CN105177162B - 检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物及检测方法 - Google Patents

检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明针对烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变开发了特异引物及检测方法。其特征在于，特异引物包括两条上游引物CPS2‑1F和CPS2‑2F以及一条公用下游引物CPS2‑R。检测方法为：基于等位基因特异PCR(AS‑PCR)原理，在冷杉醇合成关键基因NtCPS2的SNP突变位点处设计两条互补的上游引物，在其下游设计一条共用下游引物。以待测烟草品种的DNA为模板，使用两对特异性引物进行PCR扩增，电泳检测PCR扩增产物，判断PCR扩增产物是否含有297bp的特征条带。本发明设计的引物对具有操作简便、费用低廉、结果可靠、检测速度快，可区分杂合或纯合等优点，能够大大加快冷杉醇特异香气性状选育进程，缩短育种周期，提高育种效率。

Description

检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引 物及检测方法
技术领域
本发明属于分子标记领域，具体涉及一种检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物及检测方法。
背景技术
冷杉醇是一些香料烟和部分雪茄烟中重要的赖百当类物质，对烟草的香气特性起着重要作用，也是影响香味品质的类琥珀物质的重要化学前体物，此外，也有报道称冷杉醇与植物的抗虫、抗病性有关。不同类型烟草品种冷杉醇的合成存在较大差异，香料烟和大部分雪茄烟品种有冷杉醇的合成，然而大部分烤烟品种中没有冷杉醇的合成。最近的研究表明：烟草冷杉醇是以牻牛儿牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate，GGPP)为底物，由两个基因NtCPS2和NtABS编码的蛋白依次催化合成，不同烟草种质均含有NtABS基因，正是NtCPS2序列的多态性导致了不同烟草种质冷杉醇合成的差异，NtCPS2是控制冷杉醇合成的一个关键基因。研究表明，不能合成冷杉醇的烟草种质中，NtCPS2基因存在两种突变形式。一种是在NtCPS2开放阅读框中的第275位碱基位置有一个8碱基插入序列，另一种是在开放阅读框中的第292位碱基上出现了一个SNP突变，即由G转变为T。并且在不合成冷杉醇的品种中，90％以上的品种是因SNP突变引起，因此，针对NtCPS2基因的SNP突变位点开发标记引物，对利用分子标记辅助选择培育含有冷杉醇的烤烟品种，改善烤烟品种的香气品质和抗病性均具有重要意义。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)在全基因组分布广，密度大，遗传稳定，且可实现自动化检测。因此，SNP标记是目前研究较多，有广阔前景的分子标记，其在遗传图谱构建、关联分析、分子标记辅助选择育种以及种植资源筛选等方面具有重要的意义。对于海量的SNP位点，有很多的检测方法，包括基因芯片技术、荧光能量转移法、TaqMan探针技术和焦磷酸测序技术等，虽然这些方法能够高通量分型SNP，但它们都需要专门的检测设备或复杂的技术且费用昂贵。而等位基因特异PCR(AS-PCR)弥补了上述缺陷，在简单的分子实验室仅仅需要一个电泳实验即可完成，方便快捷且具有更广泛的适用性。理论上，引物3’末端的碱基对PCR的延伸来说尤为重要，如果引物的3’末端核苷酸与SNP位点一致，DNA聚合酶就可以扩增获得特异的PGR产物，不一致则无扩增产物，这样就可以通过PCR产物的有无来检测SNP。但是，这种方法并没有广泛的应用，是因为非特异性等位基因位点3’末端错配不能够有效可靠的区分两个等位基因，只是降低了延伸效率。因此，不同改良的AS-PCR方法也相继出现并成功应用，如：引入错配碱基AS-PCR、四引物扩增受阻突变体系PCR(ARMS PCR)、片段长度差异等位基因特异性PCR(FLDAS-PCR)以及基于AS-PCR原理，采用毛细管电泳技术和荧光标记复合扩增，根据PCR片段长度差异进行分型等。这些方法的出现使开发相应的SNP标记成为可能。
改善烟叶香气品质是烟草育种的重要内容之一。传统育种工作中，育种家们从分离后代中通过表型观察或昂贵的化学检测选择理想的重组基因型，这样耗时耗力且容易产生偏差。因此，分子标记辅助选择为香气品质育种开辟了一条新的途径。本研究利用引入错配碱基等位基因特异PCR，在引物3’末端不同的位置引入不同的错配碱基来改善PCR扩增效果，从而对烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的SNP位点进行分型，以期开发出用于分子标记辅助选择育种的分子标记。本发明旨在提供一种用于检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异性引物对及检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供方法简便，效率高，检测效果好的一种烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物及检测方法。利用该特异引物序列检测育种后代材料是否含有冷杉醇，不受生长条件和发育时期的影响，能够极大地加速材料的选育过程，缩短育种周期，提高育种效率。还具有成本低廉、操作简便、结果可靠、检测速度快等优点。
本发明采用的技术方案如下：
本发明公开了一种检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物，其中，所述特异引物用于检测烟草冷杉醇能否合成的特异性引物对，包括两个上游引物CPS2-1F和CPS2-2F以及下游引物CPS2-R：
上游引物CPS2-1F(5’-3’)：ACAGATGAAAGGTTTGATAG
上游引物CPS2-2F(5’-3’)：ACAGATGAAAGGTTTGATAT
下游引物CPS2-R(5’-3’)：TCTCTTATGAAGGCACGTGT。
(特异性引物对包括两条上游引物CPS2-1F和CPS2-2F以及一条公用下游引物CPS2-R)
为更好的实现本发明目的，本发明又公开了检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的检测方法，包括以下步骤：
S1，根据烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的第四号外显子cDNA序列，基于AS-PCR原理，在SNP突变处设计两个上游引物，使引物的3’末端核苷酸与SNP位点一致，同时在引物3’末端倒数第三位人工引入错配碱基T，在第四号外显子末端设计一个公用的下游引物，这样构成的两对引物形成互补引物，能够相互检测SNP的类型，同时也能够检测后代为杂合体或纯合体；
S2，提取被检测烟草品种的DNA；
S3，以被检测烟草品种的DNA为模板，使用NtCPS2基因特异性引物对被检测烟草品种的DNA进行PCR扩增；
S4，采用电泳检测PCR扩增产物，判断PCR扩增产物是否含有292bp的特征条带：
如果引物对CPS2-1F/CPS2-R有条带，而引物对CPS2-2F/CPS2-R无条带，则被检测烟草品种为正常纯合型G，有冷杉醇合成；
反之，则被检测烟草品种为突变纯合型T，不合成冷杉醇；
如果这两对引物都有扩增条带，则说明检测品种为杂合型。
PCR扩增的反应体系组成为：2×Dreamtaq MIX 10uL，模板DNA 1ul，上游引物1uL，下游引物1uL，最后用双蒸水将反应体系补至20uL。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；退火温度52℃(引物对CPS2-1F/CPS2-R)或48℃(引物对CPS2-2F/CPS2-R)30s；72℃延伸30s；共35个循环，最后72℃ 7min停止反应。
进一步的，NtCPS2的第四号外显子序列：
GTAAGCAGAACAATACAGATGAAAGGTTTGACAGAAGAGATCAAACACATGTTGAATTCGATGGAGGATGGAAGGTTAAATGTCTTAGCCTATGACACAGCTTGGGTTTCCTTTATTCCAAATACTACTAATAATGGAAATGATCAAAGACCTATGTTTCCATCTTGTCTTCAATGGATTATAGACAATCAACTTTCTGATGGTTCATGGGGAGAGGAGATTGTATTCTGCATATATGATCGACTCTTGAACACACTAGTATGTGTTATTGCATTGACATTATGGAACACGTGCCTTCAT AAGAGAAACAA
在上述基因序列中，前面划下划线的序列即为两个上游引物CPS2-1F和CPS2-2F；后面划下划线的序列即为下游引物CPS2-R。红色字体为SNP位点和错配碱基。
本发明的主要优点在于：
(1)引物序列特异性好，能够检测出纯合体和杂合体。本发明可用于烟草冷杉醇分子标记辅助育种，加速品质育种材料和资源的筛选。本研究基于引入错配碱基的等位基因特异PCR(AS-PCR)原理，根据烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2 cDNA序列的SNP位点设计两对互补特异性引物，这两对引物能够分别检测到SNP类型(G和T)，并以此判断冷杉醇的合成，避免了PCR扩增假阳性，保证了PGR扩增的特异性和准确性。同时在后代分离群体中，这两对互补引物可以结合使用来区分单株是纯合体还是杂合体，从而避免因杂合型在后代中继续分离而导致的不必要检测。这大大减少了选择的工作量，提高了选择效率。
(2)检测过程更加方便快捷，结果更加直观。与现有SNP检测技术相比，如基因芯片技术、荧光能量转移法、TaqMan探针技术和焦磷酸测序技术等，虽然这些方法能够高通量检测SNP，但它们都需要专门的检测设备或复杂的技术且费用昂贵。而AS-PCR在简单的分子实验室仅仅需要一个电泳实验即可完成，方便快捷且具有更广泛的适用性。
附图说明
图1：左右图分别为引物对CPS2-1F/CPS2-R、CPS2-2F/CPS2-R扩增效果。
图2：引物对CPS2-1F/CPS2-R(左)、CPS2-2F/CPS2-R(右)在F1群体的扩增效果。
图3：引物对CPS2-2F/CPS2-R、CPS2-1F/CPS2-R对47份烤烟的扩增结果。
图4引物对CPS2-2F/CPS2-R、CPS2-1F/CPS2-R对突变体材料的扩增结果。
图5引物对CPS2-2F/CPS2-R、CPS2-1F/CPS2-R对突变体株系TBT6相关分离群体的扩增结果。
图6表型鉴定结果。(注：a，b，c，d，e，f，g分别代表5(大白筋599)，55(革新三号)，47(NC2326)，TBT6，红花大金元，K326，中烟100的色谱图，图中红色箭头所指位置即为冷杉醇的峰位置；h是冷杉醇的离子碎片图谱。)
具体实施方式：
检测烟草NtCPS2基因单核苷酸突变的特异引物，包括两对引物，两个上游引物和一个公用下游引物，引物序列如下所示：
上游引物CPS2-1F(5’-3’)：ACAGATGAAAGGTTTGATAG
上游引物CPS2-2F(5’-3’)：ACAGATGAAAGGTTTGATAT
下游引物CPS2-R(5’-3’)：TCTCTTATGAAGGCACGTGT
本发明第二目的为提供一种烟草是否含有冷杉醇的检测方法，包括以下步骤：
S1，根据烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的第四号外显子cDNA序列。基于AS-PCR原理，在SNP突变处设计两个上游引物，使引物的3’末端核苷酸与SNP位点一致，同时在引物3’末端倒数第三位引入错配碱基T，在第四号外显子末端设计一个公用的下游引物，这样构成的两对引物形成互补引物，能够相互检测SNP的类型，同时也能够检测后代为杂合体或纯合体。
NtCPS2的第四号外显子序列：
GTAAGCAGAACAATACAGATGAAAGGTTTGACAGAAGAGATCAAACACATGTTGAATTCGATGGAGGATGGAAGGTTAAATGTCTTAGCCTATGACACAGCTTGGGTTTCCTTTATTCCAAATACTACTAATAATGGAAATGATCAAAGACCTATGTTTCCATCTTGTCTTCAATGGATTATAGACAATCAACTTTCTGATGGTTCATGGGGAGAGGAGATTGTATTCTGCATATATGATCGACTCTTGAACACACTAGTATGTGTTATTGCATTGACATTATGGAACACGTGCCTTCAT AAGAGAAACAA
在上述基因序列中，前面划下划线的序列即为两个上游引物CPS2-1F和CPS2-2F；后面划下划线的序列即为下游引物CPS2-R。红色字体为SNP位点和错配碱基。
S2，提取被检测烟草品种的DNA；
S3，以所述被检测烟草品种的DNA为模板，使用所述NtCPS2基因特异性引物对所述被检测烟草品种的DNA进行PCR扩增；
S4，采用电泳检测PCR扩增产物，判断所述PCR扩增产物是否含有292bp的特征条带，如果引物对CPS2-1F/CPS2-R有条带，而引物对CPS2-2F/CPS2-R无条带，则所述被检测烟草品种为正常纯合型G，有冷杉醇合成；反之，则所述被检测烟草品种为突变纯合型T，不合成冷杉醇；如果这两对引物都有扩增条带，则说明检测品种为杂合型。
优选的，所述PCR扩增的反应体系组成为：2×Dreamtaq MIX 10uL，模板DNA 1ul，上游引物1uL，下游引物1uL，最后用双蒸水将反应体系补至20uL。
优选的，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；退火温度52℃(引物对CPS2-1F/CPS2-R)或48℃(引物对CPS2-2F/CPS2-R)30s；72℃延伸30s；共35个循环，最后72℃ 7min停止反应。
图1为本发明实施例一中，特异引物对CPS2-1F/CPS2-R和CPS2-2F/CPS2-R在合成冷杉醇的雪茄烟Beinhart 1000-1、香料烟Samsun、Komotini Basma以及不产生冷杉醇的烤烟小黄金1025、Speight G-28、Hicks(Broad Leaf)中的扩增结果，详见表1，其中，M：DL1000Marker；
表1：用作PCR扩增模板的烟草品种类型
以下结合附图对本发明进行详细说明：
实施例一中，特异引物对CPS2-1F/CPS2-R和CPS2-2F/CPS2-R检测合成冷杉醇的雪茄烟Beinhart 1000-1、香料烟Samsun、Komotini Basma以及不产生冷杉醇的烤烟小黄金1025、Speight G-28、Hicks(Broad Leaf)的SNP类型。步骤如下：
(1)根据烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的第四号外显子上cDNA序列。在SNP的突变处设计两个上游引物，使引物的3’末端核苷酸与SNP位点一致，同时在引物3’末端倒数第三位人工引入错配碱基T，在第四号外显子末端设计一个公用的下游引物，这样构成的两对引物形成互补引物。引物序列如下：
上游引物CPS2-1F(5’-3’)：ACAGATGAAAGGTTTGATAG
上游引物CPS2-2F(5’-3’)：ACAGATGAAAGGTTTGATAT
下游引物CPS2-R(5’-3’)：TCTCTTATGAAGGCACGTGT
(2)DNA提取：样品不受烟株生长发育时期的影响，具体取样时间可以根据试验要求安排。CTAB法提取DNA。
(3)PCR反应：以上述材料DNA为模板，利用引物对CPS2-1F/CPS2-R和CPS2-2F/CPS2-R进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系组成为：2×Dreamtaq MIX 10uL，模板DNA 1ul，上游引物1uL，下游引物1uL，最后用双蒸水将反应体系补至20uL。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；退火温度52℃(引物对CPS2-1F/CPS2-R)或48℃(引物对CPS2-2F/CPS2-R)30s；72℃延伸30s；共35个循环，最后72℃ 7min停止反应。
(5)电泳检测：上述扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，其中，M：DL2000 Marker；材料编号见表1。从图1可以看出，检测结果与实际完全相符，说明本发明设计合成引物序列特异性较强。
实施例二：特异引物对CPS2-1F/CPS2-R和CPS2-2F/CPS2-R检测Samsun和SpeightG-28杂交F1群体，具体步骤方法同例一。电泳检测结果与实际相符，说明该引物对可以检测单株纯合型或杂合型，结果如图2所示。图2为本发明比较例二中，特异引物对CPS2-1F/CPS2-R和CPS2-2F/CPS2-R在Samsun和Speight G-28杂交F1群体扩增结果，其中，M：DL1000Marker。
实施例三：利用特异引物对CPS2-1F/CPS2-R和CPS2-2F/CPS2-R对46份主栽烤烟品种分型。具体步骤方法同例一。挑选引物对CPS2-1F/CPS2-R扩增有条带，同时引物对CPS2-2F/CPS2-R扩增无条带的种质，扩增其第四号外显子序列送去测序以保证该序列非插入突变而是SNP突变，然后利用(气质联用仪)GC-MS对冷杉醇的有无进行测定。结果在47份烤烟种植中筛选到三份烤烟品种大白筋599(5号)，革新三号(55号)和NC2326含有冷杉醇，红花大金元和K326无冷杉醇，并且基因型与表型相对应。如图3，图6所示。
实施例四：利用特异引物对CPS2-1F/CPS2-R和CPS2-2F/CPS2-R对不含冷杉醇且序列属于SNP突变的98份中烟100高香气EMS诱变突变体株系进行分型。具体步骤方法同例三。结果得到一个突变体株系TBT6含有冷杉醇，检测结果基因型与表型相对应。然后对这一株系相关分离群体进行分型，得到G/G纯合体6株，G/T杂合体16株，T/T纯合体4株，2株均无扩增条带(图4，图5，图6)。可直接选择G/G纯合体的6株材料留种，减少了杂合体的鉴定及干扰，每一次筛选即可缩短一个育种世代时间(烟草每一个育种世代6个月左右)，大大缩短了育种周期，提高了育种选择效率。

Claims (2)

1.一种检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的检测方法，包括以下步骤：
S1，根据烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的第四号外显子cDNA序列，基于AS-PCR原理，在SNP突变处设计两个上游引物，使引物的3′末端核苷酸与SNP位点一致，同时在引物3′末端倒数第三位人工引入错配碱基T，在第四号外显子末端设计一个公用的下游引物，这样构成的两对引物形成互补引物，能够相互检测SNP的类型，同时也能够检测后代为杂合体或纯合体；
两个上游引物CPS2-1F和CPS2-2F以及公用下游引物CPS2-R：
上游引物CPS2-1F 5′-3′：ACAGATGAAAGGTTTGATAG
上游引物CPS2-2F 5′-3′：ACAGATGAAAGGTTTGATAT
下游引物CPS2-R 5′-3′：TCTCTTATGAAGGCACGTGT；
NtCPS2的第四号外显子序列：
S2，提取被检测烟草品种的DNA；
S3，以被检测烟草品种的DNA为模板，使用NtCPS2基因特异性引物对被检测烟草品种的DNA进行PCR扩增；
S4，采用电泳检测PCR扩增产物，判断PCR扩增产物是否含有292bp的特征条带：
如果引物对CPS2-1F/CPS2-R有条带，而引物对CPS2-2F/CPS2-R无条带，则被检测烟草品种为正常纯合型G，有冷杉醇合成；
反之，则被检测烟草品种为突变纯合型T，不合成冷杉醇；
如果这两对引物都有扩增条带，则说明检测品种为杂合型。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系组成为：2×Dreamtaq MIX 10uL，模板DNA 1ul，上游引物1uL，下游引物1uL，最后用双蒸水将反应体系补至20uL。
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