JP2009513152A - 耐病性植物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ウイルス起源、細菌起源、真菌起源または卵菌起源の病原体に対して抵抗性である植物に関連し、この場合、そのような植物は、前記病原体（特に、卵菌門の生物）に対して抵抗性でない植物と比較して、ホモセリンのレベルの増大を有する。本発明はさらに、植物における内因性ホモセリンのレベルを増大させることを含む、ウイルス起源、細菌起源、真菌起源または卵菌起源の病原体に対して抵抗性である植物を得るための方法に関連する。

Description

本発明は、耐病性植物、具体的には、卵菌門の生物（卵菌類）に対して抵抗性である植物に関する。本発明はさらに、耐病性を付与する植物遺伝子、および、卵菌門の病原体に対する保護を提供するためにそのような耐病性植物を得る方法に関連する。

病原体に対する植物の抵抗性が、病原体特異的抵抗性および病原体広域抵抗性の両方のために広範囲に研究されている。多くの場合において、抵抗性は、抵抗性のための優性遺伝子によって規定される。病原体に由来する非病原性遺伝子産物または他の分子と直接的または間接的に相互作用することによって病原体認識を媒介するこれらのレース特異的な抵抗性遺伝子または遺伝子対遺伝子の抵抗性遺伝子の多くが特定されている。この認識により、病原体の成長を停止させる広範囲の様々な植物防御応答の活性化がもたらされる。

植物育種では、絶え間ない奮闘が、ほとんどが一遺伝子性の優性の抵抗性遺伝子の新しい供給源を特定するために行われている。新しく導入された１つだけの抵抗性遺伝子を有する栽培品種では、病原体が進化し、高頻度で適合し、宿主植物に首尾よく感染する能力を再び獲得するために、病気からの保護が多くの場合には急速に破壊される。従って、耐病性の新しい供給源が入手できることが非常に求められる。

代わりの抵抗性機構が、例えば、植物における防御応答の調節を介して作用する（例えば、うどんこ病病原菌であるオオムギうどんこ病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ）に対するオオムギにおける劣性ｍｌｏ遺伝子により媒介される抵抗性など）。野生型ＭＬＯ遺伝子の変異対立遺伝子を運ぶ植物は、単独攻撃された表皮細胞の細胞壁の真菌侵入の試みの阻止と一致するほぼ完全な抵抗性を示す。従って、野生型ＭＬＯ遺伝子は病原菌応答の負の調節因子として作用する。このことが国際特許出願公開ＷＯ９８０４５８６に記載される。

他の例が、エリシフェ・シコラセアルム（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）に対する感受性の喪失についてのスクリーニングにおいて見出された劣性のうどんこ病抵抗性遺伝子である。３つの遺伝子がこれまでにクローン化されている：すなわち、ＰＭＲ６（これはペクチン酸リアーゼ様タンパク質をコードする）、ＰＭＲ４（これはカロースシンターゼをコードする）、および、ＰＭＲ５（これは機能不明のタンパク質をコードする）。ｍｌｏ遺伝子およびｐｍｒ遺伝子はともに、卵菌類（例えば、べと病菌など）に対してではなく、うどんこ病に対する抵抗性を特異的に与えるようである。

広範囲の病原菌抵抗性、すなわち、様々な全身的形態の抵抗性（例えば、ＳＡＲなど）が、２つの主要な方法によって得られている。第１の方法は、植物防御および細胞死の負の調節因子を変異させることによるものである（例えば、シロイヌナズナ属におけるｃｐｒ変異体、ｌｓｄ変異体およびａｃｄ変異体など）。第２の方法は、植物防御の誘導因子または調節因子を遺伝子組換えにより過剰発現させることによるものである（例えば、ＮＰＲ１過剰発現植物の場合など）。

これらの知られている抵抗性機構の欠点は、病原菌抵抗性のほかに、これらの植物が、検出可能なさらなる望ましくない表現型（例えば、成長の発育阻止、または、細胞死の自然形成など）をしばしば示すことである。

広範囲であり、永続的であり、また、望ましくない表現型を伴わない形態の抵抗性を提供することが本発明の目的である。

本発明をもたらした研究において、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）変異体スクリーニングが、べと病病原菌のアブラナべと病菌に対する感受性の低下について行われた。ＥＭＳ変異体が高感受性シロイヌナズナ系統のＬｅｒ ｅｄｓ１−２において作製された。８個のうどんこ病抵抗性（ｄｍｒ）変異体が詳しく分析され、これらは６つの異なる遺伝子座に対応した。顕微鏡分析では、すべての変異体において、アブラナべと病菌（Ｈ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）の成長がひどく低下したことが示された。ｄｍｒ３、ｄｍｒ４およびｄｍｒ５の抵抗性には、植物防御の構成的な活性化が伴っていた。そのうえ、ｄｍｒ５ではなく、ｄｍｒ３およびｄｍｒ４はまた、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびゴロビノミセス・オロンチイ（Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ ｏｒｏｎｔｉｉ）に対して抵抗性であった。

対照的に、植物防御の高まった活性化が、ｄｍｒ１変異体、ｄｍｒ２変異体およびｄｍｒ６変異体では認められなかった。この研究の結果が、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ他（２００５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、１８（６）、５８３〜５９２に記載されている。しかしながら、この論文はＤＭＲ遺伝子の特定および特徴づけを開示していない。

本発明によれば、今回、ＤＭＲ１が、ホモセリンキナーゼ（ＨＳＫ）をコードする遺伝子であることが見出された。シロイヌナズナ属について、５つの異なる変異型のｄｍｒ１対立遺伝子が配列決定されており、それぞれがＨＳＫタンパク質における異なるアミノ酸変化をもたらしている。ＨＳＫは、アミノ酸のメチオニン、トレオニンおよびイソロイシンの生合成における重要な酵素であり、従って、必須であると考えられる。これらの様々なｄｍｒ１変異体は、植物にホモセリンを蓄積させるＨＳＫにおける異常を示す。これら５つの異なる対立遺伝子は、変異体におけるホモセリン蓄積の異なるレベルに相関する異なるレベルの抵抗性を示す。

従って、本発明は、ウイルス起源、細菌起源、真菌起源または卵菌起源の病原体に対して抵抗性である植物であって、上記病原体に対して抵抗性でない植物と比較した場合、変化したホモセリンレベルを有することを特徴とする植物を提供する。

この形態の抵抗性は、具体的には、卵菌門の病原体に対して、例えば、シロサビキン属、アファノミセス属、バシジオホラ属、ブレミア属、ヒアロペロノスポラ属、パキメトラ属、パラペロノスポラ属、ペロファシア属、ペロノフィトラ属、ツユカビ属、ペロノスクレロスポラ属、フィチウム属、フィトフトラ属、タンジクツユカビ属、プロトブレミア属、ニセツユカビ属、ササラビョウキン属、ビエンノチア属の種に対して効果的である。

この抵抗性は、植物におけるホモセリンの変化したレベルに基づく。より具体的には、この抵抗性は、植物におけるホモセリンのレベルの増大に基づく。そのようなレベルの増大は様々な方法で達成することができる。

第１に、ホモセリンを外部からの供給源によって与えることができる。第２に、内因性ホモセリンのレベルを増大させることができる。これはホモセリンキナーゼ遺伝子の酵素活性を低下させることによって達成することができ、このことはホモセリンのより低い転換をもたらし、従って、その蓄積をもたらする。あるいは、ホモセリンキナーゼ酵素の発現を低下させることができる。これもまた、ホモセリンのより低い転換をもたらし、従っ
て、その蓄積をもたらす。内因性ホモセリンのレベルを増大させるための別の方法は、アスパラギン酸経路を介するその生合成を増大させることによるものである。ホモセリンキナーゼ遺伝子の発現を低下させることは基本的には、例えば、遺伝子サイレンシングなどにより直接的であるか、または、その調節配列を改変することにより、もしくは、遺伝子の抑制を刺激することにより間接的であるかのいずれかであっても、様々な方法で達成することができる。

ＨＳＫ遺伝子を、その活性または発現を低下させるために調節することを、様々なレベルで達成することができる。第１に、内因性遺伝子を直接的に変異させることができる。これは変異誘発処理によって達成することができる。あるいは、改変されたＨＳＫ遺伝子を、遺伝子組換え技術の手段によって、もしくは、遺伝子移入によって植物に持ち込むことができ、または、ＨＳＫの発現を、例えば、調節配列を改変することによって、もしくは、遺伝子サイレンシングによって調節レベルで低下させることができる。

本発明の１つの実施形態において、植物におけるホモセリンレベルでの増大（蓄積）が、ホモセリンを植物に投与することによって達成される。これは、植物をＬ−ホモセリンにより処理することによって、例えば、ホモセリン溶液を用いた噴霧または浸透によって好適に行われる。

外因性ホモセリンによる植物の処理が国際特許出願公開ＷＯ００／７００１６から知られている。この公開公報は、ホモセリンがどのように植物に適用され、それにより、植物でのフェノール濃度の増大を生じさせるかを開示する。この公開公報は、そのように処理された植物が様々な病原体に対して抵抗性であることを示していない。実際、国際特許出願公開ＷＯ００／７００１６には、内因性ホモセリンの増大が病原体抵抗性をもたらすことは開示も、示唆もされていない。

あるいは、内因性ホモセリンは、植物のアミノ酸生合成経路またはアミノ酸代謝経路を調節することによって増大させられる。

１つの実施形態において、内因性の産生の増大は、内因性ＨＳＫ遺伝子発現の低下の結果であり、従って、これにより、ホスホ−ホモセリンへのホモセリンのあまり効率的でない変換、そして、メチオニンおよびトレオニンのその後の生合成がもたらされる。このＨＳＫの発現の低下は、例えば、ｍＲＮＡ安定性またはタンパク質安定性の低下をもたらす、ＨＳＫ遺伝子における変異の結果である。

別の実施形態において、発現の低下を、例えば、遺伝子サイレンシングによって、または、ＨＳＫ遺伝子の発現に影響を及ぼす調節配列における変異によって、転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかでＨＳＫ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることによって達成することができる。遺伝子サイレンシングを達成する方法の１例が、ＲＮＡｉによるものである。

さらなる実施形態において、内因性ホモセリンのレベルの増大を、変化をホモセリンの生合成または代謝において誘導することによって得ることができる。具体的な実施形態において、これは、酵素活性を低下させ、従って、これによりホスホ−ホモセリンへのホモセリンのより低い変換を生じさせるＨＳＫタンパク質をもたらすＨＳＫコード配列における変異によって達成される。別の実施形態が、植物におけるＬ−ホモセリンのより大きい産生、従って、植物におけるＬ−ホモセリンの蓄積を引き起こす、アスパラギン酸経路における遺伝子のアップレギュレーションである。

本発明は、シロイヌナズナ属におけるアブラナべと病菌に対する抵抗性について行われ
た研究に基づいているが、より一般には、様々な植物において、具体的には、様々な病原体（例えば、卵菌門など）による感染に対して感受性である作物植物において適用することができる一般的な概念である。

本発明は、卵菌によって引き起こされる非常に多数の植物の病気について好適であり、そのような卵菌は、例えば、レタスにおけるレタスべと病菌、ホウレンソウにおけるホウレンソウべと病菌、ウリ科のメンバー（例えば、キュウリ）におけるキュウリべと病菌、タマネギにおけるタマネギべと病菌、アブラナ科のメンバー（例えば、キャベツ）におけるアブラナべと病菌、ブドウにおけるブドウべと病菌、トマトおよびジャガイモにおける疫病菌）、ならびに、ダイズにおけるダイズ茎疫病菌であるが、これらに限定されない。

これらの他の植物におけるホモセリンのレベルは、上記で記載されたすべての技術により増大させることができる。しかしながら、植物におけるＨＳＫ遺伝子発現の改変が、ＨＳＫ遺伝子の遺伝子改変を介して、または、ＨＳＫ遺伝子における変異の特定を介して達成されることになり、遺伝子が未だ知られていないときには、遺伝子を最初に特定しなければならない。病原体抵抗性の植物（具体的には、作物植物）を、ＨＳＫ遺伝子の遺伝子改変を介して、または、ＨＳＫ遺伝子における変異の特定を介して作製するためには、オルソログＨＳＫ遺伝子をこれらの植物種から単離しなければならない。オルソログは、同じ機能を有する、他の生物に由来する遺伝子またはタンパク質として定義される。

様々な方法を他の植物におけるオルソログ配列の特定のために利用することができる。
ＨＳＫオルソログ配列を植物種において特定するための方法では、例えば、植物種のホモセリンキナーゼＥＳＴをデータベースにおいて特定すること；完全なホモセリンキナーゼの転写物またはｃＤＮＡを増幅するためのプライマーを設計すること；対応する完全な転写物またはｃＤＮＡを得るために、そのようなプライマーによる増幅実験を行うこと；および、転写物またはｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することを含むことができる。

完全な転写物またはｃＤＮＡを、コード配列の１部分のみが知られている状況で増幅するための好適な方法は、改良型ＰＣＲ技術の５’ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥ、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、ＲＬＭ−ＲＡＣＥおよびベクトレット（ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ）ＰＣＲである。

あるいは、ヌクレオチド配列が、目的とする植物について何ら得られないならば、プライマーが、多重ヌクレオチド配列アラインメントによって明らかにされるような保存されたドメインに基づいて、目的とする植物に対して近縁である植物種のＨＳＫ遺伝子に対して設計され、オルソログ配列をＰＣＲ増幅するために使用される。そのようなプライマーは好適には縮重プライマーである。

与えられた配列を、ＨＳＫオルソログであるとして評価するための別の確実な方法が、レシプロカルベストヒットを特定することによるものである。与えられた植物種の候補オルソログＨＳＫ配列が、シロイヌナズナＨＳＫタンパク質配列もしくはＤＮＡ配列または別の植物種のＨＳＫタンパク質配列もしくはＤＮＡ配列を用いて、Ｂｌａｓｔプログラムを使用して検索したとき、ＤＮＡベータベースからの最も良く合致するものとして特定される。与えられた植物種の得られた候補オルソログヌクレオチド配列が、ＢｌａｓｔＸ検索法を使用して（例えば、ＮＣＢＩまたはＴＡＩＲにおける）ＤＮＡデータベースに存在するすべてのシロイヌナズナタンパク質に対する相同性について検索するために使用される。最も良く合致するものおよびスコアが、シロイヌナズナＨＳＫタンパク質に対するものであるならば、その与えられたＤＮＡ配列は、オルソログまたはオルソログ配列であるとして記述することができる。

ＨＳＫは、これらの植物種について公開されている完全なゲノム配列から推定されるよ
うに、シロイヌナズナ属およびイネでは１個だけの遺伝子によってコードされる。これまでに調べられたほとんどの他の植物種では、２つのＨＳＫホモログが特定されているジャガイモ、タバコおよびポプラを除いて、ＨＳＫは、公開されているＤＮＡデータベースからのｍＲＮＡ配列およびＥＳＴデータの分析によって明らかにされるように、１個だけの遺伝子によってコードされるようである。オルソログの遺伝子およびタンパク質が、公開されているデータベースに存在する情報とのヌクレオチド比較およびアミノ酸比較によってこれらの植物において特定される。

あるいは、ＤＮＡ配列が、所望される植物種について何ら得られないならば、オルソログ配列が、シロイヌナズナ属もしくは他の植物のＨＳＫ遺伝子のＤＮＡプローブを使用する異種ハイブリダイゼーションによって、または、プライマーを定義するためにＨＳＫコード配列における保存されたドメインを使用するＰＣＲ法によって単離される。多くの作物種については、プライマーを設計して、その後で、ＤＮＡ配列分析のための完全なｍＲＮＡ配列またはゲノム配列を後でＰＣＲ増幅するために使用することができる部分的なＨＳＫ ｍＲＮＡ配列を得ることができる。

具体的な実施形態において、オルソログは、そのコードされたタンパク質がシロイヌナズナＨＳＫ遺伝子との少なくとも５０％の同一性を示す遺伝子、または、他の植物ＨＳＫタンパク質の遺伝子である。より具体的な実施形態において、相同性は少なくとも５５％であり、より具体的には少なくとも６０％であり、一層より具体的には少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である。

図１は、公開されているデータベースにおいて特定されているオルソログＨＳＫ配列、ならびに、ｃＤＮＡに対するＰＣＲ増幅およびその後の配列決定によって得られているオルソログＨＳＫ配列を示す。

オルソログＨＳＫ配列が特定された後、遺伝子の調節配列およびコード配列の完全なヌクレオチド配列が標準的な分子生物学的技術によって特定される。このために、植物種のゲノムライブラリーが、ＨＳＫ遺伝子を含有するゲノムクローンを特定するために、知られているホモセリンキナーゼ遺伝子に由来するプローブもしくはプライマー（例えば、上記で記載されるプローブおよびプライマーなど）によるＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによってスクリーニングされる。あるいは、改良されたＰＣＲ方法（例えば、ＲＮＡリガーゼ媒介ＲＡＣＥ（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）など）を、遺伝子配列およびｃＤＮＡ配列をゲノムＤＮＡまたは逆転写されたｍＲＮＡから直接に増幅するために使用することができる。続いて、ＤＮＡ配列決定により、完全な遺伝子配列またはコード配列の特徴づけがもたらされる。

遺伝子のＤＮＡ配列が知られると、この情報は、ホモセリンキナーゼ遺伝子の発現を上記で記載された方法のいずれかで調節するための手段を調製するために使用される。

より具体的には、低下したＨＳＫ活性を達成するために、ＨＳＫ遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることができ、または、ＨＳＫタンパク質の酵素活性を、ＨＳＫコード配列におけるヌクレオチド変化から生じるアミノ酸置換によって低下させることができる。

本発明の具体的な実施形態において、ＨＳＫ遺伝子発現のダウンレギュレーションが、ＲＮＡｉを使用する遺伝子サイレンシングによって達成される。このために、ＨＳＫアンチセンス構築物、最適化されたミクロＲＮＡ構築物、逆向き反復構築物、または、組み合わされたセンス−アンチセンス構築物を発現し、その結果、遺伝子サイレンシングをもた
らす、ＨＳＫに対応するｄｓＲＮＡを生じさせる遺伝子組換え植物が作製される。

代わりの実施形態において、ＨＳＫ遺伝子の１つまたは複数の調節因子がＲＮＡｉによって（転写活性化因子の場合には）ダウンレギュレーションされる。

別の実施形態において、調節因子が、遺伝子組換えによる過剰発現によって（リプレッサータンパク質の場合には）アップレギュレーションされる。過剰発現が、ＨＳＫ遺伝子のリプレッサータンパク質を強いプロモーター（例えば、植物バイオテクノロジーにおいて一般に使用される３５Ｓプロモーター）から発現させることによって特定の実施形態において達成される。

ＨＳＫ遺伝子のダウンレギュレーションはまた、プロモーター領域、ターミネーター領域または可能性のあるイントロンにおける調節エレメントの変異誘発によって達成することができる。ＨＳＫコード配列における変異は多くの場合、コードされたＨＳＫ酵素の発現または活性に負の影響を及ぼすアミノ酸置換または早すぎる停止コドンをもたらす。

ＨＳＫの発現に影響を及ぼすこれらの変異および他の変異が、変異誘発性の化学試薬（例えば、エチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）など）を使用することによって、植物材料をガンマ線もしくは高速中性子により照射することによって、または、他の手段によって植物において誘導される。生じたヌクレオチド変化はランダムであるが、変異誘発された植物の大規模集団では、ＨＳＫ遺伝子における変異を、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノムにおける誘導された局所的損傷を標的化する）方法を使用することによって容易に特定することができる（ＭｃＣａｌｌｕｍ他（２００１）、誘導された変異についての標的化されたスクリーニング、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８、４５５〜４５７；および、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ他（２００４）、ＴＩＬＬＩＮＧ．従来の変異誘発は機能的ゲノミクスを満たす、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１３５、６３０〜６３６）。この方法の原理は、目的とする遺伝子をＭ２世代における変異誘発された植物の大規模な集団のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅することに基づく。ＤＮＡ配列決定によって、または、１本鎖特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＣＥＬ−Ｉヌクレアーゼなど）を使用して点変異を探すことによって（Ｔｉｌｌ他（２００４）、１本鎖特異的ヌクレアーゼによるミスマッチ切断、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３２、２６３２〜２６４１）、目的とする遺伝子において変異を有する個々の植物が特定される。

多くの植物をスクリーニングすることによって、それぞれが遺伝子発現または酵素活性に対する異なる影響を与える変異型対立遺伝子の大規模な集団が得られる。遺伝子発現または酵素活性を、ＨＳＫ転写物レベルの（例えば、ＲＴ−ＰＣＲによる）分析、抗体を用いたＨＳＫタンパク質レベルの定量化、または、ＨＳＫ活性の低下の結果としてのホモセリンの蓄積を測定するアミノ酸分析によって調べることができる。これらの方法は当業者には知られている。

当業者は、ホモセリンの蓄積が、病原体抵抗性を誘導するために十分であるかを調べるために、通常の病原体試験を使用することができる。

所望されるＨＳＫ活性またはＨＳＫ発現の低下を有する植物が、その後、所望される新しい対立遺伝子のみを、欲しい作物のバックグラウンドに移すために、戻し交配されるか、または、他の育種用系統に対して交配される。

本発明はさらに、酵素活性の低下を有するＨＳＫタンパク質をコードする変異ＨＳＫ遺伝子に関連する。具体的な実施形態において、本発明は、ｄｍｒ１対立遺伝子のｄｍｒ１−１、ｄｍｒ１−２、ｄｍｒ１−３、ｄｍｒ１−４およびｄｍｒ１−５に関連する。

別の実施形態において、本発明は、図１０〜図１４に示されるような、レタス、ブドウ、キュウリ、ホウレンソウおよびトマトのＨＳＫ遺伝子の変異した形態に関連する。

本発明では、ホモセリンのレベルが増大を有する植物が、病原体（具体的には、卵菌起源の病原体）に対する抵抗性を示すことが明らかにされる。この知識により、当業者は、ＨＳＫ遺伝子を変異誘発または遺伝子組換え法によって積極的に改変することができ、しかし、同様に、これまでに知られていない天然の変異体を、ホモセリンを蓄積する特定の植物種、または、ホモセリンにおける増大をもたらすＨＳＫ遺伝子の変異体を有する特定の植物種において特定して、これらの天然の変異体を本発明に従って使用することができる。

本出願明細書において、用語「ホモセリンキナーゼ」および用語「ＨＳＫ」は交換可能に使用される。

本発明は、本発明を限定することがいかなる点でも意図されない下記の実施例において例示される。実施例では、下記の図面が参照される。

図１は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．８２）多重配列アラインメントプログラム（ＥＢＩ）を使用する、シロイヌナズナのＨＳＫタンパク質、ならびに、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ
ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（１）、ポプラ（２）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（２）、ブドウ、レタス、ジャガイモ（１）、トマト、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、アサガオ（Ｉｍｐｏｅａ ｎｉｌ）、ダイズ、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、キュウリ、ホウレンソウ、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）およびイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来するオルソログのアミノ酸配列のアラインメントを示す。配列の下には、保存されたアミノ酸配列が点によって示され、同一のアミノ酸が星印によって示される。中塗り三角および対応するテキストは、５つのシロイヌナズナｄｍｒ変異体において置換されるアミノ酸を示す。

表２は、シロイヌナズナＨＳＫ ｍＲＮＡ、および、他の植物種に由来するオルソログ配列のＧｅｎｂａｎｋアクセション番号およびＧｅｎＩｎｆｏ識別子を示す。

図２は、接種後７日での変異体（ｄｍｒ１−１、ｄｍｒ１−２、ｄｍｒ１−３およびｄｍｒ１−４）および親系統（Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２）に対する２つのアブラナべと病菌単離体（Ｃａｌａ２およびＷａｃｏ９）による分生子柄形成の割合を示す。親系統において形成された分生子柄を１００％に設定した。

図３は、ＤＭＲ１のクローニングにおける３つの主要な工程のグラフィック概略図である。ａ）ｄｍｒ１の最初のマッピングにより、遺伝子座の位置が、第２染色体の下側アームにおいて、７．４２Ｍｂの位置と、７．５６Ｍｂの位置との間に決定された。３つの挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）マーカーを設計した（Ｆ６Ｐ２３、Ｔ２３Ａ１およびＦ５Ｊ６のマーカーの位置が黒線によって示される）。これらのマーカーを使用して、組換え体を数百個の分離したＦ２植物およびＦ３植物から特定した。集められた組換え体において中断点を特定するためのこれらのＩＮＤＥＬマーカーおよびさらなるマーカーのプライマー配列が表３に示される。ｂ）１つのマーカー（Ａｔ２ｇ１７２７０）（灰色の線によって示される）が抵抗性との最も強い連鎖を示した。ｄｍｒ１遺伝子座はさらに、８個の遺伝子（ａｔ２ｇ１７２５０〜ａｔ２ｇ１７２９０）を含有する領域に範囲を定めることができた。これら８個の遺伝子を、表４に記載されるプライマーを使用して、コード配列におけ
る変異を探すために増幅および配列決定した。８個すべての候補遺伝子のＤＮＡ配列分析により、５個すべてのｄｍｒ１変異体において、Ａｔ２ｇ１７２６５における点変異の発見がもたらされた。ｃ）それぞれのｄｍｒ１変異体は、ホモセリンキナーゼをコードするＡｔ２ｇ１７２６５遺伝子において異なる場所に点変異を有する。

図４は、ＨＳＫコード配列、ならびに、ＨＳＫコード配列における５つの異なるｄｍｒ１変異の位置およびヌクレオチド置換の概略図である（中塗り三角によって示されるヌクレオチド位置は、１位で開始するＡＴＧ開始コドンに対してである）。５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲが明るい灰色の四角によって示される。ヌクレオチド配列の下には、タンパク質配列が示される。ＨＳＫタンパク質は葉緑体標的化のための推定される輸送配列（暗い灰色部分）を含有する。５つのｄｍｒ１変異から生じるアミノ酸変化がＨＳＫタンパク質におけるそのアミノ酸（ａａ）位置番号（中塗り三角）で示される。

図５は、トレオニン、メチオニンおよびイソロイシンのアミノ酸の生合成のためのアスパラギン酸経路におけるホモセリンキナーゼ酵素の位置を示す。

図６は、アブラナべと病菌の２つの異なる単離体（Ｗａｃｏ９およびＣａｌａ２）を接種した５日後のＬｅｒ ｅｄｓ１−２の実生あたりの分生子柄の数を示す。接種された実生に、ｄＨ２Ｏ、Ｄ−ホモセリン（５ｍＭ）またはＬ−ホモセリン（５ｍＭ）を病原体接種後３日で浸透させた。Ｌ−ホモセリンにより処理された実生は分生子柄形成の完全な非存在を示し、従って、抵抗性である。

図７は、トリパンブルー染色された実生の顕微鏡観察によって分析されたときの、水、Ｄ−ホモセリン（５ｍＭ）またはＬ−ホモセリン（５ｍＭ）により処理された実生におけるアブラナべと病菌の成長および発達を示す。ａ：Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２の実生におけるＨＳ処理の後での分生子柄形成（１０倍の倍率）。分生子柄形成がＬ−ホモセリン浸透の後では何ら検出されなかった。これに対して、コントロールの植物はたくさんの胞子形成を示す。ｂ：吸根の発達がＬ−ホモセリン（５ｍＭ）の浸透によって影響を受け（４０倍の倍率）、しかし、水またはＤ−ホモセリンにより処理された植物では影響を受けない。

図８は、シロイヌナズナのホモセリンキナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（Ａｔ２ｇ１７２６５、ＮＭ＿１２７２８１、ＧＩ：１８３９８３６２）を示す。

図９は、シロイヌナズナのホモセリンキナーゼタンパク質のアミノ酸配列（Ａｔ２ｇ１７２６５、ＮＭ＿１７９３１８、ＧＩ：１５２２７８００）を示す。

図１０は、レタスのホモセリンキナーゼのコード配列（ＣＤＳ）およびタンパク質のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列をそれぞれ示す。

図１１は、ブドウのホモセリンキナーゼのコード配列（ＣＤＳ）およびタンパク質のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列をそれぞれ示す。

図１２は、キュウリのホモセリンキナーゼのコード配列（ＣＤＳ）およびタンパク質のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列をそれぞれ示す。

図１３は、ホウレンソウのホモセリンキナーゼのコード配列（ＣＤＳ）およびタンパク質のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列をそれぞれ示す。

図１４は、トマトのホモセリンキナーゼのコード配列（ＣＤＳ）およびタンパク質のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列をそれぞれ示す。

実施例

ｄｍｒ変異体における病原菌抵抗性に関わる遺伝子の特徴づけ
Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ他（２００５、上掲）には、アブラナべと病菌に対して抵抗性である４つの変異体（ｄｍｒ１−１、ｄｍｒ１−２、ｄｍｒ１−３およびｄｍｒ１−４）が開示される。抵抗性のレベルを、アブラナべと病菌のＣａｌａ２単離体（これはＥ．Ｈｏｌｕｂ博士（Ｗａｒｗｉｃｋ ＨＲＩ、Ｗｅｌｌｅｓｂｏｕｒｎｅ、ＵＫ）またはＧ．Ｖａｎ ｄｅｒ Ａｃｋｅｒｖｅｋｅｎ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔｒｅｃｈｔ、ＮＬ）から入手可能である）を接種した７日後の実生の葉あたりの分生子柄を計数することによって調べることができる。高感受性である親系統のＬｅｒ ｅｄｓ１−２（Ｐａｒｋｅｒ他、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、８：２０３３〜２０４６）については、分生子柄の数が１００％で設定される。感染したｄｍｒ１変異体での分生子柄形成における低下が、親系統の実生と比較して、図２に示される。

本発明に従って、ｖａｎ Ｄａｍｍｅ他（２００５、上掲）のｄｍｒ１変異体におけるアブラナべと病菌に対する抵抗性に関わる遺伝子が、候補遺伝子のマッピングおよび配列決定の組合せによってクローン化されている。

ＤＭＲ１が、マップに基づくクローニングによって単離された。ｄｍｒ１変異体をＦＮ２Ｃｏｌ−０変異体に対して交配して、マッピング用集団を作製した。ＦＮ２変異体は、ＲＰＰ２Ａ遺伝子における高速中性子変異のためにアブラナべと病菌の単離体Ｃａｌａ２に対して感受性である（Ｓｉｎａｐｉｄｏｕ他、２００４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、３８：８９８〜９０９）。Ｆ１植物が感受性であり、Ｆ２植物のおよそ１／４がアブラナべと病菌抵抗性を示したので、５個すべてのｄｍｒ１変異体が１つだけの劣性変異を有する。

ＤＭＲ１クローニング手順が図３に例示され、下記においてより詳しく記載される。ｄｍｒ１遺伝子座のマップでの所在位置が最初に、４８個の抵抗性Ｆ２植物を遺伝子型決定して、第２染色体の下側アームに突き止められることによって決定された。６５０個のＦ２植物に対する新しい組換え体についてのさらなるスクリーニングから、（ＴＩＧＲシロイヌナズナゲノムリリース（２００４年１月のバージョン５．０）に従って）７．２ＭｂにおいてＢＡＣ Ｔ２４Ｉ１２上、および、７．５６ＭｂにおいてＢＡＣ Ｆ５Ｊ６上の２つのＩＮＤＥＬ（挿入／欠失）マーカーの間における約９０個のＦ２組換え植物が特定され、これらにより、遺伝子を、５つのＢＡＣからなるコンティグを含有する領域にマッピングすることが可能であった。

ｄｍｒ１遺伝子座を細かくマッピングするために、Ｆ２植物を遺伝子型決定し、Ｆ３世代を遺伝子型決定した。ｄｍｒ１の変異を、（ＴＩＧＲシロイヌナズナゲノムリリース（２００４年１月のバージョン５．０）に従って）７．４２ＭｂにおいてＢＡＣ Ｆ６Ｐ２３上、および、７．５６ＭｂにおいてＢＡＣ Ｆ５Ｊ６上に位置する２つのＩＮＤＥＬマーカーの間における約１３０ｋｂの領域（３つの重なるＢＡＣクローン、すなわち、Ｆ６Ｐ２３、Ｔ２３Ａ１およびＦ５Ｊ６を包含する）にマッピングすることができた。これは、ＴＡＩＲコードのＡＴ２ｇ１７０６０およびＡＴ２ｇ１７３８０を有するシロイヌナズナ遺伝子の間にある、ｄｍｒ１遺伝子座についての３０個の推定される遺伝子候補からなる領域をもたらした。さらに切断された増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカーを、ＡＴ２ｇ１７１９０遺伝子、ＡＴ２ｇ１７２００遺伝子、ＡＴ２ｇ１７２７０遺伝子、ＡＴ２ｇ１７３００遺伝子、ＡＴ２ｇ１７３１０遺伝子およびＡＴ２ｇ１７３６０遺伝子の遺伝子に
関係づけられたＳＮＰに基づいて設計した。

これらのＣＡＰＳマーカーデータによるこの領域における５つの残る組換え体の分析により、下記の８個の候補遺伝子が残った：ＡＴ２ｇ１７２３０（ＮＭ＿１２７２７７、ＧＩ：３０６７９９１３）、ＡＴ２ｇ１７２４０（ＮＭ＿１２７２７８、ＧＩ：３０６７９９１６）、ＡＴ２ｇ１７２５０（ＮＭ＿１２７２７９、ＧＩ：２２３２５７３０）、ＡＴ２ｇ１７２６０（ＮＭ＿１２７２８０、ＧＩ：３０６７９９２２）、ＡＴ２ｇ１７２６５（ＮＭ＿１２７２８１、ＧＩ：１８３９８３６２）、ＡＴ２ｇ１７２７０（ＮＭ＿１２７２８２、ＧＩ：３０６７９９２７）、ＡＴ２ｇ１７２８０（ＮＭ＿１２７２８３、ＧＩ：４２５６９０９６）、ＡＴ２ｇ１７２９０（ＮＭ＿１２７２８４、ＧＩ：３０６７９９３４）。これら８個すべての遺伝子を配列決定することにより、５つのｄｍｒ１対立遺伝子（ｄｍｒ１−１、ｄｍｒ１−２、ｄｍｒ１−３、ｄｍｒ１−４およびｄｍｒ１−５）において、ＡＴ２ｇ１７２６５コード遺伝子における点変異の発見がもたらされた。このことから、ＡＴ２ｇ１７２６５がＤＭＲ１であることが明瞭に明らかにされる。図３には、異なる対立遺伝子の点変異を有するｄｍｒ１のスキームが示される。

ＡＴ２ｇ１７２６５がホモセリンキナーゼ（ＨＳＫ）酵素をコードし、今までのところ、この機能を示す唯一のシロイヌナズナ遺伝子である。

シロイヌナズナ属において、ＨＳＫは１つだけの遺伝子（ＡＴ２ｇ１７２６５）によってコードされる（Ｌｅｅ＆Ｌｅｕｓｔｅｋ、１９９９、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３７２：１３５〜１４２）。ＨＳＫは、メチオニン、トレオニンおよびイソロイシンのアミノ酸の生合成のために要求されるアスパラギン酸経路における４番目の酵素である。ＨＳＫは、ホロセリンリン酸へのホモセリンのリン酸化を触媒する（図５）。

アミノ酸分析
ホモセリンリン酸は、シロイヌナズナ属における、メチオニン、イソロイシンおよびトレオニンの産生における中間体である。ホモセリンキナーゼはアミノ酸の産生において重要な役割を有するので、遊離アミノ酸レベルを親系統（Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２）および４つの異なるｄｍｒ１変異体において求めた。このために、葉全体からのアミノ酸を８０％メタノールにより抽出し、その後、２回目の抽出を２０％メタノールにより行った。一緒にした抽出液を乾燥し、水に溶解した。内部標準のＳ−アミノエチルシステイン（ＳＡＥＣ）を加えた後、アミノ酸をＪＯＥＬ ＡｍｉｎｏＴａｃ ＪＬＣ−５００／Ｖ（東京、日本）におけるポストカラムニンヒドリン誘導体化による自動化されたイオン交換クロマトグラフィーによって検出した。

４つの異なるｄｍｒ１変異体および親系統（Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２）のアミノ酸分析により、ｄｍｒ１変異体におけるホモセリンの蓄積が示され、これに対して、この中間体アミノ酸が親系統（Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２）では検出できなかった。メチオニン、イソロイシンおよびトレオニンのレベルにおける低下がｄｍｒ１変異体では認められなかった（表１）。
表１
親系統（Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２）および変異体（ｄｍｒ１−１、ｄｍｒ１−２、ｄｍｒ１−３およびｄｍｒ１−４）の２週齢実生の地上部分におけるホモセリン、メチオニン、トレオニンおよびイソロイシンの濃度（ｐｍｏｌ／ｍｇ新鮮重量）。

ｄｍｒ１変異体におけるＨＳＫの活性の低下により、ホモセリンが蓄積する。この影響は、一層より高いレベルのホモセリンをもたらすこの経路内へのアスパラギン酸のより強い流入によってさらに強化され得る。この高濃度の基質ホモセリンは、変異ＨＳＫによる十分なリン酸化を依然として可能にしており、その結果、メチオニン、イソロイシンおよびトレオニンのレベルがｄｍｒ１変異体親系統（Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２）では低下していないと考えられる（表１）。

病原体抵抗性はＬ−ホモセリンの適用によって達成される
効果がホモセリンについて特異的であるかどうかを調べるために、立体異性体のＤ−ホモセリンを調べた。実生全体に、水、５ｍＭのＤ−ホモセリンおよび５ｍＭのＬ−ホモセリンを浸透させた。天然アミノ酸のＬ−ホモセリンによる処理のみが、アブラナべと病菌に対する抵抗性をもたらした。水またはＤ−ホモセリンにより処理された実生は病原体成長における大きな低下を示さず、アブラナべと病菌に対して感受性であった。この浸透を、Ｃａｌａ２およびＷａｃｏ９に対してそれぞれ感受性である２つのシロイヌナズナ受入体（Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２およびＷｓ ｅｄｓ１−１）に適用した。分生子柄形成をアブラナべと病菌感受性についての指標として求めた。分生子柄を、アブラナべと病菌接種後５日、および、水、Ｄ−ホモセリンまたはＬ−ホモセリンによる浸透後２日で計数した（図６）。Ｌ−ホモセリンによる浸透は分生子柄形成の低下およびアブラナべと病菌抵抗性を明瞭にもたらす。このことはさらに、シロイヌナズナ実生のトリパンブルー染色によって植物における病原体成長を調べることによって確認された。植物に単離体Ｃａｌａ２を接種した。２日後、植物を、水、５ｍＭのＤ−ホモセリンおよび５ｍＭのＬ−ホモセリンによる浸透によって処理した。症状を接種後５日でスコア化した。症状は、Ｌ−ホモセリン浸透の実生のみが、強く低下した病原体成長を示し、分生子柄形成を何ら示さなかったことを明瞭に示した（図７）。

顕微鏡分析により、Ｌ−ホモセリン処理された葉においてだけ、吸根（感染プロセス期間中にアブラナべと病菌によって作られる栄養供給構造体）が乱されることが示された。再度ではあるが、植物におけるホモセリンのレベルの増大は病原体抵抗性をもたらすことが示される。

作物におけるＨＳＫオルソログの特定
１．配列相同性に基づくライブラリーのスクリーニング
シロイヌナズナのホモセリンキナーゼ遺伝子およびホモセリンキナーゼタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が図８および図９に示される。

ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の公開されているライブラリーを図８および図９の配列と比較した。この比較により、オレンジ、ポプラ（１）、ポプラ（２）、ジャガイモ（２）、ジャガイモ（１）、タバコ、アサガオ、ダイズ、インゲンマメ、テーダマツ、トウモロコシおよびイネにおける完全なＨＳＫコード配列および予測されたアミノ酸配列の特定がもたらされた。そのようにして特定されたオルソログタンパク質の配列情報が図１に示される。多くの他の植物種について、オルソログＤＮＡフラグメントを、シロイヌナズナ属または他の植物のＨＳＫタンパク質配列に対するレシプロカルベストヒット体としてＢｌａｓｔＸによって特定することができる。

２．異種ハイブリダイゼーションによるオルソログの特定
図８に示されるようなシロイヌナズナのＨＳＫ ＤＮＡ配列が、標準的な分子生物学的方法を使用する任意の植物種でのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって相同的な配列について検索するためのプローブとして使用される。この方法を使用して、オルソログ遺伝子が、制限酵素により消化されたＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションによって、あるいは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションによって検出される。これらの技術は当業者には広く知られている。代わりのプローブとして、任意の他のより近縁な植物種のＨＳＫ ＤＮＡ配列をプローブとして使用することができる。

３．ＰＣＲによるオルソログの特定
多くの作物種については、完全なｃＤＮＡ配列またはゲノム配列を続いてＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計するために使用される部分的なＨＳＫ ｍＲＮＡ配列または遺伝子配列を利用することができる。５’配列および３’配列が利用可能であるときには、失われている内部配列が、ＨＳＫ特異的な５’フォワードプライマーおよび３’リバースプライマーによってＰＣＲ増幅される。５’配列、内部配列または３’配列のみが利用可能であるときには、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方が設計される。利用可能なプラスミドポリリンカープライマーとの組合せで、インサート物が、目的とする植物種のゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから増幅される。類似した方法で、失われている５’配列または３’配列が、改良されたＰＣＲ技術（５’ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥ、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、ＲＬＭ−ＲＡＣＥまたはベクトレットＰＣＲ）によって増幅される。

１例として、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ（レタス）のＨＳＫ ｃＤＮＡの配列が提供される。ＮＣＢＩにおけるＧｅｎｂａｎｋのＥＳＴデータベースから、数個のＬａｃｔｕｃａ ＨＳＫ ＥＳＴを、シロイヌナズナＨＳＫアミノ酸配列から出発してｔｂｌａｓｔｎツールを使用して特定した。ＥＳＴのクラスター化およびアラインメントにより、５’ＨＳＫフラグメントについてのコンセンサス配列、および、３’ＨＳＫフラグメントについてのコンセンサス配列がもたらされた。完全なレタスＨＳＫ ｃＤＮＡを得るために、ＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（Ａｍｂｉｏｎ）をレタスの実生に由来するｍＲＮＡに対して使用した。５’ｍＲＮＡ配列を、ＥＳＴに由来する３’ＨＳＫコンセンサス配列において設計されたプライマー（Ｒ１Ｓ１ａ：ＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣＡＴＣＣＡＴＴＣＣ）と、キットに由来する５’ＲＡＣＥプライマーとを使用することによって得た。３’ｃＤＮＡ配列を、５’ＲＡＣＥフラグメントにおいて設計された２つのプライマー（Ｌｅｔ３ＲＡＣＥＯｕｔ：ＣＣＧＴＴＧＣＧＧＴＴＡＡＴＧＡＧＡＴＴ、および、Ｌｅｔ３ＲＡＣＥＩｎｎ：ＴＣＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡ）と、キットに由来する３’ＲＡＣＥプライマーとを使用することによって得た。組み立てられた配列に基づいて、新しいプライマーを、完全なＨＳＫコード部をｃＤＮＡから増幅して、図１０に示されるようなヌクレオチド配列および由来するタンパク質配列を提供するために設計した。類似する方法をトマト（図１４）およびブドウ（図１１）について使用した。

１０を越える異なる植物種に由来する完全なＨＳＫコード配列がゲノムデータベースおよびＥＳＴデータベースから特定されている。ＤＮＡ配列のアラインメントから、コード配列における保存された領域を縮重オリゴヌクレオプライマーの設計のために選択した（縮重ヌクレオチドについて、略号は、オリゴヌクレオチドを合成するすべての企業によって使用される標準的なコードであるＩＵＢヌクレオチド記号に従う；Ｇ＝グアニン、Ａ＝アデニン、Ｔ＝チミン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ、Ｄ＝ＧまたはＡまたはＴ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）。

与えられた植物種の内部ＨＳＫ ｃＤＮＡ配列を得るための手順は下記の通りである：
１．ｍＲＮＡを、標準的な方法を使用して単離する；
２．ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマーおよび標準的な方法を使用して合成する；
３．縮重したフォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲ反応を行う；
４．ＰＣＲフラグメントを標準的なアガロースゲル電気泳動によって分離し、予想されるサイズのフラグメントをゲルから単離する；
５．単離されたＰＣＲフラグメントを、標準的な方法を使用してプラスミドベクターにクローン化する；
６．ＰＣＲによって求められるような正しいインサート物サイズを有するプラスミドをＤＮＡ配列決定によって分析する；
７．ｂｌａｓｔＸを使用する配列分析により、どのフラグメントが正しい内部ＨＳＫ配列を含有するかを明らかにする；
８．内部ＤＮＡ配列を、その後、５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥのための遺伝子特異的プライマーおよび種特異的プライマーを設計して、完全なＨＳＫコード配列を（上記で記載されたように）ＲＬＭ−ＲＡＣＥによって得るために使用することができる。

１例として、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）のＨＳＫ ｃＤＮＡの配列決定が提供される。キュウリについて、２つのプライマー組合せが、内部コード配列の領域をｃＤＮＡから増幅することに成功した；組合せ１：プライマーＦ１Ｋｏｍ（ＧＡＹＴＴＣＹＴＨＧＧＭＴＧＹＧＣＣＧＴ）およびプライマーＭ１ＲＣ（ＧＣＲＧＣＧＡＴＫＣＣＲＧＣＲＣＡＧＴＴ）、ならびに、組合せ２：プライマーＭ１Ｋｏｍ（ＡＡＣＴＧＹＧＣＹＧＧＭＡＴＣＧＣＹＧＣ）およびプライマーＲ１Ｋｏｍ（ＣＣＡＴＤＣＣＶＧＧＡＡＴＣＡＡＮＧＧＶＧＣ）。増幅されたフラグメントのクローニングおよび配列決定の後、キュウリのＨＳＫ特異的プライマーを５’ＲＡＣＥのために設計し（Ｃｕｃ５ＲＡＣＥＯｕｔ：ＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＣＴＡＡＧＴＴＴＡＴＴＣＧＴＧおよびＣｕｃ５ＲＡＣＥＩｎｎ：ＡＧＡＣＡＴＡＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡ）、また、３’ＲＡＣＥのために設計した（Ｃｕｃ３ＲＡＣＥＯｕｔ：ＴＧＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧＡＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴおよびＣｕｃ３ＲＡＣＥＩｎｎ：ＣＡＣＧＡＡＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＣＣＴＣＴ）。最後に、完全なキュウリＨＳＫ ｃＤＮＡ配列を増幅し、配列決定した（図１２）。類似した方法をホウレンソウについて使用した（図１３）。

本実施例に記載されるように特定されたオルソログは、ＨＳＫの発現または活性を低下させる変異を導入するために、広く知られている技術を使用して改変することができる。あるいは、オルソログの遺伝子情報は、遺伝子サイレンシングのためのビヒクルを設計するために使用することができる。すべてのこれらの配列は、その後、対応する作物植物を形質転換して、卵菌門に対して抵抗性である植物を得るために使用される。

ＲＮＡｉによるシロイヌナズナ属におけるホモセリンキナーゼ発現の低下
ＨＳＫサイレンシング系統の作製がＲＮＡｉによってシロイヌナズナ属において達成されている。ＨＳＫエキソンの２つの約７５０ｂｐのフラグメントを向き合う方向で含有する構築物をシロイヌナズナＣｏｌ−０受入体に首尾よく形質転換した。形質転換体をアブラナべと病菌の単離体Ｗａｃｏ９に対する抵抗性について分析した。アブラナべと病菌に対する抵抗性を与える数個の遺伝子組換え系統が得られた。ＨＳＫ発現およびホモセリン蓄積の分析により、形質転換された系統において、ＨＳＫ遺伝子がサイレンシングされ、アブラナべと病菌に対する抵抗性をもたらしていることが確認される。

種子の変異化
目的とする植物種の種子を、ランダム点変異をゲノムに導入するために変異原により処理する。変異させた植物を成長させて、種子を作らせ、次世代をホモセリンの増大した蓄積についてスクリーニングする。これは、アミノ酸のホモセリンのレベルを測定することによって、ＨＳＫ遺伝子の発現のレベルをモニターすることによって、または、ＴＩＬＬＩＮＧ法により、もしくは、ＤＮＡ配列決定により、もしくは、ヌクレオチドの変化を特定するための任意の他の方法によりＨＳＫ遺伝子におけるミスセンス変異について探索することによって達成される。

選抜された植物はホモ接合性であるか、または、自家受粉もしくは相互交配によってホモ接合性にされる。増大したホモセリンレベルを有する選抜されたホモ接合植物は、増大した耐病性を確認するために、目的とする病原体に対する抵抗性の増大について試験される。

所望される作物のバックグラウンドへの変異対立遺伝子の移入
作物への所望される変異型対立遺伝子の遺伝子移入が、交配および変異型対立遺伝子の遺伝子型決定によって達成される。これは、作物の今日でのマーカー補助育種における標準的な手法である。

表
表２
シロイヌナズナＨＳＫのｍＲＮＡ配列および他の植物種からのオルソログ配列の発現配列タグ（ＥＳＴ）およびｍＲＮＡ配列についてのＧＩ番号（ＧｅｎＩｎｆｏ識別子）およびＧｅｎｂａｎｋアクセション番号。

ＧＩ番号（ｇｅｎＩｎｆｏ識別子、これは小文字の「ｇｉ」で書かれることがある）は、特定の配列を特定する一意的な整数である。ＧＩ番号は、ＮＣＢＩによって処理されるそれぞれの配列記録に連続して割り当てられる一連の数字である。従って、ＧＩ番号は、配列が変化する毎に変化する。ＮＣＢＩは、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋからのヌクレオチド配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどからのタンパク質配列を含めて、Ｅｎｔｒｅｚに登録されるすべての配列にＧＩ番号を割り当てる。従って、ＧＩ番号は、配列そのものを指定する、データベース源に依存しない一意的な配列識別子を提供する。Ｇｅｎｂａｎｋにおける配列が、１塩基対によってさえ、修正されるならば、新しいＧＩ番号が、更新された配列に割り当てられる。アクセション番号は同じままである。ＧＩ番号は常に変わらず、以前のものに戻すことができる。従って、表におけるＧＩ番号への参照は、対応する配列の明瞭かつ曖昧でない特定を提供する。

表３
ＤＭＲ１遺伝子座のマッピングにおいて使用された挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ、サイズ差
が括弧で示される）マーカーのプライマー配列および切断増幅多型配列（ＣＡＰ、多型制限部位が括弧で示される）。

表４
ＴＡＩＲコードおよびＧＩコードが示される８個の候補ＤＭＲ１遺伝子を増幅および配列決定するために使用されたプライマー配列

図１は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．８２）多重配列アラインメントプログラム（ＥＢＩ）を使用する、シロイヌナズナのＨＳＫタンパク質、ならびに、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（１）、ポプラ（２）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（２）、ブドウ、レタス、ジャガイモ（１）、トマト、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、アサガオ（Ｉｍｐｏｅａ ｎｉｌ）、ダイズ、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、キュウリ、ホウレンソウ、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）およびイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来するオルソログのアミノ酸配列のアラインメントを示す。配列の下には、保存されたアミノ酸配列が点によって示され、同一のアミノ酸が星印によって示される。中塗り三角および対応するテキストは、５つのシロイヌナズナｄｍｒ変異体において置換されるアミノ酸を示す。 図２は、接種後７日での変異体（ｄｍｒ１−１、ｄｍｒ１−２、ｄｍｒ１−３およびｄｍｒ１−４）および親系統（Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２）に対する２つのアブラナべと病菌単離体（Ｃａｌａ２およびＷａｃｏ９）による分生子柄形成の割合を示す。親系統において形成された分生子柄を１００％に設定した。 図３は、ＤＭＲ１のクローニングにおける３つの主要な工程のグラフィック概略図である。ａ）ｄｍｒ１の最初のマッピングにより、遺伝子座の位置が、第２染色体の下側アームにおいて、７．４２Ｍｂの位置と、７．５６Ｍｂの位置との間に決定された。３つの挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）マーカーを設計した（Ｆ６Ｐ２３、Ｔ２３Ａ１およびＦ５Ｊ６のマーカーの位置が黒線によって示される）。これらのマーカーを使用して、組換え体を数百個の分離したＦ２植物およびＦ３植物から特定した。集められた組換え体において中断点を特定するためのこれらのＩＮＤＥＬマーカーおよびさらなるマーカーのプライマー配列が表３に示される。ｂ）１つのマーカー（Ａｔ２ｇ１７２７０）（灰色の線によって示される）が抵抗性との最も強い連鎖を示した。ｄｍｒ１遺伝子座はさらに、８個の遺伝子（ａｔ２ｇ１７２５０〜ａｔ２ｇ１７２９０）を含有する領域に範囲を定めることができた。これら８個の遺伝子を、表４に記載されるプライマーを使用して、コード配列における変異を探すために増幅および配列決定した。８個すべての候補遺伝子のＤＮＡ配列分析により、５個すべてのｄｍｒ１変異体において、Ａｔ２ｇ１７２６５における点変異の発見がもたらされた。ｃ）それぞれのｄｍｒ１変異体は、ホモセリンキナーゼをコードするＡｔ２ｇ１７２６５遺伝子において異なる場所に点変異を有する。 図４は、ＨＳＫコード配列、ならびに、ＨＳＫコード配列における５つの異なるｄｍｒ１変異の位置およびヌクレオチド置換の概略図である（中塗り三角によって示されるヌクレオチド位置は、１位で開始するＡＴＧ開始コドンに対してである）。５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲが明るい灰色の四角によって示される。ヌクレオチド配列の下には、タンパク質配列が示される。ＨＳＫタンパク質は葉緑体標的化のための推定される輸送配列（暗い灰色部分）を含有する。５つのｄｍｒ１変異から生じるアミノ酸変化がＨＳＫタンパク質におけるそのアミノ酸（ａａ）位置番号（中塗り三角）で示される。 図５は、トレオニン、メチオニンおよびイソロイシンのアミノ酸の生合成のためのアスパラギン酸経路におけるホモセリンキナーゼ酵素の位置を示す。 図６は、アブラナべと病菌の２つの異なる単離体（Ｗａｃｏ９およびＣａｌａ２）を接種した５日後のＬｅｒ ｅｄｓ１−２の実生あたりの分生子柄の数を示す。接種された実生に、ｄＨ２Ｏ、Ｄ−ホモセリン（５ｍＭ）またはＬ−ホモセリン（５ｍＭ）を病原体接種後３日で浸透させた。Ｌ−ホモセリンにより処理された実生は分生子柄形成の完全な非存在を示し、従って、抵抗性である。 図７は、トリパンブルー染色された実生の顕微鏡観察によって分析されたときの、水、Ｄ−ホモセリン（５ｍＭ）またはＬ−ホモセリン（５ｍＭ）により処理された実生におけるアブラナべと病菌の成長および発達を示す。ａ：Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２の実生におけるＨＳ処理の後での分生子柄形成（１０倍の倍率）。分生子柄形成がＬ−ホモセリン浸透の後では何ら検出されなかった。これに対して、コントロールの植物はたくさんの胞子形成を示す。ｂ：吸根の発達がＬ−ホモセリン（５ｍＭ）の浸透によって影響を受け（４０倍の倍率）、しかし、水またはＤ−ホモセリンにより処理された植物では影響を受けない。 図８は、シロイヌナズナのホモセリンキナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（Ａｔ２ｇ１７２６５、ＮＭ＿１２７２８１、ＧＩ：１８３９８３６２）を示す。 図９は、シロイヌナズナのホモセリンキナーゼタンパク質のアミノ酸配列（Ａｔ２ｇ１７２６５、ＮＭ＿１７９３１８、ＧＩ：１５２２７８００）を示す。 図１０は、レタスのホモセリンキナーゼのコード配列（ＣＤＳ）およびタンパク質のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列をそれぞれ示す。 図１１は、ブドウのホモセリンキナーゼのコード配列（ＣＤＳ）およびタンパク質のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列をそれぞれ示す。 図１２は、キュウリのホモセリンキナーゼのコード配列（ＣＤＳ）およびタンパク質のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列をそれぞれ示す。 図１３は、ホウレンソウのホモセリンキナーゼのコード配列（ＣＤＳ）およびタンパク質のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列をそれぞれ示す。 図１４は、トマトのホモセリンキナーゼのコード配列（ＣＤＳ）およびタンパク質のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列をそれぞれ示す。

Claims (37)

1. ウイルス起源、細菌起源、真菌起源または卵菌起源の病原体に対して抵抗性である植物であって、前記病原体に対して抵抗性でない植物と比較して、ホモセリンのレベルの増大を有することを特徴とする植物。
2. 病原体が卵菌門の生物である、請求項１に記載の植物。
3. 病原体が、シロサビキン（Ａｌｂｕｇｏ）属、アファノミセス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ）属、バシジオホラ（Ｂａｓｉｄｉｏｐｈｏｒａ）属、ブレミア（Ｂｒｅｍｉａ）属、ヒアロペロノスポラ（Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）属、パキメトラ（Ｐａｃｈｙｍｅｔｒａ）属、パラペロノスポラ（Ｐａｒａｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）属、ペロファシア（Ｐｅｒｏｆａｓｃｉａ）属、ペロノフィトラ（Ｐｅｒｏｎｏｐｈｙｔｈｏｒａ）属、ツユカビ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）属、ペロノスクレロスポラ（Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ）属、フィチウム（Ｐｈｙｔｉｕｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属、タンジクツユカビ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）属、プロトブレミア（Ｐｒｏｔｏｂｒｅｍｉａ）属、ニセツユカビ（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）属、ササラビョウキン（Ｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ）属、ビエンノチア（Ｖｉｅｎｎｏｔｉａ）属の種である、請求項２に記載の植物。
4. 植物および病原体が、レタスにおけるレタスべと病菌（Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ）、ホウレンソウにおけるホウレンソウべと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ）、ウリ科のメンバー（例えば、キュウリ）におけるキュウリべと病菌（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、タマネギにおけるタマネギべと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、アブラナ科のメンバー（例えば、キャベツ）におけるアブラナべと病菌（Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、ブドウにおけるブドウべと病菌（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）、トマトおよびジャガイモにおける疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ならびに、ダイズにおけるダイズ茎疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ）から選択される、請求項２または３に記載の植物。
5. コードされた酵素のホモセリンキナーゼ活性に影響を及ぼす変異をそのホモセリンキナーゼ遺伝子に有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物。
6. ホモセリンキナーゼ遺伝子における変異が、コードされたタンパク質におけるアミノ酸置換の原因となる、請求項５に記載の植物。
7. コードされたホモセリンキナーゼの発現に影響を及ぼす変異をそのホモセリンキナーゼ遺伝子の調節配列において有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物。
8. コードされたホモセリンキナーゼの発現に影響を及ぼす、ホモセリンキナーゼ遺伝子に基づく遺伝子サイレンシング構築物をそのゲノムに有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物。
9. 植物における内因性ホモセリンのレベルの増大をもたらす、アスパラギン酸経路におけるアップレギュレーションされた遺伝子を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物。
10. 遺伝子が、図８に示されるようなシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子Ａｔ２ｇ１７２６５（ＮＭ＿１２７２８１、ＧＩ：１８３９８３６２）のオルソログ遺伝
    子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の植物。
11. 遺伝子が、表２のリストにおいて特定されるようなホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の植物。
12. 遺伝子が、図１０に示されるようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）のホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の植物。
13. 遺伝子が、図１１に示されるようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）のホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の植物。
14. 遺伝子が、図１２に示されるようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）のホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の植物。
15. 遺伝子が、図１３に示されるようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ）のホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の植物。
16. 遺伝子が、図１４に示されるようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）のホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の植物。
17. 植物における内因性ホモセリンのレベルを増大させることを含む、ウイルス起源、細菌起源、真菌起源または卵菌起源の病原体に対して抵抗性である植物を得るための方法。
18. 植物における内因性ホモセリンのレベルを増大させることが植物へのホモセリンの外部からの投与によって達成される、請求項１７に記載の方法。
19. ホモセリンが、ホモセリンの噴霧または浸透により実生を処理することによって植物に投与される、請求項１８に記載の方法。
20. 植物における内因性ホモセリンのレベルを増大させることが植物のホモセリンキナーゼ遺伝子の変異によって達成される、請求項１７に記載の方法。
21. 変異が、より低いホモセリンキナーゼ活性をもたらす１つまたは複数のアミノ酸変化を生じさせる、請求項２０に記載の方法。
22. 変異が、特に変異原または放射線による植物の変異誘発処理によってもたらされる、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 植物における内因性ホモセリンのレベルを増大させることが、植物のホモセリンキナーゼ遺伝子の発現を低下させることによって達成される、請求項１７に記載の方法。
24. 植物のホモセリンキナーゼ遺伝子の発現を低下させることが遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡｉによって達成される、請求項２３に記載の方法。
25. 植物のホモセリンキナーゼ遺伝子の発現を低下させることが、プロモーター領域、ター
    ミネーター領域またはイントロンにおける調節エレメントの変異誘発によって達成される、請求項２３に記載の方法。
26. 植物のホモセリンキナーゼ遺伝子の発現を低下させることが、ホモセリンキナーゼ遺伝子のリプレッサータンパク質を過剰発現させることによって達成される、請求項２３に記載の方法。
27. ホモセリンキナーゼ遺伝子が３５Ｓプロモーターから発現される、請求項２６に記載の方法。
28. 植物のホモセリンキナーゼ遺伝子の発現を低下させることが、ホモセリンキナーゼの活性化タンパク質または調節タンパク質をコードする植物遺伝子のサイレンシングまたは変異によって達成される、請求項２３に記載の方法。
29. 植物における内因性ホモセリンのレベルを増大させることが、アスパラギン酸経路における変化を誘導することによって達成される、請求項１７に記載の方法。
30. 変異させられるホモセリンキナーゼ遺伝子が、図８に示されるようなシロイヌナズナ属遺伝子Ａｔ２ｇ１７２６５（ＮＭ＿１２７２８１、ＧＩ：１８３９８３６２）のオルソログ遺伝子である、請求項２１〜２９に記載の方法。
31. オルソログ遺伝子が、図１０に示されるようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するレタスのホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
32. オルソログ遺伝子が、図１１に示されるようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するブドウのホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
33. オルソログ遺伝子が、図１２に示されるようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するキュウリのホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
34. オルソログ遺伝子が、図１３に示されるようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するホウレンソウのホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
35. オルソログ遺伝子が、図１４に示されるようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するトマトのホモセリンキナーゼ遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
36. 酵素活性の低下を有するホモセリンキナーゼをコードする変異植物ＨＳＫ遺伝子。
37. ｄｍｒ１対立遺伝子のｄｍｒ１−１、ｄｍｒ１−２、ｄｍｒ１−３、ｄｍｒ１−４およびｄｍｒ１−５からなる群から選択される、請求項３６に記載の変異植物ＨＳＫ遺伝子。