CN101065481A - 烟草属核酸分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的特征是烟草属(Nicotiana)核酸序列诸如在烟草属植物中编码组成性，或乙烯或衰老诱导的多肽，特别是细胞色素p450酶的序列，以及使用这些核酸序列的方法，和例如通过使用育种方法改变理想性状的植物。

Description

烟草属核酸分子及其应用
本发明涉及在烟草属(Nicotiana)植物中的烟草属核酸序列诸如编码组成性，或乙烯或衰老诱导的多肽，特别是细胞色素p450酶(下文称为p450和p450酶)的序列，以及使用这些核酸序列改变植物表型的方法。
背景
在烟草成熟或熟化过程中，各种基因的表达被改变。这些基因可以影响涉及许多次级代谢物形成的代谢途径，所述次级代谢物包括类萜，多酚和影响终产物质量性状的生物碱。例如，在许多烟草属物种中，在植物衰老和在收获后或叶熟化阶段过程中，发生烟碱形成去甲烟碱的生物转化。烟碱是去甲烟碱的主要来源。去甲烟碱生物碱是微生物介导的亚硝化作用的底物，以在叶熟化或随后的叶贮存和处理过程中形成烟草特异性的亚硝胺(TSNA)N′-亚硝基去甲烟碱(NNN)。
在烟草成熟或熟化过程中表达的基因可以是组成性表达的、乙烯诱导或衰老相关的基因，例如编码细胞色素p450的基因。细胞色素p450s，例如催化广泛范围的在化学上不相似的底物的酶促反应，其包括内源性和异生底物的氧化、过氧化和还原代谢。在植物中，p450s参与生化途径，所述生化途径包括植物产物诸如所研究的phenylpropanoids，生物碱，类萜，脂质，氰苷和芥子油苷的合成(Chappell，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.46：521-547，1995)。细胞色素p450s，也已知为p450血红素-硫醇盐蛋白质，通常充当被称为包含p450的单氧化酶系统的多成分电子传递链中的末端氧化酶。由这些酶系统催化的具体反应包括脱甲基作用，羟基化作用，环氧化作用，N-氧化作用，硫代氧化作用，N-、S-、和O-脱烷基化，脱硫作用，脱氨作用和偶氮、硝基和N-氧化物基团的还原作用。
烟草属植物p450酶的多样作用涉及对多种植物代谢物的影响，所述植物代谢物诸如phenylpropanoids，生物碱，类萜，脂质，氰苷，芥子油苷和许多其它的化学实体。一些p450酶可以影响植物代谢物的组成。例如，长期以来，理想的是通过育种来改变植物的选定脂肪酸的模式从而改善某些植物的香味和香气；然而关于涉及控制这些叶组分的水平的机制知道的很少。与脂肪酸改变相关的p450酶的下调或上调可以促进需要的脂肪酸的积累，这提供了更为优选的叶表型的品质。
关于p450酶的功能和它们在植物组成中的更多作用仍旧在发现中。例如，发现一类特殊的p450酶催化脂肪酸分解为挥发性C6-和C9-醛和β-醇，其是水果和蔬菜的“鲜绿”气味的主要起作用的因素。可以改变其它新的目标p450s的水平，从而通过改变在烟草属叶中的脂质组成和相关的分解代谢物来提高叶子组分的品质。这些叶组分中的一些受到刺激叶品质成熟的衰老的影响。还有其它的报道显示p450s酶在改变脂肪酸中具有功能性作用，所述脂肪酸涉及植物-病原体相互作用和疾病抗性。
大量多样的p450酶形式，它们不同的结构和功能使得在本发明之前他们进行对烟草属p450酶的研究非常困难。此外，因为这些膜定位的蛋白质典型地以低丰度存在并且通常在纯化过程中是不稳定的，p450酶的克隆至少部分被阻碍。因此，存在鉴定植物中p450酶和与那些p450酶相关的核酸序列的需要。具体而言，烟草属中仅有一些细胞色素p450蛋白质已经进行了报道。本文所述发明基于它们的序列同一性，发现了对应于数类p450物种的细胞色素450s和细胞色素p450片段。
除了p450序列之外，本发明包括其它组成性和乙烯或衰老诱导的序列的发现，其解决了调节涉及次级代谢物形成的代谢途径的需要，所述次级代谢物影响烟草产品的品质。这些序列还用在植物生殖质的开发中，所述植物生殖质具有理想的性状以用于开发更理想的生殖质，尤其是非-GMO(遗传修饰的生物)类型的生殖质的育种程序中。
发明概述
本发明人已经鉴定和表征了组成性，及乙烯和衰老诱导的序列，包括来自烟草的烟碱脱甲基酶的基因组克隆。还在本文中描述的是，这些序列在育种方法和在产生具有理想性质的植物(例如，转基因植物)的方法中的应用，所述理想性质诸如相对于对照植物，去甲烟碱或N′-亚硝基去甲烟碱(″NNN″)或两者的改变的水平。
在一方面，本发明的特征是产生具有减少的烟碱脱甲基酶基因的表达的烟草植物的育种方法，所述方法包括下列步骤：(a)提供具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的第一烟草植物；(b)提供包含至少一个表型性状的第二烟草植物；(c)使所述第一烟草植物与所述第二烟草植物杂交以产生F1子代植物；(d)收集不同烟碱脱甲基酶基因的表达的F1子代的种子；和(e)萌发所述种子以产生具有减少的烟碱脱甲基酶基因的表达的烟草植物。
在一个实施方案中，使用本文所述的序列和本领域已知的标准方法将烟草植物鉴定为烟碱脱甲基酶基因表达的变体(例如，在转录、翻译后或翻译水平上或在酶活性水平上)。
在该育种方法的另一个实施方案中，所述第一烟草植物包含具有突变(例如，缺失、取代、点突变、易位、倒位、复制或插入)的内源烟碱脱甲基酶基因。在另一个实施方案中，所述第一烟草植物包含具有无效突变的烟碱脱甲基酶基因，包含使内源烟碱脱甲基酶基因沉默的重组基因，或包含具有减少的或改变的酶活性的烟碱脱甲基酶。在另一个实施方案中，第一烟草植物中的烟碱脱甲基酶基因不存在。在另一个实施方案中，所述第一烟草植物是转基因植物。
用在本文公开的育种方法中的示例性第一烟草植物包括Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotianabenthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotianagoodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotianamiersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotianapetunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotianarosulata，Nicotiana rotundifolia，黄花烟草(Nicotiana rustica)，Nicotianasetchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。理想地，所述第一烟草植物是Nicotianaamplexicaulis，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotianadebneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana glutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana knightiana，Nicotianamaritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana nudicaulis，Nicotianapaniculata，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，黄花烟草，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。其它第一烟草植物包括各种烟草(Nicotiana tabacum)(或黄花烟草)或与其相关的已经被改造而具有减少的水平的烟碱脱甲基酶的转基因品系。其它的示例性第一烟草植物包括东方型烟草(Oriential tobacco)、深色烟草(dark tobacco)、烟熏烟或晾烟(flue or air-cured tobacco)、弗吉尼亚烟(Virginia)或白莱烟烟草(Burleytobacco)植物。
在上述育种方法的另一个实施方案中，所述第二烟草植物是烟草(Nicotiana tabacum)。烟草(Nicotiana tabacum)的示例性的种类包括商业种类诸如BU 64，CC 101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K 394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，OXFORD 207，′波瑞克′烟草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RGH51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SPG-28，SP G-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 90，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。
在另一个实施方案中，所述第二烟草植物的表型性状包括疾病抗性；高产率；高级指标(high grade index)；可保存性(curability)；熟化质量；可机械收割性；保持能力；叶子质量；高度，植物成熟(例如，早期成熟，早期到中期成熟，中期成熟，中期到晚期成熟，或晚期成熟)；茎长(例如，短，中等的或长茎)；或每株植物的叶子数量(例如，少(例如5-10片叶子)，中等的(例如11-15片叶子)，或多(例如16-21片叶子)。在另一个实施方案中，该方法还包括自花传粉或用步骤(b)的植物给能够用在产生杂种或雄性不育杂种中的雄性不育花粉受体，花粉供体传粉或使产生自步骤(e)的萌发的种子的植物回交或自花传粉。
在另一个方面，本发明的特征是将烟碱脱甲基酶缺陷性状培育到烟草植物中的方法，所述方法包括下列步骤：a)使具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的第一烟草植物与第二烟草植物杂交；b)产生杂交的子代烟草植物；c)从子代烟草植物中提取DNA样品；d)使DNA样品与标记核酸分子接触，所述标记核酸分子与烟碱脱甲基酶基因或其片段杂交；和e)进行用于不同烟碱脱甲基酶基因表达性状的标记辅助的育种方法。例如，将植物鉴定为具有不同的烟碱脱甲基酶的基因表达，并且如果需要，进一步测试烟碱脱甲基酶的基因表达或使用标准的生物碱图谱或免疫印迹分析进行测试。典型地，这样的标记辅助的育种方法包括使用扩增片段长度多态性，限制性片段长度多态性，随机扩增多态性展示，单核苷酸多态性，微卫星标记，或在烟草基因组中的靶向诱导的局部病灶。
在另一个方面，本发明的特征是产生烟草种子的方法，包括将选自由下列各项组成的组的任何一种烟草植物与其本身进行杂交：Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotianabenthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotianagoodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotianamiersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotianapetunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotianarosulata，Nicotiana rotundifolia，黄花烟草，Nicotiana setchelli，Nicotianastocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotianatrigonophylla。在一个实施方案中，所述方法还包括制备杂种烟草种子的方法，所述方法包括将具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的烟草植物与第二种，独特的烟草植物进行杂交。在该方法的另一个实施方案中，所述杂交包括下列步骤：(a)种植种子，所述种子来自具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的烟草植物和第二种，独特的烟草植物的杂交；(b)从种子种植烟草植物直到植物开花；(c)用来自第二烟草植物的花粉给具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的烟草植物的花进行传粉或用来自具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的烟草植物的花粉给所述第二烟草植物的花进行传粉；和(d)收获得自所述传粉的种子。
在另一个方面，本发明的特征是在烟草育种程序中开发烟草植物的方法，其包括：(a)提供具有不同的烟碱脱甲基酶基因表达的烟草植物，或其组分；和(b)将所述植物或植物组分作为使用烟草植物育种技术的育种原料的来源。用于进行该方法的示例性植物育种技术包括集团选择，回交，自花传粉，渐渗现象，谱系选择，纯系选择，单倍体/二倍体育种，或单种谱系(single seed descent)。
在另一个方面，本发明的特征是用于产生具有改变的特性的烟草植物的育种方法，所述方法包括下列步骤：(a)提供具有改变的特性的第一烟草植物，其包含核酸分子的不同的基因表达，所述核酸分子选自由下列各项组成的组中：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列；(b)提供包含至少一种表型性状的第二烟草植物；(c)使所述第一烟草植物与第二烟草植物杂交以产生F1子代植物；(d)收集具有改变的特性的F1子代的种子；和(e)使种子萌发以产生具有改变的特性的烟草植物。在一个实施方案中，所述第一烟草植物包含内源核酸分子，其选自由下列各项组成的组：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列，其中所述核酸包括突变。示例性突变包括缺失、取代、点突变、易位、倒位、复制或插入。
在另一个实施方案中，上述方法的第一烟草植物包含内源核酸分子，所述内源核酸分子选自由下列各项组成的组：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列，其中所述核酸包含无效突变。在另一个实施方案中，所述第一烟草植物包含重组基因，所述重组基因使内源核酸分子，选自由下列各项组成的组的内源核酸分子：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列的表达沉默。
如果需要，所述第一烟草植物包含内源核酸分子，所述内源核酸分子选自由下列各项组成的组：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列，其中所述核酸分子编码具有减少的或改变的酶活性的多肽。在另一个实施方案中，第一烟草植物是转基因植物。
用在本文公开的育种方法的示例性第一烟草植物包括Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotianaexcelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotianaknightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana miersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotianaotophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotiana petunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotiana rosulata，Nicotianarotundifolia，黄花烟草，Nicotiana setchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。其它第一烟草植物包括各种烟草(Nicotiana tabacum)或黄花烟草。其它的第一烟草植物是东方型烟草、深色烟草、烟熏烟或晾烟、弗吉尼亚烟或白莱烟烟草植物。
在上述育种方法的另一个实施方案中，所述第二烟草植物是烟草(Nicotiana tabacum)。烟草的示例性种类包括商业种类诸如BU 64，CC 101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K 394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，OXFORD 207，′波瑞克′烟草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SP G-28，SP G-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 90，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。
在另一个实施方案中，所述第二烟草植物的表型性状包括疾病抗性；高产率；高级指标；可保存性；熟化质量；可机械收割性；保持能力；叶子质量；高度，植物成熟(例如，早期成熟，早期到中期成熟，中期成熟，中期到晚期成熟，或晚期成熟)；茎长(例如，短，中等的或长茎)；或每株植物的叶子数量(例如，少(例如5-10片叶子)，中等的(例如11-15片叶子)，或多(例如16-21片叶子)。
在另一个实施方案中，所述方法包括用步骤(b)的植物给雄性不育或雄性不育杂种传粉或使产生自步骤(e)的萌发的种子的植物回交或给其传粉。在另一个方面，本发明的特征是将某种特性培育到烟草植物中的方法，所述方法包括下列步骤：a)使第一烟草植物与第二烟草植物进行杂交，所述第一烟草植物具有改变的特性，其包含选自由在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组的核酸分子的不同的基因表达；b)产生杂交的子代烟草植物；c)从子代烟草植物中提取DNA样品；d)使DNA样品与标记核酸分子接触，所述标记核酸分子与选自由下列各项组成的组的核酸分子杂交：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列或其片段；和e)进行改变的特性的标记辅助的育种方法。典型地，这样的标记辅助育种方法包括使用扩增片段长度多态性，限制性片段长度多态性，随机扩增多态性展示，单核苷酸多态性，微卫星标记，或在烟草基因组中的靶向诱导的局部病灶。
在另一个方面中，本发明的特征是产生烟草种子的方法，其包括使得选自由Nicotiana africana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotianaglutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotianamegalosiphon，Nicotiana miersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotianapaniculata，Nicotiana petunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotianarepanda，Nicotiana rosulata，Nicotiana rotundifolia，黄花烟草，Nicotianasetchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla组成的组的任一种植物，具有改变的特性的烟草植物到第二种，独特的烟草植物进行杂交，所述改变的特性包括选自由在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组的核酸分子的不同的基因表达。
在另一个实施方案中，杂交包括下列步骤：(a)种植种子，所述种子来自具有改变的特性的烟草植物和第二种，独特的烟草植物的杂交；(b)从种子种植烟草植物直到植物开花；(c)用来自第二烟草植物的花粉给具有改变的特性的烟草植物的花进行传粉或用来自具有改变的特性的烟草植物的花粉给所述第二烟草植物的花进行传粉；和(d)收获得自所述传粉的种子。
在另一个方面中，本发明的特征是在烟草育种程序中培育烟草植物的方法，其包括：(a)提供具有改变的特性的烟草植物，或其组分，所述改变的特性包括选自由在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组的核酸分子的不同的基因表达；和(b)将所述植物或植物组分作为使用烟草植物育种技术的育种原料的来源。示例性植物育种技术包括集团选择，回交，自花传粉，渐渗现象，谱系选择，纯系选择，单倍体/二倍体育种，或单种谱系(single seeddescent)。
在相关方面中，本发明的特征是按照上述育种方法的任一种产生的烟草植物或其组分。在另一个相关方面，本发明的特征是可再生的烟草细胞的组织培养物，所述烟草细胞获自按照本文所述方法培育或产生的植物的任一种。这些组织培养物再生出这样的烟草植物，所述烟草植物能够表达具有不同的烟碱脱甲基酶基因表达或改变的特性的烟草植物的所有生理和形态特征。示例性可再生的细胞是胚、分生细胞、种子、花粉、叶、根、根端、或花或是来自其中的原生质体或胼胝体。
在另一个相关方面，本发明的特征是产生烟草产品的方法，包括：(a)按照前述育种方法的任一种产生烟草植物；和(b)从烟草植物中制备烟草产品。示例性烟草产品包括叶子或茎或两者；无烟烟草产品；湿或干鼻烟(snuff)；嚼烟(chewing tobaccos)；卷烟(cigarette products)；雪茄烟(cigarproducts)；小雪茄烟(cigarillos)；pipe tobacco或bidis。
本发明的另一个方面的特征是分离的遗传标记，其包括与在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列基本上相同，理想地至少70％相同的核酸序列。在本发明的该方面的理想实施方案中，所述核酸序列包含这样的序列，所述序列在严格条件下与在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列的互补序列杂交。在其它的理想实施方案中，所述核酸序列是组成性的，或乙烯或衰老诱导的。此外，所述核酸序列理想地编码与在图1，图3和4，图10-158，图160A-160E，图162到170和图172-1到172-19中显示的氨基酸序列基本上相同的多肽。
在本发明的其它理想实施方案中，所述核酸序列与异源基因可操纵地连接或所述核酸序列与可诱导的、组成性的、病原体或创伤诱导的、环境或发育调节的或细胞-或组织-特异性的启动子可操纵地连接。
在另一个方面，本发明的特征是包含在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列的表达载体，其中所述载体能够指导由所述核酸序列编码的多肽的表达。
本发明的另一个方面的特征是包含在图1，图3和4，图10-158，图160A-160E，图162到170或图172-1到172-19中显示的多肽的氨基酸序列的基本纯的多肽，以及特异性识别所述多肽的抗体。
本发明的另一个方面的特征是包含在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的分离的核酸序列的植物或植物组分，其中所述核酸序列在植物或植物组分中表达，或编码多肽的核酸序列，所述多肽与在图1，图3和4，图10-158，图160A-160E，图162到170或图172-1到172-19中显示的氨基酸序列基本上相同，其中所述核酸序列在植物或植物组分中表达。理想地，所述植物或植物组分是烟草属物种，例如在表8中显示的烟草属物种。在其它理想的实施方案中，所述植物组分是叶，例如加工处理的(cured)烟草叶，茎或种子。理想的实施方案的特征是来自萌发的种子的植物。
在另一个方面，本发明的特征是包含植物或植物组分的烟草产品，所述植物或植物组分包含在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的分离的核酸序列，其中所述核酸序列在植物或植物组分中进行表达。理想地，将内源基因在加工处理的烟草植物或植物组分中的表达沉默。在其它理想的实施方案中，所述烟草产品是无烟烟草产品，湿或干的鼻烟，嚼烟，卷烟，雪茄烟，小雪茄烟，pipetobaccos或bidis。具体而言，本发明的该方面的烟草产品可以包含深色烟草，研磨过的烟草，或包含加香成分。
本发明的另一个方面的特征是在植物细胞中减少组成性，或乙烯诱导的或衰老诱导的烟草多肽的表达或酶活性的方法。该方法包括减少植物细胞中内源组成性的或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平或酶活性。在理想的实施方案中，所述烟草多肽是p450。在其它理想的实施方案中，所述植物细胞来自烟草属物种，例如在表8中显示的烟草属物种的其中之一。
在另一个理想的实施方案中，减少内源组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平包括在植物细胞中表达转基因，所述转基因编码在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列或编码包含在图1，图3和4，图10-158，图160A-160E，图162-170和图172-1到172-19中显示的氨基酸序列的多肽的核酸序列的反义核酸分子。在另一个理想的实施方案中，所述转基因在植物细胞中编码组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草核酸或氨基酸序列的双链RNA分子。在其它理想的实施方案中，所述转基因以，例如组织特异性，细胞特异性，或器官特异性方式进行表达。此外，减少内源组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平理想地包括在植物细胞中共抑制组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽。在另一个理想的实施方案中，减少内源组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平包括在植物细胞中表达显性负调控的基因产物。理想地，所述内源组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽包括基因中的突变，所述基因编码在图1，图3和4，图10到158，图160A到160E，图162-170和图172-1到172-19中显示的氨基酸序列。在其它的理想实施方案中，减少的表达发生在转录水平，翻译水平或在翻译后水平。
本发明的另一个方面的特征是在植物细胞中增加组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的表达或酶活性的方法。该方法包括在植物细胞中增加内源组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平或酶活性。在本发明的该方面的理想实施方案中，所述植物细胞来自烟草属物种，例如在表8中显示的烟草属物种。在另一个理想的实施方案中，增加组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平包括在植物细胞中表达转基因，所述转基因包括在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列或编码包含在图1，图3和4，图10-158，图160A-160E，图162-170和图172-1到172-19中显示的氨基酸序列的多肽的核酸序列。理想地，增加的表达发生在转录水平，翻译水平或在翻译后水平。
本发明的另一个方面的特征是产生组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的方法。该方法包括下列步骤：(a)提供用包含在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列的分离的核酸分子转化的细胞；(b)在表达所述分离的核酸分子的条件下培养所述转化的细胞；和(c)回收所述组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽。理想地，所述组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽是p450。在另一个理想的实施方案中，本发明的特征是按照本发明的该方面的方法产生的重组的组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽。
在另一个方面中，本发明的特征是分离组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽或其片段的方法。该方法包括下列步骤：(a)使在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列或其部分与制备自植物细胞的核酸制备物在严格杂交条件下接触，所述杂交条件提供与在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列具有至少70％或更大的序列同一性的核酸序列的检测；和(b)分离杂交的核酸序列。理想地，所述组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽是p450。
本发明另一个方面的特征是包含编码烟碱脱甲基酶的核苷酸序列的分离的核酸分子，例如DNA序列。在理想的实施方案中，第一方面的核苷酸序列基本上与编码烟草烟碱脱甲基酶的核苷酸序列相同，所述烟草烟碱脱甲基酶诸如这样的烟草烟碱脱甲基酶，其包含与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的核苷酸序列至少70％同一性的核苷酸序列，或包含SEQ IDNO：4的核苷酸2010-2949和/或3947-4562，或包含SEQ ID NO：4或SEQID NO：5的序列。本发明的第一个方面的分离的核酸分子，例如与在植物细胞中有功能的启动子可操纵地连接，并且理想地包含在表达载体内。在其它理想的实施方案中，表达载体被包含在细胞，例如植物细胞中。理想地，所述植物细胞，诸如烟草植物细胞包括在植物中。在另一个理想的实施方案中，本发明的特征是来自包含表达载体的植物的种子，例如烟草种子，其中所述种子包含分离的核酸分子，所述核酸分子在严格杂交条件下与SEQ ID NO：4的序列杂交，其与异源启动子序列可操纵地连接。此外，本发明的特征是来自包含表达载体的萌发的种子的植物，来自所述植物的绿色或加工处理的叶子，和制备自所述叶子的制品。
在另一个理想的实施方案中，所述核苷酸序列包含这样的序列，其在严格杂交条件下与SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5的核苷酸序列的互补序列，或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的片段杂交。理想地，所述核苷酸序列编码烟碱脱甲基酶，其与SEQ ID NO：3的氨基酸序列基本上相同。在本发明的第一个方面的另一个理想的实施方案中，所述烟碱脱甲基酶与SEQ ID NO：3的烟碱脱甲基酶氨基酸序列或烟碱脱甲基酶的片段具有至少70％的氨基酸序列同一性，所述烟碱脱甲基酶的片段与全长多肽相比具有改变(例如，减少)的酶活性。理想地，所述烟碱脱甲基酶包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征是分离的核酸分子，其包含这样的启动子，所述启动子在严格条件下杂交于SEQ ID NO：8的序列，或驱动转录的其片段。理想地，所述启动子(i)在用乙烯处理后或在衰老过程中被诱导；并且(ii)包括(a)SEQ ID NO：4的碱基对1-2009，或(b)至少200个连续的碱基对，其与由SEQ ID NO：4的碱基对1-2009限定的200个连续的碱基对的序列相同，或(c)20个碱基对核苷酸部分，其在序列上与在SEQ ID NO：4的碱基对1-2009中提出的20个连续碱基对部分的序列相同。
本发明的另一个方面的特征是分离的核酸启动子，其包含与SEQ IDNO：8的序列具有50％或更多的序列同一性的核苷酸序列。理想地，该分离的核酸启动子在用乙烯处理后，或在衰老过程中被诱导，并且例如包含SEQ ID NO：8的序列。备选地，所述启动子可以包含可从SEQ ID NO：8中获得的片段，其中所述片段驱动异源基因的转录或减少或改变烟碱脱甲基酶活性(例如，使基因表达沉默)。在理想的实施方案中，所述启动子序列与异源核酸序列可操纵地连接，并且可以例如被包含在表达载体中。在其它理想的实施方案中，所述表达载体被包含在细胞，例如植物细胞中。理想地，植物细胞，诸如烟草植物细胞，被包含在植物中。在另一个理想的实施方案中，本发明的特征是来自包含表达载体的植物的种子，例如烟草种子，其中所述种子包含分离的核酸分子，其在严格条件下，杂交于SEQID NO：8的序列，其与异源核酸序列可操纵地连接。此外，本发明的特征是来自包含本发明的该方面的启动子的萌发种子的植物，来自所述植物的绿色或加工处理的叶子，和由所述叶子制成的制品。
本发明的另一个方面的特征是在植物中表达异源基因的方法。该方法包括(i)将包含启动子序列的载体引入植物细胞，所述启动子序列与SEQ IDNO：8的序列具有50％或更多的序列同一性，其与异源核酸序列可操纵地连接；和(ii)从所述细胞中再生植物。此外，该方法可以包括将载体性传递到子代，并且进一步可以包括收集从子代中产生的种子的步骤。
在另一个方面，本发明的特征是在烟草植物中减少烟碱脱甲基酶的表达的方法。该方法包括下列步骤：(i)将包含SEQ ID NO：8的序列或可从SEQ ID NO：8获得的片段的载体引入烟草植物中，所述SEQ ID NO：8的序列或可从SEQ ID NO：8获得的片段与异源核酸序列可操纵地连接和(ii)在烟草植物中表达所述载体。在该方法的理想实施方案中，烟碱脱甲基酶的表达被沉默。在其它理想的实施方案中，所述载体表达RNA，诸如反义RNA或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子。
在另一个理想的方面中，本发明的特征是包含这样的内含子的分离的核酸分子，所述内含子在严格条件下杂交于SEQ ID NO：7的序列或其片段，SEQ ID NO：7的序列或其片段减少或改变烟碱脱甲基酶的酶活性(例如，沉默基因表达)或可以充当分子标记以鉴定烟碱脱甲基酶核酸序列。在理想的实施方案中，内含子包含(a)SEQ ID NO：4的碱基对2950-3946，或(b)至少200个连续的碱基对，其与SEQ ID NO：4的碱基对2950-3946所定义的200个连续的碱基对的序列相同，或(c)20个碱基对核苷酸部分，其在序列上与在SEQ ID NO：4的碱基对2950-3946中提出的20个连续的碱基对部分的序列相同。
本发明的另一个理想的方面的特征是分离的核酸内含子，所述内含子包括与SEQ ID NO：7的序列或其片段具有50％或更多序列同一性的核苷酸序列，所述SEQ ID NO：7的序列或其片段减少或改变烟碱脱甲基酶的酶活性(例如，沉默基因表达)或可以充当分子标记以鉴定烟碱脱甲基酶核酸序列。使基因表达沉默，可以例如，包括导致不具有烟碱脱甲基酶活性的基因产物的同源重组(例如使用SEQ ID NO：188的序列或其片段)或突变。具体而言，所述内含子可以包含SEQ ID NO：7的序列或可以从SEQ ID NO：7获得的片段。理想地，包含内含子的分离的核酸分子与异源核酸序列可操纵地连接并且该序列理想地被包含在表达载体中。在另一个实施方案中，所述表达载体被包含在细胞，诸如植物细胞中。具体而言，所述细胞可以是烟草细胞。包含这样的植物细胞的植物，例如烟草植物是本发明的另一个理想的实施方案，所述植物细胞包含SEQ ID NO：7的序列或可从SEQ ID NO：7获得的片段，其在表达载体中与异源核酸序列可操纵地连接。另外，来自植物的种子，例如烟草种子也是理想的，其中所述种子包含内含子，所述内含子在严格条件下杂交于与异源核酸序列可操纵地连接的SEQ ID NO：7。此外，本发明的特征是来自包含本发明的该方面的内含子的萌发的种子的植物，来自所述植物的绿色或加工处理的叶子，和从所述绿色或加工处理的叶子制成的制品。
本发明的另一个方面的特征是在植物中表达内含子的方法。该方法包括(i)将表达载体引入植物细胞，所述表达载体包含SEQ ID NO：7的序列或可从SEQ ID NO：7获得的片段，其与异源核酸序列可操纵地连接；和(ii)从细胞中再生植物。在理想的实施方案中，该方法还包括(iii)将载体性传递到子代，并可以包括收集由子代产生的种子的另外的步骤。所述方法理想地包括，例如从萌发的种子再生植物，和来自所述植物的绿色或加工处理的叶子，和从所述叶子制备制品的方法。
在另一个方面中，本发明的特征是减少烟草植物中烟碱脱甲基酶的表达的方法。该方法包括下列步骤：(i)将载体引入烟草植物，所述载体包含SEQ ID NO：7的序列或可从SEQ ID NO：7获得的片段，所述SEQ ID NO：7或可从SEQ ID NO：7获得的片段可操纵地与异源核酸序列连接和(ii)在烟草植物中表达所述载体。在该方法的理想实施方案中，使烟碱脱甲基酶的表达被沉默。在其它理想的实施方案中，所述载体表达RNA，诸如反义RNA或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子。
在另一个方面，本发明的特征是包含非翻译区的分离的核酸分子，所述非翻译区在严格条件下杂交于SEQ ID NO：9的序列或其片段，其可以改变基因的表达模式，减少或改变烟碱脱甲基酶酶活性(例如，使基因表达沉默)，或可以用作标记来鉴定烟碱脱甲基酶核酸序列。在本发明该方面的理想实施方案中，非翻译区包括(a)SEQ ID NO：4的碱基对4563-6347，或(b)至少200个连续的碱基对，其与SEQ ID NO：4的碱基对4563-6347所限定的序列的200个连续的碱基对相同，或(c)20个碱基对核苷酸部分，其在序列上与SEQ ID NO：4的碱基对4563-6347中提出的序列的20个连续的碱基对部分相同。
本发明的另一个理想的方面的特征是分离的核酸非翻译区，所述核酸非翻译区包含这样的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：9的序列具有50％或更多的序列同一性。理想地，所述非翻译区包含SEQ ID NO：9的序列或所述非翻译区包括可从SEQ ID NO：9获得的片段，其可以改变基因的表达模式，减少或改变烟碱脱甲基酶的酶活性(例如，使基因表达沉默)，或可以用作标记来鉴定烟碱脱甲基酶核酸序列。所述非翻译区理想地与异源核酸序列可操纵地连接并且可以包含在表达载体中。此外，该表达载体理想地包含在细胞，诸如植物细胞，例如烟草细胞中。本发明的另一个理想的实施方案的特征是包含植物细胞的植物，诸如烟草植物，所述植物细胞包含包括分离的核酸序列的载体，所述分离的核酸序列与SEQ ID NO：9的序列具有50％或更多的序列同一性并且与异源核酸序列可操纵地连接。
本发明的特征还在于来自植物的种子，例如烟草种子，其中所述种子包含非翻译区，所述非翻译区在严格条件下杂交于SEQ ID NO：9，其与异源核酸序列可操纵地连接。此外，本发明的特征是来自包含本发明的该方面的非翻译区的萌发的种子的植物，来自所述植物的绿色或加工处理的叶子，和由绿色或加工处理的叶子制成的制品。
在另一个方面，本发明的特征是在植物中表达非翻译区的方法。该方法包括(i)将载体引入植物细胞，所述载体包含这样的分离的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO：9的序列具有50％或更多的序列同一性，并且与异源核酸序列可操纵地连接；和(ii)从所述细胞中再生植物。此外，该方法还可以包括(iii)将载体性传递到子代，并且理想地，包括收集由子代产生的种子的另外的步骤。该方法理想地包括从萌发的种子再生植物，从所述植物再生绿色或加工处理的叶子，和从绿色或加工处理的叶子制备制品的方法。
此外，本发明的特征是在烟草植物中减少烟碱脱甲基酶的表达或改变烟碱脱甲基酶的酶活性的方法。该方法包括下列步骤：(i)将载体引入烟草植物中，所述载体包含这样的分离的核酸序列，所述分离的核酸序列与SEQ ID NO：9的序列具有50％或更多的序列同一性并且与异源核酸序列可操纵地连接和(ii)在烟草植物中表达载体。理想地，烟碱脱甲基酶的表达被沉默。在其它理想的实施方案中，载体表达RNA，例如反义RNA或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子。
本发明的另一个方面的特征是表达载体，所述表达载体包括包含编码烟碱脱甲基酶的核苷酸序列的核酸分子，其中所述载体能够指导由分离的核酸分子编码的烟碱脱甲基酶的表达。理想地，所述载体包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的序列。在其它理想的实施方案中，本发明的特征是植物或植物组分，例如烟草植物或植物组分(例如，烟草叶子或茎)，其包含核酸分子，所述核酸分子包含编码使烟碱脱甲基的多肽的核苷酸序列。
本发明的另一个方面的特征是包含分离的核酸分子的细胞，所述分离的核酸分子包括编码烟碱脱甲基酶的核苷酸序列。理想地，该细胞是植物细胞或细菌细胞，诸如土壤杆菌属(Agrobacterium)。
本发明的另一个方面的特征是植物或植物组分(例如烟草叶子或茎)，其包含编码烟碱脱甲基酶的分离的核酸分子，其中所述核酸分子在植物或植物组分中进行表达。理想地，所述植物或植物组分是被子植物、双子叶植物、茄科植物或烟草属物种。该方面的其它理想的实施方案是来自所述植物或植物组分的种子或细胞，以及来自所述植物的绿色或加工处理的叶子和由其制备的制品。
在另外的方面中，本发明的特征是烟草植物，其具有编码多肽的核酸序列的减少的表达，所述多肽例如包括SEQ ID NO：3的序列并且使烟碱脱甲基的多肽，其中所述减少的表达(或酶活性的减少)减少植物中去甲烟碱的水平。在理想的实施方案中，所述烟草植物是转基因植物，诸如包括转基因的植物，当所述转基因在转基因植物中进行表达时，使内源烟草烟碱脱甲基酶的基因表达沉默。
具体而言，所述转基因植物理想地包括下列各项中的一个或多个：表达烟草烟碱脱甲基酶的反义分子或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子的转基因；当在转基因植物中表达时，共抑制烟草烟碱脱甲基酶的表达的转基因；编码显性失活(dominant negative)基因产物，例如SEQ ID NO：3的氨基酸序列的突变形式的转基因；在编码SEQ ID NO：3的氨基酸序列的基因中的点突变；在编码烟草烟碱脱甲基酶的基因中的缺失；和在编码烟草烟碱脱甲基酶的基因中的插入。
在其它理想的实施方案中，编码多肽的核酸序列的减少的表达在转录水平、在翻译水平或在翻译后水平发生。
本发明的另一个方面的特征是烟草植物，所述烟草植物包含被稳定整合到其基因组中的重组表达盒，其中所述盒能够实现烟碱脱甲基酶活性的减少。该烟草植物的种子是理想的实施方案中的特征。其它的理想的实施方案包括来自该植物的绿色或加工处理的叶子和由其制备的制品。
本发明的另一个方面的特征是在植物中表达烟草烟碱脱甲基酶的方法。该方法包括(i)将表达载体引入植物细胞中，所述表达载体包括包含编码烟碱脱甲基酶的核苷酸序列的核酸分子；和(ii)从所述细胞中再生植物。在理想的实施方案中，该方法的特征是将载体性传递到子代，并且理想地还包括收集由子代产生的种子的另外的步骤。另外的理想的实施方案包括来自萌发的种子的植物，来自所述植物的绿色或加工处理的叶子，或由所述绿色或加工处理的叶子制备的制品。
本发明的另一个方面的特征是基本纯的烟草烟碱脱甲基酶。理想地，该烟草烟碱脱甲基酶包括与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列或包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在理想的实施方案中，所述烟草烟碱脱甲基酶，在植物细胞中表达后，将烟碱转化为去甲烟碱。在其它理想的实施方案中，所述烟草烟碱脱甲基酶，在植物细胞中表达后，被主要定位在叶子中，或所述烟草烟碱脱甲基酶由乙烯诱导或在植物衰老的过程中进行表达。
在另一个方面，本发明的特征是基本纯的抗体，其特异性地识别并且结合烟草烟碱脱甲基酶。理想地，所述抗体识别并且结合重组烟草烟碱脱甲基酶，例如包含SEQ ID NO：3的序列或其片段的重组烟草烟碱脱甲基酶。
本发明的另一个方面的特征是产生烟草烟碱脱甲基酶的方法。该方法包括下列步骤：(a)提供被用分离的核酸分子转化的细胞，所述分离的核酸分子包含编码使烟碱脱甲基的多肽的核苷酸序列；(b)在表达所述分离的核酸分子的条件下培养所述转化的细胞；和(c)回收所述烟草烟碱脱甲基酶。本发明的特征还在于按照该方法产生的重组烟草烟碱脱甲基酶。
在另一个方面，本发明的特征是分离烟草烟碱脱甲基酶或其片段的方法。该方法包括下列步骤：(a)使SEQ ID NOS：4，5，7，8，或9的核酸分子或其部分与来自植物细胞的核酸制备物在这样的杂交条件下进行接触，所述杂交条件提供核酸序列的检测，所述核酸序列与SEQ ID NOS：4，5，7，8，或9的核酸序列具有至少70％或更大的序列同一性；和(b)分离所述杂交的核酸序列。
在另一个方面，本发明的特征是分离烟草烟碱脱甲基酶或其片段的另一种方法。该方法包括下列步骤：(a)提供植物细胞DNA的样品；(b)提供寡核苷酸对，其与具有SEQ ID NOS：4，5，7，8，或9的序列的核酸分子的区域具有序列同一性；(c)使所述寡核苷酸对与植物细胞DNA在这样的条件下进行接触，所述条件适合于聚合酶链反应介导的DNA扩增；和(d)分离所述扩增的烟草烟碱脱甲基酶或其片段。在该方面的理想的实施方案中，使用制备自植物细胞的cDNA的样品进行扩增步骤。在另一个理想的实施方案中，所述烟草烟碱脱甲基酶编码多肽，所述多肽与SEQ IDNO：3的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
本发明的另一个方面的特征是在植物或植物组分中减少烟草烟碱脱甲基酶的表达的方法。该方法包括下列步骤：(a)将编码烟草烟碱脱甲基酶的转基因引入植物细胞中以产生转化的植物细胞，所述转基因与在植物细胞中有功能的启动子可操纵地连接；和(b)从转化的植物细胞中再生植物或植物组分，其中所述烟草烟碱脱甲基酶在植物或植物组分的细胞中进行表达，由此在植物或植物组分中减少烟草烟碱脱甲基酶的表达。在本发明的该方面的具体实施方案中，将编码烟草烟碱脱甲基酶的转基因例如，以组织特异性，细胞特异性或器官特异性方式，组成性地表达或诱导性地进行表达。在本发明的该方面的另一个实施方案中，转基因的表达共抑制内源烟草烟碱脱甲基酶或任何本文所述的其它多肽的表达。
本发明的另一个方面的特征是在植物或植物组分中减少烟草烟碱脱甲基酶或任何本文所述的其它多肽的表达的另一种方法。该方法包括下列步骤：(a)将编码烟草烟碱脱甲基酶的反义编码序列或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子的转基因引入植物细胞中以产生转化的植物细胞，所述转基因与在植物细胞中有功能的启动子可操纵地连接；和(b)从转化的植物细胞中再生植物或植物组分，其中烟草烟碱脱甲基酶的编码序列的反义或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子在植物或植物组分的细胞中进行表达，由此在植物或植物组分中减少烟草烟碱脱甲基酶的表达。理想地，编码烟草烟碱脱甲基酶的反义序列或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子的转基因，例如以组织特异性、细胞特异性或器官特异性方式组成性地表达或诱导性地进行表达。在其它理想的实施方案中，烟草烟碱脱甲基酶的编码序列的反义或能够诱导RNAi的RNA分子包含SEQ ID NO：1，SEQID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQID NO：61，SEQ ID NO：188的互补序列，或其片段。
本发明的另一个方面的特征是在植物或植物组分中减少烟草烟碱脱甲基酶的表达的另一种方法。该方法包括下列步骤：(a)将转基因引入植物细胞中以产生转化的植物细胞，所述转基因编码烟草烟碱脱甲基酶的显性失活的基因产物，其与在植物细胞中有功能的启动子可操纵地连接；和(b)从转化的植物细胞再生植物或植物组分，其中烟草烟碱脱甲基酶的显性失活基因产物在植物或植物组分的细胞中进行表达，由此在植物或植物组分中减少烟草烟碱脱甲基酶的表达。在本发明的该方面的具体实施方案中，编码显性失活基因产物的转基因以例如组织-特异性、细胞特异性或器官特异性方式进行组成性表达或诱导性表达。
本发明的另一个方面的特征是在植物细胞中减少烟草烟碱脱甲基酶的表达或酶活性的另一种方法。该方法包括在植物细胞中减少内源烟草烟碱脱甲基酶的水平，或其酶活性。理想地，所述植物细胞来自双子叶植物、茄科植物，或烟草属植物物种。在该方面的理想实施方案中，减少内源烟草烟碱脱甲基酶水平包括在植物细胞中表达编码烟草烟碱脱甲基酶的反义核酸分子或诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子的转基因，或包括在植物细胞中表达编码烟草烟碱脱甲基酶的双链RNA分子的转基因。理想地，所述双链RNA是对应于SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：188序列的RNA序列，或其片段。在另一个实施方案中，减少内源烟草烟碱脱甲基酶的水平包括在植物细胞中共抑制内源烟草烟碱脱甲基酶或包括在植物细胞中表达显性失活基因产物。具体而言，所述显性失活基因产物可以包括编码SEQ ID NO：3的氨基酸序列的突变形式或任何本文所述的其它氨基酸序列的基因。
在本发明的该方面的其它理想实施方案中，内源烟草烟碱脱甲基酶包括在编码SEQ ID NO：3的氨基酸序列的基因中的点突变。在其它理想的实施方案中，减少内源烟草烟碱脱甲基酶的表达的水平包括在编码烟草烟碱脱甲基酶的基因中的缺失或包括在编码烟草烟碱脱甲基酶的基因中的插入。减少的表达可以在转录水平，在翻译水平，或在翻译后水平发生。
在本发明的另一个方面的特征是鉴定在细胞中改变烟草烟碱脱甲基酶的表达的化合物的方法。该方法包括下列步骤：(a)提供包含编码烟草烟碱脱甲基酶的基因的细胞；(b)将候选化合物应用到细胞中；和(c)测量编码烟草烟碱脱甲基酶的基因的表达，其中相对于未处理的对照样品在表达中的增加或减少是化合物改变烟草烟碱脱甲基酶的表达的指示。
在该方法的理想实施方案中，部分(a)的基因编码这样的烟草烟碱脱甲基酶，其与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的同一性。理想地，所述化合物减少或增加编码所述烟草烟碱脱甲基酶的基因的表达。
在另一个方面，本发明的特征是鉴定在细胞中改变烟草烟碱脱甲基酶的活性的化合物的另一种方法。该方法包括下列步骤：(a)提供表达编码烟草烟碱脱甲基酶的基因的细胞；(b)将候选化合物应用到细胞中；和(c)测量所述烟草烟碱脱甲基酶的活性，其中相对于未处理的对照样品的活性的增加或减少是化合物改变所述烟草烟碱脱甲基酶的活性的指示。在本发明的该方面的理想实施方案中，步骤(a)的基因编码这样的烟草烟碱脱甲基酶，其与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的同一性。理想地，所述化合物减少或增加烟草烟碱脱甲基酶的活性。
本发明的另一个方面的特征是加工处理的烟草植物或植物组分，其包含(i)减少的水平的烟碱脱甲基酶或(ii)具有改变的酶活性的烟碱脱甲基酶和减少量的亚硝胺。理想地，所述植物组分是烟草叶子或烟草茎。在理想的实施方案中，亚硝胺是去甲烟碱，并且所述去甲烟碱的含量理想地是少于5mg/g，4.5mg/g，4.0mg/g，3.5mg/g，3.0mg/g，更理想地少于2.5mg/g，2.0mg/g，1.5mg/g，1.0mg/g，更理想地少于750μg/g，500μg/g，250μg/g，100μg/g，甚至更理想地少于75μg/g，50μg/g，25μg/g，10μg/g，7.0μg/g，5.0μg/g，4.0μg/g，和甚至更理想地少于2.0μg/g，1.0μg/g，0.5μg/g，0.4μg/g，0.2μg/g，0.1μg/g，0.05μg/g，或0.01μg/g，或其中次级生物碱相对于其中总的生物碱含量的百分比少于90％，70％，50％，30％，10％，理想地少于5％，4％，3％，2％，1.5％，1％，并且更理想地少于0.75％，0.5％，0.25％，或0.1％。在另一个理想的实施方案中，亚硝胺是N’-亚硝基去甲烟碱(NNN)，并且N’-NNN的含量理想地是少于5mg/g，4.5mg/g，4.0mg/g，3.5mg/g，3.0mg/g，更理想地少于2.5mg/g，2.0mg/g，1.5mg/g，1.0mg/g，更理想地少于750μg/g，500μg/g，250μg/g，100μg/g，甚至更理想地少于75μg/g，50μg/g，25μg/g，10μg/g，7.0μg/g，5.0μg/g，4.0μg/g，并且甚至更理想地少于2.0μg/g，1.0μg/g，0.5μg/g，0.4μg/g，0.2μg/g，0.1μg/g，0.05μg/g，或0.01μg/g，或其中次级生物碱相对于其中包含的总生物碱含量的百分比是少于90％，70％，50％，30％，10％，理想地少于5％，4％，3％，2％，1.5％，1％，并且更理想地少于0.75％，0.5％，0.25％，或0.1％。在本发明的该方面的另一个理想的实施方案中，所述加工处理的烟草植物或植物组分是深色烟草、白莱烟、烟熏烟(flue-cured tobacco)、弗吉尼亚烟、晾烟或东方型烟草。
此外，本发明的加工处理的烟草植物或植物组分理想地包含重组烟碱脱甲基酶基因，例如包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的序列，或其片段的基因。理想地，在加工处理的烟草植物或植物成分中，内源烟碱脱甲基酶基因或任何其它本文所述的核酸序列的表达被沉默。
本发明的另一个方面的特征是包含加工处理的植物或植物组分的烟草产品，其包括(i)烟碱脱甲基酶或本文所述的任何其它多肽的减少的表达或(ii)具有改变活性的烟碱脱甲基酶或本文所述的其它的多肽，和减少量的亚硝胺。理想地，所述烟草产品是无烟烟草、湿或干鼻烟、嚼烟、卷烟、雪茄烟、小雪茄烟、pipe tobacco或bidis。具体而言，本发明的该方面的烟草产品可以包含深色烟草、研磨过的烟草，或包括加香成分。
本发明的特征还在于制备烟草产品，例如无烟烟草产品的方法，其包含(i)烟碱脱甲基酶的减少的表达或(ii)具有改变(例如减少的)酶活性的烟碱脱甲基酶，和减少量的亚硝胺。该方法包括提供加工处理的烟草植物或植物组分，和从所述加工处理的烟草植物或植物成分中制备烟草产品，所述加工处理的烟草植物或植物组分包含(i)减少水平的烟碱脱甲基酶或(ii)具有改变的酶活性的烟碱脱甲基酶和减少量的亚硝胺。
定义
“酶活性”指包括，但不限于脱甲基作用，羟基化作用，环氧化作用，N-氧化作用，硫代氧化作用，N-、S-、和O-脱烷基化，脱硫作用，脱氨作用和偶氮、硝基和N-氧化物和其它这样的酶促反应性化学基团的还原作用。改变的酶活性指相对于对照酶(例如，野生型烟草植物烟碱脱甲基酶)的活性而言减少酶活性(例如，烟草烟碱脱甲基酶的)达至少10-20％，优选地至少25-50％，和更优选地至少55-95％或更多。酶，如烟碱脱甲基酶的活性可以使用本领域标准方法，例如本文所述的通过酵母微粒体测定进行测定。
术语“核酸”指单链或双链形式存在的，或有义或反义的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限定，涵盖天然核苷酸的已知类似物，其以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交。除非另外指出，特定的核酸序列包括其互补序列。术语“可操纵地连接”，“以可操纵的组合”和“以可操纵的顺序”指在核酸表达控制序列(诸如启动子、信号序列或转录因子结合位点的阵列)和第二核酸序列之间的功能连接，其中所述表达控制序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。理想地，可操纵连接的核酸序列指这样的基因的片段，其与相同的基因的其它序列连接以形成全长基因。
当关于细胞使用时，术语“重组”指细胞复制异源核酸，表达所述核酸或表达肽，异源肽，或由异源核酸编码的蛋白质。重组细胞可以表达在细胞的天然(native)(非重组)形式中未发现的有义或反义形式的基因或基因片段或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子。重组细胞也可以表达在细胞的天然形式中发现的基因，但是其中所述基因被以人工方式进行修饰并再次引入细胞中。
“结构基因”是包括编码蛋白质、多肽或其部分的DNA片段的基因的部分，并且不包括，例如，驱动转录起始的5′序列或3′UTR。所述结构基因可以备选地编码不可翻译的产物。所述结构基因可以是通常在细胞中发现的基因或在细胞或其被引入的细胞定位中通常未被发现的基因，在该种情况下其被称为“异源基因”。异源基因可以完全或部分来自本领域已知的任何来源，包括细菌基因组或游离基因，真核生物的核或质粒DNA、cDNA、病毒DNA或化学合成的DNA。结构基因可以包含可以影响生物学活性或其特征、表达产物的生物学活性或化学结构，表达的速率或表达控制的方式的一个或多个修饰。这些修饰包括，但不限于，一个或多个核苷酸的突变、插入、缺失和置换。
结构基因可以由不间断的编码序列构成或其可以包括一个或多个由适合的剪接点结合的内含子。所述结构基因可以是可翻译或不可翻译的，包括反义或能够诱导RNA干扰(RNAi)的RNA分子。结构基因可以是来自多个来源和来自多个基因序列(天然存在或合成的，其中合成的指化学合成的DNA)的片段的组合。
关于核酸序列，用于本文时，“外显子”指基因的核酸序列的部分，其中外显子的核酸序列编码基因产物的至少一个氨基酸。外显子典型地邻近于非编码DNA片段诸如内含子。
关于核酸序列，用于本文时，“内含子”指位于侧接编码区的基因的非编码区。内含子典型地是基因的非编码区，其被转录为RNA分子，但是接着在产生信使RNA或其它功能性结构RNA的过程中通过RNA剪接被切除。
关于核酸序列，用于本文时，“3′UTR”指邻近于外显子的终止密码子的非编码核酸序列。
“衍生自”用于指取自、获自、接受自、发现自、复制自或遗传自某一来源(化学和/或生物的)。衍生物可以通过原始来源的化学或生物操作(包括，但不限于，置换、添加、插入、缺失、提取、分离、突变和复制)而进行制备。
与DNA序列相关的“化学合成”指将组成核苷酸的部分在体外装配。DNA的手动化学合成可以使用公知的方法来完成(Caruthers， Methodology of DNA and RNA Sequencing，(1983)，Weissman(ed.)，Praeger Publishers，纽约，第一章)；自动化学合成可以使用许多商购机械之一来进行。
进行比较的序列的优化排比可以，例如通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性排比算法，通过Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)的进行相似性方法的搜索，通过这些算法的计算机执行(在Wisconsin遗传软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，或通过目测进行。
NCBI基本局部排比搜索工具(BLAST)(Altschul等，1990)获自几种来源，包括生物信息国家中心(National Center for Biological Information)(NCBI，Bethesda，Md.)和在网上，与序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn，和tblastx组合使用。其可以在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上进行评估。关于怎样使用该程序确定序列同一性的描述在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html可获得。
用于氨基酸序列并且用于本文时，术语“基本的氨基酸同一性”或“基本的氨基酸序列同一性”指多肽的特征，其中所述肽包括与在图10-159，160A-160E，162-170和172-1到172-19中显示的蛋白质序列比较，具有至少70％序列同一性，优选地80％氨基酸序列同一性，更优选地90％氨基酸序列同一性，和最优选地至少99到100％的序列同一性的序列。理想地，对于烟碱脱甲基酶而言，序列比较理想地用于细胞色素p450基序GXRXCX(G/A)(SEQ ID NO：2265)到翻译肽的终止密码子的区域的比较。
用于核酸序列和用于本文时，术语“基本的核酸同一性”或“基本的核酸序列同一性”指多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含这样的序列，其与参照组在跨越一段区域相比，所述区域对应于编码细胞色素p450基序GXRXCX(G/A)(SEQ ID NO：2265)的区域后第一核酸到翻译肽的终止密码子，具有至少50％，优选地60％，65％，70％，或75％的序列同一性，更优选地81％或91％的核酸序列同一性，并且最优选地具有至少95％，99％，或甚至100％序列同一性。
核苷酸序列是基本上相同的另一个指示是两个分子是否在严格条件下彼此杂交。严格条件是序列依赖型的并且将在不同的情况下是不同的。一般而言，在限定的离子强度和pH上，对于具体序列选择的严格条件是低于热熔点(Tm)约5℃到约20℃，通常是约10℃到约15℃。Tm是这样的温度(在限定的离子强度和pH)，其中靶序列的50％与匹配的探针杂交。典型地，严格条件将是其中盐浓度在pH 7是约0.02摩尔并且温度是至少约60℃的那些。例如，在标准的DNA杂交方法中，严格条件将包括于42℃在6xSSC中的开始的洗涤，随后在至少约55℃、典型地约60℃，通常约65℃的温度上在0.2xSSC中进行的一次或多次另外的洗涤。
出于本发明的目的，当所述核苷酸序列编码基本上相同的多肽和/或蛋白质时，核苷酸序列也是基本上相同的。因此，当一个核酸序列编码基本上与第二个核酸序列相同的多肽时，所述两个核酸序列是基本上相同的，即使它们由于遗传密码所容许的简并性在严格条件下不杂交(见，Darnell等.(1990)Molecular Cell Biology，Second Edition Scientific American BooksW.H.Freeman and Company New York for an explanation of codondegeneracy and the genetic code)。蛋白质纯度或均一性可以通过许多本领域众所周知的方式来指示，所述方式诸如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后通过染色进行观察。对于某些目的而言，可能需要高分辨率，并且可以使用HPLC或类似的用于纯化的方式。
所谓“特异性结合”或“特异性识别”特定多肽，诸如烟草烟碱脱甲基酶的抗体意为相对于等量的任何其它蛋白质，对于所述多肽具有增加的亲和性的抗体。理想的抗体是特异性结合这样的多肽的抗体，所述多肽具有在图1，图3和4，图10-158，图160A-160E，图162-170，或图172-1到172-19中显示的氨基酸序列。例如，特异性结合包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的烟草烟碱脱甲基酶的抗体理想地对于其抗原具有这样的亲和性，所述亲和性与等量的任何其它抗原，包括相关抗原相比，至少2倍、5倍、10倍、30倍或100倍更大。抗体与抗原，例如烟草烟碱脱甲基酶的结合可以通过许多本领域标准的方法例如，蛋白质印迹分析、ELISA或共免疫沉淀进行确定。特异性结合多肽，例如烟碱脱甲基酶的抗体在纯化多肽中也是有用的。
用于本文时，术语“载体”是用于将DNA片段传递给细胞的核酸分子。载体可以作用于复制DNA并且可以独立地在宿主细胞中增殖。术语“媒介物”有时与“载体”交互使用。用于本文时，术语“表达载体”指这样的重组DNA分子，其包含需要的编码序列和在具体宿主生物中表达可操纵连接的编码序列所必需的适合的核酸序列。在原核生物中用于表达必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(任选)和核糖体结合位点，经常还伴随其它序列。理想地，所述启动子包括SEQ ID NO：8的序列或驱动转录的其片段。此外，理想的是与SEQ ID NO：8的序列具有至少50％，60％，75％，80％，90％，95％，或甚至99％序列同一性并且驱动转录的启动子序列。已知真核生物细胞使用启动子、增强子和终止子以及多腺苷酸化信号，诸如SEQ ID NO：9的3′UTR序列。在某些情形中，已经观察到植物表达载体需要植物来源的内含子，诸如具有SEQ ID NO：7的序列的内含子的存在以具有稳定的表达。同样，SEQ ID NO：7的序列，或具有适合的RNA剪接点的任何其它内含子可以如本文进一步描述进行使用。理想的载体包括在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19或173-1到173-294中显示的核酸序列。
出于再生具有根的全遗传改造的植物的目的，可以将核酸插入植物细胞中，例如通过任何技术诸如体内接种或通过任何已知的体外组织培养技术以产生可以再生为全植物的转化的植物细胞。因此，例如，插入植物细胞可以通过由致病性或非致病性的A.tumefaciens的体外接种来进行。还可以使用其它这样的组织培养技术。
“植物组织”，“植物组分”或“植物细胞”包括植物的分化和未分化的组织，包括，但不限于，培养的根、茎、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的细胞，诸如单细胞、原生质体、胚和胼胝体组织。所述植物组织可以是在植物中的或以器官、组织或细胞培养物形式存在。
用于本文时，“植物细胞”包括在植物中的植物细胞和培养的植物细胞和原生质体。“cDNA”或“互补的DNA”通常指具有这样的核苷酸序列的单链DNA分子，所述核苷酸序列互补于包含内含子的未加工的RNA分子，或缺乏内含子的加工的mRNA。通过在RNA模板上的酶逆转录酶的作用来形成cDNA。
用于本文时，“烟草”包括烟熏烟、弗吉尼亚烟、白莱烟、深色烟、东方型烟和在烟草属中的其它类型的植物。烟草属的种子容易以烟草(Nicotiana tabacum)的形式商购获得。
“制品”或“烟草产品”包括产品诸如湿和干鼻烟、嚼烟、卷烟、雪茄烟、小雪茄烟、pipe tobacco、bidis和类似的烟草来源的产品。
至于“基因沉默”指相对于对照植物(例如，野生型烟草植物)的水平，在基因表达(例如，编码烟草烟碱脱甲基酶的基因的表达)水平中的减少达至少30-50％，优选地至少50-80％，和更优选地至少80-95％或更大。这种表达水平的减少可以通过使用本领域已知的标准方法或通过使用标准诱变技术，诸如本文描述的那些进行突变基因的产生来完成，所述标准方法包括，但不限于，RNA干扰、三链干扰、核酶、同源重组、病毒诱导的基因沉默、反义和共抑制技术、显性失活基因产物的表达。按照任何标准技术监测烟草烟碱脱甲基酶多肽或转录物，或两者的水平，所述标准技术包括，但不限于，RNA印迹、核糖核酸酶保护或免疫印迹。
至于氨基酸序列的“片段”或“部分”指在图1，3，4，10到158，160A到160E，162到170和172-1到172-19中显示的任何氨基酸序列的至少例如20，15，30，50，75，100，250，300，400，或500个连续氨基酸。示范性的理想的片段是SEQ ID NO：3的序列的氨基酸1-313和SEQ ID NO：3的序列的氨基酸314-517以及SEQ ID NOS：2和63的序列。此外，关于核酸序列的片段或部分，理想的片段包括在图1，3到7，10到158，162到170，172-1到172-19和173-1到173-294中显示的任何核酸序列的至少100，250，500，750，1000，或1500个连续的核酸。示范性的理想的片段是SEQ IDNO：4的序列的核酸1-2009，2010-2949，2950-3946，3947-4562，4563-6347，和4731-6347。
至于“基本纯的多肽”指已经从天然伴随其的大多数成分中分离的多肽；然而，也将这样的其它蛋白质认为是基本纯的多肽，所述其它蛋白质见于与制备物相关的微粒体部分(microsomal fraction)中，具有至少8.3pKat/mg蛋白质的酶活性。典型地，当去除了至少60重量％的与其天然相关的蛋白质和天然存在的有机分子时，所述多肽是基本纯的。优选地，所述制备物是至少75重量％，更优选地至少90重量％和最优选地至少99重量％的理想的多肽。可以通过，例如从天然来源(例如，烟草植物细胞)中提取；通过编码所述多肽的重组核酸的表达；或通过蛋白质的化学合成来获得基本纯的多肽。可以通过任何适合的方法，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过HPLC分析来测量纯度。
至于“分离的核酸分子”指去除了天然位于生物的基因组的核酸分子序列两侧的核酸序列的核酸序列。
至于“转化的细胞”指其中(或其祖先中)已经通过重组DNA技术引入DNA分子，例如编码烟草烟碱脱甲基酶的DNA分子或任何本文所述的核酸序列(例如，在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中显示的核酸序列)的细胞。
用于本文时，“烟草烟碱脱甲基酶”或“烟碱脱甲基酶”指，基本上与SEQ ID NO：3的序列相同的多肽。理想地，烟草烟碱脱甲基酶能够将烟碱(C10H14N2，也称为3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶)转化为去甲烟碱(C9H12N2)。如本文所述，可以使用本领域标准的方法来评估烟草烟碱脱甲基酶的活性，所述本领域标准方法诸如通过测量酵母表达的微粒体进行的对放射性烟碱的脱甲基作用来进行。
如本文提供的，术语“细胞色素p450”和“p450”交替使用。
本发明的其它特征和优势将通过下列详细描述，附图和权利要求变得更加显而易见。
附图简述
图1是D35-BG11(SEQ ID NO：1)的核酸序列及其翻译产物(SEQ IDNO：2)。
图2是烟草烟碱脱甲基酶基因的基因组结构的示意图。
图3是基因组烟草烟碱脱甲基酶核酸序列(SEQ ID NO：4)及其翻译产物(SEQ ID NO：3)。
图4是烟草烟碱脱甲基酶基因的编码区的核酸序列(SEQ ID NO：5)及其翻译产物(SEQ ID NO：6)。
图5是存在于烟草烟碱脱甲基酶基因组序列中的内含子的核酸序列(SEQ ID NO：7)。
图6是烟草脱甲基酶基因启动子的核酸序列(SEQ ID NO：8)。
图7是烟草烟碱脱甲基酶基因的3′UTR的核酸序列(SEQ ID NO：9)。
图8是显示具有Geno全长(″FL″)引物组的烟草品系的PCR产物的电泳图。
图9是电泳图，其显示如在实施例17中所陈述的具有引物组(1)，(2)，(3)，和(4)的烟草品系的PCR产物。所述条带的大致大小对于FL是3,500个核苷酸(nt)，对于(1)是2,600nt，对于(2)是1,400nt，对于(3)是600nt，和对于(4)是1,400nt。
图10是D58-BG7的核酸序列(SEQ ID NO：10)，作为D58-BG7(SEQID NO：10)的翻译产物的D58-BG7的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。
图11是D58-AB1的核酸序列(SEQ ID NO：12)，和作为D58-AB1(SEQ ID NO：12)的翻译产物的D58-AB1的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。
图12是D186-AH4的核酸序列(SEQ ID NO：14)，和作为D186-AH4(SEQ ID NO：14)的翻译产物的D186-AH4的氨基酸序列(SEQ IDNO：15)。
图13是D58-BE4的核酸序列(SEQ ID NO：16)，和作为D58-BE4(SEQ ID NO：16)的翻译产物的D58-BE4的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。
图14是D56-AH7(SEQ ID NO：18)的核酸序列，和作为D56-AH7(SEQ ID NO：18)的翻译产物的D56-AH7的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。
图15是D13a-5的核酸序列(SEQ ID NO：20)，和作为D13a-5(SEQ IDNO：20)的翻译产物的D13a-5的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。
图16是D56-AG10的核酸序列(SEQ ID NO：22)，和作为D56-AG10(SEQ ID NO：22)的翻译产物的D56-AG10的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。
图17是D35-33的核酸序列(SEQ ID NO：24)，和作为D35-33(SEQ IDNO：24)的翻译产物的D35-33的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)。
图18是D34-62的核酸序列(SEQ ID NO：26)，和作为D34-62(SEQID NO：26)的翻译产物的D34-62的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。
图19是D56-AA7的核酸序列(SEQ ID NO：28)，和作为D56-AA7(SEQ ID NO：28)的翻译产物的D56-AA7的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。
图20是D56-AE1的核酸序列(SEQ ID NO：30)，和作为D56-AE1(SEQID NO：30)的翻译产物的D56-AE1的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)。
图21是D35-BB7的核酸序列(SEQ ID NO：32)，和作为D35-BB7(SEQID NO：32)的翻译产物的D35-BB7的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。
图22是D177-BA7的核酸序列(SEQ ID NO：34)，和作为D177-BA7(SEQ ID NO：34)的翻译产物的D177-BA7的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)。
图23是D56A-AB6的核酸序列(SEQ ID NO：36)，和作为D56A-AB6(SEQ ID NO：36)的翻译产物的D56A-AB6的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)。
图24是D144-AE2的核酸序列(SEQ ID NO：38)，和作为D144-AE2(SEQ ID NO：38)的翻译产物的D144-AE2的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)。
图25是D56-AG11的核酸序列(SEQ ID NO：40)，和作为D56-AG11(SEQ ID NO：40)的翻译产物的D56-AG11的氨基酸序列(SEQ ID NO：41)。
图26是D179-AA1的核酸序列(SEQ ID NO：42)，和作为D179-AA1(SEQ ID NO：42)的翻译产物的D179-AA1的氨基酸序列(SEQ IDNO：43)。
图27是D56-AC7的核酸序列(SEQ ID NO：44)，和作为D56-AC7(SEQ ID NO：44)的翻译产物的D56-AC7的氨基酸序列(SEQ IDNO：45)。
图28是D144-AD1的核酸序列(SEQ ID NO：46)，和作为D144-AD1(SEQ ID NO：46)的翻译产物的D144-AD1的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)。
图29是D144-AB5的核酸序列(SEQ ID NO：48)，和作为D144-AB5(SEQ ID NO：48)的翻译产物的D144-AB5的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)。
图30是D181-AB5的核酸序列(SEQ ID NO：50)，和作为D181-AB5(SEQ ID NO：50)的翻译产物的D181-AB5的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)。
图31是D73-AC9的核酸序列(SEQ ID NO：52)，和作为D73-AC9(SEQ ID NO：52)的翻译产物的D73-AC9的氨基酸序列(SEQ ID NO：53)。
图32是D56-AC12的核酸序列(SEQ ID NO：54)，和作为D56-AC12(SEQ ID NO：54)的翻译产物的D56-AC12的氨基酸序列(SEQ ID NO：55)。
图33是D58-AB9的核酸序列(SEQ ID NO：56)，和作为D58-AB9(SEQ ID NO：56)的翻译产物的D58-AB9的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)。
图34是D56-AG9的核酸序列(SEQ ID NO：58)，和作为D56-AG9(SEQ ID NO：58)的翻译产物的D56-AG9的氨基酸序列(SEQ IDNO：59)。
图35是D56-AG6的核酸序列(SEQ ID NO：60)，和作为D56-AG6(SEQ ID NO：60)的翻译产物的D56-AG6的氨基酸序列(SEQ IDNO：61)。
图36是D35-BG11的核酸序列(SEQ ID NO：62)，和作为D35-BG11(SEQ ID NO：62)的翻译产物的D35-BG11的氨基酸序列(SEQ ID NO：63)。
图37是D35-42的核酸序列(SEQ ID NO：64)，和作为D35-42(SEQ IDNO：64)的翻译产物的D35-42的氨基酸序列(SEQ ID NO：65)。
图38是D35-BA3的核酸序列(SEQ ID NO：66)，和作为D35-BA3(SEQID NO：66)的翻译产物的D35-BA3的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)。
图39是D34-57的核酸序列(SEQ ID NO：68)，和作为D34-57(SEQ IDNO：68)的翻译产物的D34-57的氨基酸序列(SEQ ID NO：69)。
图40是D34-52的核酸序列(SEQ ID NO：70)，和作为D34-52(SEQ IDNO：70)的翻译产物的D34-52的氨基酸序列(SEQ ID NO：71)。
图41是D34-25的核酸序列(SEQ ID NO：72)，和作为D34-25(SEQ IDNO：72)的翻译产物的D34-25的氨基酸序列(SEQ ID NO：73)。
图42是D56AD10的核酸序列(SEQ ID NO：74)，和作为D56AD10(SEQ ID NO：74)的翻译产物的D56AD10的氨基酸序列(SEQ ID NO：75)。
图43是D56-AA11的核酸序列(SEQ ID NO：76)，和作为D56-AA11(SEQ ID NO：76)的翻译产物的D56-AA11的氨基酸序列(SEQ ID NO：77)。
图44是D177-BD5的核酸序列(SEQ ID NO：78)，和作为D177-BD5(SEQ ID NO：78)的翻译产物的D177-BD5的氨基酸序列(SEQ ID NO：79)。
图45是D56A-AG10的核酸序列(SEQ ID NO：80)，和作为D56A-AG10(SEQ ID NO：80)的翻译产物的D56A-AG10的氨基酸序列(SEQ ID NO：81)。
图46是D58-BC5的核酸序列(SEQ ID NO：82)，和作为D58-BC5(SEQID NO：82)的翻译产物的D58-BC5的氨基酸序列(SEQ ID NO：83)。
图47是D58-AD12的核酸序列(SEQ ID NO：84)，和作为D58-AD12(SEQ ID NO：84)的翻译产物的D58-AD12的氨基酸序列(SEQ ID NO：85)。
图48是D56-AC11的核酸序列(SEQ ID NO：86)，和作为D56-AC11(SEQ ID NO：86)的翻译产物的D56-AC11的氨基酸序列(SEQ ID NO：87)。
图49是D35-39的核酸序列(SEQ ID NO：88)，和作为D35-39(SEQ IDNO：88)的翻译产物的D35-39的氨基酸序列(SEQ ID NO：89)。
图50是D58-BH4的核酸序列(SEQ ID NO：90)，和作为D58-BH4(SEQID NO：90)的翻译产物的D58-BH4的氨基酸序列(SEQ ID NO：91)。
图51是D177-BD7的核酸序列(SEQ ID NO：92)，和作为D177-BD7(SEQ ID NO：92)的翻译产物的D177-BD7的氨基酸序列(SEQ ID NO：93)。
图52是D176-BF2的核酸序列(SEQ ID NO：94)，和作为D176-BF2(SEQ ID NO：94)的翻译产物的D176-BF2的氨基酸序列(SEQ ID NO：95)。
图53是D56-AD6的核酸序列(SEQ ID NO：96)，和作为D56-AD6(SEQ ID NO：96)的翻译产物的D56-AD6的氨基酸序列(SEQ ID NO：97)。
图54是D73A-AD6的核酸序列(SEQ ID NO：98)，和作为D73A-AD6(SEQ ID NO：98)的翻译产物的D73A-AD6的氨基酸序列(SEQ ID NO：99)。
图55是D70A-BA11的核酸序列(SEQ ID NO：100)，和作为D70A-BA11(SEQ ID NO：100)的翻译产物的D70A-BA11的氨基酸序列(SEQ ID NO：101)。
图56是D70A-BB5的核酸序列(SEQ ID NO：102)，和作为D70A-BB5(SEQ ID NO：102)的翻译产物的D70A-BB5的氨基酸序列(SEQID NO：103)。
图57是D70A-AB5的核酸序列(SEQ ID NO：104)，和作为D70A-AB5(SEQ ID NO：104)的翻译产物的D70A-AB5的氨基酸序列(SEQ IDNO：105)。
图58是D70A-AA8的核酸序列(SEQ ID NO：106)，和作为D70A-AA8(SEQ ID NO：106)的翻译产物的D70A-AA8的氨基酸序列(SEQ IDNO：107)。
图59是D70A-AB8的核酸序列(SEQ ID NO：108)，和作为D70A-AB8(SEQ ID NO：108)的翻译产物的D70A-AB8的氨基酸序列(SEQ IDNO：109)。
图60是D70A-BH2的核酸序列(SEQ ID NO：110)，和作为D70A-BH2(SEQ ID NO：110)的翻译产物的D70A-BH2的氨基酸序列(SEQ IDNO：111)。
图61是D70A-AA4的核酸序列(SEQ ID NO：112)，和作为D70A-AA4(SEQ ID NO：112)的翻译产物的D70A-AA4的氨基酸序列(SEQ IDNO：113)。
图62是D70A-BA1的核酸序列(SEQ ID NO：114)，和作为D70A-BA1(SEQ ID NO：114)的翻译产物的D70A-BA1的氨基酸序列(SEQ IDNO：115)。
图63是D70A-BA9的核酸序列(SEQ ID NO：116)，和作为D70A-BA9(SEQ ID NO：116)的翻译产物的D70A-BA9的氨基酸序列(SEQ IDNO：117)。
图64是D70A-BD4的核酸序列(SEQ ID NO：118)，和作为D70A-BD4(SEQ ID NO：118)的翻译产物的D70A-BD4的氨基酸序列(SEQ IDNO：119)。
图65是D181-AC5的核酸序列(SEQ ID NO：120)，和作为D181-AC5(SEQ ID NO：120)的翻译产物的D181-AC5的氨基酸序列(SEQ IDNO：121)。
图66是D144-AH1的核酸序列(SEQ ID NO：122)，和作为D144-AH1(SEQ ID NO：122)的翻译产物的D144-AH1的氨基酸序列(SEQ IDNO：123)。
图67是D34-65的核酸序列(SEQ ID NO：124)，和作为D34-65(SEQ IDNO：124)的翻译产物的D34-65的氨基酸序列(SEQ ID NO：125)。
图68是D35-BG2的核酸序列(SEQ ID NO：126)，和作为D35-BG2(SEQ ID NO：126)的翻译产物的D35-BG2的氨基酸序列(SEQ ID NO：127)。
图69是D73A-AH7的核酸序列(SEQ ID NO：128)，和作为D73A-AH7(SEQ ID NO：128)的翻译产物的D73A-AH7的氨基酸序列(SEQ IDNO：129)。
图70是D58-AA1的核酸序列(SEQ ID NO：130)，和作为D58-AA1(SEQ ID NO：130)的翻译产物的D58-AA1的氨基酸序列(SEQ ID NO：131)。
图71是D73A-AE10的核酸序列(SEQ ID NO：132)，和作为D73A-AE10(SEQ ID NO：132)的翻译产物的D73A-AE10的氨基酸序列(SEQ ID NO：133)。
图72是D56A-AC12的核酸序列(SEQ ID NO：134)，和作为D56A-AC12(SEQ ID NO：134)的翻译产物的D56A-AC12的氨基酸序列(SEQ ID NO：135)。
图73是D177-BF7的核酸序列(SEQ ID NO：136)，和作为D177-BF7(SEQ ID NO：136)的翻译产物的D177-BF7的氨基酸序列(SEQ ID NO：137)。
图74是D73A-AG3的核酸序列(SEQ ID NO：138)，和作为D73A-AG3(SEQ ID NO：138)的翻译产物的D73A-AG3的氨基酸序列(SEQ IDNO：139)。
图75是D70A-AA12的核酸序列(SEQ ID NO：140)，和作为D70A-AA12(SEQ ID NO：140)的翻译产物的D70A-AA12的氨基酸序列(SEQ ID NO：141)。
图76是D185-BC1的核酸序列(SEQ ID NO：142)，和作为D185-BC1(SEQ ID NO：142)的翻译产物的D185-BC1的氨基酸序列(SEQ ID NO：143)。
图77是D185-BG2的核酸序列(SEQ ID NO：144)，和作为D185-BG2(SEQ ID NO：144)的翻译产物的D185-BG2的氨基酸序列(SEQ IDNO：145)。
图78是D185-BE1的核酸序列(SEQ ID NO：146)，和作为D185-BE1(SEQ ID NO：146)的翻译产物的D185-BE1的氨基酸序列(SEQ ID NO：147)。
图79是D185-BD2的核酸序列(SEQ ID NO：148)，和作为D185-BD2(SEQ ID NO：148)的翻译产物的D185-BD2的氨基酸序列(SEQ IDNO：149)。
图80是D176-BG2的核酸序列(SEQ ID NO：150)，和作为D176-BG2(SEQ ID NO：150)的翻译产物的D176-BG2的氨基酸序列(SEQ IDNO：151)。
图81是D185-BD3的核酸序列(SEQ ID NO：152)，和作为D185-BD3(SEQ ID NO：152)的翻译产物的D185-BD3的氨基酸序列(SEQ IDNO：153)。
图82是D176-BC3的核酸序列(SEQ ID NO：154)，和作为D176-BC3(SEQ ID NO：154)的翻译产物的D176-BC3的氨基酸序列(SEQ ID NO：155)。
图83是D176-BB3的核酸序列(SEQ ID NO：156)，和作为D176-BB3(SEQ ID NO：156)的翻译产物的D176-BB3的氨基酸序列(SEQ ID NO：157)。
图84是D89-AB1的核酸序列(SEQ ID NO：158)，和作为D89-AB1(SEQ ID NO：158)的翻译产物的D89-AB1的氨基酸序列(SEQ ID NO：159)。
图85是D89-AD2的核酸序列(SEQ ID NO：160)，和作为D89-AD2(SEQ ID NO：160)的翻译产物的D89-AD2的氨基酸序列(SEQ ID NO：161)。
图86是D90A-BB3的核酸序列(SEQ ID NO：162)，和作为D90A-BB3(SEQ ID NO：162)的翻译产物的D90A-BB3的氨基酸序列(SEQ IDNO：163)。
图87是D95-AG1的核酸序列(SEQ ID NO：164)，和作为D95-AG1(SEQ ID NO：164)的翻译产物的D95-AG1的氨基酸序列(SEQ ID NO：165)。
图88是D96-AB6的核酸序列(SEQ ID NO：166)，和作为D96-AB6(SEQ ID NO：166)的翻译产物的D96-AB6的氨基酸序列(SEQ ID NO：167)。
图89是D96-AC2的核酸序列(SEQ ID NO：168)，和作为D96-AC2(SEQ ID NO：168)的翻译产物的D96-AC2的氨基酸序列(SEQ ID NO：169)。
图90是D98-AA1的核酸序列(SEQ ID NO：170)，和作为D98-AA1(SEQ ID NO：170)的翻译产物的D98-AA1的氨基酸序列(SEQ ID NO：171)。
图91是D98-AG1的核酸序列(SEQ ID NO：172)，和作为D98-AG1(SEQ ID NO：172)的翻译产物的D98-AG1的氨基酸序列(SEQ ID NO：173)。
图92是D100-BE2的核酸序列(SEQ ID NO：174)，和作为D100-BE2(SEQ ID NO：174)的翻译产物的D100-BE2的氨基酸序列(SEQ ID NO：175)。
图93是D100A-AC3的核酸序列(SEQ ID NO：176)，和作为D100A-AC3(SEQ ID NO：176)的翻译产物的D100A-AC3的氨基酸序列(SEQ ID NO：177)。
图94是D104A-AE8(69，1755)的核酸序列(SEQ ID NO：178)，和作为D104A-AE8(69，1755)(SEQ ID NO：178)的翻译产物的D104A-AE8(69，1755)的氨基酸序列(SEQ ID NO：179)。
图95是D105-AD6的核酸序列(SEQ ID NO：180)，和作为D105-AD6(SEQ ID NO：180)的翻译产物的D105-AD6的氨基酸序列(SEQ IDNO：181)。
图96是D109-AH8(14，1697)的核酸序列(SEQ ID NO：182)，和作为D109-AH8(14，1697)(SEQ ID NO：182)的翻译产物的D109-AH8(14，1697)的氨基酸序列(SEQ ID NO：183)。
图97是D110-AF12(166，1631)的核酸序列(SEQ ID NO：184)，和作为D110-AF12(166，1631)(SEQ ID NO：184)的翻译产物的D110-AF12(166，1631)的氨基酸序列(SEQ ID NO：185)。
图98是D112-AA5的核酸序列(SEQ ID NO：186)，和作为D112-AA5(SEQ ID NO：186)的翻译产物的D112-AA5的氨基酸序列(SEQ IDNO：187)。
图99是D120-AH4的核酸序列(SEQ ID NO：188)，和作为D120-AH4(SEQ ID NO：188)的翻译产物的D120-AH4的氨基酸序列(SEQ IDNO：189)。
图100是D121-AA8的核酸序列(SEQ ID NO：190)，和作为D121-AA8(SEQ ID NO：190)的翻译产物的D121-AA8的氨基酸序列(SEQ IDNO：191)。
图101是D122-AF10的核酸序列(SEQ ID NO：192)，和作为D122-AF10(SEQ ID NO：192)的翻译产物的D122-AF10的氨基酸序列(SEQ IDNO：193)。
图102是D128-AB7的核酸序列(SEQ ID NO：194)，和作为D128-AB7(SEQ ID NO：194)的翻译产物的D128-AB7的氨基酸序列(SEQ IDNO：195)。
图103是D129-AD10的核酸序列(SEQ ID NO：196)，和作为D129-AD10(SEQ ID NO：196)的翻译产物的D129-AD10的氨基酸序列(SEQ ID NO：197)。
图104是D135-AE1的核酸序列(SEQ ID NO：198)，和作为D135-AE1(SEQ ID NO：198)的翻译产物的D135-AE1的氨基酸序列(SEQ ID NO：199)。
图105是D141-AD7的核酸序列(SEQ ID NO：200)，和作为D141-AD7(SEQ ID NO：200)的翻译产物的D141-AD7的氨基酸序列(SEQ IDNO：201)。
图106是D147-AD3的核酸序列(SEQ ID NO：202)，和作为D147-AD3(SEQ ID NO：202)的翻译产物的D147-AD3的氨基酸序列(SEQ IDNO：203)。
图107是D163-AF12的核酸序列(SEQ ID NO：204)，和作为D163-AF12(SEQ ID NO：204)的翻译产物的D163-AF12的氨基酸序列(SEQ IDNO：205)。
图108是D163-AG11的核酸序列(SEQ ID NO：206)，和作为D163-AG11(SEQ ID NO：206)的翻译产物的D163-AG11的氨基酸序列(SEQ ID NO：207)。
图109是D163-AG12的核酸序列(SEQ ID NO：208)，和作为D163-AG12(SEQ ID NO：208)的翻译产物的D163-AG12的氨基酸序列(SEQ ID NO：209)。
图110是D205-BG9的核酸序列(SEQ ID NO：2 10)，和作为D205-BG9(SEQ ID NO：210)的翻译产物的D205-BG9的氨基酸序列(SEQ ID NO：211)。
图111是D207-AA5的核酸序列(SEQ ID NO：212)，和作为D207-AA5(SEQ ID NO：212)的翻译产物的D207-AA5的氨基酸序列(SEQ IDNO：213)。
图112是D207-AB4的核酸序列(SEQ ID NO：214)，和作为D207-AB4(SEQ ID NO：214)的翻译产物的D207-AB4的氨基酸序列(SEQ IDNO：215)。
图113是D207-AC4的核酸序列(SEQ ID NO：216)，和作为D207-AC4(SEQ ID NO：216)的翻译产物的D207-AC4的氨基酸序列(SEQ IDNO：217)。
图114是D209-AA10的核酸序列(SEQ ID NO：218)，和作为D209-AA10(SEQ ID NO：218)的翻译产物的D209-AA10的氨基酸序列(SEQ ID NO：219)。
图115是D209-AA12的核酸序列(SEQ ID NO：220)，和作为D209-AA12(SEQ ID NO：220)的翻译产物的D209-AA12的氨基酸序列(SEQ ID NO：221)。
图116是D209-AH10的核酸序列(SEQ ID NO：222)，和作为D209-AH10(SEQ ID NO：222)的翻译产物的D209-AH10的氨基酸序列(SEQ ID NO：223)。
图117是D87A-AF3的核酸序列(SEQ ID NO：224)，和作为D87A-AF3(SEQ ID NO：224)的翻译产物的D87A-AF3的氨基酸序列(SEQ IDNO：225)。
图118是D208-AC8的核酸序列(SEQ ID NO：226)，和作为D208-AC8(SEQ ID NO：226)的翻译产物的D208-AC8的氨基酸序列(SEQ IDNO：227)。
图119是D215-AB5的核酸序列(SEQ ID NO：228)，和作为D215-AB5(SEQ ID NO：228)的翻译产物的D215-AB5的氨基酸序列(SEQ IDNO：229)。
图120是D103-AH3的核酸序列(SEQ ID NO：230)，和作为D103-AH3(SEQ ID NO：230)的翻译产物的D103-AH3的氨基酸序列(SEQ IDNO：231)。
图121是D208-AD9的核酸序列(SEQ ID NO：232)，和作为D208-AD9(SEQ ID NO：232)的翻译产物的D208-AD9的氨基酸序列(SEQ IDNO：233)。
图122是D237-AD1的核酸序列(SEQ ID NO：234)，和作为D237-AD1(SEQ ID NO：234)的翻译产物的D237-AD1的氨基酸序列(SEQ IDNO：235)。
图123是D125-AF11的核酸序列(SEQ ID NO：236)，和作为D125-AF11(SEQ ID NO：236)的翻译产物的D125-AF11的氨基酸序列(SEQ IDNO：237)。
图124是D134-AE11的核酸序列(SEQ ID NO：238)，和作为D134-AE11(SEQ ID NO：238)的翻译产物的D134-AE11的氨基酸序列(SEQ IDNO：239)。
图125是D209-AH12的核酸序列(SEQ ID NO：240)，和作为D209-AH12(SEQ ID NO：240)的翻译产物的D209-AH12的氨基酸序列(SEQ ID NO：241)。
图126是D221-BB8的核酸序列(SEQ ID NO：242)，和作为D221-BB8(SEQ ID NO：242)的翻译产物的D221-BB8的氨基酸序列(SEQ ID NO：243)。
图127是D222-BH4的核酸序列(SEQ ID NO：244)，和作为D222-BH4(SEQ ID NO：244)的翻译产物的D222-BH4的氨基酸序列(SEQ IDNO：245)。
图128是D224-AF10的核酸序列(SEQ ID NO：246)，和作为D224-AF10(SEQ ID NO：246)的翻译产物的D224-AF10的氨基酸序列(SEQ IDNO：247)。
图129是D224-BD11的核酸序列(SEQ ID NO：248)，和作为D224-BD11(SEQ ID NO：248)的翻译产物的D224-BD11的氨基酸序列(SEQ IDNO：249)。
图130是D228-AD7的核酸序列(SEQ ID NO：250)，和作为D228-AD7(SEQ ID NO：250)的翻译产物的D228-AD7的氨基酸序列(SEQ IDNO：251)。
图131是D228-AH8的核酸序列(SEQ ID NO：252)，和作为D228-AH8(SEQ ID NO：252)的翻译产物的D228-AH8的氨基酸序列(SEQ IDNO：253)。
图132是D235-AB1的核酸序列(SEQ ID NO：254)，和作为D235-AB1(SEQ ID NO：254)的翻译产物的D235-AB1的氨基酸序列(SEQ IDNO：255)。
图133是D243-AA2的核酸序列(SEQ ID NO：256)，和作为D243-AA2(SEQ ID NO：256)的翻译产物的D243-AA2的氨基酸序列(SEQ IDNO：257)。
图134是D244-AD4的核酸序列(SEQ ID NO：258)，和作为D244-AD4(SEQ ID NO：258)的翻译产物的D244-AD4的氨基酸序列(SEQ IDNO：259)。
图135是D247-AH1的核酸序列(SEQ ID NO：260)，和作为D247-AH1(SEQ ID NO：260)的翻译产物的D247-AH1的氨基酸序列(SEQ IDNO：261)。
图136是D248-AA6的核酸序列(SEQ ID NO：262)，和作为D248-AA6(SEQ ID NO：262)的翻译产物的D248-AA6的氨基酸序列(SEQ IDNO：263)。
图137是D249-AE8的核酸序列(SEQ ID NO：264)，和作为D249-AE8(SEQ ID NO：264)的翻译产物的D249-AE8的氨基酸序列(SEQ ID NO：265)。
图138是D250-AC11的核酸序列(SEQ ID NO：266)，和作为D250-AC11(SEQ ID NO：266)的翻译产物的D250-AC11的氨基酸序列(SEQ IDNO：267)。
图139是D259-AB9的核酸序列(SEQ ID NO：268)，和作为D259-AB9(SEQ ID NO：268)的翻译产物的D259-AB9的氨基酸序列(SEQ IDNO：269)。
图140是D218A-AC2的核酸序列(SEQ ID NO：270)，和作为D218A-AC2(SEQ ID NO：270)的翻译产物的D218A-AC2的氨基酸序列(SEQ ID NO：271)。
图141是D210-BD4的核酸序列(SEQ ID NO：272)，和作为D210-BD4(SEQ ID NO：272)的翻译产物的D210-BD4的氨基酸序列(SEQ IDNO：273)。
图142是D233-AG7的核酸序列(SEQ ID NO：274)，和作为D233-AG7(SEQ ID NO：274)的翻译产物的D233-AG7的氨基酸序列(SEQ IDNO：275)。
图143是D257-AE4的核酸序列(SEQ ID NO：276)，和作为D257-AE4(SEQ ID NO：276)的翻译产物的D257-AE4的氨基酸序列(SEQ ID NO：277)。
图144是D268-AE2的核酸序列(SEQ ID NO：278)，和作为D268-AE2(SEQ ID NO：278)的翻译产物的D268-AE2的氨基酸序列(SEQ ID NO：279)。
图145是D283-AC1的核酸序列(SEQ ID NO：280)，和作为D283-AC1(SEQ ID NO：280)的翻译产物的D283-AC1的氨基酸序列(SEQ IDNO：281)。
图146是D244-AB6的核酸序列(SEQ ID NO：282)，和作为D244-AB6(SEQ ID NO：282)的翻译产物的D244-AB6的氨基酸序列(SEQ IDNO：283)。
图147是D205-BE9的核酸序列(SEQ ID NO：284)，和作为D205-BE9(SEQ ID NO：284)的翻译产物的D205-BE9的氨基酸序列(SEQ ID NO：285)。
图148是D136-AF4的核酸序列(SEQ ID NO：286)，和作为D136-AF4(SEQ ID NO：286)的翻译产物的D136-AF4的氨基酸序列(SEQ ID NO：287)。
图149是D101-BA2的核酸序列(SEQ ID NO：288)，和作为D101-BA2(SEQ ID NO：288)的翻译产物的D101-BA2的氨基酸序列(SEQ IDNO：289)。
图150是D130-AA1的核酸序列(SEQ ID NO：290)，和作为D130-AA1(SEQ ID NO：290)的翻译产物的D130-AA1的氨基酸序列(SEQ IDNO：291)。
图151是D136-AD5的核酸序列(SEQ ID NO：292)，和作为D136-AD5(SEQ ID NO：292)的翻译产物的D136-AD5的氨基酸序列(SEQ IDNO：293)。
图152是D138-AD12的核酸序列(SEQ ID NO：294)，和作为D138-AD12(SEQ ID NO：294)的翻译产物的D138-AD12的氨基酸序列(SEQ ID NO：295)。
图153是D216-AG8的核酸序列(SEQ ID NO：296)，和作为D216-AG8(SEQ ID NO：296)的翻译产物的D216-AG8的氨基酸序列(SEQ IDNO：297)。
图154是D243-AB3的核酸序列(SEQ ID NO：298)，和作为D243-AB3(SEQ ID NO：298)的翻译产物的D243-AB3的氨基酸序列(SEQ IDNO：299)。
图155是D250-AC11的核酸序列(SEQ ID NO：300)，和作为D250-AC11(SEQ ID NO：300)的翻译产物的D250-AC11的氨基酸序列(SEQ IDNO：301)。
图156是D205-AH4的核酸序列(SEQ ID NO：302)，和作为D205-AH4(SEQ ID NO：302)的翻译产物的D205-AH4的氨基酸序列(SEQ IDNO：303)。
图157是D267-AF10的核酸序列(SEQ ID NO：304)，和作为D267-AF10(SEQ ID NO：304)的翻译产物的D267-AF10的氨基酸序列(SEQ IDNO：305)。
图158是D284-AH5的核酸序列(SEQ ID NO：306)，和作为D284-AH5(SEQ ID NO：306)的翻译产物的D284-AH5的氨基酸序列(SEQ IDNO：307)。
图159A是一组由下列各项组成的核酸序列排比：D58-BG7(SEQ IDNO：10)，D58-AB1(SEQ ID NO：12)，和D58-BE4(SEQID NO：16)的排比；和D56-AH7(SEQ ID NO：18)和D13a-5(SEQ ID NO：20)的排比。在各个排比下方显示每个排比的序列之间的百分比同一性。
图159B是一组由下列各项组成的核酸序列排比：D56-AG10(SEQ IDNO：22)，D35-33(SEQ ID NO：24)，和D34-62(SEQ ID NO：26)的排比；和D56-AA7(SEQ ID NO：28)，D56-AE1(SEQ ID NO：30)，和D185-BD3(SEQID NO：152)的排比。在各个排比下方显示每个排比的序列之间的百分比同一性。
图159C是一组由下列各项组成的核酸序列排比：D56A-AB6(SEQ IDNO：36)，D35-BB7(SEQ ID NO：32)，D177-BA7(SEQ ID NO：34)，和D144-AE2(SEQ ID NO：38)的排比；和D56-AG11(SEQ ID NO：40)和D179-AA1(SEQ ID NO：42)的排比。在各个排比下方显示每个排比的序列之间的百分比同一性。
图159D是一组由下列各项组成的核酸序列排比：D56-AC7(SEQ IDNO：44)和D144-AD1(SEQ ID NO：46)的排比；和D181-AB5(SEQ ID NO：50)和D73-AC9(SEQ ID NO：52)的排比。在各个排比下方显示每个排比的序列之间的百分比同一性。
图159E是核酸序列D58-AB9(SEQ ID NO：56)，D56-AG9(SEQ ID NO：58)，D35-BG11(SEQ ID NO：62)，D34-25(SEQ ID NO：72)，D35-BA3(SEQID NO：66)，D34-52(SEQ ID NO：70)，D56-AG6(SEQ ID NO：60)，D35-42(SEQ ID NO：64)，和D34-57(SEQ ID NO：68)之间的排比。在排比下方显示排比的序列之间的百分比同一性。
图159F是一组由下列各项组成的核酸序列排比：D177-BD7(SEQ IDNO：92)和D177-BD5(SEQ ID NO：78)的排比；D56A-AG10(SEQ IDNO：80)，D58-AD12(SEQ ID NO：84)，和D58-BC5(SEQ ID NO：82)的排比。在各个排比下方显示每个排比的序列之间的百分比同一性。
图159G是一组由下列各项组成的核酸序列排比：D56-AD6(SEQ IDNO：96)，D56-AC11(SEQ ID NO：86)，D35-39(SEQ ID NO：88)，和D58-BH4(SEQ ID NO：90)的排比；和D73A-AD6(SEQ ID NO：98)和D70A-BA11(SEQ ID NO：100)的排比。在各个排比下方显示每个排比的序列之间的百分比同一性。
图159H是一组由下列各项组成的核酸序列排比：D70A-AB5(SEQ IDNO：104)和D70A-AA8(SEQ ID NO：106)的排比；和D70A-AB8(SEQ IDNO：108)，D70A-BH2(SEQ ID NO：110)，D70A-AA4(SEQ ID NO：112)的排比。在各个排比下方显示每个排比的序列之间的百分比同一性。
图159I是一组由下列各项组成的核酸序列排比：D70A-BA1(SEQ IDNO：114)和D70A-BA9(SEQ ID NO：116)的排比；和D144-AH1(SEQ ID NO：122)，D34-65(SEQ ID NO：124)，和D181-AC5(SEQ ID NO：120)的排比。在各个排比下方显示每个排比的序列之间的百分比同一性。
图159J是一组由下列各项组成的核酸序列排比：D58-AA1(SEQ IDNO：130)，D185-BC1(SEQ ID NO：142)，和D185-BG2(SEQ ID NO：144)的排比，和D177-BF7(SEQ ID NO：136)，D185-BD2(SEQ ID NO：148)，和D185-BE1(SEQ ID NO：146)的排比。在各个排比下方显示每个排比的序列之间的百分比同一性。
图159K是D70-AA12(SEQ ID NO：140)和D176-BF2(SEQ ID NO：94)的核酸序列排比。在各个排比下方显示每个排比的序列之间的百分比同一性。
图160A是一组由下列各项组成的氨基酸序列排比：D208-AD9(SEQID NO：2196)，D120-AH4(SEQ ID NO：2197)，D121-AA8(SEQ ID NO：2198)，D122-AF10(SEQ ID NO：2199)，D103-AH3(SEQ ID NO：2200)，D208-AC8(SEQ ID NO：2201)，和D235-AB1(SEQ ID NO：2202)的序列排比；D244-AD4(SEQ ID NO：2203)，D244-AB6(SEQ ID NO：2204)，D285-AA8(SEQ ID NO：2205)，D285-AB9(SEQ ID NO：2206)，和D268-AE2(SEQ IDNO：2207)的序列排比；和D100A-AC3(SEQ ID NO：2208)和D100A-BE2(SEQ ID NO：2209)的序列排比。
图160B是一组由下列各项组成的氨基酸序列排比：D205-BG9(SEQID NO：2210)，D205-BE9(SEQ ID NO：2211)，和D205-AH4(SEQ IDNO：2212)的序列排比；D259-AB9(SEQ ID NO：2213)，D257-AE4(SEQ IDNO：2214)，和D147-AD3(SEQ ID NO：2215)的序列排比；D249-AEB(SEQ IDNO：2216)和D248-AA6(SEQ ID NO：2217)的序列排比；D233-AG7(SEQID NO：2218)，D224-BD11(SEQ ID NO：2219)，和D224-AF10(SEQ ID NO：2220)的序列排比；和D105-AD6(SEQ ID NO：2221)，D215-AB5(SEQ IDNO：2222)，和D135-AE1(SEQ ID NO：2223)的序列排比。
图160C是一组由下列各项组成的氨基酸序列排比：D87A-AF3(SEQID NO：2224)和D210-BD4(SEQ ID NO：2225)的序列排比；D89-AB1(SEQID NO：2226)，D89-AD2(SEQ ID NO：2227)，D163-AG12(SEQ ID NO：2228)，D163-AG11(SEQ ID NO：2229)，和D163-AF12(SEQ ID NO：2230)的序列排比；D267-AF10(SEQ ID NO：2231)，D96-AC2(SEQ ID NO：2232)，D96-AB6(SEQ ID NO：2233)，D207-AA5(SEQ ID NO：2234)，D207-AB4(SEQ ID NO：2235)，和D207-AC4(SEQ ID NO：2236)的序列排比；和D98-AG1(SEQ ID NO：2237)和D98-AA1(SEQ ID NO：2238)的序列排比。
图160D是一组由下列各项组成的氨基酸序列排比：D209-AA10(SEQID NO：2239)，D209-AA12(SEQ ID NO：2240)，D209-AH10(SEQ IDNO：2241)，D209-AH12(SEQ ID NO：2242)，和D90a-BB3(SEQ ID NO：2243)的序列排比；D129-AD10(SEQ ID NO：2244)和D104A-AE8(SEQ ID NO：2245)的序列排比；D228-AH8(SEQ ID NO：2246)，D228-AD7(SEQ ID NO：2247)，D250-AC11(SEQ ID NO：2248)，和D247-AH1(SEQ ID NO：2249)的序列排比；和D128-AB7(SEQ ID NO：2250)，D243-AA2(SEQ IDNO：2251)，和D125-AF11(SEQ ID NO：2252)的序列排比。
图160E是D284-AH5(SEQ ID NO：2253)和D110-AF12(SEQ IDNO：2254)的氨基酸序列排比。
图161是显示通过PCR克隆细胞色素p450 cDNA片段的示意图。用于克隆的引物列为：DM(SEQ ID NO：2255)，DM4(SEQ ID NO：2256)，DM12(SEQ ID NO：2257)，DM13(SEQ ID NO：2258)，DM17(SEQ ID NO：2259)，OLIGO d(T)(SEQ ID NO：2260)，T7(SEQ ID NO：2261)，和SP6(SEQ IDNO：2262)。
图162是D425-AB10的核酸序列(SEQ ID NO：367)和作为D425-AB10(SEQ ID NO：367)的翻译产物的D425-AB10的氨基酸序列(SEQID NO：368)。
图163是D425-AB11的核酸序列(SEQ ID NO：369)和作为D425-AB11(SEQ ID NO：369)的翻译产物的D425-AB11的氨基酸序列(SEQID NO：370)。
图164是D425-AC9的核酸序列(SEQ ID NO：371)和作为D425-AC9(SEQ ID NO：371)的翻译产物的D425-AC9的氨基酸序列(SEQ IDNO：372)。
图165是D425-AC10的核酸序列(SEQ ID NO：373)和作为D425-AC10(SEQ ID NO：373)的翻译产物的D425-AC10的氨基酸序列(SEQ IDNO：374)。
图166是D425-AC11的核酸序列(SEQ ID NO：375)和作为D425-AC11(SEQ ID NO：375)的翻译产物的D425-AC11的氨基酸序列(SEQ IDNO：376)。
图167是D425-AG11的核酸序列(SEQ ID NO：377)和作为D425-AG11(SEQ ID NO：377)的翻译产物的D425-AG11的氨基酸序列(SEQ IDNO：378)。
图168是D425-AH7的核酸序列(SEQ ID NO：379)和作为D425-AH7(SEQ ID NO：379)的翻译产物的D425-AH7的氨基酸序列(SEQ IDNO：380)。
图169是D425-AH11的核酸序列(SEQ ID NO：381)和作为D425-AH11(SEQ ID NO：381)的翻译产物的D425-AH11的氨基酸序列(SEQ IDNO：382)。
图170是D427-AA5的核酸序列(SEQ ID NO：383)和作为D427-AA5(SEQ ID NO：383)的翻译产物的D427-AA5的氨基酸序列(SEQ IDNO：384)。
图171是列出在GeneChip微阵列上的克隆的探针组序列(SEQ IDNO：385-SEQ ID NO：445)的表。
图172-1是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：D424-AA4的核酸序列(SEQ ID NO：446)；D424-AF5的核酸序列(SEQ ID NO：447)和作为D424-AF5(SEQ ID NO：447)的翻译产物的D424-AF5的氨基酸序列(SEQID NO：448)，D425-AA11的核酸序列(SEQ ID NO：449)和作为D425-AA11(SEQ ID NO：449)的翻译产物的D425-AA11的氨基酸序列(SEQ ID NO：450)；和D425-AF11的核酸序列(SEQ ID NO：451)。
图172-2是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：作为D425-AF11(SEQ ID NO：451)的翻译产物的D425-AF11的氨基酸序列(SEQ IDNO：452)；D425-AH10的核酸序列(SEQ ID NO：453)和作为D425-AH10(SEQ ID NO：453)的翻译产物的D425-AH10的氨基酸序列(SEQ IDNO：454)；D426-AA3的核酸序列(SEQ ID NO：455)和作为D426-AA3(SEQID NO：455)的翻译产物的D426-AA3的氨基酸序列(SEQ ID NO：456)；和D426-AG1的核酸序列(SEQ ID NO：457)和作为D426-AG1(SEQ IDNO：457)的翻译产物的D426-AG1的氨基酸序列(SEQ ID NO：458)。
图172-3是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：D427-AA6的核酸序列(SEQ ID NO：459)和作为D427-AA6(SEQ ID NO：459)的翻译产物的D427-AA6的氨基酸序列(SEQ ID NO：460)；D427-AB6的核酸序列(SEQID NO：461)和作为D427-AB6(SEQ ID NO：461)的翻译产物的D427-AB6的氨基酸序列(SEQ ID NO：462)；D428-AC9的核酸序列(SEQ ID NO：463)和作为D428-AC9(SEQ ID NO：463)的翻译产物的D428-AC9的氨基酸序列(SEQ ID NO：464)；和D428-AH10的核酸序列(SEQ ID NO：465)。
图172-4是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：作为D428-AH10(SEQ ID NO：465)的翻译产物的D428-AH10的氨基酸序列(SEQ ID NO：466)；D429-AA1的核酸序列(SEQ ID NO：467)和作为D429-AA1(SEQ ID NO：467)的翻译产物的D429-AA1的氨基酸序列(SEQID NO：468)；D430-AA3的核酸序列(SEQ ID NO：469)和作为D430-AA3(SEQ ID NO：469)的翻译产物的D430-AA3的氨基酸序列(SEQ IDNO：470)；和D431-AE6的核酸序列(SEQ ID NO：471)和作为D431-AE6(SEQ ID NO：471)的翻译产物的D431-AE6的氨基酸序列(SEQ ID NO：472)。
图172-5是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：D113-AE9的核酸序列(SEQ ID NO：473)和作为D113-AE9(SEQ ID NO：473)的翻译产物的D113-AE9的氨基酸序列(SEQ ID NO：474)；和D114-AE12的核酸序列(SEQ ID NO：475)。
图172-6是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：作为D114-AE12(SEQ ID NO：475)的翻译产物的D114-AE12的氨基酸序列(SEQID NO：476)；D119-AC3的核酸序列(SEQ ID NO：477)和作为D119-AC3(SEQ ID NO：477)的翻译产物的D119-AC3的氨基酸序列(SEQID NO：478)；和D132-AA5的核酸序列(SEQ ID NO：479)。
图172-7是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：作为D132-AA5(SEQ ID NO：479)的翻译产物的D132-AA5的氨基酸序列(SEQ IDNO：480)；D223-BB10的核酸序列(SEQ ID NO：481)和作为D223-BB10(SEQ ID NO：481)的翻译产物的D223-BB10的氨基酸序列(SEQ ID NO：482)；D245-AA8的核酸序列(SEQ ID NO：483)和作为D245-AA8(SEQ IDNO：483)的翻译产物的D245-AA8的氨基酸序列(SEQ ID NO：484)。
图172-8是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：D246-AE12的核酸序列(SEQ ID NO：485)和作为D246-AE12(SEQ ID NO：485)的翻译产物的D246-AE12的氨基酸序列(SEQ ID NO：486)；和D279-AD1的核酸序列(SEQ ID NO：487)和作为D279-AD1(SEQ ID NO：487)的翻译产物的D279-AD1的氨基酸序列(SEQ ID NO：488)。
图172-9是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：D282-AA10的核酸序列(SEQ ID NO：489)和作为D282-AA10(SEQ ID NO：489)的翻译产物的D282-AA10的氨基酸序列(SEQ ID NO：490)；和D295-AA1的核酸序列(SEQ ID NO：491)。
图172-10是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：作为D295-AA1(SEQ ID NO：491)的翻译产物的D295-AA1的氨基酸序列(SEQID NO：492)；D101A-AE2的核酸序列(SEQ ID NO：493)和作为D101A-AE2(SEQ ID NO：493)的翻译产物的D101A-AE2的氨基酸序列(SEQ ID NO：494)；和D108-AA4的核酸序列(SEQ ID NO：495)。
图172-11是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：作为D108-AA4(SEQ ID NO：495)的翻译产物的D108-AA4的氨基酸序列(SEQID NO：496)；D124-AC5(5′)的核酸序列(SEQ ID NO：497)和作为D124-AC5(5′)(SEQ ID NO：497)的翻译产物的D124-AC5(5′)的氨基酸序列(SEQ ID NO：498)；D124-AC5(3′)的核酸序列(SEQ ID NO：499)和作为D124-AC5(3′)(SEQ ID NO：499)的翻译产物的D124-AC5(3′)的氨基酸序列(SEQ ID NO：500)；和D141-AD7的核酸序列(SEQID NO：501)。
图172-12是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：作为D141-AD7(SEQ ID NO：501)的翻译产物的D141-AD7的氨基酸序列(SEQID NO：502)；和D148-AD1的核酸序列(SEQ ID NO：503)和作为D148-AD1(SEQ ID NO：503)的翻译产物的D148-AD1的氨基酸序列(SEQ IDNO：504)。
图172-13是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：D212-BC11的核酸序列(SEQ ID NO：505)和作为D212-BC11(SEQ ID NO：505)的翻译产物的D212-BC11的氨基酸序列(SEQ ID NO：506)；和D217-AB10的核酸序列(SEQ ID NO：507)和作为D217-AB10(SEQ ID NO：507)的翻译产物的D217-AB10的氨基酸序列(SEQ ID NO：508)。
图172-14是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：D220-BC6的核酸序列(SEQ ID NO：509)和作为D220-BC6(SEQ ID NO：509)的翻译产物的D220-BC6的氨基酸序列(SEQ ID NO：510)；D225-AG9的核酸序列(SEQID NO：511)和作为D225-AG9(SEQ ID NO：511)的翻译产物的D225-AG9的氨基酸序列(SEQ ID NO：512)；D231-AF1的核酸序列(SEQ ID NO：513)和作为D231-AF1(SEQ ID NO：513)的翻译产物的D231-AF1的氨基酸序列(SEQID NO：514)；和D232-AH5的核酸序列(SEQ ID NO：515)。
图172-15是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：作为D232-AH5(SEQ ID NO：515)的翻译产物的D232-AH5的氨基酸序列(SEQID NO：516)；D240-BB8的核酸序列(SEQ ID NO：517)和作为D240-BB8(SEQ ID NO：517)的翻译产物的D240-BB8的氨基酸序列(SEQ ID NO：518)；D280-AA6的核酸序列(SEQ ID NO：519)和作为D280-AA6(SEQ ID NO：519)的翻译产物的D280-AA6的氨基酸序列(SEQ ID NO：520)；和D285-AD7的核酸序列(SEQ ID NO：521)和作为D285-AD7(SEQ ID NO：521)的翻译产物的D285-AD7的氨基酸序列(SEQ ID NO：522)。
图172-16是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：D285-AH9的核酸序列(SEQ ID NO：523)和作为D285-AH9(SEQ ID NO：523)的翻译产物的D285-AH9的氨基酸序列(SEQ ID NO：524)；D99-AB3的核酸序列(SEQID NO：525)和作为D99-AB3(SEQ ID NO：525)的翻译产物的D99-AB3的氨基酸序列(SEQ ID NO：526)；和D99-AC2的核酸序列(SEQ ID NO：527)和作为D99-AC2(SEQ ID NO：527)的翻译产物的D99-AC2的氨基酸序列(SEQ ID NO：528)。
图172-17是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：D99-AF11的核酸序列(SEQ ID NO：529)和作为D99-AF11(SEQ ID NO：529)的翻译产物的D99-AF11的氨基酸序列(SEQ ID NO：530)；D99-AH4的核酸序列(SEQID NO：531)和作为D99-AH4(SEQ ID NO：531)的翻译产物的D99-AH4的氨基酸序列(SEQ ID NO：532)；D99-AH7的核酸序列(SEQ ID NO：533)和作为D99-AH7(SEQ ID NO：533)的翻译产物的D99-AH7的氨基酸序列(SEQ IDNO：534)；D99-DB4的核酸序列(SEQ ID NO：535)和作为D99-DB4(SEQ IDNO：535)的翻译产物的D99-DB4的氨基酸序列(SEQ ID NO：536)。
图172-18是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：D99-DG4的核酸序列(SEQ ID NO：537)和作为D99-DG4(SEQ ID NO：537)的翻译产物的D99-DG4的氨基酸序列(SEQ ID NO：538)；D40-2的核酸序列(SEQ IDNO：539)和作为D40-2(SEQ ID NO：539)的翻译产物的D40-2的氨基酸序列(SEQ ID NO：540)；D301-EE11的核酸序列(SEQ ID NO：541)和作为D301-EE11(SEQ ID NO：541)的翻译产物的D301-EE11的氨基酸序列(SEQ IDNO：542)；和D302-AE10的核酸序列(SEQ ID NO：543)。
图172-19是由下列各项组成的核酸和氨基酸序列的组：作为D302-AE10(SEQ ID NO：543)的翻译产物的D302-AE10的氨基酸序列(SEQID NO：544)；D303-AC6的核酸序列(SEQ ID NO：545)和作为D303-AC6(SEQ ID NO：545)的翻译产物的D303-AC6的氨基酸序列(SEQ ID NO：546)；和D303-AC11的核酸序列(SEQ ID NO：547)和作为D303-AC11(SEQID NO：547)的翻译产物的D303-AC11的氨基酸序列(SEQ ID NO：548)。
图173-1是40-17(SEQ ID NO：549)，40-20(SEQ ID NO：550)，40-23(SEQ ID NO：551)，40-26(SEQ ID NO：552)，D40-27(SEQ ID NO：553)，40-28(SEQ ID NO：554)，和40-78(SEQ ID NO：555)的核酸序列。
图173-2是40-83(SEQ ID NO：556)，D40-86(SEQ ID NO：557)，D40-97(SEQ ID NO：558)，40-100(SEQ ID NO：559)，40-107(SEQ ID NO：560)，D41-41(SEQ ID NO：561)，和D41-60(SEQ ID NO：562)的核酸序列。
图173-3是D41-65(SEQ ID NO：563)，D41-67(SEQ ID NO：564)，D41-69(SEQ ID NO：565)，D41-99(SEQ ID NO：566)，D42-AA3(SEQ IDNO：567)，D42-AA7(SEQ ID NO：568)，和D42-AC3(SEQ ID NO：569)的核酸序列。
图173-4是D42-AC7(SEQ ID NO：570)，D42-AC8(SEQ ID NO：571)，D42-AD3(SEQ ID NO：572)，D42-AD12(SEQ ID NO：573)，D42-AF3(SEQID NO：574)，和D42-AH3(SEQ ID NO：575)的核酸序列。
图173-5是D42-BA2(SEQ ID NO：576)，D42-BB11(SEQ ID NO：577)，D42-KC9(SEQ ID NO：578)，D42-KC10(SEQ ID NO：579)，D42-LB2(SEQID NO：580)，D42-LC7(SEQ ID NO：581)，D42-TG7(SEQ ID NO：582)，和D42-UG8(SEQ ID NO：583)的核酸序列。
图173-6是D42-ZB1(SEQ ID NO：584)，D300-AA7(SEQ ID NO：585)，D300-AB3(SEQ ID NO：586)，D300-AB7(SEQ ID NO：587)，D300-AB10(SEQ ID NO：588)，D300-AB11(SEQ ID NO：589)，和D300-AC2(SEQ IDNO：590)的核酸序列。
图173-7是D300-AC6(SEQ ID NO：591)，D300-AC7(SEQ ID NO：592)，D300-AD4(SEQ ID NO：593)，D300-AD6(SEQ ID NO：594)，D300-AD10(SEQ ID NO：595)，D300-AE3(SEQ ID NO：596)，和D300-AE9(SEQ ID NO：597)的核酸序列。
图173-8是D300-AE11(SEQ ID NO：598)，D300-AF4(SEQ ID NO：599)，D300-AF5(SEQ ID NO：600)，D300-AF7(SEQ ID NO：601)，D300-AF8(SEQID NO：602)，D300-AF9(SEQ ID NO：603)，和D300-AF11(SEQ ID NO：604)的核酸序列。
图173-9是D300-AG1(SEQ ID NO：605)，D300-AG2(SEQ ID NO：606)，D300-AG3(SEQ ID NO：607)，D300-AG10(SEQ ID NO：608)，D300-AH6(SEQ ID NO：609)，D300-AH9(SEQ ID NO：610)，D300-AH10(SEQ IDNO：611)，和D300-AH11(SEQ ID NO：612)的核酸序列。
图173-10是D300-BA5(SEQ ID NO：613)，D300-BA6(SEQ ID NO：614)，D300-BA7(SEQ ID NO：615)，D300-BA12(SEQ ID NO：616)，D300-BB6(SEQ ID NO：617)，D300-BB7(SEQ ID NO：618)，和D300-BC1(SEQ IDNO：619)的核酸序列。
图173-11是D300-BC4(SEQ ID NO：620)，D300-BC7(SEQ ID NO：621)，D300-BC8(SEQ ID NO：622)，D300-BC9(SEQ ID NO：623)，D300-BD2(SEQ ID NO：624)，D300-BD7(SEQ ID NO：625)，和D300-BE1(SEQ IDNO：626)的核酸序列。
图173-12是D300-BE2(SEQ ID NO：627)，D300-BE7(SEQ ID NO：628)，D300-BE8(SEQ ID NO：629)，D300-BE9(SEQ ID NO：630)，D300-BE12(SEQ ID NO：631)，D300-BF7(SEQ ID NO：632)，D300-BF11(SEQ ID NO：633)，和D300-BG1(SEQ ID NO：634)的核酸序列。
图173-13是D300-BG2(SEQ ID NO：635)，D300-BG5(SEQ ID NO：636)，D300-BH6(SEQ ID NO：637)，D300-BH9(SEQ ID NO：638)，D300-CA1(SEQ ID NO：639)，D300-CA6(SEQ ID NO：640)，和D300-CB1(SEQ IDNO：641)的核酸序列。
图173-14是D300-CB12(SEQ ID NO：642)，D300-CC2(SEQ IDNO：643)，D300-CD2(SEQ ID NO：644)，D300-CD3(SEQ ID NO：645)，D300-CD4(SEQ ID NO：646)，D300-CD5(SEQ ID NO：647)，和D300-CE3(SEQ ID NO：648)的核酸序列。
图173-15是D300-CE7(SEQ ID NO：649)，D300-CF1(SEQ ID NO：650)，D300-CF2(SEQ ID NO：651)，D300-CF11(SEQ ID NO：652)，D300-CG2(SEQ ID NO：653)，D300-CG7(SEQ ID NO：654)，D300-CH1(SEQ ID NO：655)，和D300-CH3(SEQ ID NO：656)的核酸序列。
图173-16是D300-CH5(SEQ ID NO：657)，D300-CH7(SEQ ID NO：658)，D300-DA1(SEQ ID NO：659)，D300-DA4(SEQ ID NO：660)，D300-DB2(SEQ ID NO：661)，D300-DB4(SEQ ID NO：662)，D300-DB6(SEQ ID NO：663)，和D300-DB7-c(SEQ ID NO：664)的核酸序列。
图173-17是D300-DB8(SEQ ID NO：665)，D300-DC2(SEQ ID NO：666)，D300-DC4(SEQ ID NO：667)，D300-DC7(SEQ ID NO：668)，D300-DC10(SEQ ID NO：669)，D300-DC11(SEQ ID NO：670)，和D300-DD5(SEQ ID NO：671)的核酸序列。
图173-18是D300-DD6(SEQ ID NO：672)，D300-DE2(SEQ ID NO：673)，D300-DE9(SEQ ID NO：674)，D300-DE10(SEQ ID NO：675)，D300-DF5(SEQ ID NO：676)，D300-DF6(SEQ ID NO：677)，D300-DF8(SEQID NO：678)，和D300-DF12(SEQ ID NO：679)的核酸序列。
图173-19是D300-DG1(SEQ ID NO：680)，D300-DG3(SEQ ID NO：681)，D300-DG9(SEQ ID NO：682)，D300-DG11(SEQ ID NO：683)，D300-DH10(SEQ ID NO：684)，D301-AB10(SEQ ID NO：685)，和D301-AC5(SEQ IDNO：686)的核酸序列。
图173-20是D301-AC7(SEQ ID NO：687)，D301-AC9(SEQ IDNO：688)，D301-AD1(SEQ ID NO：689)，D301-AD2(SEQ ID NO：690)，D301-AE4c(SEQ ID NO：691)，D301-AF12(SEQ ID NO：692)，D301-AH6(SEQ ID NO：693)，和D301-AH12(SEQ ID NO：694)的核酸序列。
图173-21是D301-BB8(SEQ ID NO：695)，D301-BB9(SEQ ID NO：696)，D301-BC1(SEQ ID NO：697)，D301-BC8(SEQ ID NO：698)，D301-BD1(SEQ ID NO：699)，D301-BD2(SEQ ID NO：700)，和D301-BF3(SEQ IDNO：701)的核酸序列。
图173-22是D301-DA4(SEQ ID NO：702)，D301-DA8(SEQ IDNO：703)，D301-DB5(SEQ ID NO：704)，D301-DC6(SEQ ID NO：705)，D301-DD4(SEQ ID NO：706)，D301-DG1(SEQ ID NO：707)，D301-DG4c(SEQ ID NO：708)，和D301-EA5(SEQ ID NO：709)的核酸序列。
图173-23是D301-EA6(SEQ ID NO：710)，D301-EA7(SEQ ID NO：711)，D301-EC9(SEQ ID NO：712)，D301-EC10(SEQ ID NO：713)，D301-ED5(SEQID NO：714)，D301-ED7(SEQID NO：715)，和D301-EE7(SEQ ID NO：716)的核酸序列。
图173-24是D301-EF2(SEQ ID NO：717)，D301-EF5(SEQ ID NO：718)，D301-EF10(SEQ ID NO：719)，D301-EG12(SEQ ID NO：720)，D302-AB8(SEQ ID NO：721)，D302-AB9(SEQ ID NO：722)，D302-AB12(SEQ ID NO：723)，和D302-AC1(SEQ ID NO：724)的核酸序列。
图173-25是D302-AC5(SEQ ID NO：725)，D302-AC6(SEQ ID NO：726)，D302-AC7(SEQ ID NO：727)，D302-AC12(SEQ ID NO：728)，D302-AD4(SEQ ID NO：729)，D302-AD7(SEQ ID NO：730)，和D302-AE7(SEQ ID NO：731)的核酸序列。
图173-26是D302-AF6(SEQ ID NO：732)，D302-AF8(SEQ ID NO：733)，D302-AG2(SEQ ID NO：734)，D302-AH10(SEQ ID NO：735)，D302-BA2(SEQ ID NO：736)，D302-BA6(SEQ ID NO：737)，D302-BC3(SEQ ID NO：738)，和D302-BC6(SEQ ID NO：739)的核酸序列。
图173-27是D302-BC9(SEQ ID NO：740)，D302-BD3(SEQ ID NO：741)，D302-BD7(SEQ ID NO：742)，D302-BD9(SEQ ID NO：743)，D302-BE1(SEQ ID NO：744)，和D302-BE2(SEQ ID NO：745)的核酸序列。
图173-28是D302-BE6(SEQ ID NO：746)，D302-BE7(SEQ ID NO：747)，D302-BF1(SEQ ID NO：748)，D302-BF5(SEQ ID NO：749)，D302-BG1(SEQID NO：750)，D302-bg3(SEQ ID NO：751)，和D302-BG7(SEQ ID NO：752)的核酸序列。
图173-29是D302-Bg9(SEQ ID NO：753)，D302-BH1(SEQ ID NO：754)，D302-bh9(SEQ ID NO：755)，D302-CA5(SEQ ID NO：756)，D302-CB7(SEQID NO：757)，D302-CC1(SEQ ID NO：758)，D302-CC3(SEQ ID NO：759)，和D302-CD2(SEQ ID NO：760)的核酸序列。
图173-30是D302-CE3(SEQ ID NO：761)，D302-CE9(SEQ ID NO：762)，D302-CF2(SEQ ID NO：763)，D302-CF5(SEQ ID NO：764)，D302-CF6(SEQID NO：765)，D302-CH1(SEQ ID NO：766)，和D302-CH4(SEQ ID NO：767)的核酸序列。
图173-31是D302-CH5(SEQ ID NO：768)，D302-CH6(SEQ ID NO：769)，D302-DA2(SEQ ID NO：770)，D302-DA5(SEQ ID NO：771)，D302-DA9(SEQID NO：772)，D302-DC4(SEQ ID NO：773)，和D302-DC7(SEQ ID NO：774)的核酸序列。
图173-32是D302-DC8(SEQ ID NO：775)，D302-DC11(SEQ ID NO：776)，D302-DD3(SEQ ID NO：777)，D302-DF5(SEQ ID NO：778)，D302-DF7(SEQ ID NO：779)，D302-DG9(SEQ ID NO：780)，和D302-DH8(SEQ IDNO：781)的核酸序列。
图173-33是D303-AA9(SEQ ID NO：782)，D303-AA10(SEQ ID NO：783)，D303-AB11(SEQ ID NO：784)，D303-AC4(SEQ ID NO：785)，D303-AD3(SEQ ID NO：786)，D303-AD11(SEQ ID NO：787)，D303-AE1(SEQ ID NO：788)，和D303-ae2(SEQ ID NO：789)的核酸序列。
图173-34是D303-ae6(SEQ ID NO：790)，D303-AF5(SEQ ID NO：791)，D303-AF12(SEQ ID NO：792)，D303-AG1(SEQ ID NO：793)，D303-AG8(SEQ ID NO：794)，D303-AG9(SEQ ID NO：795)，D303-AH5(SEQ ID NO：796)，和D303-BA1(SEQ ID NO：797)的核酸序列。
图173-35是D303-BA5(SEQ ID NO：798)，D303-BB6(SEQ ID NO：799)，D303-BC1(SEQ ID NO：800)，D303-BC2(SEQ ID NO：801)，D303-BC8(SEQ ID NO：802)，D303-BC11(SEQ ID NO：803)，D303-bd2(SEQID NO：804)，和D303-BD6(SEQ ID NO：805)的核酸序列。
图173-36是D303-BD9(SEQ ID NO：806)，D303-BE3(SEQ ID NO：807)，D303-BE4(SEQ ID NO：808)，D303-BE7(SEQ ID NO：809)，D303-BF1(SEQ ID NO：810)，D303-BF6(SEQ ID NO：811)，D303-BG2(SEQ ID NO：812)，和D303-BG1(SEQ ID NO：813)的核酸序列。
图173-37是D303-BH1(SEQ ID NO：814)，D303-BH6(SEQ IDNO：815)，D414-AG2(SEQ ID NO：816)，D35-33(SEQ ID NO：817)，D35-34(SEQ ID NO：818)，和D35-35(SEQ ID NO：819)的核酸序列。
图173-38是D35-41(SEQ ID NO：820)，D35-43(SEQ ID NO：821)，D35-51(SEQ ID NO：822)，和D35-AC4(SEQ ID NO：823)的核酸序列。
图173-39是D35-AC12(SEQ ID NO：824)，D35-AE2(SEQ ID NO：825)，D35-AE6(SEQ ID NO：826)，D35-AF1(SEQ ID NO：827)，D35-AF3(SEQ IDNO：828)，和D35-AG3(SEQ ID NO：829)的核酸序列。
图173-40是D35-BA5(SEQ ID NO：830)，D35-BA12(SEQ ID NO：831)，D35-BB1(SEQ ID NO：832)，D35-BB3(SEQ ID NO：833)，和D35-BB10(SEQID NO：834)的核酸序列。
图173-41是D35-BB12(SEQ ID NO：835)，D55-AA8(SEQ ID NO：836)，D55-AB1(SEQ ID NO：837)，D55-AB5(SEQ ID NO：838)，和D55-AB6(SEQ ID NO：839)的核酸序列。
图173-42是D55-AB7(SEQ ID NO：840)，D55-AB10(SEQ ID NO：841)，D55-AA2(SEQ ID NO：842)，D55-AC2(SEQ ID NO：843)，和D55-AC5(SEQID NO：844)的核酸序列。
图173-43是D55-AC7(SEQ ID NO：845)，D55-BA7(SEQ ID NO：846)，D55-BA8(SEQ ID NO：847)，D55-BA10(SEQ ID NO：848)，D55-BA11(SEQ ID NO：849)，和D55-BB9(SEQ ID NO：850)的核酸序列。
图173-44是D55-BB10(SEQ ID NO：851)，D55-BB12(SEQ ID NO：852)，D55-BC4(SEQ ID NO：853)，D55-BC5(SEQ ID NO：854)，D55-AA6(SEQ IDNO：855)，和D56-AE5(SEQ ID NO：856)的核酸序列。
图173-45是D56-AA2(SEQ ID NO：857)，D56-AA4(SEQ ID NO：858)，D56-AA8(SEQ ID NO：859)，D56-AA9(SEQ ID NO：860)，D56-AB1(SEQ IDNO：861)，和D56-AB7(SEQ ID NO：862)的核酸序列。
图173-46是D56-AB9(SEQ ID NO：863)，D56-AC9(SEQ ID NO：864)，D56-AD3(SEQ ID NO：865)，D56-AG8(SEQ ID NO：866)，和D56-AH1(SEQID NO：867)的核酸序列。
图173-47是D56-AH10(SEQ ID NO：868)，D56-AE2(SEQ ID NO：869)，D57-AB2(SEQ ID NO：870)，D57-AB5(SEQ ID NO：871)，和D57-AB6(SEQID NO：872)的核酸序列。
图173-48是D57-AB8(SEQ ID NO：873)，D57-AB11(SEQ ID NO：874)，D57-AB12(SEQ ID NO：875)，D57-AC1(SEQ ID NO：876)，D57-AC4(SEQ ID NO：877)，和D57-AC12(SEQ ID NO：878)的核酸序列。
图173-49是D57-AD5(SEQ ID NO：879)，D57-AD8(SEQ ID NO：880)，D57-AD9(SEQ ID NO：881)，D57-AE1(SEQ ID NO：882)，D57-AE2(SEQ IDNO：883)，和D57-AE7(SEQ ID NO：884)的核酸序列。
图173-50是D57-AF2(SEQ ID NO：885)，D57-AE12(SEQ ID NO：886)，D57-AF3(SEQ ID NO：887)，D57-AF5(SEQ ID NO：888)，和D57-AF9(SEQID NO：889)的核酸序列。
图173-51是D57-AG5(SEQ ID NO：890)，D57-AG7(SEQ ID NO：891)，D57-AG11(SEQ ID NO：892)，和D57-AH10(SEQ ID NO：893)的核酸序列。
图173-52是D58-AA3(SEQ ID NO：894)，D58-AA5(SEQ ID NO：895)，D58-AB3(SEQ ID NO：896)，D58-AB5(SEQ ID NO：897)，和D58-AC1(SEQID NO：898)的核酸序列。
图173-53是D58-AC9(SEQ ID NO：899)，D58-AC11(SEQ ID NO：900)，D58-AD2(SEQ ID NO：901)，和D58-AD5(SEQ ID NO：902)的核酸序列。
图173-54是D58-AD7(SEQ ID NO：903)，D58-AD8(SEQ ID NO：904)，D58-AD10(SEQ ID NO：905)，D58-AE1(SEQ ID NO：906)，和D58-AE2(SEQ ID NO：907)的核酸序列。
图173-55是D58-AE5(SEQ ID NO：908)，D58-AE9(SEQ ID NO：909)，D58-AE10(SEQ ID NO：910)，D58-AE11(SEQ ID NO：911)，和D58-AF3(SEQID NO：912)的核酸序列。
图173-56是D58-AF6(SEQ ID NO：913)，D58-AH4(SEQ ID NO：914)，D58-AH7(SEQ ID NO：915)，D58-AH9(SEQ ID NO：916)，和D58-AH10(SEQ ID NO：917)的核酸序列。
图173-57是D58-BA5(SEQ ID NO：918)，D58-BA7(SEQ ID NO：919)，D58-BB7(SEQ ID NO：920)，D58-BC5(SEQ ID NO：921)，D58-BD3(SEQ IDNO：922)，和D58-BD7(SEQ ID NO：923)的核酸序列。
图173-58是D58-BD8(SEQ ID NO：924)，D58-BD10(SEQ ID NO：925)，D58-BE2(SEQ ID NO：926)，D58-BE11(SEQ ID NO：927)，和D58-BF1(SEQID NO：928)的核酸序列。
图173-59是D58-BF2(SEQ ID NO：929)，D58-BG3(SEQ ID NO：930)，D58-BG5(SEQ ID NO：931)，D58-BG8(SEQ ID NO：932)，D58-BG10(SEQ IDNO：933)，和D58-BG12(SEQ ID NO：934)的核酸序列。
图173-60是D58-BH10(SEQ ID NO：935)，D58-BH8(SEQ ID NO：936)，D58-BH2(SEQ ID NO：937)，D60-AA1(SEQ ID NO：938)，D60-AA2(SEQ IDNO：939)，和D60-AA3(SEQ ID NO：940)的核酸序列。
图173-61是D60-AA5(SEQ ID NO：941)，D60-AA6(SEQ ID NO：942)，D60-AA7(SEQ ID NO：943)，D60-AA8(SEQ ID NO：944)，D60-AA10(SEQID NO：945)，和D60-AA11(SEQ ID NO：946)的核酸序列。
图173-62是D60-AA12(SEQ ID NO：947)，D60-AB3(SEQ ID NO：948)，D60-AB5(SEQ ID NO：949)，D60-AB6(SEQ ID NO：950)，D60-AB7(SEQ ID NO：951)，和D60-AB8(SEQ ID NO：952)的核酸序列。
图173-63是D60-AB11(SEQ ID NO：953)，D60-AC3(SEQID NO：954)，D60-AC5(SEQ ID NO：955)，D60-AC7(SEQ ID NO：956)，D60-AC8(SEQID NO：957)，和D60-AC11(SEQ ID NO：958)的核酸序列。
图173-64是D60-AC12(SEQ ID NO：959)，D60-AD3(SEQ ID NO：960)，D60-AD4(SEQ ID NO：961)，D60-AD5(SEQ ID NO：962)，D60-AD7(SEQID NO：963)，和D60-AE1(SEQ ID NO：964)的核酸序列。
图173-65是D60-AE4(SEQ ID NO：965)，D60-AE6(SEQ ID NO：966)，D60-AE8(SEQ ID NO：967)，D60-AE12(SEQ ID NO：968)，D60-AF5(SEQID NO：969)，和D60-AF8(SEQ ID NO：970)的核酸序列。
图173-66是D60-AF11(SEQ ID NO：971)，D60-AG1(SEQ ID NO：972)，D60-AG10(SEQ ID NO：973)，D60-AG12(SEQ ID NO：974)，D60-AH1(SEQID NO：975)，和D60-AH5(SEQ ID NO：976)的核酸序列。
图173-67是D60-AH6(SEQ ID NO：977)，D60-AH9(SEQ ID NO：978)，D60-AH10(SEQ ID NO：979)，D60-AH11(SEQ ID NO：980)，和D63-AA12(SEQ ID NO：981)的核酸序列。
图173-68是D64-4(SEQ ID NO：982)，D64-AB4(SEQ ID NO：983)，D64-AB10(SEQ ID NO：984)，D65-AA6(SEQ ID NO：985)，和D65-AA7(SEQ ID NO：986)的核酸序列。
图173-69是D65-AA9(SEQ ID NO：987)，D65-AB4(SEQ ID NO：988)，D65-AB5(SEQ ID NO：989)，D65-AB8(SEQ ID NO：990)，D65-AB9(SEQID NO：991)，和D65-AB11(SEQ ID NO：992)的核酸序列。
图173-70是D65-AC1(SEQ ID NO：993)，D65-AC6(SEQ ID NO：994)，D65-AC10(SEQ ID NO：995)，D65-AC11(SEQ ID NO：996)，D65-AD3(SEQID NO：997)，和D65-AE1(SEQ ID NO：998)的核酸序列。
图173-71是D65-AE2(SEQ ID NO：999)，D65-AE10(SEQ ID NO：1000)，D65-AE11(SEQ ID NO：1001)，D65-AE12(SEQ ID NO：1002)，D65-AF1(SEQ ID NO：1003)，和D65-AF5(SEQ ID NO：1004)的核酸序列。
图173-72是D65-AF7(SEQ ID NO：1005)，D65-AG11(SEQ ID NO：1006)，D65-CE1(SEQ ID NO：1007)，D65-CE2(SEQ ID NO：1008)，D65-CE7(SEQ ID NO：1009)，和D65-CE9(SEQ ID NO：1010)的核酸序列。
图173-73是D65-CE12(SEQ ID NO：1011)，D65-CF3(SEQ IDNO：1012)，D65-CF10(SEQ ID NO：1013)，D65-CF12(SEQ ID NO：1014)，D65-CG2(SEQ ID NO：1015)，D65-CG5(SEQ ID NO：1016)，和D65-CH3(SEQ ID NO：1017)的核酸序列。
图173-74是D65-CH4(SEQ ID NO：1018)，D65-CH6(SEQ ID NO：1019)，D65-CH8(SEQ ID NO：1020)，D65-CH9(SEQ ID NO：1021)，D65-CH11(SEQ ID NO：1022)，和D65-CH12(SEQ ID NO：1023)的核酸序列。
图173-75是D66-AA4(SEQ ID NO：1024)，D66-AA5(SEQ ID NO：1025)，D66-AA6(SEQ ID NO：1026)，D66-AA9(SEQ ID NO：1027)，和D66-AB5(SEQ ID NO：1028)的核酸序列。
图173-76是D66-AB1(SEQ ID NO：1029)，D66-AB7(SEQ ID NO：1030)，D66-AC1(SEQ ID NO：1031)，D66-AC2(SEQ ID NO：1032)，和D66-AC4(SEQID NO：1033)的核酸序列。
图173-77是D66-AC7(SEQ ID NO：1034)，D66-AD1(SEQ ID NO：1035)，D66-AD3(SEQ ID NO：1036)，和D66-AD6(SEQ ID NO：1037)的核酸序列。
图173-78是D66-AD8(SEQ ID NO：1038)，D66-AE1(SEQ ID NO：1039)，D66-AE3(SEQ ID NO：1040)，D66-AE6(SEQ ID NO：1041)，D66-AE8(SEQ ID NO：1042)，和D66-AF3(SEQ ID NO：2263)的核酸序列。
图173-79是D66-AF5(SEQ ID NO：1043)，D66-AF8(SEQ ID NO：1044)，D66-AF9(SEQ ID NO：1045)，和D66-AG1(SEQ ID NO：1046)的核酸序列。
图173-80是D66-AG4(SEQ ID NO：1047)，D66-AG5(SEQ ID NO：1048)，D66-AH4(SEQ ID NO：1049)，D66-AH5(SEQ ID NO：1050)，D66-AH7(SEQ ID NO：1051)，和D66-AH8(SEQ ID NO：1052)的核酸序列。
图173-81是D66-AH9(SEQ ID NO：1053)，D66-BA3(SEQ ID NO：1054)，D66-BA8(SEQ ID NO：1055)，和D66-BB1(SEQ ID NO：1056)的核酸序列。
图173-82是D66-BB2(SEQ ID NO：1057)，D66-BB3(SEQ ID NO：1058)，D66-BB5(SEQ ID NO：1059)，和D66-BB7(SEQ ID NO：1060)的核酸序列。
图173-83是D66-BB9(SEQ ID NO：1061)，D66-BB10(SEQ ID NO：1062)，D66-BC6(SEQ ID NO：1063)，D66-BD1(SEQ ID NO：1064)，和D66-BD2(SEQ ID NO：1065)的核酸序列。
图173-84是D66-BD9(SEQ ID NO：1066)，D67-AA2(SEQ ID NO：1067)，D67-AA3(SEQ ID NO：1068)，D67-AB1(SEQ ID NO：1069)，和D67-AC5(SEQ ID NO：1070)的核酸序列。
图173-85是D67-AD1(SEQ ID NO：1071)，D67-AD4(SEQ ID NO：1072)，D67-AD6(SEQ ID NO：1073)，D67-AE2(SEQ ID NO：1074)，和D67-AE6(SEQ ID NO：1075)的核酸序列。
图173-86是D67-AF6(SEQ ID NO：1076)，D67-AG1(SEQ ID NO：1077)，D67-AG3(SEQ ID NO：1078)，D67-AG5(SEQ ID NO：1079)，和D67-AG6(SEQ ID NO：1080)的核酸序列。
图173-87是D69-AA5(SEQ ID NO：1081)，D69-AB1(SEQ ID NO：1082)，D69-AB8(SEQ ID NO：1083)，D69-AB9(SEQ ID NO：1084)，和D69-AC4(SEQ ID NO：1085)的核酸序列。
图173-88是D70A-AB10(SEQ ID NO：1086)，D70A-AC2(SEQ ID NO：1087)，D70A-AC3(SEQ ID NO：1088)，D70A-AD3(SEQ ID NO：1089)，D70A-AD5(SEQ ID NO：1090)，和D70A-AD6(SEQ ID NO：1091)的核酸序列。
图173-89是D70A-AD11(SEQ ID NO：1092)，D70A-AE10(SEQ ID NO：1093)，D70A-AF6(SEQ ID NO：1094)，D70A-AF8(SEQ ID NO：1095)，D70A-AF10(SEQ ID NO：1096)，D70A-AH5(SEQ ID NO：1097)，和D70A-AH8(SEQ ID NO：1098)的核酸序列。
图173-90是D70A-BA3(SEQ ID NO：1099)，D70A-BA6(SEQ ID NO：1100)，D70A-BA10(SEQ ID NO：1101)，D70A-BB8(SEQ ID NO：1102)，和D70A-BB11(SEQ ID NO：1103)的核酸序列。
图173-91是D70A-BC7(SEQ ID NO：1104)，D70A-BD8(SEQ IDNO：1105)，D70A-BE1(SEQ ID NO：1106)，D70A-BE5(SEQ ID NO：1107)，D70A-BE6(SEQ ID NO：1108)，和D70A-BE8(SEQ ID NO：1109)的核酸序列。
图173-92是D70A-BF2(SEQ ID NO：1110)，D70A-BF3(SEQ IDNO：1111)，D70A-BF10(SEQ ID NO：1112)，D70A-BG9(SEQ ID NO：1113)，D70A-BH8(SEQ ID NO：1114)，和D70-AE2(SEQ ID NO：1115)的核酸序列。
图173-93是D70-AE6(SEQ ID NO：1116)，D70-AF3(SEQ IDNO：1117)，D70-AG10(SEQ ID NO：1118)，D70-AH7(SEQ ID NO：1119)，D70-BE6(SEQ ID NO：1120)，和D70-BE7(SEQ ID NO：1121)的核酸序列。
图173-94是D70A-BC12(SEQ ID NO：1122)，D72-AB2(SEQ IDNO：1123)，D72-AB6(SEQ ID NO：1124)，D73A-AA12(SEQ ID NO：1125)，和D73A-AB4(SEQ ID NO：1126)的核酸序列。
图173-95是D73A-AB9(SEQ ID NO：1127)，D73A-AB 11(SEQ ID NO：1128)，D73A-AC1(SEQ ID NO：1129)，D73A-AC3(SEQ ID NO：1130)，和D73A-AC8(SEQ IDNO：1131)的核酸序列。
图173-96是D73A-AD3(SEQ ID NO：1132)，D73A-AE1(SEQ IDNO：1133)，D73A-AE3(SEQ ID NO：1134)，D73A-AE4(SEQ ID NO：1135)，D73A-AE5(SEQ ID NO：1136)，和D73A-AE9(SEQ ID NO：1137)的核酸序列。
图173-97是D73A-AE10(SEQ ID NO：1138)，D73A-AF3(SEQ ID NO：1139)，D73A-AF4(SEQ ID NO：1140)，D73A-AF7(SEQ ID NO：1141)，D73A-AF8(SEQ ID NO：1142)，和D73A-AG11(SEQ ID NO：1143)的核酸序列。
图173-98是D73A-AH1(SEQ ID NO：1144)，D73A-AH5(SEQ ID NO：1145)，D73A-AH9(SEQ ID NO：1146)，D73A-AH12(SEQ ID NO：1147)，D73A-BA9(SEQ ID NO：1148)，和D73A-BB3(SEQ ID NO：1149)的核酸序列。
图173-99是D73A-BB9(SEQ ID NO：1150)，D73A-BE1(SEQ IDNO：1151)，D73A-BF3(SEQ ID NO：1152)，D73A-BG1(SEQ ID NO：1153)，和D73A-BG3(SEQ ID NO：1154)的核酸序列。
图173-100是D73A-BG5(SEQ ID NO：1155)，D73A-BH1(SEQ IDNO：1156)，D73-AC1(SEQ ID NO：1157)，D73-AD8(SEQ ID NO：1158)，和D73-AD12(SEQ ID NO：1159)的核酸序列。
图173-101是D80-AB2(SEQ ID NO：1160)，D81-AA5(SEQ ID NO：1161)，D81-AB4(SEQ ID NO：1162)，D81-AB6(SEQ ID NO：1163)，和D81-AC5(SEQ ID NO：1164)的核酸序列。
图173-102是D82-AA8(SEQ ID NO：1165)，D82-AC9(SEQ ID NO：1166)，D82-AH9(SEQ ID NO：1167)，和D83-AD10(SEQ ID NO：1168)的核酸序列。
图173-103是D83-AG10(SEQ ID NO：1169)，D84-AD3(SEQ IDNO：1170)，D84-AE1(SEQ ID NO：1171)，D84-AF4(SEQ ID NO：1172)，D84-AG1(SEQ ID NO：1173)，和D87-AA1(SEQ ID NO：1174)的核酸序列。
图173-104是D87-AA3(SEQ ID NO：1175)，D87A-AA1(SEQ IDNO：1176)，D87A-AB1(SEQ ID NO：1177)，D87A-AB3(SEQ ID NO：1178)，D87A-AC1(SEQ ID NO：1179)，和D87A-AC3(SEQ ID NO：1180)的核酸序列。
图173-105是D87A-AF2(SEQ ID NO：1181)，D87A-AG1(SEQ ID NO：1182)，D87A-AH1(SEQ ID NO：1183)，D87A-AH3(SEQ ID NO：1184)，D87-AB2(SEQ ID NO：1185)，和D88-AA10(SEQ ID NO：1186)的核酸序列。
图173-106是D88-AB3(SEQ ID NO：1187)，D88-AB6(SEQ IDNO：1188)，D88-AB7(SEQ ID NO：1189)，D88-AB8(SEQ ID NO：1190)，D88-AC5(SEQ ID NO：1191)，和D88-AC9(SEQ ID NO：1192)的核酸序列。
图173-107是D88-AD8(SEQ ID NO：1193)，D88-AE5(SEQ IDNO：1194)，D88-AE6(SEQ ID NO：1195)，D88-AE8(SEQ ID NO：1196)，和D91-AA4(SEQ ID NO：1197)的核酸序列。
图173-108是D92-AD9(SEQ ID NO：1198)，D92-AE9(SEQ ID NO：1199)，D92-AF8(SEQ ID NO：1200)，D92-AG10(SEQ ID NO：1201)，D92-AH9(SEQ ID NO：1202)，和D93-AA1(SEQ ID NO：1203)的核酸序列。
图173-109是D93-AA2(SEQ ID NO：1204)，D93-AB1(SEQ ID NO：1205)，D93-AC3(SEQ ID NO：1206)，D93-AC4(SEQ ID NO：1207)，和D93-AD1(SEQ ID NO：1208)的核酸序列。
图173-110是D93-AE3(SEQ ID NO：1209)，D93-AE4(SEQ ID NO：1210)，D93-AF3(SEQ ID NO：1211)，D93-AG1(SEQ ID NO：1212)，D93-AH2(SEQ ID NO：1213)，和D93-AH3(SEQ ID NO：1214)的核酸序列。
图173-111是D93-AH4(SEQ ID NO：1215)，D93-BA10(SEQ IDNO：1216)，D93-BA12(SEQ ID NO：1217)，D93-BD11(SEQ ID NO：1218)，D93-BE11(SEQ ID NO：1219)，和D93-BF12(SEQ ID NO：1220)的核酸序列。
图173-112是D94-AA2(SEQ ID NO：1221)，D94-AA3(SEQ ID NO：1222)，D94-AB1(SEQ ID NO：1223)，D94-AB2(SEQ ID NO：1224)，和D94-AC3(SEQ ID NO：1225)的核酸序列。
图173-113是D94-AD1(SEQ ID NO：1226)，D94-AE1(SEQ ID NO：1227)，D94-AE3(SEQ ID NO：1228)，D94-AG2(SEQ ID NO：1229)，和D94-AH1(SEQ ID NO：1230)的核酸序列。
图173-114是D94-AH2(SEQ ID NO：1231)，D94-AH3(SEQ ID NO：1232)，D95-AC1(SEQ ID NO：1233)，D95-AD2(SEQ ID NO：1234)，D96-AA3(SEQ ID NO：1235)，和D96-AA4(SEQ ID NO：1236)的核酸序列。
图173-115是D96-AA7(SEQ ID NO：1237)，D96-AB7(SEQ ID NO：2264)，D96-AC5(SEQ ID NO：1238)，D96-AC6(SEQ ID NO：1239)，和D96-AD6(SEQ ID NO：1240)的核酸序列。
图173-116是D96-AE6(SEQ ID NO：1241)，D96-AG3(SEQ ID NO：1242)，D96-AH8(SEQ ID NO：1243)，D97-AA1(SEQ ID NO：1244)，D97-AB1(SEQ ID NO：1245)，和D97-AB3(SEQ ID NO：1246)的核酸序列。
图173-117是D97-AD1(SEQ ID NO：1247)，D97-AD2(SEQ ID NO：1248)，D97-AD4(SEQ ID NO：1249)，D97-AE1(SEQ ID NO：1250)，和D97-AE2(SEQ ID NO：1251)的核酸序列。
图173-118是D97-AE4(SEQ ID NO：1252)，D97-AF3(SEQ ID NO：1253)，D97-AG2(SEQ ID NO：1254)，D97-AG3(SEQ ID NO：1255)，和D97-AH1(SEQ ID NO：1256)的核酸序列。
图173-119是D97-AH2(SEQ ID NO：1257)，D97-AH4(SEQ ID NO：1258)，D98-AB2(SEQ ID NO：1259)，D98-AE3(SEQ ID NO：1260)，和D98-AF1(SEQ ID NO：1261)的核酸序列。
图173-120是D98-AH2(SEQ ID NO：1262)，D99-AC5(SEQ ID NO：1263)，D99-AC8(SEQ ID NO：1264)，D99-AD2(SEQ ID NO：1265)，D99-AD3(SEQ ID NO：1266)，和D99-AD4(SEQ ID NO：1267)的核酸序列。
图173-121是D99-AD6(SEQ ID NO：1268)，D99-AE1(SEQ ID NO：1269)，D99-AE5(SEQ ID NO：1270)，D99-AE6(SEQ ID NO：1271)，D99-AE7(SEQ ID NO：1272)，和D99-AE8(SEQ ID NO：1273)的核酸序列。
图173-122是D99-AF1(SEQ ID NO：1274)，D99-AF5(SEQ ID NO：1275)，D99-AF7(SEQ ID NO：1276)，D99-AG2(SEQ ID NO：1277)，D99-AG4(SEQ ID NO：1278)，D99-AG7(SEQ ID NO：1279)，和D99-AH2(SEQ ID NO：1280)的核酸序列。
图173-123是D99-AH10(SEQ ID NO：1281)，D99-DA3(SEQ ID NO：1282)，D99-DB5(SEQ ID NO：1283)，D99-DC2(SEQ ID NO：1284)，和D99-DC3(SEQ ID NO：1285)的核酸序列。
图173-124是D99-DD5(SEQ ID NO：1286)，D99-DG4(SEQ ID NO：1287)，D100A-AA4(SEQ ID NO：1288)，和D101-BG2(SEQ ID NO：1289)的核酸序列。
图173-125是D101A-AC2(SEQ ID NO：1290)，D101A-AD1(SEQ IDNO：1291)，D101A-AD2(SEQ ID NO：1292)，D101A-AE1(SEQ ID NO：1293)，和D101A-AF1(SEQ ID NO：1294)的核酸序列。
图173-126是D101C-AA1(SEQ ID NO：1295)，D 101C-AB1(SEQ IDNO：1296)，D101C-AC1(SEQ ID NO：1297)，D101C-AD3(SEQ ID NO：1298)，和D101C-BD12(SEQ ID NO：1299)的核酸序列。
图173-127是D101C-BE12(SEQ ID NO：1300)，D101C-BF12(SEQ IDNO：1301)，D101C-BG12(SEQ ID NO：1302)，和D101D-AB6(SEQ IDNO：1303)的核酸序列。
图173-128是D101D-AC5(SEQ ID NO：1304)，D101D-AG5(SEQ IDNO：1305)，D101D-AG6(SEQ ID NO：1306)，D101D-AH4(SEQ IDNO：1307)，和D101D-AH6(SEQ ID NO：1308)的核酸序列。
图173-129是D101D-BB11(SEQ ID NO：1309)，D101D-BD11(SEQ IDNO：1310)，D107-AA3(SEQ ID NO：1311)，D107-AB2(SEQ ID NO：1312)，D107-AC2(SEQ ID NO：1313)，和D107-AC3(SEQ ID NO：1314)的核酸序列。
图173-130是D107-AD2(SEQ ID NO：1315)，D107-AD3(SEQ ID NO：1316)，D107-AF1(SEQ ID NO：1317)，D107-AH1(SEQ ID NO：1318)，D108-AA6(SEQ ID NO：1319)，和D108-AB4(SEQ ID NO：1320)的核酸序列。
图173-131是D108-AB5(SEQ ID NO：1321)，D108-AC6(SEQ ID NO：1322)，D108-AD6(SEQ ID NO：1323)，D108-AF6(SEQ ID NO：1324)，D109-AA7(SEQ ID NO：1325)，和D109-AA8(SEQ ID NO：1326)的核酸序列。
图173-132是D109-AA9(SEQ ID NO：1327)，D109-AB8(SEQ ID NO：1328)，D109-AC7(SEQ ID NO：1329)，D109-AC8(SEQ ID NO：1330)，D109-AC9(SEQ ID NO：1331)，和D109-AE7(SEQ ID NO：1332)的核酸序列。
图173-133是D109-AF9(SEQ ID NO：1333)，D109-AH7(SEQ ID NO：1334)，D110-AB11(SEQ ID NO：1335)，D110-AF10(SEQ ID NO：1336)，D111-AA2(SEQ ID NO：1337)，和D111-AB1(SEQ ID NO：1338)的核酸序列。
图173-134是D111-AB3(SEQ ID NO：1339)，D111-AC3(SEQ ID NO：1340)，D111-AD1(SEQ ID NO：1341)，D111-AF1(SEQ ID NO：1342)，和D111-AG3(SEQ ID NO：1343)的核酸序列。
图173-135是D111-AH1(SEQ ID NO：1344)，D111-AH2(SEQ ID NO：1345)，D112-AD6(SEQ ID NO：1346)，D112-AE6(SEQ ID NO：1347)，和D112-AF5(SEQ ID NO：1348)的核酸序列。
图173-136是D112-AG5(SEQ ID NO：1349)，D112-AH4(SEQ IDNO：1350)，D113-AA9(SEQ ID NO：1351)，D113A-AC3(SEQ ID NO：1352)，和D113A-AD1(SEQ ID NO：1353)的核酸序列。
图173-137是D113A-AD3(SEQ ID NO：1354)，D113A-AF3(SEQ IDNO：1355)，D113A-AG2(SEQ ID NO：1356)，D113A-AH2(SEQ ID NO：1357)，D113-AB9(SEQ ID NO：1358)，和D113-AC7(SEQ ID NO：1359)的核酸序列。
图173-138是D113-AD8(SEQ ID NO：1360)，D113-AD9(SEQ IDNO：1361)，D113-AE7(SEQ ID NO：1362)，D113-AF8(SEQ ID NO：1363)，和D113-AF9(SEQ ID NO：1364)的核酸序列。
图173-139是D113-AG7(SEQ ID NO：1365)，D113-AG9(SEQ IDNO：1366)，D114-AE10(SEQ ID NO：1367)，D114-AF11(SEQ ID NO：1368)，和D115-AA6(SEQ ID NO：1369)的核酸序列。
图173-140是D133-AA7(SEQ ID NO：1370)，D133-AE8(SEQ ID NO：1371)，D133-AF9(SEQ ID NO：1372)，D133-AG8(SEQ ID NO：1373)，D138-AD10(SEQ ID NO：1374)，和D139-AD1(SEQ ID NO：1375)的核酸序列。
图173-141是D140-AA4(SEQ ID NO：1376)，D140-AD4(SEQ ID NO：1377)，D140-AF4(SEQ ID NO：1378)，D141-AA7(SEQ ID NO：1379)，D141-AB7(SEQ ID NO：1380)，和D142-AB11(SEQ ID NO：1381)的核酸序列。
图173-142是D142-AC10(SEQ ID NO：1382)，D142-AE10(SEQ IDNO：1383)，D142-AE11(SEQ ID NO：1384)，D142-AF10(SEQ ID NO：1385)，D144-AA1(SEQ ID NO：1386)，和D144A-AA9(SEQ ID NO：1387)的核酸序列。
图173-143是D144A-AB12(SEQ ID NO：1388)，D144A-AC9(SEQ IDNO：1389)，D144A-AC10(SEQ ID NO：1390)，D144A-AD12(SEQ IDNO：1391)，D144A-AE12(SEQ ID NO：1392)，和D144A-AF11(SEQ ID NO：1393)的核酸序列。
图173-144是D144A-AF12(SEQ ID NO：1394)，D144A-AG11(SEQ IDNO：1395)，D144A-AH9(SEQ ID NO：1396)，D144A-AH11(SEQ ID NO：1397)，和D144-AE4(SEQ ID NO：1398)的核酸序列。
图173-145是D144-AH3(SEQ ID NO：1399)，D145-AA8(SEQ IDNO：1400)，D145-AC10(SEQ ID NO：1401)，D145-AD7(SEQ ID NO：1402)，D145-AD9(SEQ ID NO：1403)和D145-AD10(SEQ ID NO：1404)的核酸序列。
图173-146是D145-AE7(SEQ ID NO：1405)，D145-AF7(SEQ IDNO：1406)，D145-AF8(SEQ ID NO：1407)，D145-AG8(SEQ ID NO：1408)，D145-AG9(SEQ ID NO：1409)，和D145-AG10(SEQ ID NO：1410)的核酸序列。
图173-147是D145-AH9(SEQ ID NO：1411)，D146-BB2(SEQ IDNO：1412)，D146-BC1(SEQ ID NO：1413)，D146-BD1(SEQ ID NO：1414)，和D146-BD2(SEQ ID NO：1415)的核酸序列。
图173-148是D146-BF2(SEQ ID NO：1416)，D147-AE2(SEQ IDNO：1417)，D150-AA2(SEQ ID NO：1418)，D150-AC2(SEQ ID NO：1419)，和D150-AD1(SEQ ID NO：1420)的核酸序列。
图173-149是D151-AA1(SEQ ID NO：1421)，D152-AA2(SEQ ID NO：1422)，D152-AB2(SEQ ID NO：1423)，D152-AC1(SEQ ID NO：1424)，D152-AD2(SEQ ID NO：1425)，和D152-AG2(SEQ ID NO：1426)的核酸序列。
图173-150是D152-AH2(SEQ ID NO：1427)，D153-AA7(SEQ ID NO：1428)，D153-AB2(SEQ ID NO：1429)，D153-AF2(SEQ ID NO：1430)，D153-AF7(SEQ ID NO：1431)，和D153-AF9(SEQ ID NO：1432)的核酸序列。
图173-151是D153-AG6(SEQ ID NO：1433)，D153-AG7(SEQ ID NO：1434)，D153-AG9(SEQ ID NO：1435)，D153-AH6(SEQ ID NO：1436)，和D153-AH9(SEQ ID NO：1437)的核酸序列。
图173-152是D154-AC2(SEQ ID NO：1438)，D154-AE9(SEQ IDNO：1439)，D155-AB1(SEQ ID NO：1440)，D155-AC1(SEQ ID NO：1441)，和D155-AC2(SEQ ID NO：1442)的核酸序列。
图173-153是D155-AE1(SEQ ID NO：1443)，D155-AE2(SEQ ID NO：1444)，D155-AF1(SEQ ID NO：1445)，D155-AF2(SEQ ID NO：1446)，和D155-AH2(SEQ ID NO：1447)的核酸序列。
图173-154是D156-AB1(SEQ ID NO：1448)，D156-AC3(SEQ ID NO：1449)，D156-AC4(SEQ ID NO：1450)，D156-AD3(SEQ ID NO：1451)，和D156-AF2(SEQ ID NO：1452)的核酸序列。
图173-155是D156-AF4(SEQ ID NO：1453)，D156-AG1(SEQ IDNO：1454)，D156-AG2(SEQ ID NO：1455)，D156-AG4(SEQ ID NO：1456)，和D156-AH1(SEQ ID NO：1457)的核酸序列。
图173-156是D157-AG4(SEQ ID NO：1458)，D158-AB8(SEQ ID NO：1459)，D158-AD5(SEQ ID NO：1460)，D158-AD6(SEQ ID NO：1461)，和D158-AD8(SEQ ID NO：1462)的核酸序列。
图173-157是D158-AE8(SEQ ID NO：1463)，D159-AD2(SEQ ID NO：1464)，D160-AB4(SEQ ID NO：1465)，D160-AC4(SEQ ID NO：1466)，和D160-AE4(SEQ ID NO：1467)的核酸序列。
图173-158是D160-AF4(SEQ ID NO：1468)，D160-AH4(SEQ ID NO：1469)，D161-AE5(SEQ ID NO：1470)，D161-AH5(SEQ ID NO：1471)，D164-AB1(SEQ ID NO：1472)，和D164-AB3(SEQ ID NO：1473)的核酸序列。
图173-159是D164-AC1(SEQ ID NO：1474)，D164-AC2(SEQ ID NO：1475)，D164-AC5(SEQ ID NO：1476)，D164-AE1(SEQ ID NO：1477)，和D164-AF1(SEQ ID NO：1478)的核酸序列。
图173-160是D165-AH8(SEQ ID NO：1479)，D177-BB7(SEQ IDNO：1480)，D178-AA6(SEQ ID NO：1481)，D178-AD5(SEQ ID NO：1482)，和D180-AA9(SEQ ID NO：1483)的核酸序列。
图173-161是D181-AB6(SEQ ID NO：1484)，D181-AC6(SEQ ID NO：1485)，D181-AD7(SEQ ID NO：1486)，D181-AG7(SEQ ID NO：1487)，和D181-AH6(SEQ ID NO：1488)的核酸序列。
图173-162是D182-AA1(SEQ ID NO：1489)，D182-AA2(SEQ IDNO：1490)，D182-AA4(SEQ ID NO：1491)，D182-AB2(SEQ ID NO：1492)，和D182-AC2(SEQ ID NO：1493)的核酸序列。
图173-163是D182-AC4(SEQ ID NO：1494)，D182-AD1(SEQ IDNO：1495)，D182-AD3(SEQ ID NO：1496)，D182-AF1(SEQ ID NO：1497)，和D182-AF4(SEQ ID NO：1498)的核酸序列。
图173-164是D182-Ag1(SEQ ID NO：1499)，D183-AC8(SEQ IDNO：1500)，D185-AB10(SEQ ID NO：1501)，D185-AC10(SEQ ID NO：1502)，D185-AF10(SEQ ID NO：1503)，和D185-BA1(SEQ ID NO：1504)的核酸序列。
图173-165是D185-BB3(SEQ ID NO：1505)，D186-AA3(SEQ ID NO：1506)，D186-AB4(SEQ ID NO：1507)，D186-AC2(SEQ ID NO：1508)，D186-AC3(SEQ ID NO：1509)，和D186-AD2(SEQ ID NO：1510)的核酸序列。
图173-166是D186-AD3(SEQ ID NO：1511)，D186-AE3(SEQ IDNO：1512)，D187-AB2(SEQ ID NO：1513)，D187-AB3(SEQ ID NO：1514)，D187-AC4(SEQ ID NO：1515)，D187-AE4(SEQ ID NO：1516)，和D187-AF4(SEQ ID NO：1517)的核酸序列。
图173-167是D187-AG1(SEQ ID NO：1518)，D187-AG2(SEQ IDNO：1519)，D187-AG3(SEQ ID NO：1520)，D187-AH2(SEQ ID NO：1521)，D184-AA1(SEQ ID NO：1522)，和D188-AC7(SEQ ID NO：1523)的核酸序列
图173-168是D188-AC8(SEQ ID NO：1524)，D188-AD8(SEQ IDNO：1525)，D188-AE8(SEQ ID NO：1526)，D188-AF6(SEQ ID NO：1527)，D188-AG5(SEQ ID NO：1528)，和D188-AG7(SEQ ID NO：1529)的核酸序列。
图173-169是D188-AH7(SEQ ID NO：1530)，D189-AA12(SEQ IDNO：1531)，D189-AB10(SEQ ID NO：1532)，D189-AE9(SEQ ID NO：1533)，D189-AE12(SEQ ID NO：1534)，和D189-AF12(SEQ ID NO：1535)的核酸序列。
图173-170是D189-AG10(SEQ ID NO：1536)，D190-BA6(SEQ ID NO：1537)，D190-BD6(SEQ ID NO：1538)，D190-BF6(SEQ ID NO：1539)，D190-BG6(SEQ ID NO：1540)，和D190-BH6(SEQ ID NO：1541)的核酸序列。
图173-171是D191-BC5(SEQ ID NO：1542)，D191-BD5(SEQ ID NO：1543)，D191-BF5(SEQ ID NO：1544)，D191-BG5(SEQ ID NO：1545)，和D194-AA1(SEQ ID NO：1546)的核酸序列。
图173-172是D194-AA2(SEQ ID NO：1547)，D194-AB1(SEQ ID NO：1548)，D194-AB2(SEQ ID NO：1549)，D194-AC1(SEQ ID NO：1550)，和D194-AC2(SEQ ID NO：1551)的核酸序列。
图173-173是D194-AD1(SEQ ID NO：1552)，D194-AD2(SEQ IDNO：1553)，D194-AD3(SEQ ID NO：1554)，D194-AE1(SEQ ID NO：1555)，和D194-AE2(SEQ ID NO：1556)的核酸序列。
图173-174是D194-AE3(SEQ ID NO：1557)，D194-AF1(SEQ IDNO：1558)，D194-AF2(SEQ ID NO：1559)，D194-AG2(SEQ ID NO：1560)，和D194-AG3(SEQ ID NO：1561)的核酸序列。
图173-175是D194-AH1(SEQ ID NO：1562)，D194-AH2(SEQ IDNO：1563)，D194-AH3(SEQ ID NO：1564)，D195-AB6(SEQ ID NO：1565)，D195-AD5(SEQ ID NO：1566)，和D195-AE4(SEQ ID NO：1567)的核酸序列。
图173-176是D195-AE5(SEQ ID NO：1568)，D195-AG5(SEQ IDNO：1569)，D195-AH5(SEQ ID NO：1570)，D196-AD7(SEQ ID NO：1571)，和D196-AF7(SEQ ID NO：1572)的核酸序列。
图173-177是D196-AG7(SEQ ID NO：1573)，D197-AE8(SEQ IDNO：1574)，D198-AB9(SEQ ID NO：1575)，D198-AC9(SEQ ID NO：1576)，和D198-AF9(SEQ ID NO：1577)的核酸序列。
图173-178是D199-AA10(SEQ ID NO：1578)，D199-AB10(SEQ IDNO：1579)，D199-AD10(SEQ ID NO：1580)，D199-AF10(SEQ ID NO：1581)，和D199-AG10(SEQ ID NO：1582)的核酸序列。
图173-179是D200-AB11(SEQ ID NO：1583)，D200-AC11(SEQ IDNO：1584)，D200-AD11(SEQ ID NO：1585)，D200-AE11(SEQ ID NO：1586)，和D200-AG1(SEQ ID NO：1587)的核酸序列。
图173-180是D200-AH11(SEQ ID NO：1588)，D201-AD12(SEQ ID NO：1589)，D201-AE12(SEQ ID NO：1590)，D201-AF12(SEQ ID NO：1591)，D201-AG12(SEQ ID NO：1592)，和D203-BE11(SEQ ID NO：1593)的核酸序列。
图173-181是D203-BF11(SEQ ID NO：1594)，D204-AA1(SEQ ID NO：1595)，D204-AA2(SEQ ID NO：1596)，D204-AA4(SEQ ID NO：1597)，和D204-AB1(SEQ ID NO：1598)的核酸序列。
图173-182是D204-AB3(SEQ ID NO：1599)，D204-AC1(SEQ ID NO：1600)，D204-AC2(SEQ ID NO：1601)，D204-AC4(SEQ ID NO：1602)，和D204-AD1(SEQ ID NO：1603)的核酸序列。
图173-183是D204-AD2(SEQ ID NO：1604)，D204-AD3(SEQ ID NO：1605)，D204-AD4(SEQ ID NO：1606)，D204-AE3(SEQ ID NO：1607)，和D204-AE4(SEQ ID NO：1608)的核酸序列。
图173-184是D204-AF1(SEQ ID NO：1609)，D204-AF3(SEQ ID NO：1610)，D204-AF4(SEQ ID NO：1611)，D204-AG1(SEQ ID NO：1612)，和D204-AG2(SEQ ID NO：1613)的核酸序列。
图173-185是D204-AG3(SEQ ID NO：1614)，D203-BA11(SEQ ID NO：1615)，D204-AG4(SEQ ID NO：1616)，D204-AH2(SEQ ID NO：1617)，和D204-AH1(SEQ ID NO：1618)的核酸序列。
图173-186是D204-AH3(SEQ ID NO：1619)，D205-BC9(SEQ ID NO：1620)，D205-BD9(SEQ ID NO：1621)，D206-CB3(SEQ ID NO：1622)，D206-CE3(SEQ ID NO：1623)，和D206-CF3(SEQ ID NO：1624)的核酸序列。
图173-187是D206-CG1(SEQ ID NO：1625)，D206-CH1(SEQ ID NO：1626)，D210-BF4(SEQ ID NO：1627)，和D210-BF6(SEQ ID NO：1628)的核酸序列。
图173-188是D210-BH6(SEQ ID NO：1629)，D211-BA9(SEQ ID NO：1630)，D211-BB8(SEQ ID NO：1631)，D211-BB9(SEQ ID NO：1632)，D211-BC9(SEQ ID NO：1633)，和D211-BD8(SEQ ID NO：1634)的核酸序列。
图173-189是D211-BD9(SEQ ID NO：1635)，D211-BE7(SEQ ID NO：1636)，D211-BE8(SEQ ID NO：1637)，和D211-BF8(SEQ ID NO：1638)的核酸序列。
图173-190是D211-BF9(SEQ ID NO：1639)，D211-BG8(SEQ ID NO：1640)，D211-BH7(SEQ ID NO：1641)，D212-BB11(SEQ ID NO：1642)，和D212-BB12(SEQ ID NO：1643)的核酸序列。
图173-191是D212-BD10(SEQ ID NO：1644)，D212-BD11(SEQ IDNO：1645)，D212-BE10(SEQ ID NO：1646)，D212-BE11(SEQ ID NO：1647)，D212-BF10(SEQ ID NO：1648)，和D212-BF11(SEQ ID NO：1649)的核酸序列。
图173-192是D213-BD1(SEQ ID NO：1650)，D213-BF2(SEQ ID NO：1651)，D214-AA1(SEQ ID NO：1652)，D214-AA3(SEQ ID NO：1653)，和D214-AC1(SEQ ID NO：1654)的核酸序列。
图173-193是D214-AE1(SEQ ID NO：1655)，D214-AE3(SEQ ID NO：1656)，D214-AG1(SEQ ID NO：1657)，D214-AH2(SEQID NO：1658)，和D214-AH3(SEQ ID NO：1659)的核酸序列。
图173-194是D216-AB7(SEQ ID NO：1660)，D216-AC8(SEQ IDNO：1661)，D216-AH9(SEQ ID NO：1662)，D219-BA1(SEQ ID NO：1663)，D219-BB1(SEQ ID NO：1664)，和D219-BB2(SEQ ID NO：1665)的核酸序列。
图173-195是D219-BC1(SEQ ID NO：1666)，D219-BD1(SEQ IDNO：1667)，D219-BD2(SEQ ID NO：1668)，D219-BE1(SEQ ID NO：1669)，D219-BE2(SEQ ID NO：1670)，和D219-BF2(SEQ ID NO：1671)的核酸序列。
图173-196是D219-BH1(SEQ ID NO：1672)，D220-BF6(SEQ ID NO：1673)，D220-BD6(SEQ ID NO：1674)，D223-BC11(SEQ ID NO：1675)，和D221-BC7(SEQ ID NO：1676)的核酸序列。
图173-197是D227-AE3(SEQ ID NO：1677)，D223-BB10(SEQ ID NO：1678)，D221-BF9(SEQ ID NO：1679)，D229-AD2(SEQ ID NO：1680)，D229-AE2(SEQ ID NO：1681)，D229-AF2(SEQ ID NO：1682)，和D229-AG1(SEQ ID NO：1683)的核酸序列。
图173-198是D229-AH1(SEQ ID NO：1684)，D230-AB1(SEQ IDNO：1685)，D230-AC1(SEQ ID NO：1686)，D230-AC2(SEQ ID NO：1687)，D230-AF2(SEQ ID NO：1688)，和D230-AG1(SEQ ID NO：1689)的核酸序列。
图173-199是D230-AG2(SEQ ID NO：1690)，D231-AA1(SEQ ID NO：1691)，D231-AA2(SEQ ID NO：1692)，D231-AA3(SEQ ID NO：1693)，D231-AC1(SEQ ID NO：1694)，和D231-AC2(SEQ ID NO：1695)的核酸序列。
图173-200是D231-AD2(SEQ ID NO：1696)，D231-AE1(SEQ ID NO：1697)，D231-AG2(SEQ ID NO：1698)，D231-AH1(SEQ ID NO：1699)，D231-AH2(SEQ ID NO：1700)，和D231-AH3(SEQ ID NO：1701)的核酸序列。
图173-201是D232-AD4(SEQ ID NO：1702)，D232-AE5(SEQ ID NO：1703)，D232-AE6(SEQ ID NO：1704)，和D232-AF5(SEQ ID NO：1705)的核酸序列。
图173-202是D233-AA7(SEQ ID NO：1706)，D233-AA8(SEQ ID NO：1707)，D233-AB7(SEQ ID NO：1708)，D233-AC7(SEQ ID NO：1709)，和D233-AC8(SEQ ID NO：1710)的核酸序列。
图173-203是D233-AH9(SEQ ID NO：1711)，D234-AA11(SEQ ID NO：1712)，D234-AC11(SEQ ID NO：1713)，D234-AD11(SEQ ID NO：1714)，D238-AA2(SEQ ID NO：1715)，和D239-BC3(SEQ ID NO：1716)的核酸序列。
图173-204是D239-BD4(SEQ ID NO：1717)，D239-BD6(SEQ ID NO：1718)，D239-BE4(SEQ ID NO：1719)，D240-BB7(SEQ ID NO：1720)，和D241-BC9(SEQ ID NO：1721)的核酸序列。
图173-205是D241-BE9(SEQ ID NO：1722)，D242-BA11(SEQ ID NO：1723)，D242-BB11(SEQ ID NO：1724)，D242-BB12(SEQ ID NO：1725)，D242-BC12(SEQ ID NO：1726)，和D242-BF12(SEQ ID NO：1727)的核酸序列。
图173-206是D242-BG12(SEQ ID NO：1728)，D242-BH11(SEQ IDNO：1729)，D244-AA5(SEQ ID NO：1730)，D244-AA6(SEQ ID NO：1731)，D244-AF6(SEQ ID NO：1732)，和D245-AE7(SEQ ID NO：1733)的核酸序列。
图173-207是D245-AE8(SEQ ID NO：1734)，D245-AF7(SEQ ID NO：1735)，D246-AA12(SEQ ID NO：1736)，D248-AG4(SEQ ID NO：1737)，和D249-AG9(SEQ ID NO：1738)的核酸序列。
图173-208是D250-AE10(SEQ ID NO：1739)，D251-AF2(SEQ IDNO：1740)，D251-AG2(SEQ ID NO：1741)，D252-AA5(SEQ ID NO：1742)，和D252-AB5(SEQ ID NO：1743)的核酸序列。
图173-209是D252-AC5(SEQ ID NO：1744)，D252-AD5(SEQ ID NO：1745)，D252-AF4(SEQ ID NO：1746)，D252-AF5(SEQ ID NO：1747)，D252-AG5(SEQ ID NO：1748)，和D254-AE2(SEQ ID NO：1749)的核酸序列。
图173-210是D254-AG2(SEQ ID NO：1750)，D255-AA5(SEQ IDNO：1751)，D255-AA6(SEQ ID NO：1752)，D255-AD5(SEQ ID NO：1753)，和D255-AD6(SEQ ID NO：1754)的核酸序列。
图173-211是D255-AF5(SEQ ID NO：1755)，D255-AG5(SEQ ID NO：1756)，D256-AA10(SEQ ID NO：1757)，和D256-AB10(SEQ ID NO：1758)的核酸序列。
图173-212是D256-AC10(SEQ ID NO：1759)，D256-AE10(SEQ IDNO：1760)，D256-AF9(SEQ ID NO：1761)，D256-AF10(SEQ ID NO：1762)，和D256-AG10(SEQ ID NO：1763)的核酸序列。
图173-213是D256-AH10(SEQ ID NO：1764)，D258-AC5(SEQ ID NO：1765)，D263-AE12(SEQ ID NO：1766)，D263-AF12(SEQ ID NO：1767)，和D263-AH12(SEQ ID NO：1768)的核酸序列。
图173-214是D264-AA1(SEQ ID NO：1769)，D264-AA2(SEQ ID NO：1770)，D264-AA3(SEQ ID NO：1771)，D264-AB2(SEQ ID NO：1772)，和D264-AC3(SEQ ID NO：1773)的核酸序列。
图173-215是D264-AD3(SEQ ID NO：1774)，D264-AE1(SEQ ID NO：1775)，D264-AE2(SEQ ID NO：1776)，和D264-AE3(SEQ ID NO：1777)的核酸序列。
图173-216是D264-AF2(SEQ ID NO：1778)，D264-AG2(SEQ ID NO：1779)，D264-AH2(SEQ ID NO：1780)，和D265-AA4(SEQ ID NO：1781)的核酸序列。
图173-217是D265-AA6(SEQ ID NO：1782)，D265-AC5(SEQ ID NO：1783)，D265-AC6(SEQ ID NO：1784)，和D265-AD4(SEQ ID NO：1785)的核酸序列。
图173-218是D265-AD5(SEQ ID NO：1786)，D266-AB7(SEQ ID NO：1787)，D266-AB8(SEQ ID NO：1788)，D266-AC9(SEQ ID NO：1789)，和D266-AD7(SEQ ID NO：1790)的核酸序列。
图173-219是D267-AD10(SEQ ID NO：1791)，D268-AA2(SEQ ID NO：1792)，D268-AC3(SEQ ID NO：1793)，D268-AD1(SEQ ID NO：1794)，和D268-AD2(SEQ ID NO：1795)的核酸序列。
图173-220是D268-AD3(SEQ ID NO：1796)，D268-AE3(SEQ ID NO：1797)，D268-AG2(SEQ ID NO：1798)，和D268-AG3(SEQ ID NO：1799)的核酸序列。
图173-221是D269-AA5(SEQ ID NO：1800)，D269-AD4(SEQ ID NO：1801)，D269-AE4(SEQ ID NO：1802)，D269-AF5(SEQ ID NO：1803)，D269-AF6(SEQ ID NO：1804)，和D270-AA8(SEQ ID NO：1805)的核酸序列。
图173-222是D270-AB9(SEQ ID NO：1806)，D270-AD8(SEQ ID NO：1807)，D270-AD9(SEQ ID NO：1808)，D270-AE9(SEQ ID NO：1809)，和D270-AF8(SEQ ID NO：1810)的核酸序列。
图173-223是D271-AG11(SEQ ID NO：1811)，D271-AH11(SEQ IDNO：1812)，D276-AD5(SEQ ID NO：1813)，和D276-AG6(SEQ ID NO：1814)的核酸序列。
图173-224是D276-AH4(SEQ ID NO：1815)，D276-AH6(SEQ IDNO：1816)，D277-AE8(SEQ ID NO：1817)，D277-AF9(SEQ ID NO：1818)，和D277-AH9(SEQ ID NO：1819)的核酸序列。
图173-225是D278-AF10(SEQ ID NO：1820)，D279-AA3(SEQ ID NO：1821)，D279-AB2(SEQ ID NO：1822)，D279-AC1(SEQ ID NO：1823)，和D279-AD2(SEQ ID NO：1824)的核酸序列。
图173-226是D279-AE1(SEQ ID NO：1825)，D279-AE3(SEQ ID NO：1826)，D279-AG3(SEQ ID NO：1827)，D279-BA1(SEQ ID NO：1828)，和D279-BA2(SEQ ID NO：1829)的核酸序列。
图173-227是D279-BB3(SEQ ID NO：1830)，D279-BC2(SEQ IDNO：1831)，D279-BD2(SEQ ID NO：1832)，D279-BE2(SEQ ID NO：1833)，和D279-BF3(SEQ ID NO：1834)的核酸序列。
图173-228是D279-BG1(SEQ ID NO：1835)，D279-BH3(SEQ ID NO：1836)，D280-AB5(SEQ ID NO：1837)，D280-AB6(SEQ ID NO：1838)，和D280-AC4(SEQ ID NO：1839)的核酸序列。
图173-229是D280-AC6(SEQ ID NO：1840)，D280-AD4(SEQ ID NO：1841)，D280-AD5(SEQ ID NO：1842)，D280-AD6(SEQ ID NO：1843)，和D280-AE4(SEQ ID NO：1844)的核酸序列。
图173-230是D280-AE5(SEQ ID NO：1845)，D280-AE6(SEQ ID NO：1846)，D280-AF5(SEQ ID NO：1847)，D280-AF6(SEQ ID NO：1848)，和D280-AG4(SEQ ID NO：1849)的核酸序列。
图173-231是D280-AG5(SEQ ID NO：1850)，D280-AG6(SEQ IDNO：1851)，D280-AH4(SEQ ID NO：1852)，D280-AH5(SEQ ID NO：1853)，和D280-BC4(SEQ ID NO：1854)的核酸序列。
图173-232是D280-BD4(SEQ ID NO：1855)，D280-BE4(SEQ ID NO：1856)，D280-BE6(SEQ ID NO：1857)，和D280-BF4(SEQ ID NO：1858)的核酸序列。
图173-233是D280-BG4(SEQ ID NO：1859)，D280-BH4(SEQ IDNO：1860)，D280-BH6(SEQ ID NO：1861)，D281-AA8(SEQ ID NO：1862)，和D281-AD7(SEQ ID NO：1863)的核酸序列。
图173-234是D281-AD8(SEQ ID NO：1864)，D281-AE7(SEQ IDNO：1865)，D281-AE8(SEQ ID NO：1866)，D281-AE9(SEQ ID NO：1867)，D281-AG7(SEQ ID NO：1868)，和D282-AB10(SEQ ID NO：1869)的核酸序列。
图173-235是D282-AB11(SEQ ID NO：1870)，D282-AD10(SEQ IDNO：1871)，D282-AH11(SEQ ID NO：1872)，D282-BA10(SEQ ID NO：1873)，D282-BB10(SEQ ID NO：1874)，和D282-BD10(SEQ ID NO：1875)的核酸序列。
图173-236是D288-AB3(SEQ ID NO：1876)，D289-AA4(SEQ IDNO：1877)，D289-AA6(SEQ ID NO：1878)，D289-AB4(SEQ ID NO：1879)，和D289-AB6(SEQ ID NO：1880)的核酸序列。
图173-237是D289-AD4(SEQ ID NO：1881)，D289-AE4(SEQ ID NO：1882)，D289-AE6(SEQ ID NO：1883)，D289-AF4(SEQ ID NO：1884)，和D289-AF6(SEQ ID NO：1885)的核酸序列。
图173-238是D289-AG4(SEQ ID NO：1886)，D289-AG6(SEQ ID NO：1887)，D289-AH4(SEQ ID NO：1888)，D289-AH6(SEQ ID NO：1889)，和D290-AA7(SEQ ID NO：1890)的核酸序列。
图173-239是D290-AA8(SEQ ID NO：1891)，D290-AA9(SEQ ID NO：1892)，D290-AB7(SEQ ID NO：1893)，D290-AB9(SEQ ID NO：1894)，和D290-AC8(SEQ ID NO：1895)的核酸序列。
图173-240是D290-AC9(SEQ ID NO：1896)，D290-AD7(SEQ ID NO：1897)，D290-AD8(SEQ ID NO：1898)，D290-AD9(SEQ ID NO：1899)，和D291-AA12(SEQ ID NO：1900)的核酸序列。
图173-241是D291-AB10(SEQ ID NO：1901)，D291-AB11(SEQ IDNO：1902)，D291-AC12(SEQ ID NO：1903)，D291-AD11(SEQ ID NO：1904)，和D291-AD12(SEQ ID NO：1905)的核酸序列。
图173-242是D291-AE10(SEQ ID NO：1906)，D291-AE12(SEQ IDNO：1907)，D291-AF10(SEQ ID NO：1908)，D291-AF12(SEQ ID NO：1909)，和D291-AG11(SEQ ID NO：1910)的核酸序列。
图173-243是D291-AG12(SEQ ID NO：1911)，D291-AH11(SEQ ID NO：1912)，D292-AA2(SEQ ID NO：1913)，D292-AA3(SEQ ID NO：1914)，D292-AB2(SEQ ID NO：1915)，和D292-AC2(SEQ ID NO：1916)的核酸序列。
图173-244是D292-AD1(SEQ ID NO：1917)，D292-AD2(SEQ ID NO：1918)，D292-AE1(SEQ ID NO：1919)，D292-AE2(SEQ ID NO：1920)，D292-AF1(SEQ ID NO：1921)，D292-AF3(SEQ ID NO：1922)，和D292-AH3(SEQ ID NO：1923)的核酸序列。
图173-245是D291-AA10(SEQ ID NO：1924)，D294-AB7(SEQ ID NO：1925)，D294-AB8(SEQ ID NO：1926)，D294-AB9(SEQ ID NO：1927)，和D294-AC7(SEQ ID NO：1928)的核酸序列。
图173-246是D294-AC8(SEQ ID NO：1929)，D294-AE9(SEQ IDNO：1930)，D294-AG8(SEQ ID NO：1931)，D294-AH7(SEQ ID NO：1932)，和D295-AA3(SEQ ID NO：1933)的核酸序列。
图173-247是D295-AB1(SEQ ID NO：1934)，D295-AB2(SEQ ID NO：1935)，D295-AC2(SEQ ID NO：1936)，D295-AC3(SEQ ID NO：1937)，和D295-AD1(SEQ ID NO：1938)的核酸序列。
图173-248是D295-AD2(SEQ ID NO：1939)，D295-AE3(SEQ ID NO：1940)，D295-AF1(SEQ ID NO：1941)，D295-AF2(SEQ ID NO：1942)，和D295-AG3(SEQ ID NO：1943)的核酸序列。
图173-249是D295-AH1(SEQ ID NO：1944)，D296-AA6(SEQ IDNO：1945)，D296-AE5(SEQ ID NO：1946)，D296-AF5(SEQ ID NO：1947)，和D296-AG4(SEQ ID NO：1948)的核酸序列。
图173-250是D296-AG5(SEQ ID NO：1949)，D297-AA7(SEQ ID NO：1950)，D297-AA8(SEQ ID NO：1951)，D297-AB7(SEQ ID NO：1952)，和D297-AE7(SEQ ID NO：1953)的核酸序列。
图173-251是D297-AF7(SEQ ID NO：1954)，D298-AA10(SEQ IDNO：1955)，D298-AB11(SEQ ID NO：1956)，D298-AF11(SEQ ID NO：1957)，和D298-AG12(SEQ ID NO：1958)的核酸序列。
图173-252是D35-40(SEQ ID NO：1959)，D35-AC6(SEQ ID NO：1960)，D35-BB2(SEQ ID NO：1961)，D55-AB9(SEQ ID NO：1962)，和D55-BB1(SEQ ID NO：1963)的核酸序列。
图173-253是D55-BB2(SEQ ID NO：1964)，D55-BB3(SEQ ID NO：1965)，D55-BB7(SEQ ID NO：1966)，D56-AA1(SEQ ID NO：1967)，D56-AE4(SEQ ID NO：1968)，和D56-AE9(SEQ ID NO：1969)的核酸序列
图173-254是D56-AD1(SEQ ID NO：1970)，D56-AG12(SEQ ID NO：1971)，D56-AH11(SEQ ID NO：1972)，D57-AA5(SEQ ID NO：1973)，和D57-AA7(SEQ ID NO：1974)的核酸序列。
图173-255是D57-AB10(SEQ ID NO：1975)，D57-AC2(SEQ ID NO：1976)，D57-AC3(SEQ ID NO：1977)，D57-AC6(SEQ ID NO：1978)，D57-AC9(SEQ ID NO：1979)，和D57-AC11(SEQ ID NO：1980)的核酸序列。
图173-256是D57-AD3(SEQ ID NO：1981)，D57-AE4(SEQ ID NO：1982)，D57-AE6(SEQ ID NO：1983)，D57-AE9(SEQ ID NO：1984)，和D57-AF4(SEQ ID NO：1985)的核酸序列。
图173-257是D57-AF11(SEQ ID NO：1986)，D57-AG3(SEQ ID NO：1987)，D57-AH11(SEQ ID NO：1988)，D58-AB2(SEQ ID NO：1989)，D58-AC8(SEQ ID NO：1990)，和D58-AG9(SEQ ID NO：1991)的核酸序列。
图173-258是D58-BA9(SEQ ID NO：1992)，D58-BB9(SEQ IDNO：1993)，D58-BC1(SEQ ID NO：1994)，D58-BC10(SEQ ID NO：1995)，D58-BC11(SEQ ID NO：1996)，和D58-BD4(SEQ ID NO：1997)的核酸序列。
图173-259是D58-BE8(SEQ ID NO：1998)，D58-BF4(SEQ ID NO：1999)，D60-AB4(SEQ ID NO：2000)，D60-AC4(SEQ ID NO：2001)，D60-AD11(SEQ ID NO：2002)，和D60-AF9(SEQ ID NO：2003)的核酸序列。
图173-260是D65-AB6(SEQ ID NO：2004)，D65-AC3(SEQ ID NO：2005)，D65-AC9(SEQ ID NO：2006)，D65-AC12(SEQ ID NO：2007)，D65-AE3(SEQ ID NO：2008)，和D65-AG1(SEQ ID NO：2009)的核酸序列。
图173-261是D65-CE10(SEQ ID NO：2010)，D65-CE11(SEQ IDNO：2011)，D65-CF11(SEQ ID NO：2012)，D65-CH5(SEQ ID NO：2013)，D66-AA1(SEQ ID NO：2014)，和D66-AA3(SEQ ID NO：2015)的核酸序列。
图173-262是D66-AE5(SEQ ID NO：2016)，D66-AF1(SEQ ID NO：2017)，D66-AG2(SEQ ID NO：2018)，D66-AG6(SEQ ID NO：2019)，和D66-AH3(SEQ ID NO：2020)的核酸序列。
图173-263是D66-BA11(SEQ ID NO：2021)，D66-BD6(SEQ ID NO：2022)，D66-BD8(SEQ ID NO：2023)，D67-AA5(SEQ ID NO：2024)，D67-AD3(SEQ ID NO：2025)，和D67-AE1(SEQ ID NO：2026)的核酸序列。
图173-264是D67-AE4(SEQ ID NO：2027)，D67-AG4(SEQ ID NO：2028)，D68-AF3(SEQ ID NO：2029)，D70A-AE1(SEQ ID NO：2030)，D70A-AG7(SEQ ID NO：2031)，和D70A-BC6(SEQ ID NO：2032)的核酸序列。
图173-265是D70A-BF7(SEQ ID NO：2033)，D70A-BF8(SEQ ID NO：2034)，D70A-BH1(SEQ ID NO：2035)，D70A-BH3(SEQ ID NO：2036)，和D73A-AA1(SEQ ID NO：2037)的核酸序列。
图173-266是D73A-AA3(SEQ ID NO：2038)，D73A-AA5(SEQ ID NO：2039)，D73A-AA6(SEQ ID NO：2040)，D73A-AA8(SEQ ID NO：2041)，D73A-AA9(SEQ ID NO：2042)，和D73A-AB1(SEQ ID NO：2043)的核酸序列。
图173-267是D73A-AB3(SEQ ID NO：2044)，D73A-AB5(SEQ ID NO：2045)，D73A-AB10(SEQ ID NO：2046)，D73A-AC2(SEQ ID NO：2047)，和D73A-AC5(SEQ ID NO：2048)的核酸序列。
图173-268是D73A-AC11(SEQ ID NO：2049)，D73A-AC12(SEQ IDNO：2050)，D73A-AD7(SEQ ID NO：2051)，D73A-AD10(SEQ ID NO：2052)，D73A-AE6(SEQ ID NO：2053)，和D73A-AE7(SEQ ID NO：2054)的核酸序列。
图173-269是D73A-AE8(SEQ ID NO：2055)，D73A-AE12(SEQ IDNO：2056)，D73A-AF5(SEQ ID NO：2057)，D73A-AF6(SEQ ID NO：2058)，D73A-AF12(SEQ ID NO：2059)，和D73A-AG4(SEQ ID NO：2060)的核酸序列。
图173-270是D73A-AG6(SEQ ID NO：2061)，D73A-AG10(SEQ IDNO：2062)，D73A-AH2(SEQ ID NO：2063)，D73A-AH3(SEQ ID NO：2064)，和D73A-AH10(SEQ ID NO：2065)的核酸序列。
图173-271是D93-AD3(SEQ ID NO：2066)，D97-AD3(SEQ ID NO：2067)，D97-AE3(SEQ ID NO：2068)，D97-AF1(SEQ ID NO：2069)，和D113-AH8(SEQ ID NO：2070)的核酸序列。
图173-272是D114-AA10(SEQ ID NO：2071)，D114-AC11(SEQ IDNO：2072)，D131-AD1(SEQ ID NO：2073)，D133-AD7(SEQ ID NO：2074)，和D139-AD2(SEQ ID NO：2075)的核酸序列。
图173-273是D139-AF2(SEQ ID NO：2076)，D144A-AB10(SEQ IDNO：2077)，D144A-AE9(SEQ ID NO：2078)，D144A-AG12(SEQ ID NO：2079)，D145-AC7(SEQ ID NO：2080)，和D145-AH7(SEQ ID NO：2081)的核酸序列。
图173-274是D150-AA3(SEQ ID NO：2082)，D150-AG3(SEQ ID NO：2083)，D151-AG3(SEQ ID NO：2084)，D153-AA8(SEQ ID NO：2085)，D153-AB7(SEQ ID NO：2086)，和D153-AC9(SEQ ID NO：2087)的核酸序列。
图173-275是D153-AF8(SEQ ID NO：2088)，D155-AA2(SEQ ID NO：2089)，D155-AG2(SEQ ID NO：2090)，D156-AH3(SEQ ID NO：2091)，D159-AA2(SEQ ID NO：2092)，和D164-AD1(SEQ ID NO：2093)的核酸序列。
图173-276是D181-AG6(SEQ ID NO：2094)，D182-AB1(SEQ ID NO：2095)，D182-AF2(SEQ ID NO：2096)，D185-AE10(SEQ ID NO：2097)，D186-AH3(SEQ ID NO：2098)，和D188-AC6(SEQ ID NO：2099)的核酸序列。
图173-277是D188-AF5(SEQ ID NO：2100)，D189-AD12(SEQ IDNO：2101)，D258-AG6(SEQ ID NO：2102)，D194-AA3(SEQ ID NO：2103)，D194-AB3(SEQ ID NO：2104)，D198-AD9(SEQ ID NO：2105)，和D198-AE9(SEQ ID NO：2106)的核酸序列。
图173-278是D203-BB11(SEQ ID NO：2107)，D203-BC11(SEQ IDNO：2108)，D204-AA3(SEQ ID NO：2109)，D204-AF2(SEQ ID NO：2110)，D206-CB(SEQ ID NO：2111)，和D214-AB1(SEQ ID NO：2112)的核酸序列。
图173-279是D214-AF2(SEQ ID NO：2113)，D216-AA7(SEQ IDNO：2114)，D216-AD7(SEQ ID NO：2115)，D219-BA2(SEQ ID NO：2116)，D219-BF1(SEQ ID NO：2117)，和D229-AB2(SEQ ID NO：2118)的核酸序列。
图173-280是D230-AD2(SEQ ID NO：2119)，D230-AE2(SEQ IDNO：2120)，D234-AE12(SEQ ID NO：2121)，D241-BG10(SEQ ID NO：2122)，D249-AA9(SEQ ID NO：2123)，和D255-AC5(SEQ ID NO：2124)的核酸序列。
图173-281是D270-AE7(SEQ ID NO：2125)，D270-AE8(SEQ IDNO：2126)，D276-AH5(SEQ ID NO：2127)，D279-AA2(SEQ ID NO：2128)，和D279-AB3(SEQ ID NO：2129)的核酸序列。
图173-282是D279-AC2(SEQ ID NO：2130)，D279-AC3(SEQ IDNO：2131)，D279-AD3(SEQ ID NO：2132)，和D279-AE2(SEQ ID NO：2133)的核酸序列。
图173-283是D279-AG2(SEQ ID NO：2134)，D279-AH3(SEQ IDNO：2135)，D280-BF6(SEQ ID NO：2136)，D281-AB8(SEQ ID NO：2137)，和D281-AC7(SEQ ID NO：2138)的核酸序列。
图173-284是D282-AG10(SEQ ID NO：2139)，D288-AC2(SEQ ID NO：2140)，D289-AC6(SEQ ID NO：2141)，D290-AB8(SEQ ID NO：2142)，和D291-AD10(SEQ ID NO：2143)的核酸序列。
图173-285是D291-AE11(SEQ ID NO：2144)，D291-AH12(SEQ IDNO：2145)，D292-AB3(SEQ ID NO：2146)，D292-AD3(SEQ ID NO：2147)，D292-AE3(SEQ ID NO：2148)，和D294-AE7(SEQ ID NO：2149)的核酸序列。
图173-286是D419-AH11(SEQ ID NO：2150)，D295-AE2(SEQ IDNO：2151)，D295-AG2(SEQ ID NO：2152)，D295-AH2(SEQ ID NO：2153)，D295-AH3(SEQ ID NO：2154)，和D296-AD4(SEQ ID NO：2155)的核酸序列。
图173-287是D296-AF4(SEQ ID NO：2156)，D296-AG6(SEQ IDNO：2157)，D297-AD7(SEQ ID NO：2158)，D297-AG7(SEQ ID NO：2159)，和D298-AD11(SEQ ID NO：2160)的核酸序列。
图173-288是D418-AH9(SEQ ID NO：2161)，D418-AG10(SEQ IDNO：2162)，D416-AA6(SEQ ID NO：2163)，D414-AA2(SEQ ID NO：2164)，和D269-AD5(SEQ ID NO：2165)的核酸序列。
图173-289是D268-AE1(SEQ ID NO：2166)，D258-AF6(SEQ IDNO：2167)，D256-AG9(SEQ ID NO：2168)，D255-AH6(SEQ ID NO：2169)，和D255-AE5(SEQ ID NO：2170)的核酸序列。
图173-290是D419-AE11(SEQ ID NO：2171)，D142-AA10(SEQ ID NO：2172)，D140-AH4(SEQ ID NO：2173)，D66-AF7(SEQ ID NO：2174)，和D66-AA7(SEQ ID NO：2175)的核酸序列。
图173-291是D65-AF9(SEQ ID NO：2176)，D65-AB3(SEQ IDNO：2177)，D65-AB2(SEQ ID NO：2178)，D144A-AA12(SEQ ID NO：2179)，和D64-7(SEQ ID NO：2180)的核酸序列。
图173-292是D109-BF9(SEQ ID NO：2181)，D109-BG9(SEQ IDNO：2182)，D118-AA11(SEQ ID NO：2183)，D142-AB11(5′)(SEQ IDNO：2184)，和D142-AE10(5′)(SEQ ID NO：2185)的核酸序列。
图173-293是D207-AH5(SEQ ID NO：2186)，D231-AA1(5′)(SEQ IDNO：2187)，D232-AD4(5′)(SEQ ID NO：2188)，D232-AE6(5′)(SEQ IDNO：2189)，和D288-AA3(SEQ ID NO：2190)的核酸序列。
图173-294是D289-AE6(SEQ ID NO：2191)，D290-AC7(SEQ ID NO：2192)，D58-AA2(SEQ ID NO：2193)的核酸序列。
详细描述
常规上，许多步骤涉及任何新的，理想的植物生殖质的开发。植物育种的开始要进行目前生殖质的问题和缺点的分析和明确，建立计划目标，并且明确具体的育种目标。下一个步骤是选择具有符合计划目标的要求的性状的生殖质。目标是将来自母体生殖质的理想的性状的改善的组合组合到单一种类中。理想的性状包括，例如更高的种子产率，对于疾病和昆虫的抗性，对干旱和热的耐受性，和更好的农学品质。然而，导致销售和分配的最终步骤的这些方法从进行第一次杂交的时间开始要花费6-12年的时间。因此，开发新品种是耗费时间的过程，其需要精确的远期计划，资源的有效使用，和定向上的最少变化。
通过遗传转化改善植物种类对于现代植物育种变得越来越重要。具有潜在商业利益的基因，诸如传递特定的，疾病抗性、昆虫抗性或改善的品质的理想的植物性状的基因可以通过各种基因传递技术结合到作物物种中。操控基因表达的能力提供在转化的植物中产生新特征的方式。在一些情形中，高或增加的水平的基因表达可以是理想的。例如，理想的是增加蛋白质的制备，所述蛋白质本身使疾病抗性、产率、气味，或植物的任何其它商业理想的特性最大化。类似地，通过，例如基因沉默的内源基因表达的调节可以导致更有价值的植物或植物产品的产生。
在烟草成熟或熟化的过程中，被鉴定为乙烯诱导或衰老相关的任何基因(例如具有SEQ ID NOS：4，40，44，52，54，60，70，104，138，140，158，162，188，212，226，234，和288的序列的那些)的激活、上调或下调可以影响那些代谢途径，所述代谢途径涉及许多次级代谢物的形成，所述次级代谢物包括类萜、多酚、生物碱等，其影响最终产物品质性状(例如，疾病抗性、昆虫抗性、改善的品质、改变的香味，改变的气味等)。受到本文所鉴定的基因的类似影响的可以是与在衰老过程中累积的干物质的速率和类型或在衰老过程中在植物中的干物质分配相关的代谢途径。可以显示的是在淀粉累积、木质素形成、纤维素沉积和糖转运的速率和类型中的变化。本文鉴定的基因的控制还可以影响那些代谢途径，所述代谢途径涉及衰老速率的确定，在叶子中衰老和在单一植物中的多片叶子中的衰老的一致性，和通过人工或天然方式对衰老的诱导。刺激或激活本文鉴定的基因的衰老诱导剂或活性包括例如化学品诸如弱过氧化物，杀虫剂，除草剂，生长调节剂，热处理，伤，或气体诸如臭氧和升高浓度的二氧化碳。
鉴定烟草组成性表达的，或乙烯或衰老诱导的序列
按照本发明，从转化体和非转化体烟草属品系的烟草属组织中提取RNA。接着，将提取的RNA用于产生cDNA。接着，使用两种策略来产生本发明的核酸序列。
在第一个策略中，从植物组织中提取富聚腺苷酸的RNA，并且通过反转录PCR来制备cDNA。接着，使用简并引物加寡d(T)反向引物，将单链cDNA用于产生p450特异性PCR群。引物设计基于其它植物细胞色素p450基因序列的高度保守基序进行。特异性简并引物的实例在US2004/0103449 A1和US 2004/0111759 A1和US 2004/0117869 A1专利申请出版物中的图1中提出，将其并入本文作为参考。将来自包含适合大小的插入片段的质粒的片段的序列进行进一步分析。根据所用的引物，这些大小的插入片段典型地在从约300到约800核苷酸。
在第二个策略中，开始构建cDNA文库。使用简并引物加作为反向引物的在质粒上的T7引物将质粒中的cDNA用于产生p450特异性PCR群。如在第一个策略中，对来自包含适合大小的插入片段的质粒的片段的序列进行进一步分析。
可以将已知产生高水平的去甲烟碱的烟草属植物品系(转化体)和具有低水平去甲烟碱的植物品系用作原材料。接着可以从植物中去除叶子，并且用乙烯进行处理以激活本文定义的p450酶活性。使用本领域已知的技术来提取总的RNA。接着，可以使用以在图161中所述的寡d(T)引物(SEQID NO：2260)进行的PCR(RT-PCR)来产生cDNA片段。接着，可以如在本文实施例中所更充分的描述来构建cDNA文库。
将p450型酶的保守区用作简并引物的模板，其实例显示在图161中。使用简并引物，通过PCR来扩增p450特异性条带。通过DNA测序来鉴定指示p450样酶的带。使用BLAST搜索，排比或其它工具来对PCR片段进行表征以鉴定适合的候选物。
将来自被鉴定的片段的序列信息用于开发PCR引物。将这些引物与cDNA文库中的质粒引物组合以用于克隆全长p450基因。进行大规模Southern反向分析来检查获得的所有的片段克隆和在某些情形中的全长克隆的差异表达。在本发明的该方面中，可以使用来自不同组织的标记的总cDNAs作为探针与克隆的DNA片段进行杂交来进行这些大规模的反向Southern测定从而筛选所有的克隆的插入片段。还将非放射性和放射性(P32)RNA印迹法用于表征克隆的p450片段和全长克隆。
一旦获得了表达需要水平的p450酶的植物细胞，可以使用本领域众所周知的方法和技术来从其中再生植物组织和完整的植物。接着，通过常规方式来繁殖再生的植物，并且可以通过常规植物育种技术将引入的基因传递到其它植株和栽培种中。
乙烯诱导的或衰老诱导的基因，例如在SEQ ID NOS：4，40，44，52，54，60，70，104，138，140，158，162，188，212，226，234，和288中鉴定的那些，可以编码作为烟草叶子质量参数的重要决定因素的酶，所述烟草叶子质量参数对于各种烟草产品是重要的。所述烟草产品包括湿或干鼻烟，嚼烟，卷烟，雪茄烟，小雪茄烟，pipe tobaccos，bidis和类似熏烟产品。所述叶子品质参数可以包括：视觉品质诸如颜色、表面均一性、质地、或彩斑；结构或物理特征，例示为叶片-茎比率、油质、卷烟填充潜能、松密度、保湿性和柔韧性；与气味、香味、发酵能力、燃烧速率、燃烧温度、人工香味吸收和释放相关的化学或生化性状；和烟组分，包括焦油或颗粒物质，生物碱的产生，和其它类似属性。由这些乙烯诱导或衰老相关的基因导致的酶促反应还可以产生影响病原体或昆虫相互作用的次级代谢物，其影响烟草叶子产率和质量。例如Wagner，et al.(Nature Biotechnology，19：371-374，2001)显示p450羟化酶基因的抑制大大增加cembratiene-ol，一种影响蚜虫抗性的次级代谢物的累积。
抗体的产生
通过衍生它们的氨基酸序列和选择具备抗原性且相对于其它克隆是独特的肽区域来制备肽特异性抗体。制备兔抗体以合成与载体蛋白缀合的肽。使用这些抗体，在植物组织上进行蛋白质印迹分析或其它免疫方法。此外，通过衍生它们的氨基酸序列和选择具有潜在抗原性并且相对于其它克隆是独特的肽区域来制备针对数种全长克隆的肽特异性抗体。制备兔抗体以合成与载体蛋白缀合的肽。使用这些抗体，进行蛋白质印迹分析。
基因表达的下调和改变酶活性
按照标准基因沉默方法来产生具有减少的多肽的表达的植物。(至于综述，见Arndt和Rank，Genome 40：785-797，1997；Turner和Schuch，Journal of Chemical Technology and Biotechnology 75：869-882，2000；和Klink和Wolniak，Journal of Plant Growth Regulation 19(4)：371-384，2000.)具体而言，可以将烟草烟碱脱甲基酶核酸序列(例如，SEQ ID NOS：4，5，7，8，和9或其片段诸如SEQ ID NOS：1和62的序列)，以及基本相同的核酸序列(例如，SEQ ID NO：188的序列)用于改变烟草表型或烟草代谢物，例如在任何烟草种类中的去甲烟碱。烟草烟碱脱甲基酶基因的减少的表达可以使用，例如下述途径来实现：RNA干扰(RNAi)(Smith et al.，Nature407：319-320，2000；Fire et al.，Nature 391：306-311，1998；Waterhouse et al.，PNAS 95：13959-13964，1998；Stalberg et al.，Plant Molecular Biology 23：671-683，1993；Brignetti et al.，EMBO J.17：6739-6746，1998；Allen et al.，NatureBiotechnology 22：1559-1566，2004)；病毒诱导的基因沉默(″VIGS″)(Baulcombe，Current Opinions in Plant Biology，2：109-113，1999；Cogoni和Macino，Genes Dev 10：638-643，2000；Ngelbrecht et al.，PNAS91：10502-10506，1994)；通过在有义方向传递植物内源基因来使目标基因沉默(Jorgensen et al.，Plant Mol Biol 31：957-973，1996)；反义基因的表达；同源重组(Ohl et al.，Homologous Recombination and Gene Silencing inPlants Kluwer，Dordrecht，The Netherlands，1994)；Cre/lox系统(Qin et al.，PNAS 91：1706-1710，1994；Koshinsky et al.，The Plant Journal 23：715-722，2000；Chou，et al.，Plant and Animal GenomeVII Conference Abstracts.SanDiego，CA，17-21 1999年1月)；基因捕获和T-DNA标记(Burns et al.，GenesDev.8：1087-1105，1994；Spradling，et al.，PNAS 92：10824-10830，1995；Skarnes et al.，Bio/Technology 8，827-831，1990；Sundaresan，et al.，Genes Dev.9：1797-1810，1995)；和任何其它可能的基因沉默系统进行，所述基因沉默系统可在沉默区获得，其导致烟草多肽的表达的下调或在其酶活性中的减少。如本文进一步提供，使用本文所述的技术和在本领域发现的其它技术可以将本文提供的任何核酸序列进行下调或上调。在下面更详细地描述示例性方法。
RNA干扰
RNA干扰(″RNAi″)是通常在许多生物包括植物中用于诱导有效的和特异性的翻译后基因沉默的可应用的方法(见，例如，Bosher et al.，Nat.CellBiol.2：E31-36，2000；和Tavernarakis et al.，Nat.Genetics 24：180-183，2000)。RNAi包括将具有部分或全长双链特征的RNA引入细胞或引入细胞外环境中。抑制是特异性的，因为选择来自目标基因(例如烟草烟碱脱甲基酶)的部分的核苷酸序列来产生抑制RNA。选择的部分通常包括目标基因的外显子，但是选择的部分还可以包括非翻译序列(UTRs)，以及内含子(例如SEQ ID NO：7的序列，或来自理想的植物基因的核酸序列，诸如在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的任何核酸序列)。
例如，为了构建产生能够形成双链体的RNAs的转化载体，可以将一个在有义方向，另一个在反义方向的两个核酸序列，可操纵地进行连接，并且将其置于强病毒启动子的控制下，所述强病毒启动子诸如CaMV 35S，或从木薯棕色条纹病毒(CBSV)中分离的启动子。然而，使用内源启动子，诸如具有SEQ ID NO：8的序列的烟碱脱甲基酶启动子，或驱动转录的其片段也可以是理想的。包括在这种构建体中的烟草烟碱脱甲基酶核酸序列的长度理想地是至少25个核苷酸，但是可以包括这样的序列，其包括直到全长的烟草烟碱脱甲基酶基因。
可以通过土壤杆菌介导的转化(Chuang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990，2000)将产生能够形成双链体的RNAs的构建体引入植物诸如烟草植物的基因组，导致烟草烟碱脱甲基酶中的特异性和可遗传的遗传干扰。还可以将双链RNA直接引入细胞(即，细胞内地)或细胞外地引入，例如通过将种子、幼苗或植物浸浴在包含双链RNA的溶液中来进行。
根据递送的双链RNA物质的剂量，所述RNAi可以提供目标基因的功能的部分或完全的损失。可以在至少99％的目标细胞中获得基因表达的减少或损失。通常，被注射物质的更低的剂量和在施用dsRNA后的更长时间导致更少部分的细胞的抑制。
在RNAi中所用的RNA可以包括聚合的核糖核苷酸的一条或多条链；其可以包括对磷酸—糖主链或核苷的改变。双链结构可以通过单一自我互补的RNA链或通过两条互补的RNA链来形成并且RNA双链体形成可以在细胞的内部或外部开始。可以以容许每个细胞递送至少一个拷贝的量来引入RNA。然而，更高的剂量(例如，每个细胞至少5，10，100，500或1000个拷贝)的双链物质可以产生更有效的抑制。抑制是序列特异性的，因为遗传抑制针对对应于RNA的双链体区的核苷酸序列。对于抑制，优选包含与目标基因的部分相同的核苷酸序列的RNA。相对于目标序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列对于抑制也可以是有效的。因此，可以通过本领域已知的排比算法和在核苷酸序列之间计算百分比差异来优化序列同一性。备选地，可以将RNA的双链体区在功能上定义为能够与目标基因转录物的部分杂交的核苷酸序列。
此外，用于RNAi的RNA可以在体内或体外进行合成。例如，在细胞中的内源RNA聚合酶可以介导体内转录，或可以将克隆的RNA聚合酶用于体内或体外转录。对于从体内的转基因或表达的构建体中进行转录，可以将调节区用于转录RNA一条链(或多条链)。
三链干扰
内源烟草烟碱脱甲基酶基因表达或来自需要的植物基因的核酸片段，诸如在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的任何核酸序列的表达还可以通过靶向互补于烟草基因的调节区(例如，启动子或增强子区)的脱氧核糖核苷酸序列以形成三股螺旋结构来进行下调，所述三股螺旋结构阻止靶细胞中的目标基因的转录(通常见，Helene，Anticancer Drug Des.6：569-584，1991；Helene et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36，1992；和Maher，Bioassays 14：807-815，1992)。
对于转录的抑制，在三股螺旋形成中所用的核酸分子优选地是单链的并且由脱氧核糖核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成应该以Hoogsteen碱基配对法则来促进三股螺旋形成，其通常需要相当大的嘌呤或嘧啶的一段序列存在于双链体的一条链上。核苷酸序列可以是基于嘧啶的，其将导致穿过得到的三股螺旋的三条相关链的TAT和CGC三联体。富含嘧啶的分子以与该链平行的方向提供对于所述双链体的单链的富含嘌呤区的碱基互补性。此外，可以选择富含嘌呤的核酸分子，例如包含G残基的一段序列。这些分子将与富含GC对的DNA双链体形成三股螺旋，其中大部分的嘌呤残基位于目标双链体的单链上，导致穿过在三股螺旋中的三条链的CGC三联体。
或者，对于三股螺旋形成可以被靶向的可能序列可以通过产生“转向”核酸分子得以增加。转向分子以交替的5′-3′，3′-5′方式进行合成，从而使得它们与双链体的第一条链碱基配对，接着与另一条链碱基配对，消除了存在于双链体的一条链上的嘌呤或嘧啶的相当大的一段序列的必要性。
核糖核酸酶
核糖核酸酶是这样的RNA分子，其充当酶起作用并且可以被改造以裂解其它的RNA分子。可以对核糖核酸酶进行设计以特异性地与实际上任何目标RNA配对并且裂解在特定位点的磷酸二酯骨架，由此在功能上使目标RNA失活。在此过程中，核糖核酸酶本身没有消耗，并且可以在催化上起作用来裂解多拷贝的mRNA目标分子。因此，还可以将核糖核酸酶用作下调烟草烟碱脱甲基酶的表达的工具。目标RNA-特异性核糖核酸酶的设计和使用描述在Haseloff et al.(Nature 334：585-591，1988)中。优选地，核糖核酸酶在核糖核酸酶的活性位点的每一侧上包括互补于目标序列(例如，烟草烟碱脱甲基酶或来自需要的植物基因的核酸片段，诸如在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的任何核酸序列)的至少约20个连续的核苷酸。
此外，核糖核酸酶序列还可以被包括在反义RNA中以赋予在反义RNA上的RNA-裂解活性并且因此增加反义构建体的有效性。
同源重组
基因替代技术是下调给定基因的表达的另一种理想的方法。基因替代技术基于同源重组(见，Schnable et al.，Curr.Opinions Plant Biol.1：123-129，1998)。可以通过诱变(例如，插入、缺失、复制或替代)来操纵目标酶诸如烟草烟碱脱甲基酶的核酸序列或由在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的任何核酸序列编码的多肽以减少酶的功能。接着，可以将改变的序列引入基因组中通过同源重组以替代现存的，例如野生型的基因(Puchta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：5055-5060，1996；和Kempin et al.，Nature 389：802-803，1997)。或者，可以用不具有脱甲基酶活性的基因，例如SEQ ID NO：188的序列来取代内源烟草烟碱脱甲基酶基因。
共抑制
使基因表达沉默的另一种理想的方法是共抑制(也称为有义抑制)。该技术已经显示对目标基因的转录的有效地封闭(见，例如，Napoli et al.，PlantCell，2：279-289，1990和Jorgensen et al.，美国专利号5,034,323)，所述技术以有义方向构造引入核酸，例如来自需要的植物基因的核酸片段，诸如在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的任何核酸序列。
一般而言，有义抑制包括被引入序列的转录。然而，共抑制还可以发生在被引入的序列本身不包含编码序列的时候，但是仅有内含子或非翻译序列或基本上与存在于内源基因的初级转录物中的序列相同的其它这样的序列将被抑制。被引入的序列通常基本上与被靶向抑制的内源基因相同。这样的同一性典型地大于约50％，但是优选更高的同一性(例如，80％或甚至95％)，因为它们导致更有效的抑制。共抑制的效果还可以被应用于在显示同源性或基本的同源性的基因的类似家族中的其它蛋白质。可以将来自一种植物的基因的片段用于直接，例如，抑制在不同植物种类中的同源基因的表达。
在有义抑制中，要求更少绝对同一性的被引入序列，相对于初级转录产物或充分加工的mRNA，不需要是全长的。在短于全长的序列中的更高程度的序列同一性弥补更少同一性的更长序列。此外，被引入的序列不需要具有相同的内含子或外显子模式，并且非编码片段的同一性可以是一样有效的。优选至少50个碱基对的序列，其中更优选更长长度的被引入序列(见，例如，描述在Jorgensen et al.，美国专利号5,034,323中的方法)。反义抑制
在反义技术中，克隆来自需要的植物的基因的核酸片段，诸如图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的任何核酸序列，并且将其与表达控制区可操纵地连接从而合成RNA的反义链。接着，将构建体转化到植物中并且产生RNA的反义链。在植物细胞中，已经显示反义RNA抑制基因表达。
被引入反义抑制的核酸片段通常基本上与被抑制的内源一个或多个基因的至少一部分相同，但是不需要是相同的。本文公开的烟草烟碱脱甲基酶的核酸序列可以被包括在设计的载体中从而使抑制作用应用于显示与目标基因同源或基本同源的基因的家族中的其它蛋白质。可以将来自一种植物的基因的片段直接用于，例如抑制在不同烟草种类中的同源基因的表达。
相对于初级转录产物或充分加工的mRNA，被引入的序列也不需要是全长的。一般而言，可以将更高的同源性用于弥补更短序列的使用。而且，被引入的序列不需要具有相同的内含子或外显子模式，并且非编码片段的同源性将是一样的有效。通常，这样的反义序列在长度上将通常是至少15个碱基对，优选地是约15-200个碱基对，并且更优选地是200-2,000个碱基对或更长。反义序列可以互补于待抑制基因的全部或部分，并且如本领域技术那些技术人员所理解，根据需要抑制的程度和反义序列的独特性，反义序列结合的特定一个或多个位点以及反义序列的长度将会变化。表达植物负调节物反义核苷酸序列的转录构建体在转录的方向上包括，启动子，编码有义链上的反义RNA的序列，和转录终止区。可以构建反义序列并且将其如例如在van der Krol et al.(Gene 72：45-50，1988)；Rodermel etal.(Cell 55：673-681，1988)；Mol et al.(FEBS Lett.268：427-430，1990)；Weigel和Nilsson(Nature 377：495-500，1995)；Cheung et al.，(Cell82：383-393，1995)；和Shewmaker et al.(美国专利号5,107,065)中所述进行表达。
显性负调控
可以在人工环境或在田间来测定转基因植物，从而证实所述转基因在转基因植物中赋予下调烟草基因产物，所述转基因植物表达编码烟草基因产物的显性负调控基因产物的转基因。按照本领域已知的方法来构建显性负调控转基因。典型地，显性负调控基因编码烟草基因产物的突变的负调节物多肽，其当过量表达时，干扰野生型酶的活性。
突变体
还可以使用标准的诱变的方法来产生具有减少的烟草基因产物的表达或酶活性的植物。这些诱变的方法包括，但不限于，用甲基硫酸乙酯处理种子(Hildering和Verkerk，In，The use of induced mutations in plantbreeding.Pergamon press，pp 317-320，1965)或UV-辐射，X-射线，和快中子辐射(见，例如，Verkerk，Neth.J.Agric.Sci.19：197-203，1971；和Poehlman，Breeding Field Crops，Van Nostrand Reinhold，New York(3.sup.rd ed)，1987)，使用转座子(Fedoroff et al.，1984；美国专利号4,732,856和美国专利号5,013,658)，以及T-DNA插入方法(Hoekema et al.，1983；美国专利号5,149,645)。可以存在于烟草基因中的突变的类型，包括，例如点突变、缺失、插入、复制和倒位。这些突变理想地存在于烟草基因的编码区中；然而，在烟草基因的启动子区，和内含子，或非翻译区中的突变也可以是理想的。
例如，可以将T-DNA插入诱变用于在烟草基因中产生插入突变以下调所述基因的表达。在理论上，对于在任何给定基因中获得插入片段的95％的可能性，需要约100,000个独立的T-DNA插入片段(McKinnet，PlantJ.8：613-622，1995；和Forsthoefel et al.，Aust.J.Plant Physiol.19：353-366，1992)。可以使用聚合酶链式反应(PCR)分析来筛选植物的T-DNA标记的品系。例如，可以设计用于T-DNA的一端的引物，并且可以设计用于目标基因的另一种引物，两种引物都可以用在PCR分析中。如果没有获得PCR产物，那么在目标基因中没有插入片段。相反，如果获得PCR产物，那些在目标基因中有插入片段。
可以按照标准方法(例如，在本文中所述的那些)来评估突变的烟草基因产物的表达，并且任选地可以与未突变酶的表达进行比较。当与未突变植物进行比较时，具有减少的基因的表达的突变植物是本发明的理想实施方案，所述基因编码烟草基因产物。可以将这样的植物用在本文所述的育种程序中，所述植物具有在本文所述的任何核酸序列中的突变。
组成性，或乙烯或衰老诱导的序列的过量表达
可以将本发明的核酸序列(例如，在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列，或其片段)用于在烟草属品系或制备自该品系的植物的烟草产品中增加理想的性状。具体而言，可以将本发明的核酸序列的过量表达，和/或它们的翻译产物用于增加来自次级代谢物的理想的气味和香味的产物的生物合成。此外，可以将编码烟草多肽的核酸序列的过量表达用于在烟草属品系中增加多肽的表达。
可以通过本发明的核酸序列的过量表达被赋予烟草属品系的另外的理想性状包括对细菌性萎蔫病、南方细菌萎蔫病、镰刀菌萎蔫症、马铃薯病毒Y、烟草花叶病毒、烟草蚀斑病毒、烟草叶脉斑纹病毒、苜蓿花叶病毒、野火病、根癌线虫、南方根癌线虫、胞囊线虫、黑色根腐病、青霉病、0种黑胫病真菌，和1种黑胫病真菌的抗性。可以通过过量表达本发明的核酸序列在烟草属植物中增加的其它理想性状包括增加的产率和/或等级、更好的可保存性、可收获性、保持能力、叶子品质，或熟化质量，增加或减少的高度，改变的成熟时间(例如早期成熟，早期到中期成熟，中期成熟，中期到晚期成熟，或晚期成熟)，增加或减少的茎长度，和每株植物的叶子数量的增加或减少。
植物启动子
理想的启动子是花椰菜花叶病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子或木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子。这些启动子在大多数植物组织中赋予高水平的表达，并且这些启动子的活性不依赖于病毒编码的蛋白质。CaMV是35S和19S启动子两者的来源。使用这些启动子的植物表达构建体的实例是本领域已知的。在转基因植物的大多数组织中，所述CaMV 35S启动子是强启动子。所述CaMV启动子在单子叶植物中也是具有高度活性的。而且，该启动子的活性可以通过CaMV 35S启动子的复制进一步增加(即，在2-10倍之间)。
其它有用的植物启动子包括，但不限于，胭脂氨酸合成酶(NOS)启动子，章鱼碱合酶启动子，玄参(figwort)花叶病毒(FMV)启动子，水稻肌动蛋白启动子，和遍在蛋白启动子系统。
示例性的单子叶植物启动子包括，但不限于，鸭跖草黄斑驳病毒(commelina yellow mottle virus)启动子，甘蔗badna病毒启动子，水稻tungro杆状病毒启动子，玉米条纹病毒元件，和小麦矮缩病毒启动子。
对于某些应用而言，可能理想的是以适合的水平，或在适合的发育时间，在适合的组织中产生烟草基因产物，诸如显性负调控突变的基因产物。对此目的，存在各类基因启动子，每种具有体现在其调节序列中的本身的独特的特性，响应于可诱导的信号诸如环境、激素和/或发育信息(developmental cue)时显示被调节。这些包括，但不限于，负责热调节的基因表达，光调节的基因表达的基因启动子(例如，豌豆rbcS-3A；玉米rbcS启动子；发现于豌豆中的叶绿素a/b结合蛋白质基因；或Arabssu启动子)，激素调节的基因表达(例如，来自小麦Em基因的脱落酸(ABA)反应序列；可ABA诱导的HVA1和HVA22，和大麦和拟南芥(Arabidopsis)的rd29A启动子；和创伤诱导的基因表达(例如，wunI的)，器官特异性基因表达(例如，块茎特异性的贮存蛋白质基因；来自所述的玉米的23-kDa玉米蛋白基因；或法国菜豆β-菜豆蛋白基因的)，或可病原体诱导的启动子(例如，PR-1，prp-1，或β-1，3-葡聚糖酶启动子，小麦的可真菌诱导的wirla启动子，和可线虫诱导的启动子，分别为烟草和芹菜的TobRB7-5A和Hmg-1))。
植物表达载体
典型地，植物表达载体包括(1)在5′和3′调节序列的转录控制下克隆的植物基因和(2)显性可选择的标记。如果需要，这样的植物表达载体还可以包含，启动子调节区(例如赋予可诱导的或组成性的，病原体或创伤诱导的，环境或发育调节的，或细胞或组织特异性的表达的启动子调节区)，转录开始起始位点，核糖体结合位点，RNA加工信号，转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
植物表达载体还可以任选地包含RNA加工信号，例如内含子，其已经显示对于有效的RNA合成和累积是重要的。RNA剪接序列的定位可以大大影响植物中转基因表达的水平。鉴于该事实，内含子可以位于转基因中的烟草烟碱脱甲基酶编码序列的上游或下游以改变基因表达的水平。
除了上述5′调节控制序列之外，表达载体还可以包含调节控制区，其通常存在于植物基因的3′区中。例如，3′终止子区可以被包含在表达载体中以增加mRNA的稳定性。一个这样的终止子区可以来自马铃薯的PI-II终止子区。此外，其它常用的终止子来自章鱼氨酸或胭脂氨酸合成酶信号。
植物表达载体还典型地包含显性可选择的标记基因，所述标记基因用于鉴定已经被转化的那些细胞。用于植物系统的有用的可选择的基因包括转座子Tn5(Aph II)的氨基糖苷磷酸转移酶基因，编码抗生素的抗性基因，例如编码对于潮霉素、卡那霉素、博来霉素、新霉素G418、链霉素或大观霉素的抗性的那些。光合作用所需的基因还可以用作光合作用缺陷型品系的可选择的标记。最后，编码除草剂抗性的基因可以用作可选择的标记；有用的除草剂抗性基因包括编码酶膦丝菌素乙酰转移酶且赋予对广谱除草剂Basta(Bayer Cropscience Deutschland GmbH，Langenfeld，德国)的抗性的bar基因。其它的可选择的标记包括提供对于其它这样的除草剂诸如草甘膦等，和咪唑啉酮，磺酰脲，三唑并嘧啶除草剂，诸如chlorosulfron，bromoxynil，dalapon等的抗性的基因。此外，编码二氢叶酸还原酶的基因可以与分子诸如methatrexate组合使用。
通过确定植物细胞对特定可选择试剂的敏感性和确定有效杀死大多数，如果不是全部的，被转化细胞的该试剂的浓度来促进可选择标记的有效使用。用于烟草转化的一些有用的抗生素浓度包括，例如20-100μg/ml(卡那霉素)，20-50μg/ml(潮霉素)，或5-10μg/ml(博来霉素)。用于选择除草剂抗性的转化体的有用策略由，例如Vasil描述(Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants，Vol I，II，III Laboratory Procedures and TheirApplications Academic Press，New York，1984)。
除了可选择的标记之外，可能理想的是使用报道基因。在某些情形中，可以使用报道基因，而不用可选择的标记。报道基因是这样的基因，其典型地在受体生物或组织中不存在或不表达。报道基因典型地编码提供一些表型变化或酶性质的蛋白质。这些基因的实例在Weising等(Ann.Rev.Genetics 22：421，1988)中进行提供，将其并入本文作为参考。优选的报道基因包括，但不限于，葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因和GFP基因。
在构建植物表达载体后，可以使用一些标准的方法将载体引入植物宿主中，由此产生转基因植物。这些方法包括(1)土壤杆菌介导的转化(A.tumefaciens或A.rhizogenes)(见，例如，Lichtenstein和Fuller In：GeneticEngineering，vol 6，PWJ Rigby，ed，London，Academic Press，1987；和Lichtenstein，C.P.，和Draper，J，.In：DNA Cloning，Vol II，D.M.Glover，ed，Oxford，IRI Press，1985；美国专利号4,693,976，4,762,785，4,940,838，5,004,863，5,104,310，5,149,645，5,159,135，5,177,010，5,231,019，5,463,174，5,469,976，和5,464,763；和欧洲专利号0131624，0159418，0120516，0176112，0116718，0290799，0292435，0320500，和0627752和欧洲专利申请号0267159和0604622)，(2)颗粒递送系统(见，例如美国专利号4,945,050和5,141,131)，(3)微注射方法，(4)聚乙二醇(PEG)方法，(5)脂质体介导的DNA吸收，(6)电穿孔方法(见，例如WO87/06614，和美国专利号5,384,253，5,472,869，5,641,664，5,679,558，5,712,135，6,002,070，和6,074,877(7)涡旋方法，或(8)所谓的whiskers方法(见，例如，Coffee etal.，美国专利号5,302,523和5,464,765)。可以用表达载体转化的植物组织的类型包括胚胎组织，I型和II型胼胝体组织，下胚轴，分生组织等。
一旦被引入植物组织中，结构基因的表达可以通过任何本领域已知方式进行测定，并且表达可以测量为转录的mRNA，合成的蛋白质，或基因沉默的量，其通过对烟草中的次级生物碱进行化学分析的代谢物监测进行测定(如本文所述；还见美国专利号5,583,021，将其并入本文作为参考)。已知用于植物组织的体外培养的技术，并且在许多情形中，已知用于再生为完整植物的技术(见，例如美国专利号5,595,733和5,766,900)。将引入的表达复合体传递到商用栽培品种中的方法是本领域那些技术人员已知的。
一旦获得了表达需要水平的理想基因产物的植物细胞，可以使用本领域众所周知的方法和技术从其中再生植物组织和完整植物。接着，通过常规方式来繁殖再生的植物并且通过常规植物育种技术可以将被引入的基因递送到其它品系和栽培品种中。
转基因烟草植物可以以不同的方向结合基因组基因的任何部分的核酸，所述方向例如反义方向用于下调，或例如有义方向用于过量表达。对于在烟草属品系中增加基因产物的表达，编码全长烟草基因的氨基酸序列的完整或功能部分的核酸序列的过量表达是理想的。
烟草基因的转录或翻译水平的确定
基因的表达可以例如，使用烟草基因或基因片段作为杂交探针，通过标准RNA印迹分析来进行测量(Ausubel et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，(2001)，和Sambrooket al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.，(1989))。RNA表达水平的确定还可以通过反转录PCR(rtPCR)来辅助，所述反转录PCR(rtPCR)包括定量rtPCR(见，例如Kawasaki et al.，in PCR Technology：Principles and Applications of DNAAmplification(H.A.Erlich，Ed.)Stockton Press(1989)；Wang et al.in PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(M.A.Innis，et al.，Eds.)Academic Press(1990)；和Freeman et al.，Biotechniques 26：112-122和124-125，1999)。用于确定烟草酶基因的表达的另外的众所周知的技术包括原位杂交，和荧光原位杂交(见，例如，Ausubel et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，(2001))。上述标准技术还用于比较植物之间，例如在烟草基因中具有突变的植物和对照植物之间来比较表达水平。
如果需要，烟草基因的表达(例如，在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的核酸序列，或其片段)可以在蛋白质产生的水平上，使用相同的通用方法和标准蛋白质分析技术包括Bradford测定、分光光度测定和免疫检测技术，诸如用特异于需要的多肽的抗体进行的蛋白质印迹或免疫沉淀来测量(Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，(2001)，和Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，N.Y.，(1989))。
可以使用本领域的标准方法来对本文所述的任何多肽的活性进行测定。例如，p450的活性典型地使用基于荧光的测定法来进行测定(见，例如，Donato et al.Drug Metab Dispos.32：699-706，2004)。具体而言，烟碱脱甲基酶的活性可以如本文所述使用酵母微粒体测定法进行测定。
烟草基因产物调节剂的鉴定
cDNA的分离还有利于增加或减少所述基因产物的表达的分子的鉴定。按照一种方法，将候选分子以不同的浓度加入表达烟草mRNA的细胞(例如，原核生物细胞诸如大肠杆菌或真核生物细胞诸如酵母、哺乳动物、昆虫或植物细胞)的培养基中。接着，使用标准方法诸如在本文中提到的那些，在存在和缺乏候选分子的情况下测量基因产物的表达。
候选的调节剂可以是纯化(或基本纯)的分子或可以是化合物的混合物的一种成分。在混合的化合物测定中，针对越来越小的候选化合物库的子集(例如，通过标准纯化技术，例如HPLC)来测试基因产物的表达直到证实单一化合物或最少化合物混合物改变烟草烟碱脱甲基酶基因的表达。在本发明的一个实施方案中，认为促进减少基因产物的表达的分子是特别理想的。可以证实发现在基因产物的表达或活性水平上有效的调节剂在植物中是有用的。
对于农业应用，使用本文公开的方法鉴定的分子、化合物或试剂可以用作化学品，所述化学品被用作在植物的叶子上的喷雾剂或粉剂。所述分子、化合物或试剂还可以与另一种分子组合应用于植物，所述另一种分子对植物提供某种益处。
应用
通过，例如基因沉默来调节对应于本文所述的任何序列的内源基因可以导致更有价值的植物或植物产物。具体而言，可以将本文的被鉴定为乙烯诱导或衰老相关的序列(例如，具有SEQ ID NOS：4，40，44，52，54，60，70，104，138，140，158，162，188，212，226，234，和288的序列或在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中显示的核酸序列，或其片段的那些)用于影响代谢途径，所述代谢途径涉及许多次级代谢物的形成，所述次级代谢物包括影响最终产物质量性状的类萜、多酚、生物碱等。类似地，可以将本文鉴定的基因用于调节与在衰老过程中累积的干物质的速率和类型或在衰老过程中在植物中干物质的分配相关的代谢途径。调节本文鉴定的基因还可以用于影响这样的代谢途径，所述代谢途径涉及衰老速率的确定，在叶子和在单一植物的多片叶子中的衰老的一致性，和由刺激或激活本文鉴定的基因的试剂或活性剂对衰老的诱导，并且由此控制包括叶子或其它植物组分的产物或产品的质量。
可以将本文所述的基因的启动子区用于驱动任何理想的基因产物的表达从而改善作物质量或提高具体的性状。可诱导的并且在植物生活周期的特定阶段表达的启动子可以用在构建体中以被引入植物来表达涉及气味和芳香产物的生物合成的独特基因，所述气味和芳香产物得自次级代谢物。烟草基因启动子还可以用于增加或改变影响最终使用特性的结构糖或蛋白质的表达。此外，烟草基因启动子可以组合以异源基因，所述异源基因包括涉及营养产物、药剂或工业原料的生物合成的基因。还可以将启动子序列的调节用于下调内源烟草基因，包括涉及生物碱生物合成和/或其它途径的基因。理想地，烟草基因启动子区或其它转录调节区用于改变化学品的性质诸如植物中去甲烟碱的含量和亚硝胺的水平。此外，使用本领域的标准方法可以容易地在启动子序列中鉴定的启动子基序可以用于鉴定与烟草基因产物，例如p450的表达相关或调节其的因子。
而且，使用本文所述的标准技术，可以将本发明的任何序列(例如在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列或其片段)用在减少基因表达或改变基因产物，诸如p450的酶活性的方法中。这些技术包括，但不限于，RNA干扰、三链干扰、核糖核酸酶、同源重组、病毒诱导的基因沉默，反义和共抑制技术，显性失活基因产物的表达，和使用标准诱变技术产生突变的基因。例如，减少p450的表达或改变p450的酶活性可以用于改变涉及植物-病原体相互作用和疾病抗性的脂肪酸或可以用于改变植物的选定脂肪酸的模式并且由此改变植物或植物组分的气味或香味。
此外，使用标准方法，可以将烟草基因的任何部分，包括启动子、编码序列、内含子或3′UTR或其片段用作遗传标记来分离相关基因，启动子或调节区从而在其它烟草或烟草属物种中筛选相关基因，或确定植物是否在相应的内源基因中具有突变。烟草基因的部分还可以用于通过追踪特定基因的内部移位(intergression)或损失的育种尝试来监测基因流动。
例如，如其它的烟草属物种中的一些，烟草(Nicotiana tabacum)是异源四倍体，并且可以将遗传标记用于在亲代基因组中鉴定同源基因或相关基因，所述亲代基因组不同于其中存在原始基因的基因组。还可以将相关基因的标记用于筛选现存的烟草生殖质，通过杂交产生的隔离的或合成群，从诱变处理产生的群或通过各种组织培养方法产生的群。同样，本文所述的核酸序列(例如，在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列或其片段)可以用于鉴定或影响涉及疾病或昆虫抗性、气味和香味性质、除草剂耐受性、与不需要的组分相关的质量因素的基因，或增加叶子产率的基因，或影响与结构性状或纤维含量相关的叶子或植物组分诸如木质素，纤维素等。
产物
按照本领域已知的标准方法，使用本文所述的任何烟草植物材料，产生具有减少量的亚硝胺含量的烟草产品。在一个实施方案中，使用获自加工处理的烟草植物的烟草植物材料来产生烟草产品，所述加工处理的烟草植物可以包含或被培育从而包含减少的烟碱脱甲基酶活性。例如，所述加工处理的烟草植物可以是得自杂交的烟草植物，包括被鉴定为具有烟碱脱甲基酶的不同的表达的烟草植物。理想地，所述烟草产品具有少于约5mg/g，4.5mg/g，4.0mg/g，3.5mg/g，3.0mg/g，2.5mg/g，2.0mg/g，1.5mg/g，1.0mg/g，750μg/g，500μg/g，250μg/g，100μg/g，75μg/g，50μg/g，25μg/g，10μg/g，7.0μg/g，5.0μg/g，4.0μg/g，2.0μg/g，1.0μg/g，0.5μg/g，0.4μg/g，0.2μg/g，0.1μg/g，0.05μg/g，或0.01μg/g的减少量的去甲烟碱或NNN，或其中相对于包含在其中的总生物碱含量，次级生物碱的百分比少于90％，70％，50％，30％，10％，5％，4％，3％，2％，1.5％，1％，0.75％，0.5％，0.25％，或0.1％。短语“减少的量”指与在野生型烟草植物、或植物组分或以相同方式处理的来自相同种类的烟草的烟草产品中发现的相比，在烟草植物或植物组分或烟草产品中存在的去甲烟碱或NNN或两者的量较少，所述野生型烟草植物或植物组分或以相同方式处理的来自相同种类的烟草的烟草产品没有被制成减少去甲烟碱或NNN的转基因材料。在一个实例中，以相同方式加工的相同种类的野生型烟草植物被用作对照，以测量是否已经通过本文所述的方法获得去甲烟碱或NNN或两者的减少。在另一个实例中，使用标准方法，例如通过监测基因或基因产物，例如烟碱脱甲基酶，或在基因中的具体突变的存在或缺乏，来评估具有减少量的亚硝胺含量的植物。在另一个实例中，将来自育种程序的植物的亚硝胺含量与用于培育具有减少量的亚硝胺的植物的受体品系或供体品系或两者的亚硝胺含量进行比较。按照需要，还使用其它本领域已知的适合的对照。按照烟草领域众所周知的方法来测量去甲烟碱和NNN或两者的水平。
下列实施例举例说明了实施本发明的方法并且应当被理解为对于本发明范围的例证而非限制，所述范围在后附的权利要求书中进行限定。
实施例1
植物组织的发育和乙烯处理
植物的生长
将植物种在花盆中并于温室中生长4周。将4周龄的幼苗移植入单个花盆中并于温室中生长2个月。在生长过程中将植物用含有150ppm NPK肥料的水一天浇水2次。将展开的绿叶从植物上分离进行下述的乙烯处理。
细胞系78379
将烟草品系78379用作植物材料来源，所述烟草品系78379是由肯塔基大学给出的白莱烟烟草品系。将一百株植物按照培养烟草领域的标准进行培养，移植，并用不同数字(1-100)进行标记。根据推荐地那样进行受精和田间管理。
所述100株植物中的四分之三将20和100％之间的烟碱转化为去甲烟碱。所述100株植物中的四分之一将少于5％的烟碱转化为去甲烟碱。87号植物具有最少的转化(2％)而21号植物具有100％的转化。将转化少于3％的植物归类为非转化体。制备87号植物和21号植物的自花传粉种子，以及杂交(21×87和87×21)种子来研究基因和表型差异。来自自交21的植物为转化体，而99％的来自87的自交株为非转化体。来自87的植物的另外1％显示低转化(5-15％)。来自反交的植物全部为转化体。
细胞系4407
将烟草属品系4407用作植物材料的来源，所述烟草品系4407为白莱烟品系。选择一致和代表性的植物(100)并进行标记。100株植物的97株为非转化体而三株为转化体。56号植物具有最少的转化量(1.2％)而58号植物具有最高的转化水平(96％)。用这两种植物制备自花传粉种子和杂交种子。
来自自交58的植物以3∶1转化体对非转化体的比例分离。植物58-33和58-25分别被鉴定为纯合的转化体和非转化体植物品系。通过其后代的分析确认了58-33的稳定转化。
细胞系PBLB01
PBLB01是由ProfiGen，Inc.开发的白莱烟品系并被用作植物材料的来源。转化体植物选自PBLB01的起始种子。
乙烯处理方法
将绿叶从2-3个月温室培养的植物上取下并喷以0.3％乙烯溶液(Prep brand Ethephon(Rhone-Poulenc))。将每片喷过的叶子悬挂于处理架上，所述处理架装备了增湿器并覆以塑料。在处理过程中，用乙烯溶液周期性地喷样品叶子。在乙烯处理后的大约24-48个小时，收集叶子进行RNA抽提。取另一份小样进行代谢组分分析以测定叶代谢物的浓度和更加具体的目标组分如多种生物碱。
作为实例，可以如下进行生物碱分析。将样品(0.1g)于150rpm与0.5ml 2N NaOH和5ml抽提溶液一起进行摇动，所述抽提溶液包含作为内标的喹啉和甲基叔丁醚。在配备了FID检测器的HP 6890 GC上分析样品。对于检测器和注射器使用250℃的温度。在以每分钟10℃的110-185℃的温度梯度上使用由熔融的硅石组成的HP柱(30m-0.32nm-1mm)，所述熔融的硅石交联了5％的苯酚和95％的聚甲基硅氧烷。于100℃以1.7cm3min-1的流速以40∶1的裂解比率以2∶1的注射体积利用氦作为载气来操作所述柱。
实施例2
RNA分离
为了进行RNA提取，如上述用乙烯处理来自两个月龄的温室培养的植物的中叶。将0和24-48小时的样品用于RNA抽提。在一些情况下，从除去花头后10天的植物上取在衰老过程之下的叶子样品。也将这些样品用于抽提。根据生产商的方案利用Rneasy Plant Mini Kit(Qiagen，Inc.，Valencia，California)分离总RNA。
利用DEPC处理的研体和研杵将组织样品在液氮下研磨成精细粉末。将大约100毫克的研磨组织转移入无菌的1.5ml Eppendorf管中。将此样品试管置于液氮中直到收集了所有样品。随后，将如试剂盒中提供的450μl缓冲液RLT(加入巯基乙醇)加入到每只单个管中。剧烈涡旋样品并于56℃温育3分钟。随后将裂解物应用到置于2ml收集管中的QIAshredder离心柱上，并以最大速度离心2分钟。收集流过物并将0.5体积的乙醇加入到清除的裂解物中。充分混合样品并转移到置于2ml收集管中的Rneasy微型离心柱上。于10,000rpm将样品离心1分钟。接下来，将700μl的缓冲液RW1吸移到Rneasy柱上并于10,000rpm离心1分钟。将缓冲液RPE吸移到在新收集管中的Rneasy柱上并于10,000rpm离心1分钟。再次将缓冲液RPE加入到Rneasy离心柱上并以最大速度离心2分钟以干燥所述膜。为了除去任何残余的乙醇，将膜置于单独的收集管中并以最大速度再离心1分钟。将Rneasy柱转移入新的1.5ml收集管中，并将40μl不含RNA酶的水直接吸移到Rneasy膜上。将此最终洗脱管于10,000rpm离心1分钟。通过变性甲醛凝胶和分光光度计分析总RNA的质与量。
遵照生产商的方案使用Oligotex聚A+RNA纯化试剂盒(QiagenInc.)分离聚(A)RNA。使用250μl最大体积中的大约200μg的总RNA。将250μl体积的缓冲液OBB和15μl的Oligotex混悬液加入到250μl的总RNA中。通过吸移将组分充分混合并在加热模块上于70℃温育3分钟。随后将样品置于室温大约20分钟。通过以最大速度离心2分钟将Oligotex：mRNA复合物沉淀。除了50μl上清液之外，将全部从微量离心管中除去。用OBB缓冲液进一步处理样品。通过涡旋将Oligotex：mRNA沉淀重悬于400μl的缓冲液OW2中。将此混合物转移到置于新管中的小离心柱上并以最大速度离心1分钟。将离心柱转移到新的管中并向柱中加入另外400μl的缓冲液OW2。随后以最大速度将所述管离心1分钟。将所述离心柱转移到最终的1.5ml微量离心管中。用60μl的热(70℃)缓冲液OEB洗脱样品。通过变性甲醛凝胶和分光光度分析来分析聚腺苷酸产物。
实施例3
反转录PCR
按照生产商的方案使用SuperScript反转录酶(Invitrogen，Carlsbad，California)制备第一链cDNA。富含聚A+的RNA/寡dT引物混合物由少于5μg的总RNA，1μl的10mM dNTP混合物，1μl的寡d(T)12-18(0.5μg/μl)，和多达10μl的DEPC处理的水组成。将每个样品于65℃温育5分钟，随后置于冰上至少1分钟。反应混合物通过顺序加入每种下列组分进行制备：2μl 10X RT缓冲液，4μl的25mM MgCl2，2μl的0.1M DTT，和1μl的RNA酶OUT重组RNA酶抑制剂。将另外9μl的反应混合物吸移到每种RNA/引物混合物中并轻轻混合。将其于42℃温育2分钟并将1μl的Super ScriptII RT加入到每管中。将所述管于42℃温育50分钟。于70℃终止反应15分钟并于冰上冷却。通过离心收集样品并将1μl的RNA酶H加入到每管中并于37℃温育20分钟。用200pmoles的正向引物和100pmoles反向引物(后带1个随机碱基的18nt寡d(T)的混合物)进行第二次PCR。
反应条件为94℃ 2分钟和随后在94℃ 1分钟，45℃-60℃ 2分钟，72℃ 3分钟的40个PCR循环，于72℃再延伸10min。利用1％的琼脂糖凝胶通过电泳分析10微升的扩增样品。将正确大小的片段从琼脂糖凝胶上纯化出来。
实施例4
PCR片段群的生成
按照生产商的说明书将来自实施例3的PCR片段连接入pGEM-TEasy载体(Promega，Madison，Wisconsin)。将连接产物转化入JM109感受态细胞中并接种在LB培养基板上进行蓝/白筛选。选择菌落并将其于37℃过夜培养于具有1.2ml LB培养基的96孔板中。对于所有选定的菌落都制成冷冻的贮存母液。以Wizard SV小量制备试剂盒(Promega)利用Beckman′s Biomeck 2000小量制备机器人由板中纯化质粒DNA。用100μl水洗脱质粒DNA并保存于96孔板中。通过EcoRI消化质粒并利用1％的琼脂糖凝胶进行分析以确定DNA量和插入片段的大小。利用CEQ 2000测序仪(Beckman，Fullerton，California)对包含400-600bp插入片段的质粒进行测序。通过BLAST搜索将序列与GenBank数据库进行比对(见，例如图159A到159K)。鉴定p450相关片段并进一步进行分析。或者，将p450片段从扣除文库中分离。也如上所述对这些片段进行分析。
实施例5
cDNA文库构建
如下通过由乙烯处理的叶子制备总RNA来构建cDNA文库。首先，利用改进的酸苯酚和氯仿抽提方法由乙烯处理的烟草品系58-33的叶子中抽提总RNA。改进所述方法以使用一克组织，所述组织进行过研磨并随后在5ml抽提缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.5；200mM NaCl；10mMEDTA；0.5％SDS)中进行涡旋，向其中加入5ml苯酚(pH5.5)和5ml氯仿。将抽提样品离心并保留上清液。将此抽提步骤重复2-3次直到上清液看起来清亮。加入大约5ml的氯仿以去除痕量的苯酚。通过加入3倍体积的乙醇和1/10体积的3M NaOAc(pH5.2)将RNA由合并的上清液级分中沉淀并于-20℃保存1小时。在转移到Corex玻璃容器中后将RNA级分于9,000RPM于4℃离心45分钟。用70％乙醇洗涤沉淀物并于9,000RPM于4℃离心5分钟。干燥沉淀后，将沉淀的RNA溶解于0.5ml不含RNA酶的水中。分别通过变性甲醛凝胶和分光光度计分析总RNA的质与量。
通过下列方案利用寡(dT)纤维素方法(Invitrogen)和微量离心柱(Invitrogen)将得到的总RNA用于分离聚A+RNA。将大约20mg的总RNA进行两次纯化以获得高质量的聚A+RNA。通过进行变性甲醛凝胶和随后的已知全长基因的RT-PCR来分析聚A+RNA产物以确保高质量的mRNA。
接下来，采用cDNA合成试剂盒，ZAP-cDNA合成试剂盒，和ZAP-cDNA Gigapack III gold克隆试剂盒(Stratagene，La Jolla，California)将聚A+RNA用作模板来产生cDNA文库。所述方法包括遵循指定的生产商方案。将大约8μg的聚A+RNA用来构建cDNA文库。初级文库的分析揭示了大约2.5×106-1×107pfu。利用IPTG和X-gal通过互补测定完成文库质量背景测试，其中重组斑以高于背景反应的超过100倍进行表达。
通过随机PCR进行的更加定量的文库分析显示插入cDNA的平均大小为大约1.2kb。该方法使用两步PCR法。对于第一步，基于获自p450片段的初步序列信息设计反向引物。利用设计的反向引物和T3(正向)引物由cDNA文库扩增相应的基因。将PCR反应进行琼脂糖电泳并切除相应的高分子量条带，将其纯化，克隆和测序。在第二步中，由5′UTR或p450的起始编码区设计作为正向引物的新引物与反向引物(由p450的3′UTR设计)一起用于随后的PCR中来获得全长p450克隆。
除了反向引物之外，如实施例3中所述，通过PCR扩增由构建的cDNA文库生成p450片段。将位于cDNA插入片段质粒下游的T7引物用作反向引物。如实施例4中所述对PCR片段进行分离，克隆和测序。
通过这种PCR方法由构建的的cDNA文库分离全长p450基因。使用基因特异性反向引物(由p450片段下游序列设计)和正向引物(在文库质粒上的T3)克隆全长基因。对PCR片段进行分离，克隆和测序。如果必要的话，应用第二个PCR步骤。在第二个步骤中，由克隆的p450s的5′UTR设计的新的正向引物与由p450克隆的3′UTR设计的反向引物一起用于随后的PCR反应中来获得全长p450克隆。随后对克隆进行测序。
实施例6
克隆片段的表征-反向DNA印迹分析
对于在以上实施例中鉴定的所有p450克隆进行非放射性大规模反向DNA印迹测定以检测差异表达。观察到在不同p450簇之间的表达水平非常不同。对于具有高度表达的那些进行进一步的实时检测。
如下进行非放射性DNA印迹操作。
1)如实施例2中所述使用Qiagen Rnaeasy试剂盒由乙烯处理的和未处理的转化体(58-33)和非转化体(58-25)的叶子抽提总RNA。
2)通过生物素尾端标记单链cDNA产生探针，所述单链cDNA衍生自以上步骤中生成的富含聚A+的RNA。如实施例3中所述通过转化体和非转化体总RNA(Invitrogen)的RT-PCR生成这种经标记的单链cDNA，除了使用生物素化的寡dT作为引物(Promega)。这些被用作与克隆DNA杂交的探针。
3)用限制性酶EcoRI消化质粒DNA并在琼脂糖凝胶上进行电泳。同时将凝胶干燥并转移到两个尼龙膜上(Biodyne B)。将一个膜与转化体探针杂交而另一个与非转化体探针杂交。杂交前将膜进行UV-交联(自动交联装置，254nm，Stratagene，Stratalinker)。
或者，利用位于p-GEM质粒两条臂上的序列T3和SP6作为引物，由每个质粒进行PCR扩增插入片段。通过在96孔预运行(Ready-to-run)琼脂糖凝胶上进行电泳来分析PCR产物。将确认的插入片段点在两个尼龙膜上。将一个膜与转化体探针杂交而另一个与非转化体探针杂交。
4)根据生产商的说明书(Enzo MaxSence kit，Enzo Diagnostics，Inc，Farmingdale，NY)，对洗涤严格性进行改进，对膜进行杂交和洗涤。将膜于42℃与杂交缓冲液(2xSSC缓冲的甲酰胺，含有去污剂和杂交增强剂)预杂交30min并与10μl变性探针于42℃过夜杂交。随后将膜在室温于1X杂交洗涤缓冲液中洗涤1次持续10min，并于68℃洗涤4次持续15min。所述膜可以用于检测操作。
5)如生产商的检测方法(Enzo Diagnostics，Inc.)中所述通过碱性磷酸酶标记随后进行NBT/BCIP colometric检测对经洗涤的膜进行检测。用1x封闭溶液于室温将膜封闭1小时，用1X检测试剂洗涤3次达10min，用1X预显色反应缓冲液洗涤2次达5min，并且随后在显色溶液中将斑点显色30-45min直到斑点显现。所有试剂都由生产商提供(Enzo Diagnostics，Inc)。此外，还利用KPL DNA杂交和检测试剂盒根据生产商的说明书(KPL，Gaithersburg，Maryland)进行大规模反向DNA测定。
实施例7
克隆的表征-RNA印迹分析
作为DNA印迹分析的备选，如在RNA印迹测定的实施例中所述对一些膜进行杂交和检测。如下利用RNA杂交来检测在烟草属中差异表达的mRNA。
利用一种随机引导方法来由克隆的p450制备探针(Megaprime DNALabelling Systems，Amersham Biosciences)。混合下列组分：25ng变性的DNA模板；4μl每种未标记的dTTP，dGTP和dCTP；5μl的反应缓冲液；P32-标记的dATP和2μl的KlenowI；和H2O，使反应达到50μl。将混合物于37℃温育1-4小时，并以2μl的0.5M EDTA终止。使用前通过于95℃温育5分钟将探针变性。
由乙烯处理和未处理的数对烟草品系的新鲜叶制备RNA样品。在一些情况下使用富含聚A+的RNA。用DEPC H2O(5-10μl)将大约15μg总RNA或1.8μg mRNA(如实施例5中所述的RNA和mRNA抽提方法)达到等同体积。加入相同体积的加样缓冲液(1xMOPS；18.5％甲醛；50％甲酰胺；4％Ficoll400；溴酚蓝)和0.5μl EtBr(0.5μg/μl)。随后将样品在制备物中变性用来通过电泳分离RNA。
用1X MOP缓冲液(0.4M吗啉代丙烷磺酸；0.1M醋酸钠-3 xH2O；10mM EDTA；用NaOH调节至pH 7.2)将样品在甲醛凝胶(1％琼脂糖，1xMOPS，0.6M甲醛)上进行电泳。通过毛细管法在10XSSC缓冲液(1.5M NaCl；0.15M柠檬酸钠)中将RNA转移到Hybond-N+膜上(Nylon，Amersham Pharmacia Biotech)达24小时。在杂交前将具有RNA样品的膜进行UV交联(自动交联装置，254nm，Stratagene，Stratalinker)。
将膜在42℃与5-10ml预杂交缓冲液(5xSSC；50％甲酰胺；5xDenhardt′s-溶液；1％SDS；100μg/ml热变性剪切的非同源性DNA)预杂交1-4小时。弃去旧的预杂交缓冲液，加入新的预杂交缓冲液和探针。于42℃过夜进行杂交。用2xSSC于室温洗涤膜达15分钟，随后用2xSSC洗涤。
如在下面的表1中所举例说明，RNA印迹法和反向DNA印迹法在确定相对于未被诱导的植物，哪个基因被乙烯处理所诱导中是有用的。有趣的是，不是所有的片段在转化体和非转化体中都受到类似的影响。对细胞色素p450片段中的一些进行部分测序以确定它们的结构相关性。将该信息随后用于分离和表征目标全长基因克隆。
表1：乙烯处理对mRNA诱导的作用
片段     诱导的mRNA表达乙烯处理
    转化体
D56-AC7(SEQ ID No：44)     +
D56-AG11(SEQ ID No：40)     +
D56-AC12(SEQ ID No：54)     +
D70A-AB5(SEQ ID No：104)     +
D73-AC9(SEQ ID No：52)     +
D70A-AA12(SEQ ID No：140)     +
D73A-AG3(SEQ ID No：138)     +
D34-52(SEQ ID No：70)     +
D56-AG6(SEQ ID No：60)     +
在获自转化体和非转化体白莱烟品系的烟草组织上利用全长克隆进行Northern分析，所述转化体和非转化体白莱烟品系都通过乙烯处理进行诱导。该分析用于鉴定相对于乙烯诱导的转化体品系相对于乙烯诱导的非转化体白莱烟品系在乙烯诱导的转化体品系中显示表达升高的全长克隆。通过这样做，全长克隆的功能性关系可以通过比较转化体和非转化体品系之间叶组分的生化差异进行确定。
如在下面的表2中显示，与被指示为+的非转化体处理的组织相比，在转化体乙烯处理的组织中，被指示为++和+++的6个克隆显示明显更高的表达。在未被乙烯处理的转化体和非转化体品系中，所有的这些克隆显示极少的表达或没有任何表达。
表2：在转化体乙烯处理的组织中具有升高的表达的克隆
全长克隆     转化体 非转化体
D101-BA2(SEQ ID NO：288)     ++ +
D207-AA5(SEQ ID NO：212)     ++ +
D208-AC8(SEQ ID NO：226)     +++ +
D237-AD1(SEQ ID NO：234)     ++ +
D89-AB1(SEQ ID NO：158)     ++ +
D90A-BB3(SEQ ID NO：162)     ++ +
实施例8
由克隆的基因编码的多肽的免疫检测
由三个p450克隆选择对应于20-22个氨基酸长的肽区，其1)与其它克隆具有较低的或没有同源性和2)具有良好的亲水性和抗原性。下面列出选自各个p450克隆的肽区的氨基酸序列。将合成的肽与KHL(匙孔血蓝蛋白)缀合并随后注射入兔体内。第4次注射后2和4周收集抗血清(AlphaDiagnostic Intl.Inc.San Antonio，TX)。
D234-AD1 DIDGSKSKLVKAHRKIDEILG(SEQ ID NO：2266)
D90a-BB3 RDAFREKETFDENDVEELNY(SEQ ID NO：163)
D89-AB1 FKNNGDEDRHFSQKLGDLADKY(SEQ ID NO：2267)
通过蛋白质印迹分析对抗血清检查与来自烟草植物组织的目标蛋白的交叉反应性。粗制蛋白提取物获自乙烯处理的(0-40小时)转化体和非转化体品系的中叶。根据生产商的方案使用RC DC蛋白质测定试剂盒(BIO-RAD)测定提取物的蛋白质浓度。
将两毫克蛋白质加载到每个泳道上并利用Laemmli SDS-PAGE系统在10％-20％的梯度凝胶上分离蛋白质。用Trans-Blot Semi-Dry细胞(BIO-RAD)将蛋白质由凝胶转移到PROTRAN硝化纤维素转移膜(Schleicher & Schuell)上。用ECL Advance Western Blotting检测试剂盒(Amersham Biosciences)检测并显现目标p450蛋白。在兔体内制备抗合成性KLH缀合物的一抗。与过氧化物酶偶联的抗兔IgG的二抗购自Sigma。一抗和二抗都以1∶1000稀释使用。抗体显示对于蛋白质印迹上单一条带的强烈反应性，提示抗血清对于目标靶肽是单特异性的。抗血清还与缀合到KLH上的合成肽具有交叉反应性。
实施例9
分离的核酸片段的核酸同一性，结构相关性和GeneChip杂交
结合RNA印迹分析对超过100个克隆的p450片段进行测序以确定它们的结构相关性。该方法使用基于位于p450基因羧基末端附近的两个共同p450基序中任一个的正向引物。所述正向引物对应于细胞色素p450基序FXPERF(SEQ ID NO：2268)或GRRXCP(A/G)(SEQ ID NO：2269)。反向引物使用来自质粒的标准引物，位于pGEM质粒两臂上的SP6或T7，或者来自聚腺苷酸尾巴的标准引物。下面描述所用的方法。
根据生产商的方案(Beckman Coulter)利用分光光度法评估起始双链DNA的浓度。将模板用水稀释到合适的浓度，通过于95℃加热2分钟进行变性，随后将其置于冰上。利用0.5-10μl的变性DNA模板，2μl的1.6pmol的正向引物，8μl的DTCS Quick Start Master Mix在冰上制备测序反应物并用水使总体积达到20μl。热循环程序由30个循环的下列循环组成：96℃ 20秒，50℃ 20秒，和60℃ 4分钟，随后保持于4℃。
通过加入5μl的终止缓冲液(等体积的3M NaOAc和100mM EDTA和1μl的20mg/ml糖原)终止测序反应。用60μl的冷95％  乙醇沉淀样品并于6000xg离心6分钟。弃去乙醇。用200μl的冷70％乙醇洗涤沉淀物两次。在沉淀干燥后，加入40μl的SLS溶液并重悬沉淀。覆盖一层矿物油，并将样品置于CEQ 8000自动测序仪上作进一步分析。
为了确证核酸序列，使用p450基因的FXPERF(SEQ ID NO：2268)或GRRXCP(A/G)(SEQ IDNO：2269)区的正向引物或质粒或聚腺苷酸尾巴的反向引物在两个方向上对核酸序列进行重新测序。所有的测序都在两个方向上至少进行两次。
将细胞色素p450片段的核酸序列彼此相比较，从对应于编码GRRXCP(A/G)(SEQ ID NO：2269)基序区之后的第一个核酸的编码区一直到终止密码子。将此区选作p450蛋白之间遗传多样性的指征。在70个过量基因中，观察到大量遗传上不同的p450基因，类似于其它植物物种的情况。在比较核酸序列之后，发现可以将基因基于它们的序列同一性插入不同的序列组。发现p450成员的最佳独特组被确定为具有75％或更大核酸同一性的那些序列。(见例如，US 2004/0162420专利申请出版物中的表1，将其并入本文作为参考)。减少百分比同一性导致明显更大的组。观察到优选的分组为具有81％或更大核酸同一性的那些序列，更加优选的分组具有91％或更大核酸同一性，且最优选的分组具有99％或更大核酸同一性的那些序列。大多数分组包含至少两个成员并经常包含三个或更多的成员。未反复发现其它的，提示所采用的方法能够在所用的组织中分离低和高表达的mRNA。
基于75％或更大的核酸同一性，发现两个细胞色素p450组包含与以前的烟草细胞色素基因具有同一性的核酸序列，所述以前的烟草细胞色素基因在遗传上与在所述组中的那些不同。组23在用于表3A的参数中显示与GenBank序列GI：1171579(SEQ ID NO：2270)(CAA64635)和GI：14423327(SEQ ID NO：2271)(或AAK62346)具有核酸同一性。GI：1171579(SEQ ID NO：2270)与组23成员具有核酸同一性，与组23的成员的同一性范围在96.9％到99.5％，而GI：14423327(SEQ ID NO：2271)与该组具有95.4％到96.9％范围的同一性。组31的成员与GenBank报道的GI：14423319序列(SEQ ID NO：2272)(AAK62342)具有76.7％到97.8％范围的同一性的核酸同一性。如用于表3A中时，在表3A的其它p450同一性组中不包含与以前报道的烟草p450s基因的参数同一性。
具有适合的核酸简并探针的共有序列对于组可以用于优先鉴定和分离来自烟草属植物的每个组中的另外的成员。
表3A：烟草属p450核酸序列同一性组
组    片段
1    D58-BG7(SEQ ID NO：10)，D58-AB1(SEQ ID NO：12)；D58-BE4(SEQ ID NO：16)
2    D56-AH7(SEQ ID NO：18)；D13a-5(SEQ ID NO：20)
3    D56-AG10(SEQ ID NO：22)；D35-33(SEQ ID NO：24)；D34-62(SEQID NO：26)
4    D56-AA7(SEQ ID NO：28)；D56-AE1(SEQ ID NO：30)；185-BD3(SEQ ID NO：152)
5    D35-BB7(SEQ ID NO：32)；D177-BA7(SEQ ID NO：34)；D56A-AB6(SEQ ID NO：36)；D144-AE2(SEQ ID NO：38)
6    D56-AG11(SEQ ID NO：40)；D179-AA1(SEQ ID NO：42)
7    D56-AC7(SEQ ID NO：44)；D144-AD1(SEQ ID NO：46)
8    D144-AB5(SEQ ID NO：48)
9    D181-AB5(SEQ ID NO：50)；D73-AC9(SEQ ID NO：52)
10   D56-AC12(SEQ ID NO：54)
11   D58-AB9(SEQ ID NO：56)；D56-AG9(SEQ ID NO：58)；D56-AG6(SEQ ID NO：60)；D35-BG11(SEQ ID NO：62)；D35-42(SEQ ID NO：64)；D35-BA3(SEQ ID NO：66)；D34-57(SEQ ID NO：68)；D34-52(SEQ IDNO：70)；D34-25(SEQ ID NO：72)
12   D56-AD10(SEQ ID NO：74)
13   56-AA11(SEQ ID NO：76)
14   D177-BD5(SEQ ID NO：78)；D177-BD7(SEQ ID NO：92)
15   D56A-AG10(SEQ ID NO：80)；D58-BC5(SEQ ID NO：82)；D58-AD12(SEQ ID NO：84)
16   D56-AC11(SEQ ID NO：86)；D35-39(SEQ ID NO：88)；D58-BH4(SEQ ID NO：90)；D56-AD6(SEQ ID NO：96)
17   D73A-AD6(SEQ ID NO：98)；D70A-BA11(SEQ ID NO：100)
18   D70A-AB5(SEQ ID NO：104)；D70A-AA8(SEQ ID NO：106)
19   D70A-AB8(SEQ ID NO：108)；D70A-BH2(SEQ ID NO：110)；D70A-AA4(SEQ ID NO：112)
20   D70A-BA1(SEQ ID NO：114)；D70A-BA9(SEQ ID NO：116)
21   D70A-BD4(SEQ ID NO：118)
22   D181-AC5(SEQ ID NO：120)；D144-AH1(SEQ ID NO：122)；D34-65(SEQ ID NO：124)
23   D35-BG2(SEQ ID NO：126)
24   D73A-AH7(SEQ ID NO：128)
25   D58-AA1(SEQ ID NO：130)；D185-BC1(SEQ ID NO：142)；D185-BG2(SEQ ID NO：144)
26   D73-AE10(SEQ ID NO：132)
27   D56-AC12(SEQ ID NO：134)
28   D177-BF7(SEQ ID NO：136)；D185-BE1(SEQ ID NO：146)；D185-BD2(SEQ ID NO：148)
29   D73A-AG3(SEQ ID NO：138)
30   D70A-AA12(SEQ ID NO：140)；D176-BF2(SEQ ID NO：94)
31   D176-BC3(SEQ ID NO：154)
32   D176-BB3(SEQ ID NO：156)
33   D186-AH4(SEQ ID NO：14)
在乙烯活化后，将GeneChip微阵列杂交(Affymetrix Inc.；Santa Clara，CA)用于鉴定在接近纯合系的转化体和非转化体之间具有差异表达模式的基因。芯片大小是18微米并且阵列格式是100-2187，容纳528个探针组(11,628个探针)。将7对杂交用于获得微阵列结果的单独的证实。这些由下列各项组成：一对(转化体/非转化体)4407-33/4407-25未处理的白莱烟烟草样品，四对乙烯处理的4407-33/4407-25样品，一对乙烯处理的深色烟草NL Madole/181，另一对对于烟草转化接近纯合的品系，和一对自然衰老的叶子4407＝33/25(表3B)。
表3B.来自GeneChip杂交的转化体∶非转化体标准化信号比率
   未处理的白莱烟(4407-33/25)                 乙烯处理的白莱烟(4407-33/25)   乙烯处理的深色烟草(178/NLMadole)   衰老的白莱烟(4407-33/25)
 诱导的D121-AA8D120-AH4D35-BG11对照肌动蛋白样I(5′)肌动蛋白样I(3′)     1.031.441.731.181.09   Exp1     Exp2   Exp3     Exp4     16.608.1728.761.020.93   2.571.693.400.970.85
  2.1431.902.320.991.12     12.9012.7413.060.740.81   5.172.8722.220.731.08     12.197.5519.100.570.79
如使用Genome Explorations，Inc(Memphis，TN)的检测工具产生的表达报告所证实，所有的14组杂交是成功的。主要报告包括噪音的分析、标度因子、背景、总探针组、存在和不存在的探针组的数量和百分比、持家对照的信号强度。使用软件GCOS组合以其它软件来进一步分析和呈现所述数据。进行处理对之间的信号比较，并且编辑对于所有的杂交的所有的各个探针的总数据，并且还分析了表达数据。基于信号强度的结果显示仅有两个基因，D121-AA8和D120-AH4，和一个片段，即作为D121-AA8的部分片段的D35-BG11，当与非转化体品系相比时，在乙烯处理的转化体品系中具有可再现的诱导。将在转化体品系，例如白莱烟烟草种类4407-33中基因的信号，测定为与在相关的非转化体纯化系，4407-25中的基因信号的比率。在没有乙烯处理的情况下，对于所有的基因，转化体与非转化体信号的比率达到1.00。为了消除背景差异的影响，还计算了标准化的信号比率。通过用相应的不成对比率除处理的成对比率获得标准化的信号比率。在乙烯处理和分析后，如通过四次独立的分析所确定，相对于非转化体品系，在转化体品系中，两个基因，D121-AA8和D120-AH4被诱导。这两个基因具有99.8％的相对同源性并且它们在转化体种类中的相对杂交信号范围比它们的非转化体对应物中的信号高约2-22倍。基于标准化的比率，两个肌动蛋白样，内对照克隆在转化体品系中没有被诱导。此外，其编码区完整地被包含在D121-AA8和D120-AH4基因中的片段(D35-BG11)，在成对纯合转化体和非转化体品系中的相同样品中被高度诱导。此外，D121-AA8和D120-AH4基因在纯合的深色烟草对，NL Madole和181的转化体品系中被强诱导(8到28倍)，因此证实了在转化体品系中的这些基因的乙烯诱导是在植物中的反应。同样，在通过自然衰老的样品4407-33/25的杂交进行的比较中鉴定相同的基因。使用特异于D121-AA8的引物进行的这些材料的RT-PCR测定证实了该基因的微阵列结果。
基于这些结果，将所述D121-AA8基因(其cDNA序列是SEQ ID NO：5的序列；图4)鉴定为目标烟草烟碱脱甲基酶基因。鉴于p450命名规则，确定D121-AA8最类似于CYP82E家族中的p450s(The ArabidopsisGenome Initiative(AGI)and The Arabidopsis Information Resource(TAIR)；Frank，Plant Physiol.110：1035-1046，1996；Whitbred et al.，Plant Physiol.124：47-58，2000)；Schopfer和Ebel，Mol.Gen.Genet.258：315-322，1998；和Takemoto等，Plant Cell Physiol.40：1232-1242，1999)。
实施例10
酶活性的生化分析
生化分析，例如，如并入本文作为参考的先前提交的申请中所述，确定了SEQ ID NO：5的序列编码烟草烟碱脱甲基酶(SEQ ID NO：3；图3和4)。
特别地，通过如下测定酵母细胞中异源表达的p450的酶活性，确定候选克隆D121-AA8的功能为烟碱脱甲基酶的编码基因。
1.酵母表达载体的构建
将烟草烟碱脱甲基酶编码cDNA(D121-AA8)的推定蛋白质编码序列D120-AH4，D121-AA8，208-AC-8和D208-AD9克隆入酵母表达载体pYeDP60。通过包含这些序列的PCR引物在翻译起始密码子(ATG)的上游或终止密码子(TAA)的下游引入合适的BamHI和MfeI位点(下面下划线的)。扩增的PCR产物上的MfeI与载体上的EcoRI位点相容。用来扩增D121-AA8 cDNA的引物是5′-TAGCTACGC GGATCCATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3′(SEQ IDNO：2194)和5′-CTGGATCA CAATTGTTAGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTATAAAGCTCAGGTGCCAGGC-3′(SEQ ID NO：2297)。将编码蛋白质C末端九个额外氨基酸，包括六个组氨酸的序列片段，结合到反向引物中以利于诱导后6-His标记的p450的表达。酶消化后在参照GAL10-CYC1启动子的有义方向上将PCR产物连接入pYeDP60载体中。另外，通过限制性酶切分析和DNA测序确认酵母表达载体的正确构建。通过对于酵母微粒体的去垢剂相的SDS-PAGE凝胶电泳来观察p450蛋白质的表达。基于基因序列，p450蛋白质的预期大小是59kD，通过凝胶分析来证实该结果。
2.酵母转化
将改进来表达拟南芥NADPH-细胞色素p450还原酶ATR1的WAT11酵母品系用pYeDP60-p450cDNA质粒进行转化。将50微升的WAT11酵母细胞混悬液与～1μg质粒DNA在具有0.2cm电极隙的比色杯中混合。Eppendorf电穿孔仪(Model 2510)应用2.0kV的脉冲。将细胞铺到SGI板上(5g/L bactocasamino acids，6.7g/L无氨基酸的酵母氮碱(nitrogen base)，20g/L葡萄糖，40mg/L DL-色氨酸，20g/L琼脂)。通过直接在随机选择的菌落上进行的PCR分析确认转化体。
3.在转化的酵母细胞中的p450的表达
利用单一酵母菌落接种30mL SGI培养基(5g/L bactocasamino acids，6.7g/L无氨基酸的酵母氮碱，20g/L葡萄糖，40mg/L DL-色氨酸)并于30℃培养大约24小时。将等分试样的这种培养物以1∶50稀释到1000mL的YPGE培养基中(10g/L酵母提取物，20g/L细菌培养用蛋白胨，5g/L葡萄糖，30ml/L乙醇)并培养直到葡萄糖被完全耗尽，如通过Diastix尿分析试剂条(Bayer，Elkhart，IN)的比色变化所示。通过加入DL-半乳糖到终浓度2％来起始克隆P450的诱导。在使用前将培养物再培养20小时进行体内活性测定或进行微粒体制备。
使用表达pYeDP60-CYP71D20(催化烟草(Nicotiana tabacum)中5-表-aristolochene和1-deoxycapsidiol的羟基化作用的p450)的WAT11酵母细胞作为p450表达和酶活性测定的对照。
为了更加详细地评估p450的酵母表达的有效性，进行简化的CO差异光谱分析。简化的CO光谱在450nm上显现来自所有四种p450转化的酵母品系的蛋白质的峰。在来自对照，未转化的酵母细胞或空白，载体对照酵母细胞的对照微粒体中没有观察到类似的峰。所述结果显示p450蛋白在具有pYeDP60-CYP 450的酵母品系中得以有效表达。酵母微粒体中表达的p450蛋白的浓度为从45到68nmole/mg总蛋白。
4.体内酶测定
通过对酵母培养物饲以DL-烟碱(吡咯烷-2-14C)来测定转化的酵母细胞中烟碱脱甲基酶的活性。将14C标记的烟碱(54mCi/mmol)加入到75μl的半乳糖诱导的培养物中达到最终浓度55μM。在14ml聚丙烯试管中以摇动将测定培养物温育6小时并以900μl甲醇进行抽提。离心后，以rp-HPLC分离20μl的甲醇提取物并通过LSC对去甲烟碱级分进行量化。
WAT11(pYeDP60-CYP71D20)的对照培养物并未将烟碱转变成去甲烟碱，显示WAT11酵母株并不包含能够催化烟碱生物转化成去甲烟碱步骤的内源酶活性。相反，表达烟草烟碱脱甲基酶基因的酵母生产出可检测量的去甲烟碱，显示SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的翻译产物的烟碱脱甲基酶活性。
5.酵母微粒体制备
半乳糖诱导20小时后，通过离心收集酵母细胞并用TES-M缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，0.6M山梨糖醇，10mM 2-巯基乙醇)洗涤两次。将沉淀物重悬于抽提缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，0.6M山梨糖醇，2mM 2-巯基乙醇，1％牛血清白蛋白，1片/50ml的蛋白酶抑制剂混合物(Roche))。随后用玻璃珠(直径0.5mm，Sigma)破裂细胞并将细胞提取物以20,000xg离心20min以除去细胞碎片。将上清液于100,000xg进行超速离心60min，得到的沉淀物包含微粒体级分。将所述微粒体级分以1mg/mL的蛋白质浓度悬浮于TEG-M缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，20％甘油和1.5mM 2-巯基乙醇)。将微粒体制剂保存于液氮冷冻库中待用。
6.酵母微粒体制备物中的酶活性测定
用酵母微粒体制备物进行烟碱脱甲基酶活性的测定。特别地，DL-烟碱(吡咯烷-2-14C)获自Moravek Biochemicals并具有54mCi/mmol的特异性活性。氯丙嗪(CPZ)和氧化的细胞色素C(cyt.C)，二者都是P450抑制剂，购自Sigma。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)是细胞色素P450通过NADPH：细胞色素P450还原酶的典型电子供体。在对照温育中不存在NADPH。常规酶测定包括微粒体蛋白(约1mg/ml)，6mMNADPH，和55μM14C标记的烟碱。在使用时，CPZ和Cyt.C的浓度分别为1mM和100μM。反应在25℃进行1小时并通过加入300μl甲醇到每个25μl反应混合物中进行终止。离心后，使用来自Varian的InertsilODS-33μ(150×4.6mm)色谱柱以反相高效液相色谱(HPLC)系统(Agilent)分离20μl的甲醇提取物。恒溶剂流动相是甲醇和50mM磷酸钾缓冲液，pH 6.25的混合物，比率是60∶40(v/v)并且流速是1ml/min。收集去甲烟碱峰并以2900tri-carb液体闪烁计数器(LSC)(Perkin Elmer)进行量化，所述去甲烟碱峰是通过与真实可信的未标记去甲烟碱相比较而确定的。在1小时温育后基于14C标记的去甲烟碱的产生来计算烟碱脱甲基酶的活性。
在来自表达CYP71D20的对照酵母细胞和三个用基因D120-AH4，D208-AC8，和D208-AD9转化的测试p450酵母培养物的微粒体制备物中观察到p450样的活性。然而，对照和三个测试p450s没有显示任何去甲烟碱转化的形成，显示它们不包含能够催化烟碱脱甲基的内源或诱导酶。相反，来自HPLC和LSC分析的结果显示使用获自表达烟草烟碱脱甲基酶基因(D121-AA8)的酵母细胞的微粒体样品，产生自烟碱脱甲基作用的可检测的去甲烟碱的量。这些结果显示烟碱脱甲基酶活性得自D121-AA8基因产物。所述烟碱脱甲基酶活性需要NADPH，并且显示被p450特异性抑制剂所抑制，与烟草烟碱脱甲基酶作为p450一致。烟草烟碱脱甲基酶(D121-AA8)的酶活性是约10.8pKat/mg蛋白质，如通过放射性强度和蛋白质浓度所计算。将获得的酵母细胞的典型的酶测定结果组显示于下面的表中(表4)。
表4：在表达D121-AA8和对照P450基因的酵母细胞的微粒体中的脱甲基酶活性
  样品 微粒体 微粒体+1mM氯丙嗪 微粒体+100μM细胞色素C 微粒体-NADPH
  D121-AA8 10.8±1.2*pkat/mg蛋白质 1.4±1.3pkat/mg蛋白质 2.4±0.7pkat/mg蛋白质 0.4±0.1pkat/mg蛋白质
  对照(CYP71D20) 未检测到 未检测到 未检测到 未检测到
*n＝12，其它的n＝3
使用来自D121-AA8酵母细胞的微粒体，从所述测定中去除NADPH导致烟碱脱甲基酶活性的消失；因此没有形成去甲烟碱(表4)。当将两种已知的P450抑制剂，氯丙嗪(CPZ，1mM)和氧化的细胞色素c(cyt C，100μM，)单独加入酶测定混合物中并在加入甲醇终止溶液之前温育1小时，烟碱脱甲基酶活性明显减少(表4)。综上所述，这些实验证实D121-AA8编码细胞色素p450蛋白质，当其在酵母中表达时，催化烟碱转化为去甲烟碱。
实施例11
分离的核酸片段的相关氨基酸序列同一性
推断由实施例8获得的细胞色素p450片段的核酸序列的氨基酸序列。推断区对应于紧接GXRXCP(A/G)(SEQ ID NO：2273)序列基序之后到羧基末端，或终止密码子的氨基酸。在比较片段的序列同一性之后，观察到具有70％或更大氨基酸同一性的那些序列的独特组。观察到优选的分组为具有80％或更大氨基酸同一性的那些序列，更加优选的分组具有90％或更大氨基酸同一性，且最优选的分组具有99％或更大氨基酸同一性的那些序列。发现几个独特的核酸序列与其它片段具有完全的氨基酸同一性，所以只报道了具有相同氨基酸的一个成员。
表5的组19的氨基酸同一性对应于基于它们的核酸序列的三个独特的组。组成员的氨基酸序列和它们的同一性显示在图159H中。指示出氨基酸差异。
对于使用植物的基因克隆和功能性研究，选择了每个氨基酸同一性组的至少一个成员。此外，对于基因克隆和功能性研究选择了组成员，所述成员通过如RNA和DNA分析评估，受乙烯处理或其它生物学差异的不同影响。为了有助于基因克隆，表达研究和整体植物评估，可以基于基因序列同一性和不同序列制备肽特异性抗体。
表5：烟草属p450氨基酸序列同一性组
组   片段
1    D58-BG7(SEQ ID NO：11)，D58-AB1(SEQ ID NO：13)
2    D58-BE4(SEQ ID NO：17)
3    D56-AH7(SEQ ID NO：19)；D13a-5(SEQ ID NO：21)
4    D56-AG10(SEQ ID NO：23)；D34-62(SEQ ID NO：27)
5    D56-AA7(SEQ ID NO：29)；D56-AE1(SEQ ID NO：31)；185-BD3(SEQ IDNO：153)
6    D35-BB7(SEQ ID NO：33)；D177-BA7(SEQ ID NO：35)；D56A-AB6(SEQID NO：37)；D144-AE2(SEQ ID NO：39)
7    D56-AG11(SEQ ID NO：41)；D179-AA1(SEQ ID NO：43)
8    D56-AC7(SEQ ID NO：45)；D144-AD1(SEQ ID NO：47)
9    D144-AB5(SEQ ID NO：49)
10   D181-AB5(SEQ ID NO：51)；D73-AC9(SEQ ID NO：53)
11   D56-AC12(SEQ ID NO：55)
12   D58-AB9(SEQ ID NO：57)；D56-AG9(SEQ ID NO：59)；D56-AG6(SEQ IDNO：61)；D35-BG11(SEQ ID NO：63)；D35-42(SEQ ID NO：65)；D35-BA3(SEQ IDNO：67)；D34-57(SEQ ID NO：69)；D34-52(SEQ ID NO：71)
13   D56AD10(SEQ ID NO：75)
14   D56-AA11(SEQ ID NO：77)
15   D177-BD5(SEQ ID NO：79)；D177-BD7(SEQ ID NO：93)
16   D56A-AG10(SEQ ID NO：81)；D58-BC5(SEQ ID NO：83)；D58-AD12(SEQID NO：85)
17   D56-AC11(SEQ ID NO：87)；D56-AD6(SEQ ID NO：97)
18   D73A-AD6(SEQ ID NO：99)
19   D70A-AB5(SEQ ID NO：105)；D70A-AB8(SEQ ID NO：109)；D70A-BH2(SEQ ID NO：111)；D70A-AA4(SEQ ID NO：113)；D70A-BA1(SEQ ID NO：115)；D70A-BA9(SEQ ID NO：117)
20   D70A-BD4(SEQ ID NO：119)
21   D181-AC5(SEQ ID NO：121)；D144-AH1(SEQ ID NO：123)；D34-65(SEQID NO：125)
22   D35-BG2(SEQ ID NO：127)
23   D73A-AH7(SEQ ID NO：129)
24   D58-AA1(SEQ ID NO：131)；D185-BC1(SEQ ID NO：143)；D185-BG2(SEQID NO：145)
25   D73-AE10(SEQ ID NO：133)
26   D56-AC12(SEQ ID NO：135)
27   D177-BF7(SEQ ID NO：137)；185-BD2(SEQ ID NO：149)
28   D73A-AG3(SEQ ID NO：139)
29   D70A-AA12(SEQ ID NO：141)；D176-BF2(SEQ ID NO：95)
30   D176-BC3(SEQ ID NO：155)
31   D176-BB3(SEQ ID NO：157)
32   D186-AH4(SEQ ID NO：15)
实施例12
全长克隆的相关氨基酸序列同一性
对实施例5中克隆的全长烟草属基因的核酸序列推断它们完整的氨基酸序列。通过三个保守的p450结构域基序的存在鉴定细胞色素p450基因，所述三个保守的p450结构域基序对应于羧基末端上的UXXRXXZ(SEQ ID NO：2274)，PXRFXF(SEQ ID NO：2275)或GXRXC(SEQ ID NO：2276)，其中U是E或K，X是任何氨基酸而Z是P，T，S或M。利用BLAST程序将它们的全长序列彼此和与已知的烟草基因相比较来对所有的p450基因的氨基酸同一性进行表征。所述程序使用NCBI特别的BLAST工具(比对两种序列(bl2seq)，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html)。在没有对于核酸序列的滤器的BLASTN和对于氨基酸序列的BLASTP之下比对两种序列。基于它们的百分比氨基酸同一性，将每种序列归类到同一性组中，其中所述组包含与另一成员共有至少85％同一性的成员。观察到优选的分组为具有90％或更大氨基酸同一性的那些序列，更加优选的组具有95％或更大氨基酸同一性，且最优选的分组具有99％或更大氨基酸同一性的那些序列。使用这些标准，鉴定了25个独特的组并且将其描述在表6中。推断全长烟碱脱甲基酶基因的氨基酸序列具有在SEQ ID NO：5中提供的序列(图4)。
在用于表6的氨基酸同一性的参数中，发现三组包含与已知烟草基因的超过85％或更大的同一性。对于全长序列，组5的成员与GenBank序列GI：14423327(SEQ ID NO：2271)(或AAK62346)具有多达96％的氨基酸同一性。组23与GI：14423328(SEQ ID NO：2277)(或AAK62347)具有多达93％的氨基酸同一性，并且组24与GI：14423318(SEQ ID NO：2278)(或AAK62343)具有92％的同一性。
表6：全长烟草属p450基因的氨基酸序列同一性组
1    D208-AD9(SEQ ID NO：233)；D120-AH4(SEQ ID NO：189)；D121-AA8(SEQ ID NO：191)，D122-AF10(SEQ ID NO：193)；D103-AH3(SEQ ID NO：231)；D208-AC8(SEQ ID NO：227)；D235-AB1(SEQ ID NO：255)
2    D244-AD4(SEQ ID NO：259)；D244-AB6(SEQ ID NO：283)；D285-AA8(SEQ ID NO：2205)；D285-AB9(SEQ ID NO：2206)；D268-AE2(SEQ ID NO：279)
3    D100A-AC3(SEQ ID NO：177)；D100A-BE2(SEQ ID NO：2209)
4    D205-BE9(SEQ ID NO：285)；D205-BG9(SEQ ID NO：211)；D205-AH4(SEQ ID NO：303)
5    D259-AB9(SEQ ID NO：269)；D257-AE4(SEQ ID NO：277)；D147-AD3(SEQ ID NO：203)
6    D249-AE8(SEQ ID NO：265)；D-248-AA6(SEQ ID NO：263)
7    D233-AG7(SEQ ID NO：275)；D224-BD11(SEQ ID NO：249)；DAF10
8    D105-AD6(SEQ ID NO：181)；D215-AB5(SEQ ID NO：229)；D135-AE1(SEQ ID NO：199)
9    D87A-AF3(SEQ ID NO：225)，D210-BD4(SEQ ID NO：273)
10   D89-AB1(SEQ ID NO：159)；D89-AD2(SEQ ID NO：161)；D163-AG11(SEQID NO：207)；D163-AF12(SEQ ID NO：205)
11   D267-AF10(SEQ ID NO：305)；D96-AC2(SEQ ID NO：169)；D96-AB6(SEQID NO：167)；D207-AA5(SEQ ID NO：213)；D207-AB4(SEQ ID NO：215)；D207-AC4(SEQ ID NO：217)
12   D98-AG1(SEQ ID NO：173)；D98-AA1(SEQ ID NO：171)
13   D209-AA12(SEQ ID NO：221)；D209-AA11；D209-AH10(SEQ ID NO：223)；D209-AH12(SEQ ID NO：241)；D90A-BB3(SEQ ID NO：163)
14   D129-AD10(SEQ ID NO：197)；D104A-AE8(SEQ ID NO：179)
15   D228-AH8(SEQ ID NO：253)；D228-AD7(SEQ ID NO：251)，D250-AC11(SEQ ID NO：267)；D247-AH1(SEQ ID NO：261)
16   D128-AB7(SEQ ID NO：195)；D243-AA2(SEQ ID NO：257)；D125-AF11(SEQ ID NO：237)
17   D284-AH5(SEQ ID NO：307)；D110-AF12(SEQ ID NO：185)
18   D221-BB8(SEQ ID NO：243)
19   D222-BH4(SEQ ID NO：245)
20   D134-AE11(SEQ ID NO：239)
21   D109-AH8(SEQ ID NO：183)
22   D136-AF4(SEQ ID NO：287)
23   D237-AD1(SEQ ID NO：235)
24   D112-AA5(SEQ ID NO：187)
25   D283-AC1(SEQ ID NO：281)
基于靠近羧基端的介于UXXRXXZ p450结构域(SEQ ID NO：2274)和GXRXC p450结构域(SEQ ID NO：2276)之间的高度保守氨基酸同源性，来对全长基因进行进一步分组。如在图160A到160E中所显示，基于保守结构域之间的序列同源性对各个克隆进行比对，并将其置于独特的同一性组中。在数种情况下尽管所述克隆的核酸序列是独特的，对于所述区域的氨基酸序列是相同的。观察到优选的分组具有90％或更大的氨基酸同一性的那些序列，更优选的分组具有95％或更大的氨基酸同一性，并且最优选的分组具有99％或更大的氨基酸同一性的那些序列。最终的分组类似于基于除了组17(表6的)之外的克隆的完整氨基酸序列的百分比同一性的分组，将所述组17分成两个独特的组。
在用于表7的氨基酸同一性的参数中，发现三个组包含与已知烟草基因的90％或更大的同一性。对于全长序列，组5的成员与GenBank序列GI：14423326(SEQ ID NO：2279)(或AAK62346)具有高达93.4％的氨基酸同一性。组23与GI：14423328(SEQ ID NO：2277)(或AAK62347)具有高达91.8％的氨基酸同一性，并且组24与GI：14423318(SEQ ID NO：2278)(或AAK62342)具有98.8％的同一性。
表7：在烟草属p450基因的保守结构域之间的区域的氨基酸序列同一性组
1    D208-AD9(SEQ ID NO：233)；D120-AH4(SEQ ID NO：189)；D121-AA8(SEQ ID NO：191)，D122-AF10(SEQ ID NO：193)；D103-AH3(SEQ ID NO：231)；D208-AC8(SEQ ID NO：227)；D23 5-AB1(SEQ ID NO：255)
2    D244-AD4(SEQ ID NO：259)；D244-AB6(SEQ ID NO：283)；D285-AA8(SEQ ID NO：2205)；D285-AB9(SEQ ID NO：2206)；D268-AE2(SEQ ID NO：279)
3    D100A-AC3(SEQ ID NO：177)；D100A-BE2(SEQ ID NO：2209)
4    D205-BE9(SEQ ID NO：285)；D205-BG9(SEQ ID NO：211)；D205-AH4(SEQ ID NO：303)
5    D259-AB9(SEQ ID NO：269)；D257-AE4(SEQ ID NO：277)；D147-AD3(SEQ ID NO：203)
6    D249-AE8(SEQ ID NO：265)；D-248-AA6(SEQ ID NO：263)
7    D233-AG7(SEQ ID NO：275)；D224-BD11(SEQ ID NO：249)；DAF10
8    D105-AD6(SEQ ID NO：181)；D215-AB5(SEQ ID NO：229)；D135-AE1(SEQ ID NO：199)
9    D87A-AF3(SEQ ID NO：225)，D210-BD4(SEQ ID NO：273)
10   D89-AB1(SEQ ID NO：159)；D89-AD2(SEQ ID NO：161)；D163-AG11(SEQID NO：207)；D163-AF12(SEQ ID NO：205)
11   D267-AF10(SEQ ID NO：305)；D96-AC2(SEQ ID NO：169)；D96-AB6(SEQID NO：167)；D207-AA5(SEQ ID NO：213)；D207-AB4(SEQ ID NO：215)；D207-AC4(SEQ ID NO：217)
12   D98-AG1(SEQ ID NO：173)；D98-AA1(SEQ ID NO：171)
13   D209-AA12(SEQ ID NO：221)；D209-AA11；D209-AH10(SEQ IDNO：223)；D209-AH12(SEQ ID NO：241)；D90A-BB3(SEQ ID NO：163)
14   D129-AD10(SEQ ID NO：197)；D104A-AE8(SEQ ID NO：179)
15   D228-AH8(SEQ ID NO：253)；D228-AD7(SEQ ID NO：251)，D250-AC11(SEQ ID NO：267)；D247-AH1(SEQ ID NO：261)
16   D128-AB7(SEQ ID NO：195)；D243-AA2(SEQ ID NO：257)；D125-AF11(SEQ ID NO：237)
17   D284-AH5(SEQ ID NO：307)；D110-AF12(SEQ ID NO：185)
18   D221-BB8(SEQ ID NO：243)
19   D222-BH4(SEQ ID NO：245)
20   D134-AE11(SEQ ID NO：239)
21   D109-AH8(SEQ ID NO：183)
22   D136-AF4(SEQ ID NO：285)
23   D237-AD1(SEQ ID NO：235)
24   D112-AA5(SEQ ID NO：187)
25   D283-AC1(SEQ ID NO：281)
26   D110-AF12(SEQ ID NO：185)
实施例13
缺乏一种或多种烟草P450特异性结构域的烟草属细胞色素P450克隆
四个克隆与在表6中报道的其它烟草细胞色素基因具有高度核酸同源性，范围从90％到99％的核酸同源性。所述四个克隆包括D136-AD5(SEQID NO：292)，D138-AD12(SEQ ID NO：294)，D243-AB3(SEQ ID NO：298)和D250-AC11(SEQ ID NO：300)。不过，由于核苷酸移码，这些基因并不包含三个C-末端细胞色素p450结构域的其中一个或多个并且被排除在表6或表7中出现的同一性组之外。
一个克隆D95-AG1的氨基酸同一性不包含用于将在表6或表7中的p450烟草基因进行分组的第三个结构域，GXRXC(SEQ ID NO：2276)。该克隆的核酸序列与其它烟草细胞色素基因具有低同源性，并且因此，该克隆代表在烟草属中的细胞色素p450基因的新的组。
实施例14
烟草属细胞色素P450片段和克隆在烟草质量的变化调控中的应用
烟草p450核酸片段或完整基因的应用在鉴定和选择那些具有变化的烟草表型或烟草组分，更重要的是，变化的代谢物的植物中是有用的。通过多种转化系统生成转基因烟草植物，所述转化系统在下调方向，例如反义方向，或过量表达例如有义方向上等结合了选自本文所报告的那些的核酸片段或全长基因。对于全长基因的过量表达，任何编码本发明中所述全长基因的完整或功能性部分或氨基酸序列的核酸序列都是有利的。这些核酸序列理想地对于提高某种酶的表达是有效的并且因此导致烟草属内的表型效应。通过一系列回交获得纯合的烟草属品系并评估表型变化，包括但不限于，利用本领域普通技术人员常规可获得的技术进行内源性p450RNA，转录物，p450表达肽和植物代谢物浓度的分析。烟草植物中呈现的变化提供了对于目标选定基因的功能性作用的信息或者用作优选的烟草属植物物种的信息。
实施例15
来自转化体白莱烟烟草的基因组烟草烟碱脱甲基酶的克隆
如以上实施例中所述(还见生产商的方法)利用Qiagen Plant Easy试剂盒由转化体白莱烟烟草植物品系4407-33(烟草(Nicotiana tabacum)品种4407品系)提取基因组DNA。
基于在前述实施例中克隆的5′启动子和3′UTR区设计引物。正向引物为5′-GGC TCT AGA TAA ATC TCT TAA GTT ACT AGG TTC TAA-3′(SEQ ID NO：2280)和5′-TCT CTA AAG TCC CCT TCC-3′(SEQ IDNO：2288)而反向引物为5′-GGC TCT AGA AGT CAA TTA TCT TCT ACAAAC CTT TAT ATA TTA GC-3′(SEQ ID NO：2281)，和5′-CCA GCA TTCCTC AAT TTC-3′(SEQ ID NO：2289)。用100μl反应混合物将PCR应用于4407-33基因组DNA。使用Pfx高保真酶进行PCR扩增。在电泳后将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行观察。观察到分子量大约为3.5kb的单一条带并从凝胶上将其切下。利用凝胶纯化试剂盒(Qiagen；基于生产商的方法)纯化得到的条带。通过酶XbaI(NEB；根据生产商的说明书使用)消化纯化的DNA。利用相同方法通过XbaI消化pBluescript质粒。将片段进行凝胶纯化并连接入pBluescript质粒中。将连接混合物转化入感受态细胞GM109中并接种到包含100mg/l氨苄青霉素的LB平板上，伴随以蓝/白筛选。挑取白色菌落并培养在包含氨苄青霉素的10ml LB液体培养基中。通过小量制备提取DNA。利用CEQ 2000测序仪(Beckman，Fullerton，California)基于生产商的方法对包含插入片段的质粒DNA进行测序。使用T3和T7引物以及8种其它内部引物进行测序。对序列进行组合和分析，由此提供基因组序列(SEQ ID NO：4；图3)。基于基因组序列，确定在转化体和非转化体烟草品系中的烟碱脱甲基酶基因都不包含转座元件。
将SEQ ID NO：5的序列与SEQ ID NO：4的序列相比较能够确定基因编码部分内的单一内含子(鉴定为SEQ ID NO：7的序列；图5)。如图2中所示，烟草烟碱脱甲基酶的基因组结构包括在单一内含子侧面的两个外显子。第一个外显子跨越SEQ ID NO：4的核苷酸2010-2949，其编码SEQ IDNO：3的氨基酸1-313，第二个外显子跨越SEQ ID NO：4的核苷酸3947-4562，其编码SEQ ID NO：3的氨基酸314-517。因此，所述内含子跨越SEQ ID NO：4的核苷酸2950-3946。内含子序列提供在图5中并且是SEQ ID NO：7的序列。基因组DNA序列的翻译产物作为SEQ ID NO：3的序列提供在图3中。烟草烟碱脱甲基酶氨基酸序列包含内质网膜锚定基序。
实施例16
由转化体烟草克隆5′侧翼序列(SEO ID NO：8)和3′UTR(SEO ID NO：9)
A.来自转化体烟草叶组织的总DNA的分离
从转化体烟草4407-33的叶中分离基因组DNA。根据生产商的方案使用来自Qiagen，Inc.(Valencia，Ca)公司的DNeasy Plant Mini试剂盒进行DNA的分离。在此将生产商的手册Dneasy′Plant Mini and DNeasy PlantMaxi Handbook，Qiagen January 2004并入作为参考。DNA制备方法包括下列步骤：在液氮下，将烟草叶组织(大约20mg干重)研磨成精细粉末，进行1分钟。将组织粉末转移入1.5ml管中。将缓冲液AP1(400μl)和4μl的RNA酶贮存溶液(100mg/ml)加入到最大100mg的研磨叶组织中并进行剧烈涡旋。将混合物于65℃温育10min并在温育期间通过倒位试管将其混合2-3次。随后将缓冲液AP2(130μl)加入到裂解物中。将混合物混合并在冰上温育5min。将裂解物应用到QIAshredder Mini离心柱上并离心2min(14,000rpm)。将流过物级分转移到新的管中，不扰动细胞碎片沉淀。随后将缓冲液AP3/E(1.5体积)加入到澄清的裂解物中并通过抽吸进行混合。将来自在前步骤的包括任何沉淀物的混合物(650μl)应用到DNeasy Mini离心柱上。将混合物于＞6000xg(＞8000rpm)离心1min并弃去流过物。用剩余样品对此进行重复并弃去流过物和收集管。将DNeasyMini离心柱置于新的2ml收集管中。随后将缓冲液AW(500μl)加入到DNeasy柱上并离心1min(＞8000rpm)。弃去流过物。在接下来的步骤中重新使用该收集管。随后将缓冲液AW(500μl)加到DNeasy柱上并离心2min(＞14,000rpm)以便干燥膜。将DNeasy柱转移到1.5ml管中。随后将缓冲液AE(100μl)吸取到DNeasy膜上。将混合物于室温(15-25℃)温育5min并随后离心1min(＞8000rpm)来洗脱。
通过在琼脂糖凝胶上将样品进行电泳来评估DNA的质与量。
B.结构基因5′侧翼序列的克隆
使用改进的反向PCR方法克隆来自SEQ ID NO：5的结构基因的5’侧翼序列的750个核苷酸。首先，基于已知序列片段中的限制性位点和5’侧翼序列下游的限制性位点间距来选择合适的限制性酶。基于这种已知的片段设计两条引物。正向引物位于反向引物的下游。反向引物位于已知片段的3’部分。
克隆方法包括下列步骤：
用20-40个单位的合适的限制性酶(EcoRI和SpeI)在50μl反应混合物中消化纯化的基因组DNA(5μg)。用1/10体积的反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳以确定DNA是否消化完全。在完全消化后通过于4℃过夜连接进行直接连接。将200μl包含10μl消化DNA和0.2μl T4 DNA连接酶(NEB)的反应混合物于4℃过夜连接。在获得人工小环状基因组之后进行连接反应物的PCR。用10μl连接反应物和来自已知片段的2条引物在两个不同方向上于50μl反应混合物中进行PCR。应用梯度PCR程序，退火温度为45-56℃。
进行琼脂糖凝胶电泳以检查PCR反应。从凝胶上切下的所需的条带并使用来自QIAGEN的QIAquick凝胶纯化试剂盒来纯化所述条带。按照生产商的说明书将纯化的PCR片段连接入pGEM-T Easy载体(Promega，Madison，WI)中。按照生产商的说明书利用SV小量制备试剂盒(Promega，Madison，WI)通过小量制备来抽提转化的DNA质粒。利用CEQ 2000测序仪(Beckman，Fullerton，CA)对包含插入片段的质粒DNA进行测序。通过上述方法克隆5’侧翼序列的大约758nt(SEQ ID NO：4的核苷酸1241-2009)。
C.结构基因的较长5′侧翼序列(SEQ ID NO：8；图6)的克隆
根据生产商的用户手册，使用BD基因组步移(genome walker)通用试剂盒(Clontech laboratories，Inc.，PaloAlto，CA)来克隆结构基因D121-AA8，另外的5′侧翼序列。在此将生产商的手册BD Genome Walker August，2004并入作为参考。通过将样品在0.5％琼脂糖凝胶上进行电泳来测试烟草基因组DNA的大小和纯度。对烟草33文库基因组步移构建设立总共4次平端反应(DRA I，STU I，ECOR V，PVUII)。在消化DNAs的纯化之后，将消化的基因组DNAs连接到基因组步移接头上。通过利用接头引物AP1和来自D121-AA8的基因特异性引物(CTCTATTGATACTAGCTGGTTTTGGAC；SEQ ID NO：22 82)对四种消化的DNA’s进行初步PCR反应。将初步PCR产物直接用作模板进行嵌套PCR。在PCR反应中使用试剂盒提供的接头嵌套引物和来自已知克隆D121-AA8(SEQ ID NO：5)的嵌套引物(GGAGGGAGAGTATAACTTACGGATTC；SEQ ID NO：2283)。通过进行凝胶电泳检测PCR产物。从凝胶上切下所需的条带，利用来自QIAGEN的QIAquick凝胶纯化试剂盒纯化PCR片段。根据生产商的说明书将纯化的PCR片段连接入pGEM-T Easy载体(Promega，Madison，WI)中。利用SV小量制备试剂盒(Promega，Madison，WI)并按照生产商的说明书通过小量制备抽提转化的DNA质粒。利用CEQ 2000测序仪(Beckman，Fullerton，CA)对包含插入片段的质粒DNA进行测序。通过上述方法克隆另一种大约853nt的5’侧翼序列，包括SEQ ID NO：4的核苷酸399-1240。
按照相同的方法进行第二轮的基因组步移，其中不同在于使用下列引物GWR1A(5′-AGTAACCGATTGCTCACGTTATCCTC-3′)(SEQ IDNO：2284)和GWR2A(5′-CTCTATTCAACCCCACACGTAACTG-3′)(SEQID NO：2285)。通过该方法克隆另外的约398nt的侧翼序列，包括SEQ IDNO：4的核苷酸1-398。
对调节元件的搜索揭示，除了“TATA”盒，“CAAT”盒，和“GAGA”盒之外，数种MYB-样识别位点和器官特异性元件存在于烟草烟碱脱甲基酶启动子区。使用标准的方法鉴定的推定导出(elicitor)反应性元件和氮调节的元件也出现在启动子区中。
D.结构基因的3′侧翼序列的克隆
按照生产商的使用手册，将BD基因组步移通用试剂盒(Clontechlaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)用于克隆结构基因，D121-AA8的3′侧翼序列。克隆的方法与本实施例前述部分C所述相同，除了所用的基因特异性引物之外。设计的第一条引物接近D121-AA8结构基因的末端(5′-CTAAAC TCT GGT CTG ATC CTG ATA CTT-3′)(SEQ ID NO：2286)。进一步设计的嵌套引物在D121-AA8结构基因的引物1的下游(CTA TAC GTA AGGTAA ATC CTG TGG AAC)(SEQ ID NO：2287)。通过凝胶电泳来检查最终PCR产物。从凝胶上切除需要的带。使用来自QIAGEN的QIAquick凝胶纯化试剂盒来纯化PCR片段。按照生产商的说明书，将纯化的PCR片段连接到pGEM-T Easy载体(Promega，Madison，WI)中。按照生产商的说明书，使用SV小量制备试剂盒(Promega，Madison，WI)通过小量制备来提取转化的DNA质粒。使用CEQ 2000测序仪(Beckman，Fullerton，CA)来对包含插入片段的质粒DNA进行测序。通过上述方法来克隆约1617个核苷酸的另外的3′侧翼序列(SEQ ID NO：4的核苷酸4731-6347)。将3′UTR区的核酸序列显示于图7中。
实施例17
筛选烟草属的烟碱脱甲基酶基因的存在或不存在
如下面的表8所示，将43个烟草属物种，49个黄花烟草品系，和约600个烟草(Nicotiana tabacum)品系接种在花盆中，并将得到的植物培养在温室中。
表8：
 科学名称或常用名称或来源  目录号
 Nicotiana africana  TW6
 Nicotiana amplexicaulis  TW10
 Nicotiana arentsii  TW12
 Nicotiana attenuata  TW13
 Nicotiana benavidesii  TW15
 Nicotiana benthamiana  TW16
 Nicotiana bigelovii  TW18
 Nicotiana bonariensis  TW28
 Nicotiana clevelandii  TW30
 Nicotiana corymbosa  TW35
 Nicotiana debneyi  TW36
 Nicotiana excelsior  TW46
 Nicotiana exigua  TW48
 Nicotiana glauca  TW53
 Nicotiana glutinosa  TW58
 Nicotiana goodspeedii  TW67
 Nicotiana gossei  TW68
 Nicotiana hesperis  TW69
 Nicotiana ingulba  TW71
 Nicotiana kawakamii  TW72
 Nicotiana knightiana  TW73
 Nicotiana maritima  TW82
 Nicotiana megalosiphon  TW83
 Nicotiana miersii  TW85
 Nicotiana nesophila  TW87
 Nicotiana noctiflora  TW88
 Nicotiana nudicaulis  TW90
 Nicotiana otophora  TW94
Nicotiana palmeri TW98
 Nicotiana paniculata  TW99
 Nicotiana petunioides  TW105
 Nicotiana plumbaginifolia  TW106
 Nicotiana repanda  TW110
 Nicotiana rosulata  TW112
 Nicotiana rotundifolia  TW114
 黄花烟草(Nicotiana rustica)  TW116
 Nicotiana setchelli  TW121
 Nicotiana solanifolia  TW123
 Nicotiana stocktonii  TW126
 Nicotiana eastii  TW127
 Nicotiana suaveolens  TW128
 Nicotiana thrysiflora  TW139
 Nicotiana tomentosa  TW140
 Nicotiana tomentosiformis  TW142
 Nicotiana trigonophylla  TW143
 Nicotiana undulata  TW145
 4384-HHS  TR1
 43103-5  TR10
 43104-1  TR11
 4401  TR12
 巴西利亚#7  TR13
 巴西利亚#23  TR14
 巴西利亚Selvaggio  TR15
 巴西利亚  TR16
 Erbasanta  TR17
 68 Olson  TR18
 C 39-193  TR19
 4385 L-5-6  TR2
 德国#2  TR20
 德国#1  TR21
 Mahorka #1  TR22
 Mahorka #2  TR23
 Mahorka #3  TR24
 Mahorka #4  TR25
 Mahorka #5  TR26
 Mahorka #6  TR27
 Mahorka #7  TR28
 Mahorka #8  TR29
 4386 L-5-6  TR3
 Mahorka #9  TR30
 Mahorka #10  TR31
 Mahorka #11  TR32
 Mahorka #12  TR33
 Kostoff  TR34
 Bak #46  TR35
 Koriotes  TR36
 Jainkaya Sol  TR37
 Jainkaya bl  TR38
 Drosqi  TR39
 4390 L-5-2-1  TR4
 14 No.23057  TR40
 爱丁堡25  TR41
 Ja.Bot.Car.  TR42
 R.Bot.Car.  TR43
 HARBIN  TR44
 Normal  TR45
 Matsui  TR46
 布尼  TR47
 杜蒙  TR48
 Chinensis  TR49
 4398 L-5-2-1  TR5
 Campanulata  TR50
 Acutifolia  TR51
 Fructicosa  TR52
 Acutifolia  TR53
 Nordugel  TR54
 GC-1  TR55
 Hasankeyf  TR56
 PNE 241-5  TR57
 PNE 362-4  TR58
 PNE 369-3  TR59
 4399 L-5-2-1  TR6
 PNE 373-13  TR60
 PNE 407-5  TR61
 PNE 412-8  TR62
 PNE 417-4  TR63
 PNE 418-6  TR64
 PNE 420-6  TR65
 PNE 427-4  TR66
 TI 1674  TR67
 TI 1685  TR68
 TI 1686  TR69
 43054  TR7
 TI 1693  TR70
 Rustica  TR71
 Rustica  TR72
 Rustica  TR73
 Rustica  TR74
 Rustica  TR75
 Rustica  TR76
 Rustica  TR77
 选自PI499194  TR78
 选自PI499200  TR79
 43101  TR8
 选自PI499206  TR80
 93024  TR81
 Rustica  TR82
 佛罗里达301  TC195
 DF 300  TC465
 Mos Res Black Mammoth  TC481
 Tom Rossen(TR)Madole  TC486
 MS KY 16  TC521
 NC-BMR 42  TC570
 烟草KDH-926  TC575
 烟草KDH-959  TC576
 烟草KDH-960  TC577
 Nance  TC616
 TN D94  TC621
 Burley Mammoth KY16  TC12
 Ex.12  TC13
 Golden Burley  TC14
 GR 2  TC15
 GR 5  TC16
 GR 6  TC17
 GR 13  TC21
 KY153  TC216
 KY157  TC217
 KY163  TC219
 GR 14  TC22
 KY165  TC220
 Little Sweet Orinoco  TC221
 Little Yellow  TC222
 Madole(NN)  TC223
 One Sucker  TC224
 Virginia 312  TC228
 GR 17  TC23
 GR 18  TC25
 GR 19  TC26
 GR 36  TC28
 GR 38  TC29
 GR 38A  TC30
 GR 40  TC31
 GR 42  TC32
 GR 42C  TC33
 GR 43  TC34
 GR 44  TC35
 GR 45  TC36
 GR 53  TC39
 Greenbrior  TC40
 H-47  TC42
 Harouova  TC43
 Harrow 12  TC44
 Harrow Velvet  TC45
 Aurelius  TC459
 Harwill  TC46
 Black Mammoth  TC460
 Browleaf  TC462
 D-534-A-1  TC464
 DF 516  TC467
 DF 911  TC468
 HI Burley 21  TC47
 Improved Madole  TC471
 Jernigan’s Madole  TC472
 肯塔基州151  TC473
 Little Crittenden  TC476
 Lizard Tail Orinoco  TC477
 Improved Brior  TC48
 Mos Res(MR/NN)Madole  TC480
 Mos Res Little Crittenden  TC482
 Mos Res Little Wood  TC483
 Narrow Leaf(NL)Madole  TC484
 Sears Special  TC485
 VA 310  TC487
 Walkers Broadleaf  TC489
 Judy’s Pride  TC49
 Woods  TC490
 Baur  TC491
 Bel MS-1  TC492
 Bel MS-2  TC493
 Catterton  TC494
 Dean  TC495
 Gertz  TC496
 Keller  TC497
 马里兰10  TC498
 马里兰14 D2  TC499
 Kelly Brownleaf  TC50
 马里兰21  TC500
 马里兰59  TC501
 马里兰64  TC502
 马里兰201  TC503
 马里兰341  TC504
 马里兰Stand-Up Mammoth  TC508
 MD B100  TC509
 Kelly Burley  TC51
 Moore  TC511
 Posey  TC512
 Robinson Med Broadleaf  TC513
 Sweeney  TC514
 Thompson  TC515
 Ward  TC516
 威尔逊市  TC517
 MS 400  TC518
 MS 402  TC519
 KY1  TC52
 MS Burley1  TC520
 MS PA Swarr Hibshman  TC523
 SB 400  TC524
 SB Burley 1  TC526
 K5  TC53
 Samsun  TC536
 Samsun(PHYB)-1  TC537
 Samsun(PHYB)-2  TC538
 KY9  TC54
 SamsunHolmes(NN)  TC540
 SamsunNO 15  TC541
 Samsun-BLK SHK Tol  TC542
 Smyrna  TC543
 Smyrna NO 9  TC544
 Smyrna NO 23  TC545
 Smyrna-BLK SHK Tol  TC546
 Stanimaka NO 20  TC547
 土耳其  TC548
 赞西亚(Mitchell-Mor)  TC549
 赞西亚(Smith)  TC550
 赞西亚Yaka NO 18A  TC552
 赞西亚-Parental  TC554
 Perique  TC556
 KY12  TC56
 VA 309  TC560
 VA 409  TC562
 KYBSS  TC565
 NC-BMR 90  TC571
 KDH-926  TC575
 KDH-926  TC575
 KDH-959  TC576
 KDH-959  TC576
 KDH-960  TC577
 C8  TC578
 VA 331  TC592
 Smith TO 448A  TC594
 LN KY 171  TC605
 SI KY 171  TC607
 SI KY 160  TC608
 KY19  TC61
 IG KY 171  TC610
 IG KY 160  TC611
 PY KY 160  TC612
 PY KY 171  TC613
 Shirey  TC617
 TN D950  TC622
 VA 355  TC638
 VA 359  TC639
 OS 802  TC640
 Black Mammoth SM Stalk  TC641
 Elliot Madole  TC643
 Goose Creek Red  TC644
 Little Wood  TC645
 KY56  TC72
 KY57  TC73
 KY58  TC74
 Uniform  TC83
 Warner  TC86
 Yellow Twist Bud  TC88
 委内瑞拉  TI106
 烟草Hoja parado(Galpoa)  TI1068
 阿根廷  TI1068
 秘鲁  TI1075
 土耳其  TI1217
 土耳其  TI1218
 土耳其  TI1219
 土耳其  TI1222
 土耳其  TI1223
 土耳其  TI1224
 土耳其  TI1225
 土耳其  TI1229
 土耳其  TI1230
 土耳其  TI1235
 土耳其  TI1236
 土耳其  TI1237
 西班牙  TI1239
 西班牙  TI1245
 西班牙  TI1246
 西班牙  TI1247
 西班牙  TI1250
 西班牙  TI1251
 西班牙  TI1253
 南斯拉夫  TI1254
 巴拉圭  TI1255
 埃塞俄比亚  TI1268
 埃塞俄比亚  TI1269
 埃塞俄比亚  TI1270
 埃塞俄比亚  TI1271
 韩国，南部  TI1278
 巴西  TI128
 韩国，南部  TI1280
 南斯拉夫  TI1282
 南斯拉夫  TI1283
 南斯拉夫  TI1284
 南斯拉夫  TI1285
 南斯拉夫  TI1286
 南斯拉夫  TI1287
 巴西  TI129
 南斯拉夫  TI1291
 南斯拉夫  TI1292
 南斯拉夫  TI1293
 南斯拉夫  TI1295
 南斯拉夫  TI1296
 南斯拉夫  TI1297
 玻利维亚  TI1301
 玻利维亚  TI1302
 阿根廷  TI1306
 巴布亚新几内亚  TI1311
 希腊  TI1313
 新西兰  TI1315
 新西兰  TI1317
 新西兰  TI1318
 南斯拉夫  TI1320
 南斯拉夫  TI1321
 南斯拉夫  TI1322
 南斯拉夫  TI1324
 南斯拉夫  TI1325
 南斯拉夫  TI1326
 南斯拉夫  TI1327
 南斯拉夫  TI1329
 南斯拉夫  TI1332
 南斯拉夫  TI1333
 奥地利  TI1349
 古巴  TI1373
 古巴  TI1375
 古巴  TI1376
 保加利亚  TI1378
 保加利亚  TI1379
 保加利亚  TI1380
 保加利亚  TI1380
 保加利亚  TI1381
 保加利亚  TI1382
 保加利亚  TI1383
 保加利亚  TI1384
 保加利亚  TI1385
 保加利亚  TI1386
 保加利亚  TI1387
 保加利亚  TI1388
 保加利亚  TI1389
 保加利亚  TI1407
 保加利亚  TI1408
 保加利亚  TI1409
 保加利亚  TI1410
 保加利亚  TI1411
 保加利亚  TI1412
 意大利  TI1414
 利比里亚  TI1426
 利比里亚  TI1427
 波兰  TI1444
 古巴  TI1452
 古巴  TI1453
 巴西  TI1455
 德国  TI1459
 德国  TI1460
 西班牙  TI1485
 保加利亚  TI1492
 保加利亚  TI1493
 保加利亚  TI1494
 保加利亚  TI1496
 瑞士  TI1506
 澳大利亚  TI1507
 澳大利亚  TI1508
 德国  TI1532
 德国  TI1533
 比利时  TI1534
 比利时  TI1535
 奥地利  TI1536
 意大利  TI1538
 伊朗  TI1555
 伊朗  TI1556
 美国  TI1561
 美国  TI1562
 美国  TI1563
 波兰  TI1567
 波兰  TI1568
 波兰  TI1569
 波兰  TI1570
 日本  TI158
 日本  TI1594
 意大利  TI1595
 意大利  TI1596
 意大利  TI1599
 意大利  TI1600
 意大利  TI1601
 意大利  TI1602
 罗得西亚  TI1603
 日本  TI1604
 日本  TI1605
 南斯拉夫  TI1623
 美国  TI186
 美国  TI187
 美国  TI240
 美国  TI241
 美国 TI271
 哥伦比亚 TI291
 美国 TI331
 罗马尼亚 TI380
 罗马尼亚 TI381
 美国 TI395
 美国 TI396
 美国 TI444
 美国 TI480
 美国 TI484
 美国 TI486
 美国 TI532
 美国 TI538
 哥伦比亚 TI540
 哥伦比亚 TI541
 洪都拉斯 TI567
 洪都拉斯 TI568
 厄瓜多尔 TI569
 阿尔及利亚 TI69
 洪都拉斯 TI706
 伊朗 TI73
 委内瑞拉 TI776
 前苏联 TI86
 前苏联 TI87
 前苏联 TI88
 前苏联 TI90
 前苏联 TI92
 前苏联 TI93
 前苏联 TI94
 巴西  TI97
 巴西  TI975
 TI1007
 TI1025
 TI1026
 Tabaco Corriente  TI105
 Ambireno  TI1050
 古巴  TI1061
 Lampazo  TI1067
 Hoja Parado(Galpao)  TI1068
 Judi Pride Bertel  TI1075
 Americano Tracuateua  TI108
 Guayabito  TI1080
 Crillo Saltono  TI1082
 Crillo Saltono  TI1083
 Chileno Colorado，Hoja Anjosta  TI1085
 Chileno Grande Colorado  TI1095
 Creja De Mula  TI1119
 Chinese X Amarellinho  TI1143
 Cubano De La Sierra  TI115
 TI119
 TI1211
 TI1215
 TI1277
 TI1288
 Begej  TI1331
 Fodya  TI1350
 TI1352
 Oxviz  TI1356
 Kulsko  TI1380
 Tekne  TI1388
 Nuk  TI1397
 Amarillo Rio Grande Do Sul  TI14
 Guacharo U.S.A  TI1473
 TI1482
 TI1484
 Rippel  TI1498
 Amarelao  TI1499
 Immune 580 MS  TI1501
 W.K.39  TI1502
 Sirone  TI1508
 Espado  TI151
 Simmaba  TI152
 Russian Burley  TI1534
 Vorstenladen  TI1541
 Selesion Olor  TI1543
 NF 2617  TI1550
 NFC 2  TI1551
 Kutsaga E-1  TI1552
 CH T.Z.273-3B  TI1556
 Beinhart 1000-1  TI1561
 Lonibow  TI1573
 A17  TI1574
 A22  TI1575
 A23  TI1576
 Parado  TI1583
 Quin Diaz  TI1585
 Ke-Shin No.1  TI1592
 BT 101  TI1594
 Shiroenshu 201  TI1604
 Higo  TI161
 Lonibow  TI1613
 Little Gold 1025  TI1618
 MA-Song-Ta  TI1619
 Nanbu  TI162
 Tan-Yuh-1  TI1620
 Veliki Hercegovac  TI1623
 (S.P.I.27525)  TI178
 科尔多瓦  TI198
 弗吉尼亚  TI220
 弗吉尼亚  TI222
 No.3  TI230
 科尔多瓦  TI255
 科尔多瓦  TI257
 科尔多瓦  TI260
 科尔多瓦  TI268
 Cubano  TI295
 TI301
 Hoja Ancha  TI309
 TI312
 Chocoa  TI313
 帕尔米拉  TI318
 Cubano  TI323
 TI341
 TI343
 TI350
 TI382
 Zapatoca  TI384
 Tachuleo  TI385
 Arcial Chico  TI394
 TI407
 Copan  TI421
 弗吉尼亚  TI424
 TI429
 Tachuelo  TI432
 Cordoncillo  TI438
 Repello and Bravo Negro  TI445
 TI447
 Costillo Nigro，Blanco，Pina  TI450
 Hubana and Palmira  TI476
 Colorado  TI508
 TI510
 TI514
 Chaco Chivo  TI515
 肯塔基州  TI527
 TI528
 Tabaco Blanco  TI530
 TI554
 Cacho Do Chivo  TI560
 Dolores De Copan  TI562
 Barbasco  TI578
 TI582
 TI592
 TI596
 TI606
 TI629
 Blanco，科罗拉多  TI630
 Tlapacoyan  TI645
 TI657
 TI661
 Oja-De-Vastago  TI665
 Chanchamayo  TI687
 Daule  TI691
 TI717
 Amarillo Riogrande  TI74
 Monte Libano  TI764
 TI785
 弗吉尼亚  TI789
 TI792
 Cacerio De Songoy  TI794
 Gumo  TI797
 TI822
 Negro or Salom  TI870
 Capadare and Rabo De Gallo  TI889
 TI946
 Rabo De Gallo  TI955
 Virginia Bright  TI964
 KY171(ph_)  04GH#105-1
 KY171(ph_)  04GH#105-2
 KY171(ph_)  04GH#105-3
 KY171(ph_)  04GH#105-4
 KY171(ph_)  04GH#105-5
 KY171(ph_)  04GH#105-6
 KY171(ph_)  04GH#107-1
 KY171(ph_)  04GH#107-2
 KY171(ph_)  04GH#107-3
 KY171(ph_)  04GH#107-4
 KY171(ph_)  04GH#107-5
 KY171(ph_)  04GH#107-6
 NL.Madole(ph_)  04GH#114-1
 NL.Madole(ph_)  04GH#114-2
 NL.Madole(ph_)  04GH#114-3
 NL.Madole(ph_)  04GH#114-4
 NL.Madole(ph_)  04GH#114-5
 NL.Madole(ph_)  04GH#114-6
 NL.Madole(ph_)  04GH#115-1
 NL.Madole(ph_)  04GH#115-2
 NL.Madole(ph_)  04GH#115-3
 NL.Madole(ph_)  04GH#115-4
 NL.Madole(ph_)  04GH#115-5
 NL.Madole(ph_)  04GH#115-6
 TN D950(ph_)  04GH#124-1
 TN D950(ph_)  04GH#124-2
 TN D950(ph_)  04GH#124-3
 TN D950(ph_)  04GH#124-4
 TN D950(ph_)  04GH#124-5
 TN D950(ph_)  04GH#124-6
 TN D950(ph_)  04GH#125-1
 TN D950(ph_)  04GH#125-2
 TN D950(ph_)  04GH#125-3
 TN D950(ph_)  04GH#125-4
 TN D950(ph_)  04GH#125-5
 TN D950(ph_)  04GH#125-6
 Basma(PhPh)  04GH#68
 KY14  86-00-K-7-1
叶子样品取自6周龄的植物。按照生产商的说明书，使用Dneasy植物最少试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)进行来自叶子的DNA提取。
基于本文所述的5′启动子和3′UTR区来设计引物。正向引物是5′-GGCTCT AGA TAA ATC TCT TAA GTT ACT AGG TTC TAA-3′(SEQ IDNO：2290)，反向引物是5′-GGC TCT AGA AGT CAA TTA TCT TCT ACAAAC CTT TAT ATA TTA GC-3′(SEQ ID NO：2291)(来自5′侧翼区的-750到180nt 3′UTR)。将提取自所有上述烟草属品系中的基因组DNA用于PCR分析。将100μl的反应混合物和Pfx高保真酶用于PCR扩增。由于在物种之间的较少的同源性，所用的退火温度是54℃(该温度低于上述用于从4407转化体烟草中克隆基因组序列的温度2℃)。将该PCR产物在电泳后，在0.8％的琼脂糖凝胶上进行观察。具有约3.5kb分子量的单一条带在凝胶上存在或不存在。将具有阳性条带的品系认为是具有目标基因。对于缺乏阳性条带的品系而言，使用4组另外的引物来进行4个另外的PCR反应。这些引物组选自基因的不同的区域。所述4组引物是：
(1)从起始密码子(5′-GCC CAT CCT ACA GTT ACC TAT AAA AAGGAA G-3′)(SEQ ID NO：2292)到终止密码子(5′-ACC AAG ATG AAA GATCTT AGG TTT TAA-3′)(SEQ ID NO：2293)，
(2)从起始密码子的上游570nt(5′-CTG ATC GTG AAG ATG A-3′)(SEQ ID NO：2294)到内含子的末端(5′-TGC TGC ATC CAA GAC CA-3′)(SEQ ID NO：2295)，
(3)从内含子的起始的300nt的下游(5′-GGG CTA TAT GGA TTCGC-3′)(SEQ ID NO：2296)到内含子的末端(5′-TGC TGC ATC CAA GACCA-3′)(SEQ ID NO：2295)，和
(4)从内含子的起始的300nt下游(5′-GGG CTA TAT GGA TTC GC-3′)(SEQ ID NO：2296)到3′UTR(5′-AGT CAA TTA TCT TCT ACA AAC CTTTAT ATA TTA GC-3′)(SEQ ID NO：2195)。
如果5个上述PCR反应都显示没有正确的条带，认为所述品系缺乏目标基因。基因组DNA的量和目标烟碱脱甲基酶基因的PCR产物的实例描述在图8和9中。
将被鉴定为缺乏烟碱脱甲基酶基因的生殖质用作用栽培的烟草育种的来源材料。然而，在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中显示的任何核酸序列，或其片段可以以类似方式进行使用。物种间或物种内杂交方法组合以标准育种方法，诸如回交或谱系法可以用于将异常或不存在的烟碱脱甲基酶基因或在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中显示的任何核酸序列或其片段，从供体来源传递到栽培的烟草中。对于烟碱脱甲基酶的筛选实验的结果显示在下面的表9中。可以用其本身或另一种阴性品系(例如，Nicotiana africana x Nicotiana africana或Nicotiana africana x Nicotianaamplexicaulis或任何适合的育种组合)来培育对于烟碱脱甲基酶是阴性的品系。还按照本领域已知的标准烟草育种技术来用任何商购品种的烟草来培育阴性品系。可以按照本领域标准的方法来用任何其它相容性植物培育烟草品系。
表9：来自筛选烟草属的烟碱脱甲基酶基因的示例性结果
科学名称或常用名称或(起源)     目录号     筛选结果
Nicotiana africana     TW6     阴性
Nicotiana amplexicaulis     TW10     阴性
Nicotiana arentsii     TW12     阴性
Nicotiana benthamiana     TW16     阴性
Nicotiana bigelovii     TW18     阴性
Nicotiana corymbosa     TW35     阴性
Nicotiana debneyi     TW36     阴性
Nicotiana excelsior     TW46     阴性
Nicotiana exigua     TW48     阴性
Nicotiana glutinosa     TW58     阴性
Nicotiana goodspeedii     TW67     阴性
Nicotiana gossei     TW68     阴性
Nicotiana hesperis     TW69     阴性
Nicotiana ingulba     TW71     阴性
Nicotiana knightiana     TW73     阴性
Nicotiana maritima     TW82     阴性
Nicotiana megalosiphon     TW83     阴性
Nicotiana miersii     TW85     阴性
Nicotiana nesophila     TW87     阴性
Nicotiana noctiflora     TW88     阴性
Nicotiana nudicaulis     TW90     阴性
Nicotiana otophora     TW94     阳性
Nicotiana palmeri     TW98     阴性
Nicotiana paniculata     TW99     阴性
Nicotiana petunioides     TW105     阴性
Nicotiana plumbaginifolia     TW106     阴性
Nicotiana repanda     TW110     阴性
Nicotiana rosulata     TW112     阴性
Nicotiana rotundifolia     TW114     阴性
黄花烟草     TW116     阴性
Nicotiana setchelli     TW121     阴性
Nicotiana stocktonii     TW126     阴性
Nicotiana eastii     TW127     阴性
Nicotiana suaveolens     TW128     阴性
Nicotiana thrysiflora     TW139     阳性
Nicotiana tomentosa     TW140     阳性
Nicotiana tomentosiformis     TW142     阳性
Nicotiana trigonophylla     TW143     阴性
NL Madole     原种     阳性
KY 14     原种     阳性
TN 86     原种     阳性
Coker 176     原种     阳性
KY21     TC62     阳性
KY22     TC63     阳性
KY24     TC64     阳性
KY26     TC65     阳性
KY33     TC66     阳性
KY34     TC67     阳性
KY35     TC68     阳性
KY41A     TC69     阳性
KY54     TC71     阳性
KY52     TC70     阳性
弗吉尼亚528     TC85     阳性
弗吉尼亚B-29     TC86     阳性
401 Cherry Red     TC227     阳性
401 Cherry Red Free     TC228     阳性
KY170     TC474     阳性
KY171     TC475     阳性
马里兰609     TC505     阳性
马里兰Mammoth     TC507     阳性
VA403     TC580     阳性
KY908     TC630     阳性
Earl Jennett Madole     TC642     阳性
Kavala     TC533     阳性
Kavala No 15A     TC534     阳性
GR 10     TC19     阳性
GR 10A     TC20     阳性
GR 24     TC27     阳性
NOD 9     TI1745     阳性
NOD 12     TI1747     阳性
NOD 17     TI1749     阳性
80111 Pudawski 66CMS     TI1661     阳性
84160 Pudawski 66     TI1683     阳性
MII 109     TI1715     阳性
密西西比Heirloom     TI1716     阳性
Ovens 62     TI1741     阳性
BT 101     TI1594     阳性
肯塔基州MI 429     TI1595     阳性
Shiroenshu 201     TI1604     阳性
Shiroenshu 202     TI1605     阳性
Ostrolist 2747 II     TI1568     阳性
Ergo     TI1349     阳性
白莱烟323     TI1535     阳性
俄国白莱烟     TI1534     阳性
Puremozhetz 83     TI1569     阳性
Bulsunov 80     TI1537     阳性
阿玛里洛Riogrande     TI74     阳性
Espado     TI151     阳性
Crillo Saltono     TI1082     阳性
Kutsaga E-1     TI1552     阳性
Beinhart 1000-1     TI1561     阳性
Kelly Brownleaf     TC50     阳性
KY9     TC54     阳性
Black Mammoth     TC460     阳性
Lizard Tail Orinoco     TC477     阳性
Bel MS-2     TC493     阳性
马里兰201     TC503     阳性
Perique     TC556     阳性
NC-BMR 90     TC571     阳性
LN KY 171     TC605     阳性
萨姆森     TC536     阳性
赞西亚-Parental     TC554     阳性
(土耳其)     TI1222     阳性
Hongrois(西班牙)     TI1246     阳性
(埃塞俄比亚)     TI1269     阳性
Ravajk(南斯拉夫)     TI1284     阳性
(玻利维亚)     TI1301     阳性
Adjuctifolia(新西兰)     TI1317     阳性
NO.6055(古巴)     TI1375     阳性
(保加利亚)     TI1386     阳性
Grande Reditto(意大利)     TI1414     阳性
(德国)     TI1459     阳性
(瑞士)     TI1506     阳性
Sirone(澳大利亚)     TI1508     阳性
Dubek 566(波兰)     TI1567     阳性
鹿儿岛Maruba(日本)     TI158     阳性
Erzegovina Lecce MI 411(意大利)     TI1602     阳性
(哥伦比亚)     TI291     阳性
Okso(前苏联)     TI86     阳性
实施例18
在烟碱脱甲基酶基因中产生或造成突变并筛选遗传性变异
使用分子技术包括在基因组中靶向诱导的局部病灶(TILLING)，DNA指纹法诸如扩增片段长度多态性(AFLP)，和单核苷酸多态性(SNP)，来筛选在编码烟碱脱甲基酶的序列或由图1、3-7、10-158、162到170、172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的核酸序列所代表的任何其它基因中的先存在的遗传性变异或突变。在实践中，使用代表先存在的遗传变异的植物群体诸如转基因植物(例如，本文所述的那些的任一种)或通过使生殖组织、种子或其它植物组织与化学诱变剂诸如烷化剂、例如乙烷磺酸甲酯(EMS)，或辐射诸如X-射线或γ-射线接触产生的那些。对于诱变处理的种群，对于每种类型的植物组织，通过实验确定诱变的化学品或辐射的剂量从而使获得的突变频率低于由致死率或生殖不育性表征的阈值水平。基于突变的预期频率，估计得自诱变处理的M1代种子的数量或M1植物种群的大小。M1植物的子代，M2代表示这样的种群，其理想地对于基因，例如烟碱脱甲基酶基因中的突变进行评估。
可以将Tilling，DNA指纹法，SNP或类似的技术用于在需要的基因诸如烟碱脱甲基酶基因中检测诱导的或天然存在的遗传变异。所述变异可以得自缺失、置换、点突变、易位、倒位、复制、插入或完全的无效突变。这些技术可以用在标记辅助的选择(MA育种程序)以将烟碱脱甲基酶基因或在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294显示的任何核酸序列或其片段中的无效或不相似的等位基因传递或培育到其它的烟草中。育种者可以通过使包含无效或不相似的等位基因的基因型与农艺上理想的基因型杂交来产生分离的种群。使用来自烟碱脱甲基酶序列或在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的核酸序列，或其片段的标记，使用前面列出的技术之一，可以筛选在F2或回交代的植物。可以使被鉴定具有无效或不相似的等位基因的植物进行回交或自花传粉来产生可以被筛选的下一代。根据所用的预期遗传模式或MAS技术，可能必须的是，在回交的每个周期前给选定的植物进行自花传粉从而辅助需要的个体植物的鉴定。可以重复回交或其它的育种方法直到回收回归亲本的需要的表型。
实施例19
将不同的烟碱脱甲基酶基因表达培育或传递到栽培的烟草中
A.亲代品系的选择
将供体烟草品系鉴定为具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的那些(例如，使用基于PCR的策略被鉴定为缺乏烟碱脱甲基酶基因的烟草品系或对于烟碱脱甲基酶是无效的烟草品系或表达具有改变的酶活性的烟碱脱甲基酶的烟草品系；或表达转基因的烟草品系也被认为对于烟碱脱甲基酶基因的表达是不同的，所述转基因改变或使基因表达沉默)或具有在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的任何核酸序列或其片段的变体的那些，并且选择所述供体烟草品系作为供体亲本。按照本领域已知的标准方法，例如本文所述的那些来产生这些植物。其它的供体植物包括已经经过诱变处理并且随后被鉴定为具有不同的烟碱脱甲基酶基因活性或基因产物的不同的活性的烟草植物，所述基因产物由在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294所显示的任何核酸序列，或其片段编码。一个示范性的供体亲代是烟草品系，黄花烟草。
所述受体烟草品系典型地是任何商业烟草品种诸如烟草(Nicotianatabacum)TN 90。其它有用的烟草(Nicotiana tabacum)品种包括BU 64，CC101，CC 200，CC 27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K326，K 346，K 358，K 394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY 14，KY 160，KY17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，Narrow Leaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NCBH 129，OXFORD 207，′Perique′烟草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RG H51，RGH4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SP G-28，SPG-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。来自这些品种的种子还可以来自通过使用标准化学或分子方法筛选烟碱转化的缺乏或存在得到的来源。这些商业物种还提供按照本文所述方法改变烟碱脱甲基酶活性的材料。本领域已知的其它无效品系和受体或供体品系也是有用的，并且被鉴定与本文所述的烟碱脱甲基酶基因不相似的品系也充当供体亲本。受体品系还可以选自用于烟熏烟、白莱烟、深色烟草、弗吉尼亚烟或东方型烟草的任何烟草种类。表10显示示范性烟草属物种，其显示与烟草(Nicotiana tabacum)的育种相容性(还见，例如，由APS公开的Compendium of Tobacco Diseases由Japan Tobacco Inc.公开的 The Genus Nicotiana Illustrated。
表10可与烟草(Nicotiana tabacum)相容的示范性烟草(Nicotiana)物种
    科学名称或常用名称或(来源)   目录号     PI号     筛选结果
    Nicotiana amplexicaulis   TW10     PI271989     阴性
    Nicotiana benthamiana   TW16     PI555478     阴性
    Nicotiana bigelovii   TW18     PI555485     阴性
    Nicotiana debneyi   TW36     阴性
    Nicotiana excelsior   TW46     PI224063     阴性
    Nicotiana glutinosa   TW58     PI555507     阴性
    Nicotiana goodspeedii   TW67     PI241012     阴性
    Nicotiana gossei   TW68     PI230953     阴性
    Nicotiana hesperis   TW69     PI271991     阴性
    Nicotiana knightiana   TW73     PI555527     阴性
    Nicotiana maritima   TW82     PI555535     阴性
    Nicotiana megalosiphon   TW83     PI555536     阴性
    Nicotiana nudicaulis   TW90     PI555540     阴性
    Nicotiana paniculata   TW99     PI555545     阴性
    Nicotiana plumbaginifolia   TW106     PI555548     阴性
    Nicotiana repanda   TW110     PI555552     阴性
    黄花烟草   TW116     阴性
    Nicotiana suaveolens   TW128     PI230960     阴性
    Nicotiana sylvestris   TW136     PI555569     阴性
    Nicotiana tomentosa   TW140     PI266379     阳性
    Nicotiana tomentosiformis   TW142     阳性
    Nicotiana trigonophylla   TW143     PI555572     阴性
B.基因传递
按照标准育种方法，供体亲本与供体亲本以相互的方式进行杂交(cross)或杂交(hybridize)。按照标准方法鉴定的成功的杂交产生能育的F1植物，或如果需要，与受体亲本回交的F1植物。对来自F1植物的F2代的植物种群，关于不同的烟碱脱甲基酶基因表达(例如，按照标准方法，例如通过使用基于本文所述的烟碱脱甲基酶的核苷酸序列信息的引物的PCR方法，鉴定由于缺乏烟碱脱甲基酶基因，不能表达烟碱脱甲基酶的植物)或在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294显示的任何核酸序列，或其片段的不同表达，来进行筛选。或者，将用于评估植物生物碱含量的本领域的已知的任何标准筛选方法用于鉴定不能将烟碱转化为去甲烟碱的植物。接着，将选定的植物与受体亲本进行杂交，并且给第一代回交(BC1)植物进行自花传粉以产生BC1F2种群，又对所述BC1F2种群进行关于不同的烟碱脱甲基酶基因表达的筛选(例如，烟碱脱甲基酶基因的无效形式)。重复回交、自花传粉和筛选的过程，例如至少4次，直到最终的筛选产生能育的并且与受体亲本相当相似的植物。如果需要，给这种植物进行自花传粉，并且随后，再次对子代进行筛选以证实所述植物显示不同的烟碱脱甲基酶基因表达(例如，显示关于烟碱脱甲基酶的无效条件的植物)或在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中显示的任何核酸序列，或其片段的不同表达。任选地进行选定植物的细胞遗传学分析以证实染色体组与染色体配对的相互关系。使用标准方法来产生选定植物的培育种子，所述方法包括，例如田间测试，确证对于烟碱脱甲基酶的无效条件，或由在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中显示的任何核酸序列或其片段编码的多肽的无效或增加的条件，和对加工处理的叶子进行化学分析以证实生物碱的水平，特别地去甲烟碱含量和去甲烟碱/烟碱+去甲烟碱的比率或其它的由那些基因序列提供的这些理想性质，所述基因序列见于在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的任何核酸序列，或其片段。
在通过在受体(例如，黄花烟草)和供体亲本(例如，TN 90)之间杂交得到的原始F1杂种与供体(例如，TN 90)杂交或回交的情形中，给这种回交的子代进行自花传粉以产生BC1F2代，对所述BC1F2代关于烟碱脱甲基酶的无效或不相似的形式，或由在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19，和173-1到173-294中显示的任何核酸序列，或其片段编码的多肽的无效或增加的条件，进行筛选。关于育种尝试的剩下的内容在上述段落中进行描述。
C.农学性能测试和表型的确证
使用标准田间方法，在田间，对通过育种和筛选产生的品系进行评估，所述育种和筛选关于不同的烟碱脱甲基酶基因表达(例如，关于烟碱脱甲基酶的无效条件)或在图1，3-7，10-158，162-170，172-1到172-19和173-1到173-294中显示的任何核酸序列，或其片段的表达进行。将包括原始受体亲本(例如，TN 90)的对照基因型包括在内，并将选中项目(entries)以完全随机的分组设计或其它适合的田间设计排列在田间。使用烟草的标准农学实践，例如，将烟草进行收获，称重，在加工处理之前和过程中取样进行化学以及其它常规的测试。进行数据的统计学分析以证实选定的品系与受体，例如亲本品系TN 90的相似性。
实施例20
将改变的特性培育或传递到栽培的烟草中
还可以将本文所述的基因的任一个，例如在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的那些核酸序列的任一个的表达按照本文所述的方法进行改变。这些基因提供改变植物表型，例如改善香味，或香气或两者，改善器官感觉性质，或改善可保存性的基础。接着，按照本领域已知的标准方法，例如本文所述的那些，将被鉴定具有改变的表型的植物用在育种方法中。
实施例21
杂种植物产生
被开发用于使用原生质体融合产生杂种植物的标准原生质体培养方法的应用对于产生具有不同基因表达(例如，不同烟碱脱甲基酶基因表达)的植物也是有用的。因此，从具有不同基因表达的第一和第二烟草植物产生原生质体。通过成功的原生质体融合培养胼胝体并接着再生植物。鉴定得到的子代杂种植物并按照标准方法将其对于不同的基因表达进行选择，并且如果需要，可以将其用在任何标准育种方法中。
WO 03/078577，WO 2004/035745，PCT/US/2004/034218，和PCT/US/2004/034065和所有本文参考的其它参考文献、专利、专利申请出版物、和专利申请结合入本文作为参考，其程度如同这些参考文献、专利、专利申请出版物和专利申请的每一个单独并入本文作为参考。
预期本领域那些技术人员在考虑本发明的前述详细的描述后，在本发明的实践上作出各种修改和改进。因此，意欲将这些修改和改进包括在下列权利要求的范围内。

Claims (94)

1.一种产生具有减少的烟碱脱甲基酶基因的表达的烟草植物的育种方法，所述方法包括下列步骤：
(a)提供具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的第一烟草植物；
(b)提供包含至少一个表型性状的第二烟草植物；
(c)使所述第一烟草植物与所述第二烟草植物杂交以产生F1子代植物；
(d)收集具有所述不同的烟碱脱甲基酶基因的表达的所述F1子代的种子；和
(e)萌发所述种子以产生具有减少的烟碱脱甲基酶基因的表达的烟草植物。
2.权利要求1的方法，其中所述第一烟草植物包括具有突变的内源烟碱脱甲基酶基因。
3.权利要求2的方法，其中所述第一烟草植物包括的突变是缺失、置换、点突变、易位、倒位、复制或插入。
4.权利要求1的方法，其中所述第一烟草植物包括具有无效突变的烟碱脱甲基酶基因。
5.权利要求1的方法，其中所述第一烟草植物包括使内源烟碱脱甲基酶基因沉默的重组基因。
6.权利要求1的方法，其中所述第一烟草植物包括具有减少或改变的酶活性的烟碱脱甲基酶。
7.权利要求1的方法，其中所述第一烟草植物是转基因植物。
8.权利要求1的方法，其中所述第一烟草植物包括Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotianabenthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotianagoodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotianamiersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotianapetunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotianarosulata，Nicotiana rotundifolia，黄花烟草(Nicotiana rustica)，Nicotianasetchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。
9.权利要求8的方法，其中所述第一烟草植物包括Nicotianaamplexicaulis，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotianadebneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana glutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana knightiana，Nicotianamaritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana nudicaulis，Nicotianapaniculata，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，黄花烟草，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。
10.权利要求1的方法，其中所述第一烟草植物是烟草(Nicotianatabacum)。
11.权利要求1的方法，其中所述第一烟草植物是东方型烟草、深色烟草、烟熏烟或晾烟，弗吉尼亚烟或白莱烟烟草植物。
12.权利要求1的方法，其中所述第二烟草植物是烟草(Nicotianatabacum)。
13.权利要求11的方法，其中所述烟草是BU 64，CC 101，CC 200，CC27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，NarrowLeaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，OXFORD207，′Perique′烟草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SP G-28，SP G-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 90，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。
14.权利要求1的方法，其中所述第二烟草植物是东方型烟草、深色烟草、烟熏烟或晾烟，弗吉尼亚烟或白莱烟烟草植物。
15.权利要求1的任一项的方法，其中所述表型性状包括疾病抗性；高产率；高级指数；可保存性；熟化品质；可机械收割性；保持能力；叶子品质；高度；成熟；茎长；或每株植物的叶子数量。
16.权利要求1的方法，其还包括用步骤(b)的植物给雄性不育或雄性不育杂种传粉。
17.权利要求1的方法，其还包括使产生自步骤(e)的萌发的种子的植物回交或传粉。
18.一种将烟碱脱甲基酶缺陷性状培育到烟草植物中的方法，所述方法包括下列步骤：
a)使具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的第一烟草植物与第二烟草植物杂交；
b)产生所述杂交的子代烟草植物；
c)从子代烟草植物中提取DNA样品；
d)使所述DNA样品与标记核酸分子接触，所述标记核酸分子与烟碱脱甲基酶基因或其片段杂交；和
e)进行用于不同烟碱脱甲基酶基因表达性状的标记辅助的育种方法。
19.权利要求18的方法，其中所述标记辅助的育种方法包括使用扩增片段长度多态性，限制性片段长度多态性，随机扩增多态性展示，单核苷酸多态性，微卫星标记，或在烟草基因组中靶向诱导的局部病灶。
20.一种产生烟草种子的方法，其包括将选自由下列各项组成的组的任何一种烟草植物与其本身或与第二种独特的烟草进行杂交：Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotianabenthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotianagoodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotianamiersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotianapetunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotianarosulata，Nicotiana rotundifolia，黄花烟草，Nicotiana setchelli，Nicotianastocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotianatrigonophylla。
21.权利要求20的方法，其包括制备杂交的烟草种子的方法，所述方法包括将具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的第一烟草植物与第二种独特的烟草植物进行杂交。
22.权利要求21的方法，其中杂交包括下列步骤：
(a)种植种子，所述种子来自具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的烟草植物和第二种独特的烟草植物的杂交；
(b)从所述种子生长烟草植物直到所述植物开花；
(c)用来自所述第二烟草植物的花粉给具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的烟草植物的花进行传粉或用来自具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的烟草植物的植物的花粉给所述第二烟草植物的花进行传粉；和
(d)收获得自所述传粉的种子。
23.一种在烟草育种程序中开发烟草植物的方法，其包括：
(a)提供具有不同的烟碱脱甲基酶基因表达的烟草植物，或其组分；和
(b)将所述植物或组分作为使用烟草植物育种技术的育种原料的来源。
24.权利要求23的方法，其中所述植物育种技术包括集团选择，回交，自花传粉，渐渗现象，谱系选择，纯系选择，单倍体/二倍体育种，或单种谱系。
25.一种烟草植物或其组分，其中所述植物按照权利要求1，18，20或23的任一项产生。
26.一种获自按照权利要求1，18，20或23的任一项产生的植物的任一种的可再生烟草细胞的组织培养物，其中所述组织培养物再生这样的烟草植物，所述烟草植物能够表达具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的烟草植物的所有生理和形态学特征。
27.权利要求26的组织培养物，其中所述可再生的细胞是胚、分生细胞、种子、花粉、叶、根、根端、或花或是来自其中的原生质体或胼胝体。
28.一种产生烟草产品的方法，其包括：(a)提供按照权利要求1，18，20或23的任一项产生的烟草植物；和(b)从所述烟草植物中制备烟草产品。
29.权利要求28的方法，其中所述烟草产品是加工处理的叶子或茎。
30.权利要求28的方法，其中所述烟草产品是无烟的烟草产品。
31.权利要求28的烟草产品，其中所述烟草产品是湿或干鼻烟，嚼烟，卷烟，雪茄烟，小雪茄烟，pipe tobacco或bidis。
32.一种产生具有改变的特性的烟草植物的育种方法，所述方法包括下列步骤：
(a)提供具有改变的特性的第一烟草植物，其包含核酸分子的不同的基因表达，所述核酸分子选自由下列各项组成的组中：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列；
(b)提供包含至少一种表型性状的第二烟草植物；
(c)使所述第一烟草植物与所述第二烟草植物杂交以产生F1子代植物；
(d)收集具有所述改变的特性的所述F1子代的种子；和
(e)使种子萌发以产生具有所述改变的特性的烟草植物。
33.权利要求32的方法，其中所述第一烟草植物包括内源核酸分子，所述内源核酸分子选自由下列各项组成的组：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列，其中所述核酸包括突变。
34.权利要求33的方法，其中所述第一烟草植物包括的突变是缺失、置换、点突变、易位、倒位、复制或插入。
35.权利要求32的方法，其中所述第一烟草植物包括内源核酸分子，所述内源核酸分子选自由下列各项组成的组：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列，所述核酸包括无效突变。
36.权利要求32的方法，其中所述第一烟草植物包含重组基因，所述重组基因使内源核酸分子，选自由下列各项组成的组的内源核酸分子：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列的表达沉默。
37.权利要求32的方法，其中所述第一烟草植物包含内源核酸分子，所述内源核酸分子选自由下列各项组成的组：在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列，其中所述核酸分子编码具有减少的或改变的酶活性的多肽。
38.权利要求32的方法，其中所述第一烟草植物是转基因植物。
39.权利要求32的方法，其中所述第一烟草植物包括Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotianaexcelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotianaknightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana miersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotianaotophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotiana petunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotiana rosulata，Nicotianarotundifolia，Nicotiana rustica，Nicotiana setchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。
40.权利要求32的方法，其中所述第一烟草植物是烟草。
41.权利要求32的方法，其中所述第一烟草植物是东方型烟草、深色烟草、烟熏烟或晾烟、弗吉尼亚烟或白莱烟烟草植物。
42.权利要求32的方法，其中所述第二烟草植物是烟草。
43.权利要求32的方法，其中所述烟草是BU 64，CC 101，CC 200，CC27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14xL8，NarrowLeaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，OXFORD207，′Perique′烟草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SP G-28，SP G-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 90，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。
44.权利要求32的方法，其中所述第一烟草植物是东方型烟草、深色烟草、烟熏烟或晾烟、弗吉尼亚烟或白莱烟烟草植物。
45.权利要求32的任一项方法，其中所述表型性状包括疾病抗性；高产率；高级指数；可保存性；熟化品质；可机械收割性；保持能力；叶子品质；高度；植物成熟；茎长；或每株植物的叶子数量。
46.权利要求32的方法，其还包括用步骤(b)的植物给雄性不育或雄性不育杂种传粉。
47.权利要求32的方法，其还包括使步骤(e)的萌发的种子产生的植物回交或传粉。
48.将一种特性培育到烟草植物中的方法，所述方法包括下列步骤：a)使第一烟草植物与第二烟草植物进行杂交，所述第一烟草植物具有改变的特性，其包含选自由在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组的核酸分子的不同的基因表达；
b)产生所述杂交的子代烟草植物；
c)从子代烟草植物中提取DNA样品；
d)使DNA样品与标记核酸分子接触，所述标记核酸分子与在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列或其片段杂交；和
e)进行改变的特性的标记辅助的育种方法。
49.权利要求48的方法，其中所述标记辅助的育种方法包括使用扩增片段长度多态性，限制性片段长度多态性，随机扩增多态性展示，单核苷酸多态性，微卫星标记，或在烟草基因组中的靶向诱导的局部病灶。
50.一种产生烟草种子的方法，其包括使得选自由Nicotiana africana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotiana benthamiana，Nicotianabigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotiana goodspeedii，Nicotianagossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotianamaritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotiana miersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotianapalmeri，Nicotiana paniculata，Nicotiana petunioides，Nicotianaplumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotiana rosulata，Nicotianarotundifolia，Nicotiana rustica，Nicotiana setchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii和Nicotiana suaveolens组成的组的第一烟草植物与具有改变的特性的第二烟草植物进行杂交，所述改变的特性包括选自由在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组的核酸分子的不同的基因表达。
51.权利要求50的方法，其中所述第二烟草植物是烟草。
52.权利要求51的方法，其中所述烟草是BU 64，CC 101，CC 200，CC27，CC 301，CC 400，CC 500，CC 600，CC 700，CC 800，CC 900，Coker 176，Coker 319，Coker 371 Gold，Coker 48，CU 263，DF911，Galpao烟草，GL 26H，GL 350，GL 737，GL 939，GL 973，HB 04P，K 149，K 326，K 346，K 358，K394，K 399，K 730，KT 200，KY 10，KY 14，KY 160，KY 17，KY 171，KY 907，KY 160，Little Crittenden，McNair 373，McNair 944，msKY 14x L8，NarrowLeaf Madole，NC 100，NC 102，NC 2000，NC 291，NC 297，NC 299，NC 3，NC 4，NC 5，NC 6，NC 606，NC 71，NC 72，NC 810，NC BH 129，OXFORD207，′Perique′烟草，PVH03，PVH09，PVH19，PVH50，PVH51，R 610，R 630，R 7-11，R 7-12，RG 17，RG 81，RG H4，RG H51，RGH 4，RGH 51，RS 1410，SP 168，SP 172，SP 179，SP 210，SP 220，SP G-28，SP G-70，SP H20，SP NF3，TN 86，TN 90，TN 97，TN D94，TN D950，TR(Tom Rosson)Madole，VA 309，VA 309，或VA 359。
53.权利要求51的方法，其中杂交包括下列步骤：
(a)种植种子，所述种子来自具有改变的特性的烟草植物和第二种，独特的烟草植物的杂交；
(b)从所述种子生长烟草植物直到所述植物开花；
(c)用来自所述第二烟草植物的花粉给具有改变的特性的烟草植物的花进行传粉或用来自具有所述改变的特性的烟草植物的植物的花粉给所述第二烟草植物的花进行传粉；和
(d)收获得自所述传粉的种子。
54.一种在烟草育种程序中开发烟草植物的方法，其包括：
(a)提供具有改变的特性的烟草植物，或其组分，所述改变的特性包括选自由在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组的核酸分子的不同的基因表达；和
(b)将所述植物或组分作为使用烟草植物育种技术的育种原料的来源。
55.权利要求54的方法，其中所述植物育种技术包括集团选择，回交，自花传粉，渐渗现象，谱系选择，纯系选择，单倍体/二倍体育种，或单种谱系。
56.一种烟草植物或其组分，其中所述植物按照权利要求32，48或54的任一项产生。
57.一种获自按照权利要求32，48，50或54的任一项产生的植物的任一种的可再生烟草细胞的组织培养物，其中所述组织培养物再生这样的烟草植物，所述烟草植物能够表达具有改变的特性的烟草植物的所有生理和形态学特征。
58.权利要求57的组织培养物，其中所述可再生的细胞是胚、分生细胞、种子、花粉、叶、根、根端、或花或是来自其中的原生质体或胼胝体。
59.一种产生烟草产品的方法，所述方法包括：(a)提供按照权利要求32，48，50或54的任一项产生的烟草植物；和(b)从所述烟草植物产生烟草产品。
60.权利要求59的方法，其中所述烟草产品是加工处理的叶子或茎。
61.权利要求59的方法，其中所述烟草产品是无烟烟草产品。
62.权利要求59的烟草产品，其中所述烟草产品是湿或干鼻烟，嚼烟，卷烟，雪茄烟，小雪茄烟，pipe tobacco或bidis。
63.一种分离的遗传标记，其包括的核酸序列与选自由在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组中的核酸序列基本上相同。
64.权利要求63的分离的遗传标记，其中所述核酸序列与选自由在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组中的核酸序列是至少70％相同的。
65.权利要求63的分离的遗传标记，其中所述核酸序列包括的序列在严格条件下与选自由在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组中的核酸序列的互补序列杂交。
66.权利要求63的分离的遗传标记，其中所述核酸序列是组成性的，或乙烯或衰老诱导的。
67.权利要求63的分离的遗传标记，其中所述核酸序列编码多肽，所述多肽与选自由在图1，图3和4，图10-158，图160A到160E，图162-170，和图172-1到172-19中显示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列基本上相同。
68.权利要求63的分离的遗传标记，其中所述核酸序列与异源基因可操纵地连接。
69.权利要求63的分离的遗传标记，其中所述核酸序列与可诱导，组成性的，病原体或伤口诱导的，环境或发育调节的，或细胞或组织特异性启动子可操纵地连接。
70.一种表达载体，所述表达载体包括核酸序列，所述核酸序列选自由在图1，图3-7，图10-158，图162到170，图172-1到172-19，和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组，所述载体能够指导由所述核酸序列编码的多肽的表达。
71.一种植物或植物组分，其包括由在图1，图3-7，图10-158，图162-170，图172-1到图172-19和图173-1到173-294中显示的核酸序列组成的组的分离的核酸序列，其中所述核酸序列在所述植物或所述植物组分中表达。
72.权利要求71的植物或植物组分，其中所述植物或植物组分是烟草属物种。
73.权利要求72的植物或植物组分，其中所述烟草属的物种选自在表8中显示的烟草属物种的组。
74.权利要求71的植物或植物组分，其中所述植物组分是叶、茎或种子。
75.权利要求74的植物或植物组分，其中所述叶子是加工处理的烟草叶子。
76.一种烟草产品，其包括权利要求71的植物或植物组分。
77.权利要求76的烟草产品，其中所述烟草产品是无烟烟草产品。
78.权利要求76的烟草产品，其中所述烟草产品是湿或干鼻烟、嚼烟、卷烟、雪茄烟、小雪茄烟、pipe tobacco或bidis。
79.一种从权利要求74的萌发的种子产生的植物。
80.一种在植物细胞中减少组成性、或乙烯诱导或衰老诱导的烟草多肽的表达或酶活性的方法，所述方法包括在所述植物细胞中减少内源组成性、或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平或酶活性。
81.权利要求80的方法，其中所述烟草多肽是p450。
82.权利要求80的方法，其中所述植物细胞来自烟草属的物种。
83.权利要求82的方法，其中所述烟草属的物种选自在表8中显示的烟草属物种的组。
84.权利要求80的方法，其中减少所述内源组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平包括在所述植物细胞中表达转基因，所述转基因编码选自由下列各项组成的组的核酸序列的反义核酸分子：在图1，图3-7，图10-158，图162到170，图172-1到172-19，和图173-1到173-294中显示的核酸序列。
85.权利要求80的方法，其中减少所述组成性、或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平包括表达在所述植物细胞中表达转基因，所述转基因包括选自由下列各项组成的组的核酸序列：在图1，图3-7，图10-158，图162到170，图172-1到172-19，和图173-1到173-294中显示的核酸序列，所述转基因编码组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的双链RNA分子。
86.权利要求80的方法，其中减少所述内源组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平包括在所述植物细胞中共抑制所述组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽。
87.权利要求80的方法，其中减少所述内源组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平包括在所述植物细胞中表达显性失活基因产物。
88.权利要求87的方法，其中所述内源组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽包含在基因中的突变，所述基因编码选自由在图1，图3和4，图10-158，图160A到160E，图162-170，和图172-1到172-19中显示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
89.权利要求80的方法，其中所述减少的表达在转录水平、在翻译水平或在翻译后水平发生。
90.一种在植物细胞中增加组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的表达或酶活性的方法，所述方法包括在所述植物细胞中增加内源组成性，或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平或酶活性。
91.权利要求90的方法，其中所述植物细胞来自烟草属物种。
92.权利要求91的方法，其中所述烟草属的物种选自在表8中显示的烟草属物种的组。
93.权利要求90的方法，其中增加所述组成性、或乙烯或衰老诱导的烟草多肽的水平包括在所述植物细胞中表达转基因，所述转基因包括选自由下列各项组成的组的核酸序列：在图1，图3-7，图10-158，图162到170，图172-1到172-19，和图173-1到173-294中显示的核酸序列。
94.权利要求90的方法，其中所述增加的表达在转录水平、在翻译水平，或在翻译后水平发生。
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