JP2016532437A - ホウレンソウにおけるperonospora耐性のための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年10月8日に出願された米国仮出願第61/888,501号、及び2013年11月4日に出願された米国仮出願第61/899,780号の利益を主張し、その全体を参照することにより本明細書に組み入れられたものとする。
2014年10月7日に作成された、Microsoft Windowsで稼働するシステムで定量して2キロバイトである「SEMB013WO_ST25.txt」のファイル名に含まれる配列リストは、本明細書と共に電子出願され、それを参照することにより、本明細書に組み入れられたものとする。
べと病に対する耐性を有するホウレンソウ植物の開発:
出願者は、提示されたとき、DMに対するホウレンソウ植物の広範囲の耐性を付与するS.tetrandraからの遺伝子座を発見した。本明細書に概説する方法を用いて、QTLは、隣接する配列SDA00543(配列番号:1)、及びSDA00419(配列番号:2)で、または、少なくとも96%、97%、98%、99%、または100%同一の配列を含む、少なくとも95%同一の配列で定義された遺伝子座における、S.oleraceaの連鎖群6(LG6)に対応する,S.tetrandraの領域に位置し、当業者は、多型が異なる集団においてそのような領域内に存在し得ることを理解するであろう。多くの遺伝子マーカーは、S.oleraceaゲノム全体に配置することができ、そして、マーカーは、隣接した配列SDA00543(配列番号1及び3)、及び配列SDA00419(配列番号2及び4)内のSNP、及び/または、INDELから、及びS.oleraceaゲノム全体に配置された他のフラグメントで開発することができ、本発明に基づく、S.tetrandraの遺伝子移入の存在または非存在を同定するために使用することができることを、当業者は、更に、理解するであろう。マーカーの例としては、例えば、Khattakら(Euphytica 148:311−318, 2006)に記載されている。本明細書に記載された遺伝子座、及びDM−耐性を付与する対立遺伝子の同定は、同一領域、及びそれに遺伝子的に連結した(連鎖不均衡において)領域におけるその他いずれかのマーカーの使用を可能にする。従って、使用してもよいそのような他のマーカー例は、Dm−1(Phytopathology98:894−900, 2008)を含むが、それに限定されない。Dm−1は、レース6に対する耐性を予測し、及び増幅断片長多型(AFLP)由来のPfs−1に連結された共優性の配列特徴化増幅領域(SCAR) マーカーである。
DMに対する広範囲の耐性を付与するS.tetrandraから遺伝子移入されたゲノム領域を含むホウレンソウ植物(S.oleracea)、及び同物を得る方法が本明細書に提供される。マーカー支援の遺伝子移入は、第一の生殖質から第二の生殖質へ、1つまたは複数のマーカーにより定義された染色体領域の転送を伴う。遺伝子移入のゲノム領域を含む交配された子孫は、第一の生殖質(例えば、DMに対する耐性を備えた生殖質)から、所望の遺伝子移入したゲノム領域における特徴的なマーカーの組み合わせにより、及び、連結された、若しくは、未連結の両方の第二の生殖質の所望の遺伝子背景に特徴的なマーカーを同定することができる。
本発明の実施において使用することができる遺伝子マーカーとしては、制限断片長多型(RFLP)、増幅断片長多型(AFLP)、単純配列反復(SSR)、単純配列長多型(SSLP)、一塩基多型(SNP)、挿入/欠失多型(Indel)、タンデム反復数(VNTR)、ランダム増幅多型DNA(RAPD)、イソ酵素、及び当業者に公知のその他のものが挙げられるが、それに限定されない。マーカーの発見と作物の開発は、マーカー支援の育種活動への応用に対する初期のフレームワークを提供する(米国特許出願番号:2005/0204780;2005/0216545;2005/0218305;及び、2006/00504538)。得られた「遺伝子地図」は、特徴的遺伝子座(多型核酸マーカーまたは対立遺伝子を同定することができる他の遺伝子座)の互いの相対的な位置を表す。
以下の定義は,本発明をより良く定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。特に指示のない限り、用語は、当業者による従来の使用法に基づき理解されるべきである。
受託番号をGB1860及びGB1861と指定した、Spinacia tetrandraの種子寄託は、本出願時期の前からSeminis Vegetable Seeds社により維持されている。少なくとも2500種の種子寄託は、また、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)を用いておこなった。ATCCのアドレスは、10801ユニバーシティブールバード、マナッサス、バージニア州20110−2209 USA(10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110−2209)である。アクセッションはアクセッション受託番号PTA−120533及びPTA−120534が割り当てられている。これらのアクセッションの寄託日は、2013年8月14日である。寄託へのアクセスは、要望に応じて本出願の係属中も利用できる。寄託は、最新の要望の後30年、または5年間に、公共寄託で、または特許の法的拘束力の期間内でのどちらか長い方で維持され、そしてその期間内で実行不可能な場合に代替される。出願人は、この特許、または、植物品種保護法(7U.S.C.2321以下参照)を含む、品種保護の任意の他の形態に基づき付与された権利の侵害を放棄するものではない。
Spinacia tetrandraは、利用可能なホウレンソウ属の遺伝子バンクコレクションの小サブセットを表わす。S.tetrandraの4つのアクセッションは研究に組み入れられた。そのような実施例2に記載のアッセイなどの病変テストは、4つのS.tetrandraのアクセッション:3つの追加のS.turkestanicaのアクセッション、及び、おそらくS.tetrandraと推定される未知の種の1つのアクセッションを含むように設計した。S.tetrandraなどの非栽培ホウレンソウのアクセッションは、植物育種で問題を引き起こす、種子休眠の困難な問題を示した。本研究では、他のエントリと比較して、S.tetrandra種子は、Brennerによる研究と一致して、発芽の深刻な不足に苦労したが(The U.S.Spinach Germplasm Collection, paper presented at The T.E. Morelock International Spinach Conference, Fayetteville, AR, 2009)、それは、いくつかの種子が1月の作付けに続いて秋に発芽した9個のS.tetrandraのアクセッションから観察された。
べと病に対する耐性についてホウレンソウのアクセッションをスクリーニングするために使用した試験は、植物の新品種保護のための国際機関(UPOV)に由来する。「Protocol for Tests on Distinctness, Uniformity, and Stability of Spinacia oleracea L. Spinach」UPOV Code:SPINA_OLE, CPVO−TP/055/5は、2013年2月27日に採択され、発効した。 手順は以下の通りである:
S.tetrandraの病変アッセイ及び不均一性の観点から、耐性に関連するマーカーが好ましい対立遺伝子の効率的かつ正確な選択のために同定された。S.tetrandraから継承された、DMに対する耐性は、BC1集団にマッピングし、それは実施例1で記載した通りに発育した。合計54の個体群は、Peronospora farinosa f. sp. spinaciaeレース12を用いた表現型となった。これらBC1の個体群は強い耐性、または完全に影響を受けやすい応答のいずれかを示し、2クラスで採点した。S. oleraceaにおける耐性を含む連結グループ6(LG6)の狭い区間内に位置するマーカーは、さらなる研究のために選択した(表4)(Khattak et al., Euphytica 148:311−318, 2006)。マッピング研究は、標準インターバルマッピングを使用して、mapQTLで実施した。
新規なPeronospora farinosa f. sp. spinaciaeの病原性分離株は、定期的に、世界的に発生する。現在までに、14のレースが公式に命名され、最近は、年に1回の割合で、命名されている。実施例1に記載の通り、2つのBC1ファミリーを、耐性破壊株による葉ディスクアッセイで試験した。SE4712、SE4712は、2013年の春に、米国、カリフォルニア州の野外から単離した。その後、それをPeronosporaに関する国際ワーキンググループ(IWPG)によりUA4712と改名された。DMに対する既存の耐性を破ることが示されているが、未だ、公式なレース指定を受けていない。
Claims (42)
- Peronospora farinosa f.sp.Spinaciaeに対する広範囲な耐性を付与するSpinacia tetrandraからの移入遺伝子座をそのゲノムに含むSpinacia oleraceaホウレンソウ植物。
- Peronospora farinosa f.sp.spinaciae(Pfs)の、レース7、10、11、12、13、及び14に対して前記広範囲な耐性を含む、請求項1記載の前記ホウレンソウ植物。
- Peronospora farinosa f.sp.spinaciae (Pfs)のレース1〜14及びUA4712に対して、前記広範囲な耐性を含む、請求項1記載の前記ホウレンソウ植物。
- 近交植物として定義される、請求項1記載の前記ホウレンソウ植物。
- ハイブリッド植物として定義される、請求項1記載の前記ホウレンソウ植物。
- 農学的エリート植物として定義される、請求項1記載の前記ホウレンソウ植物。
- 前記移入遺伝子座が、配列番号1または2に対して、少なくとも95%同等の配列でSpinacia tetrandraゲノムに隣接するように定義される、前記ホウレンソウ植物。
- 該遺伝子座を含む種子の代表的サンプルが、受託番号PTA−120533または受託番号PTA−120534の下で寄託された、請求項6記載の前記農学的エリートホウレンソウ植物。
- 請求項1に記載の前記植物を生成する種子。
- 請求項1記載の前記植物の植物部分。
- 植物部分が、胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、雌しべ、花、細胞、及び茎から成る群から選択される、請求項10記載の前記植物部分。
- Peronospora farinosa f.sp.spinaciaeに対する広範囲の耐性を付与するSpinacia tetrandraからの対立遺伝子を含み、Spinacia tetrandraに遺伝子的に連結されている全ての、または、幾つかの遺伝子座を欠く、組換え染色体セグメント。
- Spinacia oleraceaからの少なくとも第一の遺伝子座を含むとして更に定義される、請求項12記載の前記染色体セグメント。
- Peronospora farinosa f.sp.Spinaciaeに対する広範囲の耐性を付与するSpinacia tetrandraからの該対立遺伝子を含む種子の代表的サンプルが、受託番号PTA−120533、または、受託番号PTA−120534の下で寄託された、請求項12記載の前記染色体セグメント。
- 請求項14記載の前記染色体セグメントを含む、Spinacia oleraceaホウレンソウ植物。
- 請求項14記載の前記染色体セグメントを含む、Spinacia oleraceaホウレンソウ種子。
- 該耐性を付与するSpinacia tetrandraからの染色体セグメントを有する少なくとも第一の遺伝子多型、または遺伝子連鎖不均衡を植物のゲノムに存在することに基づく該植物の選択を含み、前記遺伝子座が、配列番号1若または2、もしくはそれに少なくとも95%同等の配列に対応する遺伝子座によりSpinacia tetrandraに隣接する、Peronospora farinosa f.sp.spinaciaeに対する広範囲な耐性を有する植物を選択する方法。
- 前記植物が、Spinacia tetrandraからの少なくとも1つの移入遺伝子座をそのゲノムに含む、Spinacia oleracea植物である、請求項17記載の前記方法。
- 前記植物が、Spinacia tetrandra植物である、請求項17記載の前記方法。
- 表現型アッセイで、該広範囲の耐性の存在を確認するステップを更に含む、請求項17記載の前記方法。
- 該遺伝子座を含む子孫植物生成するために、遺伝子座を含む該植物を別のホウレンソウ植物と交配することを更に含む、請求項17記載の前記方法。
- Peronospora farinosa f.sp.spinaciae(Pfs)に対して、広範囲な耐性を付与する少なくとも1つの遺伝子座をそのゲノムに含む農学的エリートホウレンソウ植物を生成するための方法であって、前記方法は、
(i)第一のホウレンソウ植物を第二のホウレンソウ植物と交配し、前記第一の植物が、Peronospora farinosa f. sp. Spinaciaeに対して広範囲の耐性を付与するSpinacia tetrandraからの少なくとも1つの遺伝子座をそのゲノムに含み、前記第二の植物は該遺伝子座を欠き、
(ii)該遺伝子座を含む該交配からもたらされる少なくとも第一の子孫ホウレンソウ植物を選択する、ことを含む、前記方法。 - (iii)次世代の子孫植物を生成するために、子孫植物のホウレンソウをそれ自身、または別のホウレンソウ植物と交配するステップを更に含む、請求項22記載の前記方法。
- ステップ(ii)及び(iii)が少なくとも約3回〜約10回繰り替えされる、請求項23記載の前記方法。
- 前記第一の植物がSpinacia tetrandra植物で、前記第二の植物がSpinacia oleracea植物である請求項22記載の前記方法。
- 選択が、配列番号1及び2で記載された遺伝子多型の検出に基づく子孫のゲノム内に、または、該遺伝子座と遺伝子連鎖不均衡にある、該遺伝子座を同定することを含み、前記遺伝子座は、配列番号1または2、もしくは、それに対して少なくとも95%同等の配列に対応する遺伝子座によりSpinacia tetrandraゲノムに隣接する、請求項22記載の前記方法。
- Peronospora farinosa f.sp.spinaciae (Pfs)に対する広範囲の耐性を含み、農学的エリートSpinacia oleracea植物内に、耐性を付与するSpinacia tetrandraからの染色体セグメントを移入することを含む、農学的エリートのホウレンソウ植物を生成する方法であって、該遺伝子座が、配列番号1または2、もしくは、少なくともそれと95%同等の配列におけるSpinacia tetrandraの対立遺伝子に対応する遺伝子座に隣接するSpinacia tetrandraゲノムの領域に位置すると定義された前記方法。
- 該遺伝子移入が、反復親としてSpinacia oleracea植物を用いて、少なくとも約3〜10世代の戻し交配により該遺伝子座以外の該植物におけるSpinacia oleraceaゲノムの本質的に全てを回収することを含む、請求項27記載の前記方法。
- 表現型アッセイによる広範囲な耐性の存在を確認するステップを更に含む、請求項27記載の前記方法。
- 該遺伝子座を含む少なくとも第一の植物を同定し、及び該遺伝子座を含む子孫植物を生成するために別のホウレンソウ植物に該遺伝子座を含む植物と交配させることを、更に含む請求項27記載の前記方法。
- S.oleracea内に、Peronospora farinosa f.sp.spinaciae (Pfs)に対する広範囲な耐性を付与するS.tetrandraから遺伝子座を移入することにより入手可能なホウレンソウ植物またはその子孫。
- 前記広範囲な耐性が、Peronospora farinosa f. sp. spinaciae (Pfs)のレース7、10、11、12、13及び14に対する耐性を含む、請求項31記載の前記ホウレンソウ植物。
- 前記広範囲な耐性が、Peronospora farinosa f.sp. spinaciae(Pfs)の全ての公知のレースに対する耐性を含む、請求項31記載のホウレンソウ植物。
- 近交植物として定義される、請求項31記載の前記ホウレンソウ植物。
- ハイブリッド植物として定義される、請求項31記載の前記ホウレンソウ植物。
- 農学的エリート植物として定義される、請求項31記載の前記ホウレンソウ植物。
- 前記移入遺伝子座が、Spinacia tetrandraゲノムにおいて、配列番号1または2により隣接すると定義される、請求項31記載の前記ホウレンソウ植物。
- 該遺伝子座を含む種子の代表的サンプルが、受託番号PTA−120533、または、受託番号PTA−120534の下で寄託される、請求項31記載の前記ホウレンソウ植物。
- 請求項31の前記植物を生成する種子。
- 請求項31の前記植物の植物部分。
- 植物部分が、胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、雌しべ、花、細胞、及び茎から成る群から選択される、請求項40記載の植物部分。
- 請求項1に記載のホウレンソウ植物の採取した葉を含む食物製品。
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