CN108754028A - 一种检测抗烟草花叶病毒Np基因的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测抗烟草花叶病毒Np基因的分子标记及其应用。所述分子标记的序列如SEQ No.1所示。使用特异性引物对待测植株进行PCR扩增，根据扩增产物是否含有所述分子标记来判断植株是否含有Np基因。该分子标记的特异性引物对的序列如SEQ No.2和SEQ No.3所示。本发明所述的分子标记可用于筛选新的抗烟草花叶病毒种质资源。

Description

一种检测抗烟草花叶病毒Np基因的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于植物分子遗传学和烟草种质创新技术领域，进一步属于烟草抗病育种技术领域，具体涉及一种检测抗烟草花叶病毒Np基因的分子标记及其应用。
背景技术
普通烟草花叶病是烟叶生产中分布广、为害重的主要病害之一，其病原烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）广泛存在于寄主活体及其残体上，即使在低温和高温条件仍旧能保持一定的活性，而且其寄主范围非常广，能侵染茄科（烟草、番茄、茄子）、葫芦科（西瓜）、十字花科（油麦菜）等科植物。
选育抗TMV的品种，是应对花叶病最为经济和有效的手段，前人已将野生烟草心叶烟（Nicotiana glutinosa）中对TMV免疫的N基因转育到栽培烟草中。尽管N基因是显性单基因控制，是人类首次克隆的植物抗病基因，但由于连锁累赘的存在，迄今仍没有适宜的高抗TMV烤烟品种进行大规模推广种植。因此，现阶段除了利用烟草基因组序列数据、设计引物、从大批量含N基因的杂交后代筛选短的抗TMV片段外，还在抗TMV的其它野生烟草资源中寻求新的TMV抗源，并转育栽培烟草 。已有的研究表明在野生烟草种质资源中，除N. glutinosa外，还有N. arentsii，N. wigandioides，N. undulata，N. stocktonii，N. repanda，N. cordiforlia，N. knightiana，N. paniculata等高抗TMV，这些抗TMV的野生烟基因组具有与N. glutinosa抗TMV的N基因同源的基因。通过比较分析发现：圆锥烟草（Nicotiana paniculata PI555550）含有与N基因同源的Np基因，Np基因独有一个完整的2.06 kb长的反转录转座子。
因此，本发明利用该反转录转座子筛选抗病相关分子标记，为筛选新的抗病种质资源和烤烟品种的抗病改良提供新材料与数据支撑。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抗烟草花叶病毒Np基因的分子标记，所述分子标记的序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的第二目的在于提供一种检测抗烟草花叶病毒Np基因的方法，即使用特异性引物对待测植株进行PCR扩增，根据扩增产物是否含有所述分子标记来判断植株是否含有Np基因。
本发明的第三目的在于提供一种检测所述分子标记的特异性引物对，所述特异性引物对的正向引物序列如SEQ No.2所示，反向引物序列如SEQ No.3所示。
本发明的第四目的在于提供一种所述分子标记的应用，即利用所述分子标记筛选新的抗烟草花叶病毒植物种质资源，利用新的种质资源培育新的抗病品种。
本发明的第五目的在于提供一种检测所述分子标记的试剂盒。
本发明所述的分子标记能够特异性地检测出抗烟草花叶病毒Np基因，而无法检测出同源N基因，可为筛选含有抗烟草花叶病毒Np基因的抗源奠定基础。
附图说明
图1为使用分子标记检测Np基因（左）和N基因（右）；
其中，M. 100bp；1. N.glutinosa；2. RBST；3. 红花大金元；4. 红花大金元×N.paniculata 的F1杂交种；5. N.paniculata。
图2为F1杂交种接种TMV表现的枯斑。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的一种抗烟草花叶病毒Np基因的分子标记的序列如SEQ ID No.1所示。抗烟草花叶病毒Np基因来源于烟草野生种圆锥烟草（Nicotiana paniculata），与来源于烟草野生种心叶烟（N. glutinosa）抗性显性单基因N基因是同源基因。Np基因具有一个独特而完整的2.06 kb长的LTR反转录转座子，该LTR位于Np基因的第三个内含子中。本发明所述分子标记是以该LTR的部分核苷酸序列为模板筛选获得。
如果在检测植物中发现该分子标记，即表明含有Np基因。因此，本发明提供了一种检测抗烟草花叶病毒Np基因的方法。该方法为使用特异性引物对待测植株进行PCR扩增，根据扩增产物是否含有所述分子标记来判断植株是否含有Np基因。具体包括如下步骤：
（1）提取植株叶片DNA；
（2）以DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增，PCR体系为：1×PCR Buffer，0.25mmol/L dNTPs， 2.0 mmol/L MgCl2，50 ng模板DNA，正反向引物各0.75 μmol/L，1 U TaqDNA聚合酶；PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性60 sec，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min；
（2）扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离检测；
（3）根据电泳结果判断待测植株是含有Np基因。
作为本发明的一种优选，所述分子标记的特异性引物对的正向引物序列如SEQNo.2所示，反向引物序列如SEQ No.3所示。
本发明所述的分子标记可用于筛选新的抗烟草花叶病毒植物种质资源，得到的种质资源可以用于培育新的抗病品种。所述分子标记还可用于制造检测试剂盒。作为本发明的一种优选，所述试剂盒含有上文所述的特异性引物对。
下面将结合具体实施例，对本发明进行进一步的说明。实施例中所用材料为烤烟主栽品种红花大金元、圆锥烟草N. paniculata PI555550（含Np基因）、N. glutinosa（含N基因）、RBST（含N基因）和红花大金元×N.paniculata 远缘杂交的F1代杂交种，并对其进行抗性鉴定。
实施例1：使用分子标记检测Np基因和N基因
Qiagen试剂盒提取红花大金元、N. glutinosa、N.paniculata、RBST及F1代杂交种的DNA，分别利用Np基因及N基因分子标记的特异性引物进行PCR扩增。PCR体系为：1×PCRBuffer，0.25 mmol/L dNTPs， 2.0 mmol/L MgCl2，50 ng模板DNA，正反向引物各0.75 μmol/L，1 U Taq DNA聚合酶；PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性60 sec，55 ℃复性1 min，72 ℃ 延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min
Np基因分子标记的正反向引物序列如SEQ No.2和SEQ No.3所示。
N基因分子标记的正反向引物序列如SEQ No.4和SEQ No.5所示。
从图1可看出：仅圆锥烟草和F1代杂交种扩增出526 bp大小的Np基因分子标记片段，N. glutinosa和RBST 扩增出N基因片段，而红花大金元没有扩增出任何片段。结果表明：该526 bp片段为含Np基因的植株所特有，其序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2：F1代杂交种TMV接种抗性鉴定
以半叶枯斑法接种TMV，即在25℃温室自然光照下，以10 mg/mL的0.2 mL花叶病病毒汁液摩擦接种半叶，另外一半涂清水作为对照，观察F1代杂交种是否有枯斑。如图2所示：TMV接种7d后，F1代杂交种开始出现细小枯斑，说明具有TMV抗性。
综上所述，圆锥烟草提供了新的TMV抗性基因，并且本发明提供的特异性分子标记及其特异性引物能有效地检测出Np基因的存在与否，为筛选新的种质资源提供了方法和工具。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种检测抗烟草花叶病毒Np基因的分子标记及其应用
<130> 2018
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 526
<212> DNA
<213> Nicotiana paniculata PI555550
<400> 1
tgccaaatgt tcaatttgca aaccaagaca taattttgtc tttccgagat ctttcatctc 60
gaattctttc tttaaataat caattgcctt ttggagttct ataggagttc caataaggtt 120
tatgtcatca acatatacgg caaatacaac aaattccgat gttgttttct ttataaaaac 180
acatggacaa atggcatcat ttatatatcc atttcggcgg atatctttag aactcaacaa 240
gctccttttg gacttggagg agaacattgc attctctatg ataagtattg ttcccttagg 300
cagagttata gtagctcttc cagagccttc aattaattta ctactaccag aaattgtagt 360
aacatctgcc ttacacgtat ttaaatgaga gaaatatttc ttctctttga atattgtatg 420
tgtcgtacat gaatcaacta aataaatatt tttataatta aacactgatc caggtttgct 480
ttgtgaggta tccatatttg caagtgtctt gaattctgac caagtg 526
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成片段
<400> 2
tgatgcacaa agatcccgtt 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成片段
<400> 3
gacctctgtg cattcatctt atca 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成片段
<400> 4
accagaatga tatgttccac 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成片段
<400> 5
ggactcaacg ttaattctct g 21

Claims (7)

1.一种抗烟草花叶病毒Np基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记的序列如SEQID No.1所示。
2.一种检测抗烟草花叶病毒Np基因的方法，其特征在于，使用特异性引物对待测植株进行PCR扩增，根据扩增产物是否含有权利要求1所述分子标记来判断植株是否含有Np基因。
3.一种权利要求2所述检测抗烟草花叶病毒Np基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取植株叶片DNA；
（2）以DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增，PCR体系为：1×PCR Buffer，0.25mmol/L dNTPs， 2.0 mmol/L MgCl2，50 ng模板DNA，正反向引物各0.75 μmol/L，1 U TaqDNA聚合酶；PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性60 sec，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min；
（3）扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离检测；
（4）根据电泳结果判断待测植株是含有Np基因。
4.一种权利要求1所述分子标记的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的正向引物序列如SEQ No.2所示，反向引物序列如SEQ No.3所示。
5.一种权利要求1所述分子标记的应用，其特征在于，筛选新的抗烟草花叶病毒植物种质资源，利用新的种质资源培育新的抗病品种。
6.一种检测权利要求1所述分子标记的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求4所述的特异性引物对。
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