CN110499387A - 一种小麦旗叶长qtl连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

一种小麦旗叶长qtl连锁的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及小麦分子育种领域，具体公开了一种小麦旗叶长QTL连锁的分子标记及其应用。本发明提供了与小麦旗叶长QTL QFll‑5B连锁的SNP分子标记，位于RefSeqv1.0基因组版本的5B染色体长臂上，其为SEQ ID NO.31所示序列的第51位，多态性为C/T，可通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的引物扩增得到。该分子标记能准确跟踪小麦旗叶长QTL QFll‑5B，预测小麦的旗叶长特性，便于进行分子设计育种。本发明还公开了鉴定所述分子标记的方法，利用该方法能够加强旗叶长的预测的准确性，以便快速筛选出具有增加旗叶长的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦高产量品种的选育进程。

Description

一种小麦旗叶长QTL连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及作物遗传育种领域，具体涉及小麦旗叶长QTL QFll-5B连锁的SNP分子标记以及该分子标记的应用。
背景技术
普通小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的作物之一，其播种面积占全国耕地面积的20％-30％。它是35％人口的主要食物。据报道，小麦生产应该增加70％以满足未来的粮食需求。
目前世界可耕地面积减少，人口增加，迫切期望小麦年产量快速增加。产量的大小直接取决于小麦的光合作用，而旗叶的大小对光合作用有很大的影响,因此旗叶大小对小麦的最终产量具有很大的影响。旗叶长是一种重要的农艺性状，在小麦中对产量潜力起着重要作用，因为种子的有机物一半是由旗叶提供，灌浆期是小麦的一个关键时期，直接影响小麦的产量。此外，旗叶决定了小麦的冠层结构，它影响开花时间，光照量，光合作用，种子灌浆，并最终影响每株植物的籽粒产量。
小麦产量性状是复杂的数量性状，受多个数量性状基因位点(Quantitativetrait locus，QTL)控制，具有遗传力低、受环境影响大、选择难度高的特性，所以在选育过程中，传统的育种方法存在时间长、消费大、成本高、成果小的问题。分子标记辅助育种，不依赖于表型选择，即不受环境、基因互作、基因与环境互作等因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)指的是基因组内DNA某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化而引起的DNA序列多态性。其技术是利用己知序列信息来比对寻找SNP位点，再利用发掘的变异位点设计特异性的引物来对基因组DNA或cDNA进行PCR扩增，得到基于SNP位点的特定的多态性产物，最后利用电泳技术分析产物的多态性。SNP标记的优点是数量多，分布广泛；在单个基因和整个基因组中分布不均匀；SNP等位基因频率容易估计。
KASP是由LGC公司(Laboratory of the Government Chemist)(http://www.lgcgenomics.com)研发的竞争性等位基因特异性PCR技术(Kompetitive AlleleSpecific PCR,KASP)具有低成本、高通量特点的新型基因分型技术，通过引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及In Del位点进行精准的双等位基因分型，在水稻、小麦、大豆等作物的分子标记辅助选择中得到广泛应用。
此前有学者对旗叶长进行了QTL定位，发现与之相关的QTL在小麦中广泛存在，然而目前与小麦旗叶长性状相关可用于实际分子育种的紧密连锁的分子标记却并不多。因此研究获得有关旗叶长的QTL或基因，利用分子生物学技术，增加旗叶长，进而增加产量，最终达到选育高产小麦新品种的目的，在小麦育种工作中意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供与小麦旗叶长QTL QFll-5B紧密连锁的分子标记。
本发明的另一目的在于提供所述分子标记的荧光定量PCR引物。
本发明的第三个目的在于提供上述小麦旗叶长QTL QFll-5B紧密连锁的分子标记的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
基于以上目的，申请人利用小麦品种‘川农16’为父本，以小麦品系‘20828’为母本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单穗传法，一直到F8代，获得含有199个系的重组自交系，构成遗传作图群体。对重组自交系群体旗叶长表型鉴定，提取亲本‘20828’、‘川农16’和重组自交系群体植株DNA，本研究使用小麦55K SNP芯片(北京博奥晶典生物技术有限公司(http://www.capitalbiotech.com))来定位小麦旗叶长QTL。小麦55K SNP芯片是在小麦660K SNP芯片的基础上开发的一款经济型中密度SNP芯片。芯片包含55，000个左右的小麦SNP标记，均匀分布在21条染色体上，每条染色体上平均有2，600个标记，标记间的平均遗传距离约为0.1cM，平均物理距离小于300Kb，适合于一般的种质资源多样性分析、遗传作图与新基因发掘、比较基因组分析、品种注册与鉴别(指纹分析)。
根据55K SNP芯片数据，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的旗叶长表型数据，用QTL IciMapping 4.0中的完备区间作图法(Inclusive Composite IntervalMapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2017-2019三个年份共10个生态点及10个生态点旗叶长的BLUP(最佳线性无偏预测，best linear unbiased prediction)值来检测QTL，在5B染色体长臂上的3.4cM区间定位出稳定表达的小麦旗叶长主效QTLQFll-5B，对侧翼标记进行物理定位并每隔1Mbp筛选位于区间内的基因，共筛选获得20个基因，并对这些基因在亲本‘20828’和‘川农16’进行克隆，对获得多态性位点并进行分子标记的开发，共设计了10对共30条KASP引物(表1)，最终得到标记KASP-5B-FLL与旗叶长QTLQFll-5B紧密连锁。
本发明所述的小麦旗叶长QTL QFll-5B，正效应位点来自母本‘20828’，该QTL位于小麦染色体5B长臂上，在RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为439.7Mbp-534.4Mbp。本发明提供了上述小麦旗叶长QTL QFll-5B在调控小麦旗叶长性状中的应用。
进一步地，本发明提供了小麦旗叶长QTL QFll-5B的SNP分子标记KASP-5B-FLL，其与小麦旗叶长QTL QFll-5B紧密连锁。SNP分子标记KASP-5B-FLL与QFll-5B之间的遗传距离小于1cM，其为SEQ ID NO.31所示序列的第51位，其多态性为C/T。
本发明的小麦旗叶长QTL QFll-5B的分子标记KASP-5B-FLL由核苷酸序列如SEQID NO.1～3所示的引物对PCR扩增获得。
进一步地，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’端分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’端分别添加不同的荧光修饰基团。
优选地，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’分别添加不同的荧光修饰基团。所述荧光修饰基团包括但不限于FIFC、FAM、TET、HEX、JOE、TAMRA、BHQ。
本发明提供了上述分子标记KASP-5B-FLL在作物分子辅助育种、培育转基因小麦或小麦种质资源改良中的应用。
本发明提供了上述分子标记KASP-5B-FLL在培育长旗叶性状的小麦或高产小麦以及在筛选具有长旗叶性状的小麦品种或品系中的应用。
本发明还提供了用于检测小麦旗叶长QTL QFll-5B的SNP分子标记KASP-5B-FLL的特异性引物对，其上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。
本发明提供了上述特异性引物对在小麦种质资源改良中的应用。
本发明提供了上述特异性引物对在小麦长旗叶材料创制或在筛选具有长旗叶性状的小麦品种或品系或培育高产小麦中的应用。
含有上述特异性引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种鉴定小麦旗叶长QTL QFll-5B的分子标记方法，以待鉴定材料的DNA作为模板，用三条引物序列分别为SEQ ID NO.1～3所示的特异性引物对进行PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型；所述引物组合物中，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’分别添加不同的荧光修饰基团，将能够读取到SEQID NO.2所标记的荧光基团的植株鉴定为含有旗叶长QTL QFll-5B的小麦。
具体地，上述的应用，包括如下步骤：
1)提取待测植株的基因组DNA；
2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增分子标记KASP-5B-FLL的引物，在仪器CFX96 Real-Time System，进行PCR扩增反应并读取荧光值；
3)检测PCR扩增产物荧光，如果能够读取HEX荧光，则待测植株为具有多旗叶长性状的小麦资源。
上述PCR扩增的扩增体系为：5μL Master Mix、三条引物SEQ ID No：1、2和3按照10ng/μL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH2O 460μL进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。
上述PCR扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。
本发明公开了位于小麦5B染色体上的与小麦旗叶长连锁的分子标记KASP-5B-FLL，该分子标记是小麦5B染色体长臂上旗叶长QTL QFll-5B的侧翼标记，连锁度高。该标记可用来检测小麦5B染色体上的旗叶长QTL，。本发明的有益效果至少体现在以下：
(1)本发明首次公开了来自小麦‘20828’的旗叶长QTL QFll-5B，位于小麦5B染色体长臂上，能显著增加小麦旗叶长。该QTL在小麦产量(调控旗叶长)育种中具有较高的利用价值。
(2)本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦‘20828’的旗叶长QTLQFll-5B的分子标记KASP-5B-FLL，且为共显性标记，分子标记KASP-5B-FLL与旗叶长QTLQFll-5B极显著相关，呈现共分离标记特征，连锁度高。该标记可用来检测小麦5B染色体上的旗叶长QTL，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高产小麦的分子辅助育种。检测准确高效、扩增方便稳定。
本发明提供的分子标记KASP-5B-FLL与小麦5B上的旗叶长QTL QFll-5B紧密连锁，可用来对小麦旗叶长这一性状进行定位，用于分子标记辅助选择的准确性高，能快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高产小麦的分子辅助育种，并且提高适应不同环境的小麦旗叶大小品种的选择鉴定效率，且成功率高。采用本发明的分子标记和方法能够准确地在育种过程中选择旗叶长度合适的植株，提高育种工作效率，并为小麦旗叶长基因的研究提供基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中小麦旗叶长QTL QFll-5B在5B染色体上的定位。
图2为本发明实施例1中‘20828’ב川农16’的重组自交系株系植株分子标记KASP-5B-FLL检测的荧光读值结果；其中，HEX(蓝色，‘川农16’)荧光为有较短旗叶长的株系，FAM(橙色，‘20828’)荧光为较长旗叶长株系；绿色荧光为杂合株系；黑色荧光为空白对照。
图3为本发明实施例2中小麦‘20828’×小麦品种‘川麦60’的重组自交系株系植株分子标记KASP-5B-FLL检测的荧光读值结果；其中，其中，HEX(蓝色，‘20828’)荧光为有较短旗叶长的株系，FAM(橙色，‘川麦60’)荧光为较短旗叶长株系；绿色荧光为杂合株系；黑色荧光为空白对照。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明实施例中所用的小麦种质资源均来自四川农业大学小麦研究所种质资源库。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1小麦旗叶长QTL QFll-5B及其分子标记KASP-5B-FLL的获得
(1)利用小麦品系‘20828’为母本，以小麦品种‘川农16’为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单穗传法，一直到F8代，获得含有199个系的重组自交系，构成遗传作图群体。
(2)重组自交系群体旗叶长表型鉴定：小麦成熟期对重组自交系旗叶长进行分析鉴定，去除每行两端的单株，分别收取五个长势一致的单株，计算旗叶长，并得出平均值，代表该株系的旗叶长。
(3)55K SNP芯片分析
a)DNA提取：用CTAB法提取亲本‘20828’、‘川农16’和重组自交系群体植株DNA。
b)使用超微量分光光度计对提取的DNA进行质量检测，合格后送样至公司进行基因型分析，在本研究中双亲和作图群体的基因型分析由北京博奥晶典生物技术有限公司(http://www.capitalbiotech.com)与贾继增课题组合作开发的55K SNP芯片完成。
c)连锁图谱的构建：根据55K SNP芯片数据，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的旗叶长表型数据，用QTL IciMapping 4.0中的完备区间作图法(InclusiveComposite Interval Mapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2017-2019三个年份共10个生态点及10个生态点旗叶长的BLUP(最佳线性无偏预测，best linearunbiased prediction)值来检测QTL，定位出小麦旗叶长QTL QFll-5B，并计算QFll-5B的位置和分子标记之间的遗传距离。
d)遗传图谱的密化和紧密连锁分子标记的获得：为了密化遗传图谱并获得与旗叶长QTL QFll-5B紧密连锁的分子标记，利用55K SNP芯片数据定位结果对侧翼标记进行物理定位并筛选位于区间内的基因，对这些基因在亲本‘20828’和‘川农16’进行克隆，对获得多态性位点并进行分子标记的开发，利用DNAMAN设计KASP引物(共设计30条，10对KASP引物)(表1)，最终得到标记KASP-5B-FLL与旗叶长QTL QFll-5B紧密连锁。
表1 10对KASP引物序列
注：表2中下划线部分为FAM标签序列，波浪线部分为HEX标签序列
e)进行分析。设计的10对KASP引物中最终得到了4个分子标记，其中KASP-5B-FLL与旗叶长QTL QFll-5B紧密连锁，结果见图1，2。
实施例2分子标记KASP-5B-FLL在选择控制旗叶长QTL QFll-5B上的应用
(1)利用长旗叶的普通小麦品系‘20828’为母本，短旗叶的普通小麦品系‘川麦60’为父本构建重组自交系，在后代株系中随机选择54个株系。
(2)对所获得的54个株系进行KASP-5B-FLL标记检测，具体方法为：提取54个株系的DNA；将其作为模板，以分子标记KASP-5B-FLL的特异性引物对为引物进行PCR扩增并进行荧光读值，所述引物为：
FAM标签上引物：(下划线部分为FAM标签序列)
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTGATAGCAAAGTATGTTGC-3’(SEQ ID No.1)
HEX标签上引物：(波浪线部分为HEX标签序列)
通用下游引物：
5’-CATTCAAAATTCAACCGAAG-3’(SEQ ID No.3)
上述PCR扩增的扩增体系为：5μL Master Mix、三条引物SEQ ID No：1、2和3按照10ng/μL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH2O 460μL进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。
上述PCR扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。
荧光读值结果(见图3)，将检测到与‘20828’一致的HEX(蓝色)荧光的植株基因型记为A，为长旗叶型株系，同‘川麦60’一样表现为FAM(橙色)荧光的植株基因型记为B，为短旗叶型株系。各个株系基因型与旗叶长田间表型值如表2所示。
表2‘20828’ב川麦60’重组自交系KASP-5B-FLL基因型与表型对应结果
结果显示，与含有旗叶长QTL QFll-5B的‘20828’类型相同的植株平均旗叶长为14.42，极显著高于与‘川麦60’类型的植株旗叶长(平均12.53)。实际结果与预期结果一致，说明本发明的旗叶长QTL QFll-5B确实有显著增长小麦旗叶的作用；同时本发明的分子标记KASP-5B-FLL可以用与跟踪鉴定旗叶长QTL QFll-5B。
虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种小麦旗叶长QTL连锁的分子标记及其应用
<130> KHP191114977.0
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cacaacaatg aagttggttt 20
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Claims (10)

1.小麦旗叶长QTL QFll-5B连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记为KASP-5B-FLL，位于RefSeqv1.0基因组版本的5B染色体长臂上，与QFll-5B之间的遗传距离小于1cM，其为SEQ ID NO.31所示序列的第51位，其多态性为C/T。
2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记可通过以下引物组合扩增得到，所述引物组合含有3条引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。
3.根据权利要求2所述的SNP分子标记，其特征在于，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’端分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’端分别添加不同的荧光修饰基团。
4.一种引物组合，其特征在于，含有核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示的引物。
5.权利要求1-3任一所述的SNP分子标记或权利要求4所述的引物组合在作物分子育种、培育转基因小麦或小麦种质资源改良中的应用。
6.权利要求1-3任一所述的SNP分子标记或权利要求4所述的引物组合在培育长旗叶性状的小麦或高产小麦中的应用。
7.权利要求1-3任一所述的SNP分子标记或权利要求4所述的引物组合在筛选具有长旗叶性状的小麦品种或品系中的应用。
8.一种鉴定权利要求1-3任一所述的SNP分子标记的方法，其特征在于，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求4所述的引物组合对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型；所述引物组合物中，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’分别添加不同的荧光修饰基团，将能够读取到SEQ IDNO.2所标记的荧光基团的植株鉴定为含有小麦旗叶长QTL QFll-5B的植株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增反应体系：5μLMaster Mix、引物SEQ ID No：1、2和3按照10ng/μL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH2O 460μL进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白；
荧光定量PCR程序：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。
10.小麦旗叶长QTL QFll-5B在调控小麦旗叶长性状中的应用，所述的小麦旗叶长QTLQFll-5B位于小麦染色体5B短臂上，在RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为493.7Mbp-534.4Mbp其可通过SEQ ID NO.1-3所示的引物检测得到；所述小麦旗叶长QTL QFll-5B显著增加小麦旗叶长，平均LOD值为7.65，解释约3％-35％的表型变异。
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