行早期筛选和淘汰，大大提高了选择效率，节约了生产成本。
附图说明
图1为芝麻(中芝13×ZZM2289)RIL群体叶片长和宽的分布图。
图2为连锁群图谱。图中星号所示为叶片长和宽主效基因位点qLS9-1在连锁群上的位置，与其紧密连锁的分子标记为ZMM6206。
图3为分子标记ZMM6206的引物在(中芝13×ZZM2289)RIL群体亲本及34个株系中扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳的胶板照片示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中按照《芝麻种质资源描述规范和数据标准》(张秀荣等，北京：中国农业出版社，2007)的方法鉴定叶片的长和宽，用于比较分析不同材料叶片的大小，按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所述的条件进行DNA提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。实验过程中涉及的所有试剂成分均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。
实施例1芝麻叶片长和宽主效基因位点的发掘
(1)构建大叶/小叶芝麻重组自交系(RIL)群体并鉴定叶片长和宽
利用芝麻大叶品种中芝13(植株最大叶片部位1/3处叶长23.0cm，叶宽11.7cm)和小叶种质ZZM2289(植株最大叶片部位1/3处叶长15.0cm，叶宽6.7cm)进行杂交，获得F1种子，F1植株自交产生F2代种子，F2植株自交产生F3代种子，F3代开始按株行种植并自交产生种子，每个株行只收获1个单株的种子，种植成为下一代的1个株行，以此类推，最终获得F8代分离群体，即重组自交系(RIL)群体。
在湖北武汉阳逻种植该群体，植株终花后，调查亲本及RIL各株系1/3植株处叶片的长和宽，每个株系调查5株，每株测定一对叶片。结果见图1，统计分析表明叶片长和宽表现分布呈连续性分布，变异分布呈正态分布，且变异范围很宽，说明芝麻叶片的长和宽属于数量性状。
(2)亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA的提取
利用CTAB法提取叶片基因组总DNA，具体步骤如下：
A.将各亲本及RIL分离群体叶片适量放入超低温冰箱-70℃存放，备用。使用时，自超低温冰箱(-70℃)取适量叶片样品，立即放入冰冻处理的研钵中，加入液氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入在65℃的水浴锅中预热过的CTAB提取液(2％CTAB，0.1MTris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，pH 7.5)，混合均匀，放入65℃的水浴锅中水浴40min；
B.取出离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇按体积比为24:1混合的混合液，缓慢上下颠倒离心管30-50次，使充分混匀，1300g离心10min；
C.取离心后的上清于另一离心管中，重复B步骤一次。然后再取上清加入0.6倍体积冰冷异戊醇中，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。然后置于-20℃静置30min，挑出沉淀，用75％(体积比)酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解；
D.再次重复B步骤一次，取上清，向其中加入0.1倍体积的NaAc(3mol/L，PH5.2)，混匀后缓慢加入2倍体积的冰冷无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，75％(体积比)酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃冰箱中保存备用，即得各亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA。
(3)引物的开发及多态性的筛选
根据芝麻基因组序列(http://ocri-genomics.org/Sinbase/index.html)在开发SSR引物。SSR引物具体的开发方法是先利用SSRHunter软件在每个scaffiold搜索SSR，然后用Primer5.0软件设计SSR引物。共设计了942对SSR引物，在此基础上，对这些引物进行亲本间多态性筛选。筛选结果表明，有81对引物在双亲间有差异，多态率为8.6％。多态性筛选程序如下：
A.自父母本中各随机选择5株的DNA等量混合，总浓度调整至20ng/ul，用作筛选引物的DNA模板。
B.PCR扩增反应。具体反应体系及扩增程序如下：
PCR反应体系：
PCR扩增程序：
(4)PCR扩增产物凝胶电泳测试获得多态性筛选结果
将以上获得的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以获得双亲多态性筛选结果，具体步骤如下：
胶板制备：
玻璃板用10％(质量比)NaOH溶液浸泡24小时，洗净，晾干。短胶板用无尘纸巾均匀涂抹硅烷化剂(AMMRESCO)，长胶板涂抹1ml反硅烷化剂，放置5min后，将玻璃装好，并以边条隔开，四周用制胶夹夹紧。准备就绪后用注射器将6％(质量比)聚丙烯酰胺胶液60ml缓慢注入玻璃间的缝隙中，直至灌满到玻璃板模具的顶部，注意避免产生气泡。小心插入梳子不带齿的一边，并用夹子夹牢，聚合2小时以上。
反硅烷化剂：500ml稀释液(95％无水乙醇，0.5％冰醋酸，4.5％ddH2O)中加1-2ml亲和硅烷；
6％(质量比)聚丙烯酰胺胶液:5.7％(质量比)丙烯酰胺，0.3％(质量比)N,N’-甲叉二丙烯酰胺，42％(质量比)尿素，1×TBE缓冲液。灌胶前每60ml胶液加入10％(质量比)过硫酸铵390ul和TEMED 39ul；
电泳：
去掉制胶夹，取出胶板，小心的取出梳子，冲洗并擦净玻璃外侧，固定于电泳槽上，上下槽各加500ml 1×TBE缓冲液，以恒功率75W电泳30min直到电压回升，用注水器冲洗凝胶的上表面以冲走析出的尿素和碎胶，插上梳子。在PCR产物中加入0.5倍体积的上样缓冲液，95℃变性5min，冰浴冷却3min以上，每个点样孔点样5ul，1800伏恒压电泳约80min，当二甲苯青FF到达2/3胶板时停止电泳。取下胶板，用自来水冲洗降温。
1×TBE：Tris-base108g，硼酸55g，0.5M EDTA(PH8.0)40ml，定容至1000ml即成10×TBE，使用时稀释10倍即为1×TBE工作液；
上样缓冲液：98％(体积比)去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.005％(质量比)二甲苯青FF，0.005％(质量比)溴酚蓝。
银染法染色：
将两块玻璃板分离开来，长玻璃板连同凝胶用蒸馏水漂洗3次，每次3min，放入染色液(含0.15％的AgNO3)中染色10min，用蒸馏水快速漂洗5-6s。放入显影液(含0.2％的NaOH，0.04％的甲醛，35℃)中显影，至带型清晰，然后在蒸馏水中漂洗1次，室温下自然晾干，拍照保存。观察胶板上各引物在双亲中的扩增带型，双亲带型有差异的引物即为多态性引物。
(5)上述筛选得到的多态性引物在RIL群体中的分析及叶片长和宽基因位点定位
将上述筛选得到的多态性引物在RIL群体中进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色及带型统计(父本带型统计为a，母本带型统计为b)，得到群体基因型数据，根据连锁交换规律，利用软件Joinmap3.0构建遗传连锁图谱(图2为第9号连锁群图谱)，最小LOD值设为2.5。然后利用RIL群体的524个株系的叶片长和宽表型数据、基因型数据及遗传连锁图谱数据，运行Windows QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法(Composite IntervalMapping,CIM)，进行基因定位分析。结果在第9号连锁群上定位到影响叶片长和宽的主效基因位点qLS9-1，可解释叶长表型15.7％的变异(即贡献率15.7％)，同时解释叶宽表型18.1％的变异(即贡献率18.1％)。该位点来自于小叶种质ZZM2289的等位基因具有减小叶片长和宽效应，与其紧密连锁(遗传距离0.89cM)的分子标记为SSR标记ZMM6206，其引物序列为：
ZMM6206F：5’-ACGATGAATGCAAGATTGGG-3’
ZMM6206R：5’-GGTTTCCCAAGAGGGAGTTC-3’
实施例2上述主效基因位点qLS9-1紧密连锁的分子标记ZMM6206的引物在芝麻育种后代叶片长和宽筛选及早期预测中的应用
利用另一大叶品种中芝11与小叶种质ZZM2289杂交后构建包含367个株系的RIL群体(F7代)，在苗期对各株系进行分子鉴定，具体步骤包括叶片总DNA的提取(具体如实施例1中的DNA提取方法)和利用叶片长和宽主效基因位点qLS9-1紧密连锁的分子标记ZMM6206的引物进行分子鉴定，即经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳及带型统计(具体如实施例1中的PCR扩增、凝胶电泳及带型统计方法)，保留含有与小叶亲本相同的264bp条带株系(即含有叶片长和宽主效基因位点qLS9-1的株系)共148个，其中群体亲本及34个株系电泳后染色得到的胶板照片见图3，其中，第1、2号样品分别是母本和父本，第4、5、6、7、10、12、14、15、16、20、22、24、25、28、29、31、32号株系(扩增可得到与小叶父本相同的264bp条带)。另将该RIL群体367个株系于盛花后期进行叶片长和宽测定，结果表明：通过分子标记辅助选择得到的148个株系中，叶片长和叶片宽同时低于该RIL群体均值(18.7cm和10.6cm)的株系占72.3％(见表1，共108个)，选择准确率较不使用标记辅助选择提高22.3个百分点。
该RIL群体植株中最大叶片部位叶片长小于18.7cm，且叶宽小于10.6cm的株系共138个，其中通过分子标记可将78.3％的小叶株系选择出来(108个)，选择效率提高了28.3个百分点。由此，通过鉴定上述主效基因位点来预测芝麻育种后代的叶片大小表现，可大大提高芝麻小叶品种的育种效率。
表1分子标记辅助选择得到的叶片长和宽同时低于群体均值的108个株系

Claims (3)

1.一个与上述芝麻叶片长和宽主效基因位点紧密连锁的分子标记ZMM6206，其特征在于：该分子标记的引物序列为：
ZMM6206F：5’-ACGATGAATGCAAGATTGGG-3’
ZMM6206R：5’-GGTTTCCCAAGAGGGAGTTC-3’。
2.芝麻叶片长和宽主效基因位点的分子标记鉴定方法，其特征在于：用分子标记ZMM6206的引物ZMM6206F和ZMM6206R扩增芝麻叶片总DNA，只扩增获得264bp的扩增片段时，则表明存在本发明所述的调控芝麻叶片长和宽主效基因位点，预测芝麻叶片的长和宽较小；
ZMM6206F和ZMM6206R的序列如下：
ZMM6206F：5’-ACGATGAATGCAAGATTGGG-3’
ZMM6206R：5’-GGTTTCCCAAGAGGGAGTTC-3’。
3.根据权利要求1所述的分子标记在芝麻育种后代叶片长和宽筛选及早期预测中的应用。
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