WO2015108000A1 - タバコのＥｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍに対する抵抗性の判定方法及びその利用 - Google Patents

タバコのＥｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍに対する抵抗性の判定方法及びその利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2015108000A1
WO2015108000A1 PCT/JP2015/050544 JP2015050544W WO2015108000A1 WO 2015108000 A1 WO2015108000 A1 WO 2015108000A1 JP 2015050544 W JP2015050544 W JP 2015050544W WO 2015108000 A1 WO2015108000 A1 WO 2015108000A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
base
tobacco
gene
seq
sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/050544
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
佐藤　正紀
雅雄 新井
智之 田島
朋也 藤村
知之 小松
Original Assignee
日本たばこ産業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日本たばこ産業株式会社 filed Critical 日本たばこ産業株式会社
Publication of WO2015108000A1 publication Critical patent/WO2015108000A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Definitions

  • the resistance of tobacco to Erysiphe cichoracearum can be easily determined.
  • Amplification of the first polynucleotide and the second polynucleotide can be performed by, for example, PCR, but other known gene amplification methods such as LCR (ligase chain reaction) method, SDA (Strand Displacement Amplification) method, etc. , LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method or the like may be used.
  • LCR ligase chain reaction
  • SDA Strand Displacement Amplification
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • the primer sequence for amplifying each polynucleotide only needs to sandwich or contain the mutation site, and the location and length of the primer sequence are not particularly limited. Moreover, as long as it can function as a primer for amplifying a sequence having a predetermined number of bases including a mutation site, the sequence may contain one or more substitutions, deletions and additions. In addition, the primer may be labeled with a fluorescent substance, a radioactive substance, or the like as necessary.
  • a forward primer (SEQ ID NO: 12) and a reverse primer (SEQ ID NO: 13) a continuous region containing the position of the first mutation in the first gene (position 2997 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) To position 3160 and positions 2923 to 3086 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3) can be amplified.
  • a forward primer (SEQ ID NO: 12) and a reverse primer (SEQ ID NO: 16) a continuous region including the position of the first mutation in the first gene (position 2997 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1) To position 3279 and positions 2923 to 3205 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3) can be amplified.
  • a forward primer SEQ ID NO: 14
  • a reverse primer SEQ ID NO: 15
  • a continuous region including the position of the second mutation in the second gene positions 2891 to 3230 in SEQ ID NO: 2.
  • Positions 2893 to 3230) in SEQ ID NO: 4 can be amplified.
  • the method for detecting a mutation from each amplified polynucleotide is not particularly limited, and a known method for detecting a mutation (base substitution, deletion and insertion) can be used. Moreover, only one type of method may be used, or a plurality of types of methods may be used in combination.
  • the size of each amplified polynucleotide may be examined.
  • a known method may be used as a method for examining the size of the polynucleotide, and is not particularly limited.
  • electrophoresis methods such as agarose gel electrophoresis, polyacrylamide electrophoresis, and capillary gel electrophoresis can be used.
  • a method of designing a probe that specifically hybridizes to a mutated part and confirming the presence or absence of mutation or deletion by hybridizing is not particularly limited, and for example, PCR using the TaqMan TM probe method or MassARRAY TM analysis of Sequenom, which is a measurement technique using TOF-MS, can be used.
  • the probe include a first mutation in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a second mutation in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a length of 10 bases or more, preferably 16 to 500 bases More preferably, an oligonucleotide that hybridizes to a continuous base sequence having a length of 20 to 200 bases, particularly preferably 20 to 50 bases, can be used.
  • the probe may be labeled with an appropriate means such as a fluorescent substance or a radioactive substance, if necessary.
  • the first mutation and the second mutation can be used as a codominant marker.
  • a codominant marker refers to a DNA marker that can also identify heterozygotes for a target locus.
  • Allyl-specific PCR method When the first mutation and the second mutation are detected by the above-described (7) allele-specific PCR method, in order to determine whether each mutation is homozygous or heterozygous, It is necessary to perform PCR using a primer set that amplifies a polynucleotide (sequence of positive marker) including a sequence after mutation, and a primer set that amplifies a polynucleotide (sequence of a mutation) that includes a sequence before mutation (negative marker).
  • a primer set (first primer set) for amplifying a polynucleotide containing the sequence after the mutation of the first mutation (first polynucleotide) and a sequence after the mutation of the second mutation are included.
  • Primer set (second primer set) for amplifying a polynucleotide (second polynucleotide) primer for amplifying a polynucleotide (third polynucleotide) containing a sequence before the mutation of the first mutation PCR using the set (third primer set) and the primer set (fourth primer set) for amplifying the polynucleotide (fourth polynucleotide) containing the sequence before the second mutation, respectively.
  • the first primer set includes a first primer designed to include the mutated sequence of the first mutation or a complementary sequence thereof
  • the second primer set includes the mutated sequence of the second mutation or A second primer designed to include its complementary sequence
  • a third primer set includes a third primer designed to include the pre-mutation sequence of the first mutation or its complementary sequence
  • the fourth primer set includes a fourth primer designed to include a sequence before mutation of the second mutation or a complementary sequence thereof.
  • the sequence before or after the mutation of the first mutation or the second mutation included in these primers, or a complementary sequence thereof is present on the 3 ′ end side of the primer.
  • the primer set which can amplify the objective polynucleotide more specifically can be provided.
  • the first polynucleotide When the first polynucleotide is not amplified and the third polynucleotide is amplified, there is no first mutation, the first polynucleotide is amplified, and the third polynucleotide is not amplified.
  • the first mutation is homozygous, and when the first polynucleotide and the third polynucleotide are amplified, it can be determined that the first mutation is heterozygous.
  • the second polynucleotide when the second polynucleotide is not amplified and the fourth polynucleotide is amplified, there is no second mutation, the second polynucleotide is amplified, and the fourth polynucleotide is not amplified.
  • the determination method according to the present embodiment it is easier to determine whether it is resistant or susceptible to Erysiphe cichoracearum than when determining resistance based on a phenotype. Can do. Furthermore, since co-dominant markers can also identify heterozygous genotypes, test crosses are not required in backcross breeding described below.
  • the early determination method using the DNA marker according to the present embodiment is more efficient and effective than the phenotypic selection according to the prior art.
  • tobacco root- knot nematode disease (Yi et al . (1998) Mapping the Root-Knot Nematode Resistance Gene (Rk) in Tobacco with RAPD Markers. 82: 1319-1322), tobacco epidemic (Johnson et al . (2002) Marker-assisted selection for resistance to black shank disease in tobacco. Plant Dis. 86: 1303-1309), tobacco wildfire (Yi et al . (1998) Identification of RAPD markers linked to the wildfire resistance gene of tobacco using bulked segregant analysis.Tobacco Science 42: 52-57), black root disease (Kenward et al .
  • the first mutation and the second mutation other than the first mutation that are considered to cause resistance between a resistant variety (eg, “Kokubun”) and a susceptible variety Mutation may be used for resistance determination.
  • a resistant variety eg, “Kokubun”
  • a susceptible variety Mutation may be used for resistance determination.
  • FIGS. 7 to 17 there are mutations other than the first mutation and the second mutation between the resistant variety and the susceptible variety. Also by detecting these, since it can be determined whether or not the first gene and the second gene are derived from “Kokubun”, resistance to Erysiphe cichoracearum can be determined.
  • the determination method according to the second embodiment of the present invention is a method for determining the resistance of tobacco to Erysiphe cichoracearum, wherein in the genomic DNA of tobacco, (i) a first sequence comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • the gene has one or more mutations shown in (1) to (20) below: (1) the base at position 444 is substituted with C; (2) Inserting TACTATADATASATATATATATAATATAATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATADAT (SEQ ID NO: 19) between positions 1049 and 1050; (3) deletion of bases from position 2265 to position 2268; (4) Substitution of the nucleotide sequence from position 3023 to position 3024 with TA; (5) deletion of bases from position 3430 to position 3431; (6) deletion of base at position 3547; (7) the base at position 3562 is substituted with T; (8) TA inserted between positions 3598 and 3599;
  • the determination method according to the third embodiment of the present invention is a method for determining the resistance of tobacco to Erysiphe cichoracearum .
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (however, the base symbol “t” "Is read as” u ") and the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 (provided that the base symbol" t "in the sequence listing is read as” u ")
  • the fact that the second mRNA is not detected is used as an index of resistance.
  • the detection of the splicing variant of the first mRNA and the splicing variant of the second mRNA in tobacco may be used as an indicator of resistance.
  • the first mRNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (however, the base symbol “t” in the sequence listing shall be read as “u”), and the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 ( However, the detection of the second mRNA consisting of the base symbol “t” in the sequence listing shall be read as “u”, and the detection of the splicing variant of the first mRNA and the splicing variant of the second mRNA Is, but not limited to, the length of cDNA fragments derived from the first mRNA and the second mRNA obtained by reverse transcription of the transcript contained in the extract extracted from tobacco and amplified with specific primers. This can be done by comparing or decoding the base sequence.
  • the final fixed line self-bred the backcross line, against which resistance against Erysiphe cichoracearum was tested based on phenotype, and resistance to Erysiphe cichoracearum was fixed.
  • Self-breeding resistant individuals at a segregation ratio of diseased individuals 15 to sex individuals 1).
  • the "Kokubu" for a population of hybrid progeny of the susceptible variety (F 2), representing the resistance to Erysiphe cichoracearum
  • F 2 the susceptible variety
  • a variety having fixed resistance to Erysiphe cichoracearum resistant individuals are self-bred at a segregation ratio of 15 susceptible individuals to 1 resistant individuals
  • the symptom that appears in each seedling is the concentration of Erysiphe cichoracearum to be inoculated, the stage of the seedling to be inoculated, and the greenhouse in which the seedling is grown.
  • the environment such as temperature and humidity, there may be a difference in the symptoms of powdery mildew disease, and there is a risk that resistance will be misjudged due to inoculation of Erysiphe cichoracearum .
  • the DNA marker includes one or more mutation sites shown in (1) to (20) described in the second embodiment of the first gene shown in SEQ ID NO: 1 in tobacco genomic DNA. (21) to (21) described in the second embodiment above, of a polynucleotide comprising a continuous base sequence of not less than 5000 bases or a complementary sequence thereof, or a second gene shown in SEQ ID NO: 2 in tobacco genomic DNA. And a polynucleotide comprising a continuous base sequence of 20 to 5000 bases including one or more mutation sites shown in 33) or a complementary sequence thereof.
  • a DNA marker can be used in the determination method according to the second embodiment.
  • the determination kit in addition to the first primer set and the second primer set, from the tobacco genomic DNA, the first sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • a third primer set for amplifying a third polynucleotide comprising a continuous base sequence of 20 to 5000 bases including bases corresponding to positions 3023 and 3024 of one gene or a complementary sequence thereof;
  • a fourth base consisting of a continuous base sequence of 20 to 5000 bases including the bases corresponding to positions 2981 and 2982 of the second gene shown in SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence from the genomic DNA of tobacco
  • the first primer set comprises a sequence Comprising a first primer comprising a nucleotide sequence corresponding to positions 3097 and 3098 of the first gene shown in No.
  • a primer set (first primer set) for amplifying a polynucleotide containing the sequence after the mutation of the first mutation (first polynucleotide), and a polynucleotide containing the sequence after the mutation of the second mutation Primer set for amplifying nucleotides (second polynucleotide) (second primer set), primer set for amplifying polynucleotide (third polynucleotide) containing the sequence before mutation of the first mutation (Third primer set) and a primer set (fourth primer set) for amplifying a polynucleotide (fourth polynucleotide) containing the sequence before the second mutation can be provided. Therefore, the allyl-specific PCR method described above can be easily performed.
  • the position of the base sequence corresponding to positions 3097 and 3098 of the first gene shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence in the first primer or its complementary sequence (ii) the sequence in the second primer The base sequence corresponding to positions 2982 and 2983 of the second gene shown in No. 2 or the position of its complementary sequence, (iii) the 30th position of the first gene shown in SEQ ID No. 3 in the third primer And the position of the base sequence corresponding to position 3024 or its complementary sequence, and (iv) the base sequence corresponding to positions 2981 and 2982 of the second gene shown in SEQ ID NO: 4 in the fourth primer, or
  • the position of the complementary sequence is preferably present on the 3 ′ end side of each primer.
  • the determination kit comprises 10 bases containing one or more mutation sites shown in (1) to (20) of the first gene shown in SEQ ID NO: 1 described in the second embodiment.
  • the probe can be used in the determination method according to the second embodiment.
  • “Instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc. .
  • the kit according to the present invention may also include a container containing a diluent, a solvent, a washing solution or other reagent.
  • the first mutation is a substitution of the base sequence corresponding to positions 3023 to 3024 of the first gene with TA
  • the second mutation is the 2981 of the second gene. It may be a deletion of the base corresponding to the position and position 2982.
  • a determination method is a method for determining the resistance of tobacco to Erysiphe cichoracearum , wherein the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (however, the base symbol “t” in the sequence listing) "Is read as” u ”) and the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 (provided that the base symbol" t "in the sequence listing is read as” u ") The fact that the second mRNA is not detected is used as an index of the resistance.
  • a breeding method is a method for breeding tobacco that is resistant to Erysiphe cichoracearum , and uses the determination method of the present invention to select a tobacco that is resistant to Erysiphe cichoracearum . It is characterized by including a process.
  • a kit for determining resistance to tobacco Erysiphe cichoracearum includes 20 bases corresponding to positions 3097 and 3098 of the first gene shown in SEQ ID NO: 1 from tobacco genomic DNA.
  • a second primer set for amplifying a second polynucleotide comprising a continuous base sequence of 20 bases to 5000 bases including bases corresponding to positions 2982 and 2983, or a complementary sequence thereof. It is characterized by that.
  • the kit for determining resistance to tobacco Erysiphe cichoracearum is a contiguous base sequence of 10 bases or more including the bases at positions 3097 and 3098 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a complement thereof.
  • a first probe that hybridizes to the sequence and a second probe that hybridizes to a continuous base sequence of 10 bases or more including the bases at positions 2982 and 2983 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence thereof It is characterized by having.
  • the obtained cDNA was subcloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen), and BigDye Terminator.
  • the respective nucleotide sequences were determined using V3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technology) and DNA Analyzer 3730xl (Life Technology). As shown in FIGS. 3 to 4, they were prepared from “Tsukuba No. 1” leaves. All of the first gene cDNAs (represented as resistance 1 to 3 in the figure: SEQ ID NOs: 6 to 8) were prepared from the leaves of “SR1” (indicated as diseased in the figure). It was a splicing variant in which deletion or insertion occurred from the same position on the base sequence with respect to SEQ ID NO: 5). Further, as shown in FIGS.
  • the cDNA of the second gene prepared from the leaves of “Tsukuba No. 1” (shown as resistance 1-2 in the figure: SEQ ID NOs: 10 to 11) is all “SR1 To the cDNA of the second gene prepared from the leaves (shown as susceptibility in the figure: SEQ ID NO: 9), a splicing variant in which a deletion occurred from the same position on the base sequence.
  • Resistant varieties for each genomic DNA extracted from susceptible variety and F 1, forward primer (5'-TTCAGAATTATATTCTTCCCTCCC-3 ': SEQ ID NO: 12) and reverse primer (5'-ACTGCTCTATTGATGTATATCTGG-3': SEQ ID NO: 13 ) was used to amplify a continuous region including the mutation site in the first gene.
  • forward primer for each genomic DNA extracted from susceptible variety and F 1, forward primer (5'-CCAGAGAGGTTCAGGTTTGCAAGAG-3 ': SEQ ID NO: 14) and reverse primer (5'-TTTTGAACCCCCTTCGTGAAGATCC-3': PCR was performed using SEQ ID NO: 15) to amplify a continuous region including the mutation site in the second gene.
  • the forward primer was previously labeled with PET and FAM fluorescent labels.
  • PCR was performed using QIAGEN Multiplex PCR Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions. As a temperature condition, after reacting at 95 ° C. for 15 minutes, a cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 90 seconds and 72 ° C. for 60 seconds was repeated 40 cycles, and then reacted at 72 ° C. for 10 minutes.
  • the peak differs between the PCR product derived from the resistant variety and the PCR product derived from the susceptible variety, and the mutation is detected. It was shown to get.
  • the mutation was heterozygous (F 1 )
  • two peaks were detected, indicating that it can be used as a codominant DNA marker.
  • the resistance of the resistant cultivar “Kokubun” to Erysiphe cichoracearum is based on the substitution of the nucleotide sequence from position 3023 to position 3024 of the first gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 with TA; Because the translation product of the normal first gene and the second gene is not synthesized by the mutation of both the 2981 and 2982 deletions of the second gene comprising the base sequence shown in FIG. It can be said that it has been brought.

Abstract

タバコのゲノムＤＮＡにおいて、（ｉ）配列番号３に示す塩基配列からなる第一の遺伝子の第３０２３位及び第３０２４位に対応する塩基に第一の変異が生じており、（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなる第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基に第二の変異が生じていることを該抵抗性の指標とする、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法、及びその利用。

Description

タバコのＥｒｙｓｉｐｈｅ　ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍに対する抵抗性の判定方法及びその利用
　本発明は、タバコ（Nicotiana tabacum）の病原菌Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法及びその利用に関するものである。
　Erysiphe cichoracearum（タバコのうどんこ病菌）に対して抵抗性のタバコ品種を育成するため、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定技術は重要である。
　従来、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定は、タバコの苗にErysiphe cichoracearumを接種し、病徴が現われるか否かを判定する方法によってなされている。
日本国公表特許公報「特表２０００－５１６８１１号公報（２０００年１２月１９日公表）」
Wan H. (1962) Inheritance of resistance to powdery mildew in Nicotiana tabacum L. Tobacco Sci. 6: 180-183 Bai et al. (2008) Naturally Occurring Broad-Spectrum Powdery Mildew Resistance in a Central American Tomato Accession Is Caused by Loss of Mlo Function. MPMI 21:30-39
　しかしながら、従来技術に係るタバコのErysiphe cichoracearum（タバコのうどんこ病菌）に対する抵抗性の判定方法では、各苗に現れる病徴が、接種するErysiphe cichoracearumの濃度や接種しようとする苗のステージ、苗を育てる温室内の温湿度等の環境に左右されて、うどんこ病発病の症状に差がでることや、Erysiphe cichoracearumの接種漏れ等により、抵抗性の判定を誤るおそれがある。
　また、Erysiphe cichoracearumは絶対寄生菌であり、植物体の生きた組織からの養分の供給が増殖に必須であるため、人工培養が不可能な菌である。そのため、上記判定方法において接種のために用いるErysiphe cichoracearumの維持には時間と労力を要する。
　これらの課題を鑑み、本発明者らは、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定のためのＤＮＡマーカーを開発すべく鋭意検討を行っている。ＤＮＡマーカーとは、品種間又は個体間におけるＤＮＡの塩基配列の並び方の違いであり、品種又は個体を識別するための目印となる並び方の違いのことを指す。
　なお、これまで、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定のためのＤＮＡマーカーは報告されておらず、それどころか、古典的な遺伝学的な研究から、タバコ在来種「国分」（日本たばこ葉たばこ研究所所蔵）を由来とするErysiphe cichoracearumに対する抵抗性が劣性二因子であることが推定されているものの（非特許文献１）、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性に関する分子生物学的な知見は一切存在しない。
　また、他の植物のうどんこ病抵抗性に関連する遺伝子についての報告はあるが（特許文献１、非特許文献２）、他の植物に感染するうどんこ病菌は、オオムギのうどんこ病菌はBlumeria graminis f. sp. hordei、イネのうどんこ病菌はSphaerotheca fusca、シロイヌナズナのうどんこ病菌はGolovinomyces orontii、トマトのうどんこ病菌はOidiopsis siculaなど、ペチュニアのうどんこ病菌はOidium sp.など、ナスのうどんこ病菌はOidiopsis sicula Scaliaなど、ピーマン（トウガラシ）のうどんこ病菌はOidiopsis siculaと、タバコに感染するうどんこ病菌であるErysiphe cichoracearumとは属が異なっており、各植物のうどんこ病菌は他の植物に相互に感染しない。すなわち、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性に関与する遺伝子は一切知られておらず、他の植物におけるうどんこ病に対する抵抗性はタバコに直接利用することはできない。
　また、タバコは複二倍体（四倍体）であり、相同遺伝子が少なくとも二つ以上存在するため、他の二倍体の植物と比べて遺伝様式が複雑である。特に、上述したように、タバコ在来種「国分」を由来とするErysiphe cichoracearumに対する抵抗性は劣性二因子であり、抵抗性に関与する一つの遺伝子を交雑により罹病性品種に導入しても抵抗性の表現型は示さず、由来の異なる二つの遺伝子を導入する必要があるので、従来技術のように表現型に基づいて抵抗性を判定するには多くの労力が必要となる上に、選抜の効率が極めて低い。
　本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性を容易に判定するための技術及びその利用を提供することを主たる目的とする。
　本発明に係る第一の判定方法は、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、該タバコのゲノムＤＮＡにおいて、（ｉ）配列番号３に示す塩基配列からなる第一の遺伝子の第３０２３位及び第３０２４位に対応する塩基に第一の変異が生じており、（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなる第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基に第二の変異が生じていることを該抵抗性の指標とすることを特徴としている。
　本発明に係る第二の判定方法は、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、該タバコのゲノムＤＮＡにおいて、（ｉ）配列番号３に示す塩基配列からなる第一の遺伝子の下記（１）～（２０）に示す一つ以上の変異が生じており：（１）第４４４位の塩基がＣに置換；（２）第１０４９位と第１０５０位との間に配列番号１９に示す塩基配列が挿入；（３）第２２６５位から第２２６８位までの塩基が欠失；（４）第３０２３位から第３０２４位までの塩基配列がＴＡに置換；（５）第３４３０位から第３４３１位までの塩基が欠失；（６）第３５４７位の塩基が欠失；（７）第３５６２位の塩基がＴに置換；（８）第３５９８位と第３５９９位との間にＴＡが挿入；（９）第３６４１位と第３６４２位との間にＡが挿入；（１０）第３６９１位の塩基がＡに置換；（１１）第３６９５位の塩基がＴに置換；（１２）第３６９８位の塩基がＣに置換；（１３）第３７０７位の塩基がＣに置換；（１４）第３７７０位から第３７８４位までの塩基が欠失；（１５）第３７９０位の塩基がＣに置換；（１６）第３７９８位の塩基がＧに置換；（１７）第３８０７位から第３８１０位までの塩基が欠失；（１８）第３８４９位と第３８５０位との間に配列番号２０に示す塩基配列が挿入；（１９）第３８６４位の塩基がＧに置換；（２０）第４０９０位の塩基がＡに置換；（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなる第二の遺伝子の下記（２１）～（３３）に示す一つ以上の変異が生じていること：（２１）第９１６位の塩基がＡに置換；（２２）第１００６位の塩基がＣに置換；（２３）第１０４６位の塩基がＧに置換；（２４）第１０８１位の塩基がＡに置換；（２５）第１１１５位と第１１１６位との間にＡが挿入；（２６）第１１１６位と第１１１７位との間にＡが挿入；（２７）第１６６８位の塩基がＴに置換；（２８）第２１８９位の塩基がＡに置換；（２９）第２９８１位及び第２９８２位の塩基が欠失；（３０）第３６４８位の塩基がＣに置換；（３１）第３７０２位の塩基がＧに置換；（３２）第３８９４位の塩基がＧに置換；（３３）第３８９５位から第３８９６位の塩基が欠失；を該抵抗性の指標とすることを特徴としている。
　本発明に係る第三の判定方法は、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、該タバコにおいて、配列番号５に示す塩基配列（ただし、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）からなる第一のｍＲＮＡ、及び配列番号９に示す塩基配列（ただし、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）からなる第二のｍＲＮＡが検出されないことを該抵抗性の指標とすることを特徴としている。
　本発明に係る育種方法は、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコの育種方法であって、本発明の判定方法を用いて、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコを選抜する選抜工程を包含することを特徴としている。
　本発明に係るタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーは、タバコのゲノムＤＮＡにおける、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第一のポリヌクレオチドと、タバコのゲノムＤＮＡにおける、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第二のポリヌクレオチドと、を含んでいることを特徴としている。
　本発明に係るタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定キットは、タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第一のポリヌクレオチドを増幅するための第一のプライマーセットと、タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第二のポリヌクレオチドを増幅するための第二のプライマーセットと、を備えていることを特徴としている。
　本発明に係るタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定キットは、配列番号１に示す塩基配列における第３０９７位及び第３０９８位の塩基を含む１０塩基以上の連続した塩基配列若しくはその相補配列にハイブリダイズする第一のプローブと、配列番号２に示す塩基配列における第２９８２位及び第２９８３位の塩基を含む１０塩基以上の連続した塩基配列若しくはその相補配列にハイブリダイズする第二のプローブと、を備えていることを特徴としている。
　本発明に係る判定方法、ポリヌクレオチドによれば、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性を容易に判定することができる。
　本発明に係る育種方法によれば、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコを容易に育種することができる。
　本発明に係るＤＮＡマーカー及び判定キットによれば、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性を容易に判定することができる。
本発明の一実施形態に係る判定方法におけるＳＳＣＰ法の結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る判定方法におけるＣＡＰＳ法の結果を示す図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第一の遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第一の遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第二の遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第二の遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第一の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第一の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第一の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第一の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第一の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第二の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第二の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第二の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第二の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第二の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 罹病性品種及び抵抗性品種における第二の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較する図である。 第一の遺伝子に関する相補性試験の結果を示す図である。 第一の遺伝子に関する相補性試験の結果を示す図である。 第二の遺伝子に関する相補性試験の結果を示す図である。 第二の遺伝子に関する相補性試験の結果を示す図である。 第二の遺伝子に関する相補性試験の結果を示す図である。 第二の遺伝子に関する相補性試験の結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係る判定方法におけるＰＣＲ法の結果を示す図である。
　〔１．判定方法〕
　本発明は、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法を提供する。
　（第一実施形態）
　本発明の一実施形態（第一実施形態）に係る判定方法は、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、タバコのゲノムＤＮＡにおいて、（ｉ）配列番号３に示す塩基配列からなる第一の遺伝子の第３０２３位及び第３０２４位に対応する塩基に第一の変異が生じており、（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなる第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基に第二の変異が生じていることを抵抗性の指標とする。すなわち、一つの観点において、本実施形態に係る判定方法は、第一の遺伝子及び第二の遺伝子における、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性をもたらす変異箇所をＤＮＡマーカーとして利用する方法である。
　タバコ（Nicotiana tabacum）は複二倍体であり、第一の遺伝子と、塩基配列及び機能が第一の遺伝子に類似した第二の遺伝子と、の２つの遺伝子が存在する。第一の遺伝子及び第二の遺伝子は、何れも本発明者らが独自に見出した遺伝子であり、第一の遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号５に、第二の遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号９に示す。
　なお、本明細書において、「変異」とは、塩基の置換、欠失又は挿入を指し、特に記載がない場合は、Erysiphe cichoracearumに対して罹病性の（抵抗性ではない）タバコ品種（以降、罹病性品種とも記載する）が有する塩基配列に対する、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコ品種（以降、抵抗性品種とも記載する）の塩基配列の差異を指す。また、本明細書において、「変異箇所」とは、罹病性品種及び抵抗性品種における上記変異の塩基の位置を指す。また、変異が欠失である場合に、当該変異を含む塩基配列とは、当該欠失部位の両側に隣接する塩基を含む塩基配列を指す。
　なお、上記変異は、罹病性品種と抵抗性品種との間に存在するＤＮＡ多型と捉えることができる。
　一実施形態において、第一の変異は、罹病性品種における第一の遺伝子の第７イントロン末端部のスプライシング認識部位のＡＧが、抵抗性品種ではＴＡに置換している変異である。また、第二の変異は、罹病性品種における第二の遺伝子の第６イントロンの５－６番目の塩基ＡＧが、抵抗性品種では欠失している変異である。これらの変異は、第一の遺伝子及び第二の遺伝子の両方について、罹病性品種において生成されるｍＲＮＡのスプライシングバリアント（Splicing variant）を抵抗性品種において生じさせる（第一の遺伝子について図３～４を、第二の遺伝子について図５～６を参照。なお、図中「罹病性」は、罹病性品種から検出されたｍＲＮＡの塩基配列を示し、「（抵抗性１～）」は、それぞれ抵抗性品種から検出されたｍＲＮＡの塩基配列の例を示す）。スプライシングバリアントとは、遺伝子の転写生成物（ｍＲＮＡ前駆体）からイントロンが切り出されて成熟ｍＲＮＡとなる際に、エクソンのスキッピング等により複数種類の転写産物が生じることをいう。この結果として、生成されたタンパク質の機能が変化する場合があることが知られている。
　なお、本明細書において、デオキシリボ核酸及びリボ核酸をアルファベット一文字表記で示すことがあり、「Ａ」及び「ａ」はアデニンを、「Ｔ」及び「ｔ」はチミンを、「Ｃ」及び「ｃ」はシトシンを、「Ｇ」及び「ｇ」はグアニンを、「Ｕ」及び「ｕ」はウラシルをそれぞれ意味する。
　図７～１１は、罹病性品種と抵抗性品種との第一の遺伝子のゲノムＤＮＡの配列を比較した図である。第一の変異の位置は、罹病性品種（配列番号３）における第３０２３位及び第３０２４位に対応し、抵抗性品種（配列番号１）における第３０９７位及び第３０９８位であり、図９に示すように、当該位置の塩基配列は、罹病性品種ではＡＧであり、抵抗性品種ではＴＡである。
　図１２～１７は、罹病性品種と抵抗性品種との第二の遺伝子のゲノムＤＮＡの配列を比較した図である。第二の変異の位置は、罹病性品種（配列番号４）における第２９８１位及び第２９８２位に対応し、抵抗性品種（配列番号２）における第２９８２位及び第２９８３位の塩基の間であり、図１４に示すように、当該位置の塩基配列は、罹病性品種ではＡＧであり、抵抗性品種では欠失している。
　これらの変異は、タバコ在来種「国分」が有する変異である。言い換えれば、本実施形態に係る判定方法は、タバコ在来種「国分」が持つ、病原菌Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性の原因となる第一の遺伝子における塩基置換が生じる位置と、第二の遺伝子における塩基欠失が生じる位置との２箇所の塩基配列を調べることにより、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性を判定する方法である。
　（検出工程）
　本実施形態に係る判定方法は、第一の変異及び第二の変異を検出する方法は特に限定されないが、例えば、タバコのゲノムＤＮＡから、第一の変異を含む連続した塩基配列からなる第一のポリヌクレオチドを増幅し、増幅した第一のポリヌクレオチドを用いて第一の変異を検出する第一の検出工程と、当該ゲノムＤＮＡから、第二の変異を含む連続した塩基配列からなる第二のポリヌクレオチドを増幅し、増幅した第二のポリヌクレオチドを用いて第二の変異を検出する第二の検出工程と、を包含していてもよい。すなわち、一つの観点において、第一の変異を含む連続した塩基配列からなる第一のポリヌクレオチド、及び、第二の変異を含む連続した塩基配列からなる第二のポリヌクレオチドをＤＮＡマーカーとして用い、第一の変異及び第二の変異を検出してもよい。
　タバコのゲノムＤＮＡは、定法に基づいてタバコから抽出すればよく、例えば、植物体から、液体窒素を用いた凍結破砕法や、市販の抽出キットを用いて抽出することができるが、これらに限定されない。また、ゲノムＤＮＡは、粗精製物であってもよいし、いくつかの精製工程を経た精製品であってもよい。
　第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドの増幅は、例えばＰＣＲ法によって行うことができるが、他の公知の遺伝子増幅方法、例えば、ＬＣＲ（ligase chain reaction）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等によって行ってもよい。
　増幅する各ポリヌクレオチドの長さは、後述する各種検出方法が利用可能な長さであれば特に限定されないが、例えば、第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドの長さは、２０塩基以上５０００塩基以下であることがより好ましく、５０塩基以上５００塩基以下であることがさらに好ましい。
　各ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列は、変異箇所を挟むか、又は含んでいればよく、プライマー配列の場所や長さなどは特に限定されない。また、変異箇所を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射性物質等により標識されていてもよい。
　例えば、フォワードプライマー（配列番号１２）及びリバースプライマー（配列番号１３）を用いることにより、第一の遺伝子における第一の変異の位置を含む連続した領域（配列番号１に示す塩基配列における第２９９７位～第３１６０位、配列番号３に示す塩基配列における第２９２３位～第３０８６位）を増幅することができる。また、フォワードプライマー（配列番号１２）及びリバースプライマー（配列番号１６）を用いることにより、第一の遺伝子における第一の変異の位置を含む連続した領域（配列番号１に示す塩基配列における第２９９７位～第３２７９位、配列番号３に示す塩基配列における第２９２３位～第３２０５位）を増幅することができる。また、フォワードプライマー（配列番号１４）及びリバースプライマー（配列番号１５）を用いることにより、第二の遺伝子における第二の変異の位置を含む連続した領域（配列番号２における第２８９１位～第３２３０位、配列番号４における第２８９３位～第３２３０）を増幅することができる。
　増幅された各ポリヌクレオチドから変異を検出する方法は、特に限定されず、変異（塩基の置換、欠失及び挿入）を検出するための公知の方法を用いることができる。また、用いる方法は、一種類のみでもよいし、複数種類の方法を組み合わせて用いてもよい。
　以下、変異を検出する方法として代表的なものを挙げるが、本実施形態はこれに限定されない。
　（１）市販のシーケンサー等を利用し、各ポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
　（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism：一本鎖高次構造多型）法を用いて変異の有無を検出する方法。
　（３）変異箇所の配列（変異前の配列又は変異後の配列）を特異的に認識する制限酵素による処理後に、切断の有無により判定する方法（ＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法）。制限酵素は、例えば、四塩基認識酵素又は六塩基認識酵素等を用いることができ、好ましくは四塩基認識酵素を用いることができる。具体例としては、これらに限定するものではないが、例えば、第一の変異を含む抵抗性品種の配列を認識する制限酵素としてＢｆａＩ、第一の変異の箇所における罹病性品種の配列を認識する制限酵素としてＢｃｉＴ１３０、第二の変異を含む抵抗性品種の配列を認識する制限酵素としてＢｓｅＲＩ及びＢｓｍＡＩ等を利用することができる。その他、意図的に設計したミスマッチプライマーによって制限酵素認識部位を作成するｄＣＡＰＳ（derived CAPS）を用いてもよい。
　（４）欠失の有無を確認する方法としては、増幅した各ポリヌクレオチドのサイズを調べてもよい。ポリヌクレオチドのサイズを調べる方法としては、公知の方法を用いればよく、特に限定されないが、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動等の電気泳動法を用いることができる。
　（５）変異部分に特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、ハイブリダイズさせることで変異や欠失の有無を確認する方法。解析手法は、特に限定はされないが、例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ法を用いたＰＣＲやＴＯＦ－ＭＳを利用した測定技術であるＳｅｑｕｅｎｏｍ社のＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）解析等を用いることができる。プローブとしては、例えば、配列番号１に示す塩基配列における第一の変異を含む、又は、配列番号２に示す塩基配列における第二の変異を含む、１０塩基長以上、好ましくは１６～５００塩基長、より好ましくは２０～２００塩基長、特に好ましくは２０～５０塩基長の連続した塩基配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いることができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。
　（６）ＨＲＭ（High Resolution Melting：高感度融解温度曲線解析）法により変異を検出する方法。
　（７）変異箇所の配列（変異前の配列又は変異後の配列）を一部に含ませてプライマー配列を設計し、ＰＣＲ法等によって増幅させることにより、抵抗性品種ではポリヌクレオチドの増幅が起きるが、罹病性品種ではポリヌクレオチドの増幅が起きない、又は、抵抗性品種ではポリヌクレオチドの増幅が起きないが、罹病性品種ではポリヌクレオチドの増幅が起きるようにして、増幅の有無によって変異の有無を検出する方法（アリル特異的ＰＣＲ法）。
　これらの手法は、何れも、ヘテロ接合型の遺伝子型についても検出することができる。言い換えれば、上記手法を用いることにより、第一の変異及び第二の変異を共優性マーカーとして利用することができる。共優性マーカーとは、目的とする遺伝子座について、ヘテロ接合も特定できるＤＮＡマーカーのことを指す。
　また、上述したように、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性は劣性二因子であるため、ゲノムＤＮＡが第一の変異及び第二の変異をホモ接合型で有しているときに、タバコがErysiphe cichoracearumに対する抵抗性を有していると判定することにより、表現型と一致した判定を行うことができる。
　なお、第一の変異の検出は、上述したように、罹病性品種（配列番号３）における第３０２３位及び第３０２４位、抵抗性品種（配列番号１）における第３０９７位及び第３０９８位の塩基配列を検出してもよいが、その相補配列を検出することによって検出してもよい。すなわち、上記検出工程において、第一のポリヌクレオチドの代わりにその相補配列からなるポリヌクレオチドを増幅し、当該増幅したポリヌクレオチドを用いて第一の変異を検出するようにしてもよい。その場合に、プローブを用いて変異を検出するときは、そのプローブも上記相補配列にハイブリダイズするものとなる。
　同様に、第二の変異の検出は、上述したように、罹病性品種（配列番号４）における第２９８１位及び第２９８２位、抵抗性品種（配列番号２）における第２９８２位から第２９８３位までの塩基配列を検出してもよいが、その相補配列を検出することによって検出してもよい。すなわち、上記検出工程において、第二のポリヌクレオチドの代わりにその相補配列からなるポリヌクレオチドを増幅し、当該増幅したポリヌクレオチドを用いて第二の変異を検出するようにしてもよい。その場合に、プローブを用いて変異を検出するときは、そのプローブも上記相補配列にハイブリダイズするものとなる。
　（アリル特異的ＰＣＲ法）
　上述した（７）アリル特異的ＰＣＲ法により第一の変異及び第二の変異を検出する場合、各変異がホモ接合型であるかヘテロ接合型であるかを判定するためには、各変異の変異後の配列を含むポリヌクレオチド（ポジティブマーカー）を増幅するプライマーセット、及び各変異の変異前の配列を含むポリヌクレオチド（ネガティブマーカー）を増幅するプライマーセットを用いたＰＣＲをそれぞれ行う必要がある。
　詳細には、第一の変異の変異後の配列を含むポリヌクレオチド（第一のポリヌクレオチド）を増幅するためのプライマーセット（第一のプライマーセット）、第二の変異の変異後の配列を含むポリヌクレオチド（第二のポリヌクレオチド）を増幅するためのプライマーセット（第二のプライマーセット）、第一の変異の変異前の配列を含むポリヌクレオチド（第三のポリヌクレオチド）を増幅するためのプライマーセット（第三のプライマーセット）、第二の変異の変異前の配列を含むポリヌクレオチド（第四のポリヌクレオチド）を増幅するためのプライマーセット（第四のプライマーセット）をそれぞれ用いて、ＰＣＲを行う。
　第一のプライマーセットは、第一の変異の変異後の配列またはその相補配列を含むように設計した第一のプライマーを含み、第二のプライマーセットは、第二の変異の変異後の配列またはその相補配列を含むように設計した第二のプライマーを含み、第三のプライマーセットは、第一の変異の変異前の配列またはその相補配列を含むように設計した第三のプライマーを含み、第四のプライマーセットは、第二の変異の変異前の配列またはその相補配列を含むように設計した第四のプライマーを含む。
　特に、これらのプライマーが含む第一の変異若しくは第二の変異の変異前若しくは変異後の配列又はその相補配列は、当該プライマーの３’末端側に存在していることが好ましい。これにより、目的のポリヌクレオチドをより特異的に増幅することができるプライマーセットを提供することができる。
　そして、第一のポリヌクレオチドが増幅されず、第三のポリヌクレオチドが増幅されたときには、第一の変異は存在せず、第一のポリヌクレオチドが増幅され、第三のポリヌクレオチドが増幅されなかったときには、第一の変異はホモ接合型であり、第一のポリヌクレオチド及び第三のポリヌクレオチドが増幅されたときには、第一の変異はヘテロ接合型であると判定することができる。また、第二のポリヌクレオチドが増幅されず、第四のポリヌクレオチドが増幅されたときには、第二の変異は存在せず、第二のポリヌクレオチドが増幅され、第四のポリヌクレオチドが増幅されなかったときには、第二の変異はホモ接合型であり、第二のポリヌクレオチド及び第四のポリヌクレオチドが増幅されたときには、第二の変異はヘテロ接合型であると判定することができる。このように、ＰＣＲの増幅産物を共優性マーカーとして利用することができる。
　（本実施形態の効果）
　病原菌Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性に関する遺伝子は劣性であり、第一の遺伝子と第二の遺伝子との２つの遺伝子が存在するので、２つの劣性形質を持つ（劣性二因子）個体のみが抵抗性を示し、第一の遺伝子と第二の遺伝子との何れかのみ変異を持つ個体では、病原菌Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性の表現型は示さない。ゆえに、例えば、抵抗性系統と罹病性系統のＦ１交雑の自殖後代（Ｆ２）の集団からは１６分の１の割合でしか抵抗性の個体は出現しないため、全ての植物を育成して抵抗性の検定を行い、従来技術のように表現型に基づいて選抜するには多くの労力が必要となる上に、選抜の効率が極めて低い。
　これに対し、本実施形態に係る判定方法を用いれば、表現型に基づいて抵抗性を判定する場合に比べて簡便にErysiphe cichoracearumに対して抵抗性であるか罹病性であるかを判定することができる。さらに、共優性マーカーでは、ヘテロ接合型の遺伝子型についても識別することができるため、後述する戻し交雑育種において、検定交雑が不要となる。
　このような点において、従来技術に係る表現型選抜に比べ、本実施形態に係るＤＮＡマーカーによる早期判定法は効率的で有効である。
　また、一般に、目的とする有用遺伝子の極近傍に農業形質に悪影響を示す遺伝子が存在し、交雑による組換えでは容易に断ち切ることが出来なくなる、いわゆるリンケージドラッグ（連鎖のひきずり）が生じ、目的形質だけを持つ優良個体の選抜が極めて困難になることがある。この問題はＤＮＡマーカーを利用することで解決することが可能である。例えば、イネでは、イネいもち病に対する圃場抵抗性遺伝子Ｐｉ　２１を陸稲品種から水稲品種に導入する試みが８０年近く行われたが、抵抗性遺伝子を導入すると食味を低下するために抵抗性と良食味を合わせ持つ品種の育成には至らなかった。近年、抵抗性遺伝子の近傍に食味に関わる遺伝子が存在してリンケージドラッグが生じることが明らかになった。そこで抵抗性遺伝子の極近傍にＤＮＡマーカーを配置し、選抜に用いることにより連鎖の切れた組換え個体を獲得し、抵抗性で良食味の系統を育成している（Saka et al. (2009)、ゲノム情報を利用したイネいもち病圃場抵抗性遺伝子座Ｐｉ２１　近傍の不良形質の除去、育種学研究１１（別２）ｐ１３３）。仮に本発明で見出した変異を持つ遺伝子の近傍にリンケージドラッグが存在した場合、遺伝子の近傍にＤＮＡマーカーを配置し交雑と選抜とを実施することで、前述のイネの場合と同様にリンケージドラッグを排除することが可能になり、優良なタバコ品種が育成できると考えられる。
　また、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性だけでなく、他の病害虫抵抗性、例えば、タバコ根こぶ線虫病（Yi et al. (1998) Mapping the Root-Knot Nematode ResistanceGene (Rk) in Tobacco with RAPD Markers. Plant Dis. 82:1319-1322）、タバコ疫病（Johnson et al. (2002) Marker-assisted selection for resistance to black shank disease in tobacco. Plant Dis. 86:1303-1309）、タバコ野火病（Yi et al. (1998) Identification of RAPD markers linked to the wildfire resistance gene of tobacco using bulked segregant analysis. Tobacco Science 42:52-57）、タバコ黒根病（Kenward et al. (1999) Isolation and characterization of Tnd - 1, a retrotransposon marker linked to black root rot resistance in tobacco. Theor Appl Genet 98: 387）、タバコ黄斑えそ病（Noguchi et al. (1999) Deletion of a large genomic segment in tobacco varieties that are resistant to potato virus Y (PVY). MGG 262:822-829）、タバコモザイク病（Dinesh-Kumar et al. (2000) Structure-function analysis of the tobacco mosaic virus resistance gene N.　PNAS 97:14789-14794）などの他の病害虫の抵抗性検定についても、各抵抗性を判定するためのＤＮＡマーカーを用いて、本実施形態に係る判定方法における検出工程と同時に実施することにより、育種における選抜効率は飛躍的に向上することができる。
　（第二実施形態）
　また、他の実施形態（第二実施形態）において、抵抗性品種（たとえば「国分」）と罹病性品種との間の、抵抗性をもたらすと考えられる第一の変異及び第二の変異以外の変異を抵抗性判定に利用してもよい。図７～１７に示すように、抵抗性品種と罹病性品種との間には、第一の変異及び第二の変異以外にも変異が存在する。これらを検出することによっても、第一の遺伝子及び第二の遺伝子が、「国分」由来であるか否かを判定することができるため、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性を判定することができる。
　すなわち、本発明の第二実施形態に係る判定方法は、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、タバコのゲノムＤＮＡにおいて、（ｉ）配列番号３に示す塩基配列からなる第一の遺伝子の下記（１）～（２０）に示す一つ以上の変異が生じており：
　（１）第４４４位の塩基がＣに置換；
　（２）第１０４９位と第１０５０位との間にＴＡＣＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ（配列番号１９）が挿入；
　（３）第２２６５位から第２２６８位までの塩基が欠失；
　（４）第３０２３位から第３０２４位までの塩基配列がＴＡに置換；
　（５）第３４３０位から第３４３１位までの塩基が欠失；
　（６）第３５４７位の塩基が欠失；
　（７）第３５６２位の塩基がＴに置換；
　（８）第３５９８位と第３５９９位との間にＴＡが挿入；
　（９）第３６４１位と第３６４２位との間にＡが挿入；
　（１０）第３６９１位の塩基がＡに置換；
　（１１）第３６９５位の塩基がＴに置換；
　（１２）第３６９８位の塩基がＣに置換；
　（１３）第３７０７位の塩基がＣに置換；
　（１４）第３７７０位から第３７８４位までの塩基が欠失；
　（１５）第３７９０位の塩基がＣに置換；
　（１６）第３７９８位の塩基がＧに置換；
　（１７）第３８０７位から第３８１０位までの塩基が欠失；
　（１８）第３８４９位と第３８５０位との間にＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡ（配列番号２０）が挿入；
　（１９）第３８６４位の塩基がＧに置換；
　（２０）第４０９０位の塩基がＡに置換；
　（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなる第二の遺伝子の下記（２１）～（３３）に示す一つ以上の変異が生じていること：
　（２１）第９１６位の塩基がＡに置換；
　（２２）第１００６位の塩基がＣに置換；
　（２３）第１０４６位の塩基がＧに置換；
　（２４）第１０８１位の塩基がＡに置換；
　（２５）第１１１５位と第１１１６位との間にＡが挿入；
　（２６）第１１１６位と第１１１７位との間にＡが挿入；
　（２７）第１６６８位の塩基がＴに置換；
　（２８）第２１８９位の塩基がＡに置換；
　（２９）第２９８１位及び第２９８２位の塩基が欠失；
　（３０）第３６４８位の塩基がＣに置換；
　（３１）第３７０２位の塩基がＧに置換；
　（３２）第３８９４位の塩基がＧに置換；
　（３３）第３８９５位から第３８９６位の塩基が欠失；
　を抵抗性の指標とするものであり得る。
　なお、各変異の検出する検出工程については、第一実施形態と同様に行うことができる。
　（第三実施形態）
　また、さらに他の実施形態（第三実施形態）において、タバコにおける第一の遺伝子及び第二の遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）に基づいて、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性を判定してもよい。図３～６に示すように、抵抗性品種における第一の遺伝子及び第二の遺伝子の転写産物は、罹病性品種における第一の遺伝子及び第二の遺伝子の転写産物のスプライシングバリアントである。ゆえに、タバコにおける第一の遺伝子及び第二の遺伝子の転写産物が、罹病性品種における第一の遺伝子及び第二の遺伝子の転写産物であるときにはErysiphe cichoracearumに対して罹病性であり、そのスプライシングバリアントである場合にはErysiphe cichoracearumに対して抵抗性であると判定することができる。
　すなわち、本発明の第三実施形態に係る判定方法は、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、タバコにおいて、配列番号５に示す塩基配列（ただし、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）からなる第一のｍＲＮＡ、及び配列番号９に示す塩基配列（ただし、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）からなる第二のｍＲＮＡが検出されないことを抵抗性の指標とするものである。さらに、タバコにおいて、第一のｍＲＮＡのスプライシングバリアント、及び第二のｍＲＮＡのスプライシングバリアントを検出したことを抵抗性の指標としてもよい。
　なお、タバコにおいて、配列番号５に示す塩基配列（ただし、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）からなる第一のｍＲＮＡ、及び配列番号９に示す塩基配列（ただし、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）からなる第二のｍＲＮＡの検出、並びに、第一のｍＲＮＡのスプライシングバリアント、及び第二のｍＲＮＡのスプライシングバリアントの検出は、これに限定するものではないが、タバコから抽出した抽出物に含まれる転写産物を逆転写し、特異的プライマーで増幅した第一のｍＲＮＡ及び第二のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ断片の長さの比較又は塩基配列を解読することによって行うことができる。
　〔２．育種方法〕
　本発明はまた、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコの育種方法を提供する。すなわち、本発明の一実施形態に係る育種方法は、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコの育種方法であって、本発明に係る判定方法を用いて、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコを選抜する選抜工程を包含するものである。
　従来、タバコ在来種「国分」由来のErysiphe cichoracearumに対する抵抗性を、戻し交雑育種法を用いて付与し品種を育成する場合、「国分」のErysiphe cichoracearumに対する抵抗性は、上述したように劣性二因子に支配されていることから、戻し交雑世代のErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の因子は、ヘテロ型となり表現型として現れない。ゆえに、以下のように、非常に煩雑な工程が必要となる。
　すなわち、各世代において、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性を判別するために、「国分」と罹病性品種との交雑後代（ＢＣ１世代）に対して、罹病性品種を交雑（戻し交雑系統）するとともに、「国分」を交雑(検定交雑系統)して、この検定交雑系統について、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性を表現型に基づいて検定し、その結果得られた抵抗性と罹病性との分離割合から、戻し交雑系統のうちからErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の分離系統（抵抗性個体１に対して罹病性個体３の分離割合になった系統）を判別し、この系統について交雑を繰り返して、世代をすすめる。最終固定系統は、戻し交雑系統を自殖し、これに対して、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性を表現型に基づいて検定し、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性が固定された品種（自殖１世代目に抵抗性個体１に対して罹病性個体１５の分離割合で抵抗性個体を自殖）を得る。
　また、交雑育種法を用いてErysiphe cichoracearumに対して抵抗性の品種を育成する場合は、「国分」と、罹病性品種との交雑後代（Ｆ２）の集団について、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性を表現型に基づいて検定し、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性が固定された品種（抵抗性個体１に対して罹病性個体１５の分離割合で抵抗性個体を自殖）を得る。
　一方、二倍体植物では、戻し交雑世代のErysiphe cichoracearumに対する抵抗性因子はホモ接合型となり表現型として現れることから、検定交雑系統の作成は不要である。
　また、上述したように、従来技術に係るタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法では、各苗に現れる病徴が、接種するErysiphe cichoracearumの濃度や接種しようとする苗のステージ、苗を育てる温室内の温湿度等の環境に左右されて、うどんこ病発病の症状に差がでることや、Erysiphe cichoracearumの接種漏れ等により、抵抗性の判定を誤るおそれがある。また、Erysiphe cichoracearumは絶対寄生菌であり、植物体の生きた組織からの養分の供給が増殖に必須であるため、人工培養が不可能な菌である。そのため、上記判定方法において接種のために用いるErysiphe cichoracearumの維持には時間と労力を要する。
　これに対し、上記育種方法によれば、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性を、表現型に基づいて検定する代わりに、本発明に係る判定方法に基づいて検定することができる。本発明に係る判定方法は、上述したように、非常に早期に容易にErysiphe cichoracearumに対する抵抗性を判定することができる上、ヘテロ接合型の遺伝子型を検出することができるため、戻し交雑育種における検定交雑は不要となる。よって、本発明に係る育種方法によれば、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコを容易に育種することができる。
　また、上述したように、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコを選抜する際、他の病害虫抵抗性についての判定を同時に実施することにより、育種における選抜効率を飛躍的に向上することができる。また、上記変異をＤＮＡマーカーとして利用することで、「国分」由来のリンケージドラッグが存在する場合に、これを排除することが容易になる。
　〔３．ＤＮＡマーカー〕
　本発明はまた、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーを提供する。本発明の一実施形態に係るＤＮＡマーカーは、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーであって、タバコのゲノムＤＮＡにおける、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第一のポリヌクレオチドと、タバコのゲノムＤＮＡにおける、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第二のポリヌクレオチドと、を含んでいる。本実施形態に係るＤＮＡマーカーは、第一実施形態に係る判定方法において用いることができる。
　また、上記ＤＮＡマーカーは、タバコのゲノムＤＮＡにおける、配列番号１に示す第一の遺伝子の、上記第二実施形態に記載の（１）～（２０）に示す一つ以上の変異箇所を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドと、タバコのゲノムＤＮＡにおける、配列番号２に示す第二の遺伝子の、上記第二実施形態に記載の（２１）～（３３）に示す一つ以上の変異箇所を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドと、を含んでいるものであってもよい。このようなＤＮＡマーカーは、上記第二実施形態に係る判定方法において用いることができる。
　〔４．判定キット〕
　本発明はまた、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定キットを提供する。
　本発明の一実施形態に係る判定キットは、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定キットであって、タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第一のポリヌクレオチドを増幅するための第一のプライマーセットと、タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第二のポリヌクレオチドを増幅するための第二のプライマーセットと、を備えている。第一のプライマーセット及び第二のプライマーセットは、上記第一実施形態に係る判定方法において用いることができる。
　特に、上記判定キットを、上述したアリル特異的ＰＣＲ法を利用した判定方法において用いる場合、第一のプライマーセット及び第二のプライマーセットに加えて、タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号３に示す第一の遺伝子の第３０２３位及び第３０２４位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第三のポリヌクレオチドを増幅するための第三のプライマーセットと、タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号４に示す第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第四のポリヌクレオチドを増幅するための第四のプライマーセットをさらに備え、第一のプライマーセットは、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基配列又はその相補配列を含む第一のプライマーを備え、第二のプライマーセットは、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基配列又はその相補配列を含む第二のプライマーを備え、第三のプライマーセットは、配列番号３に示す第一の遺伝子の第３０２３位及び第３０２４位に対応する塩基配列又はその相補配列を含む第三のプライマーを備え、第四のプライマーセットは、配列番号４に示す第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基配列又はその相補配列を含む第四のプライマーを備えていることが好ましい。
　これにより、第一の変異の変異後の配列を含むポリヌクレオチド（第一のポリヌクレオチド）を増幅するためのプライマーセット（第一のプライマーセット）、第二の変異の変異後の配列を含むポリヌクレオチド（第二のポリヌクレオチド）を増幅するためのプライマーセット（第二のプライマーセット）、第一の変異の変異前の配列を含むポリヌクレオチド（第三のポリヌクレオチド）を増幅するためのプライマーセット（第三のプライマーセット）、及び、第二の変異の変異前の配列を含むポリヌクレオチド（第四のポリヌクレオチド）を増幅するためのプライマーセット（第四のプライマーセット）を提供することができるため、上述したアリル特異的ＰＣＲ法を容易に実施することができる。
　なお、（ｉ）第一のプライマーにおける、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基配列又はその相補配列の位置、（ｉｉ）第二のプライマーにおける、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基配列又はその相補配列の位置、（ｉｉｉ）第三のプライマーにおける、配列番号３に示す第一の遺伝子の第３０２３位及び第３０２４位に対応する塩基配列又はその相補配列の位置、及び（ｉｖ）第四のプライマーにおける、配列番号４に示す第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基配列又はその相補配列の位置は、各プライマーの３’末端側に存在していることが好ましい。これにより、目的のポリヌクレオチドをより特異的に増幅することができるプライマーセットを提供することができる。
　また、特に限定されないが、各プライマーセットが備えるプライマーのＧＣ含量は、例えば、５０％～７０％の範囲とするのが好ましく、５０％～６５％の範囲とすることがより好ましい。プライマーのＴｍ値も特に限定されないが、例えば、５０℃～６５℃とすることが好ましく、５０℃～６０℃とすることがより好ましい。
　また、一変形例において、上記判定キットは、タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号１に示す第一の遺伝子の、上記第二実施形態に記載の（１）～（２０）に示す一つ以上の変異箇所を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーセットと、タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号２に示す第二の遺伝子の、上記第二実施形態に記載の（２１）～（３３）に示す一つ以上の変異箇所を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーセットと、を備えているものであってもよい。上記プライマーセットは、上記第二実施形態に係る判定方法において用いることができる。
　また、本発明の他の実施形態に係る判定キットは、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定キットであって、配列番号１に示す塩基配列における第３０９７位及び第３０９８位の塩基を含む１０塩基以上の連続した塩基配列若しくはその相補配列にハイブリダイズする第一のプローブと、配列番号２に示す塩基配列における第２９８２位及び第２９８３位の塩基を含む１０塩基以上の連続した塩基配列若しくはその相補配列にハイブリダイズする第二のプローブと、を備えている。第一のプローブ及び第二のプローブは、上記第一実施形態に係る判定方法において用いることができる。
　なお、一変形例において、上記判定キットは、配列番号１に示す第一の遺伝子の、上記第二実施形態に記載の（１）～（２０）に示す一つ以上の変異箇所を含む１０塩基以上の連続した塩基配列又はその相補配列にハイブリダイズするプローブと、配列番号２に示す第二の遺伝子の、上記第二実施形態に記載の（２１）～（３３）に示す一つ以上の変異箇所を含む１０塩基以上の連続した塩基配列又はその相補配列にハイブリダイズするプローブと、を備えているものであってもよい。上記プローブは、上記第二実施形態に係る判定方法において用いることができる。
　また、本発明に係る判定キットは、上述したプライマーセット及びプローブを両方とも備えていてもよいし、その他、溶媒、分散媒、試薬、それらを使用するための指示書などを備えていてもよい。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、物質Ａ及び物質Ｂを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙又はその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスク又はテープ、ＣＤ－ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液又はその他の試薬を内包した容器を備え得る。
　〔５．抵抗性母本の作出方法〕
　本発明はまた、病原菌Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性母本を作出する方法を提供する。本発明の一実施形態に係る抵抗性母本の作出方法は、第一の遺伝子及び第二の遺伝子の両方が変異した変異体を作製することにより、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性母本を作出するものである。
　上記変異体における変異箇所は、上述した第一の変異及び第二の変異に限定されない。第一の遺伝子及び第二の遺伝子の領域内であれば、第一の変異及び第二の変異以外の変異、例えば、アミノ酸変異、ナンセンス変異やスプライシングバリアント等を生じさせるエクソン又はイントロンにおける塩基の置換や欠失等の変異が、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性をもたらすことは、容易に推定される（例えば、特許文献１におけるオオムギに感染する病原菌Blumeria graminisに対する抵抗性母本の作出についての記載を参照）。
　変異は、例えば、エチルメタンスルホネート、ニトロソメチル尿素やアジ化ナトリウム等の化学物質処理や、Ｘ線、γ線や重イオンビーム等の放射線照射処理により導入することができる。
　また、タバコ罹病性品種において第一の遺伝子又は第二の遺伝子にそれぞれの自然突然変異が生じていた場合、その変異を特定し、変異同士を集積することも可能である。
　また、ＲＮＡｉ等の手法により、第一の遺伝子及び第二の遺伝子の両方を発現抑制することにより、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性を示す遺伝子組換えタバコを作製することも可能である。
　〔６．第一の遺伝子及び第二の遺伝子〕
　第一の遺伝子及び第二の遺伝子に関し、配列番号１～１１に示すポリヌクレオチドも本発明の範疇である。配列番号１～４に示すポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドを増幅し、上述した変異を検出することにより、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定に用いることができる。また、配列番号１～４に示すポリヌクレオチドは、本発明に係る判定キットが備えるプライマー又はプローブとして用いるオリゴヌクレオチドの設計及び製造のために用いることができる。また、配列番号５～１１に示すポリヌクレオチドは、本発明に係る判定方法において、タバコから単離又は増幅することにより、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定に用いることができる。
　なお、第一の遺伝子及び第二の遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて相同性検索を行い、相同性が高い遺伝子として、ペチュニアのＨＱ８８０６０７（９２％）、バレイショのＨＱ８８０６１０（９１％）、ナスのＨＱ８８０６０８（９１％）、トマトのＡＫ３２２４４３（８８％）及びピーマンのＪＮ８９６６２９．１（８８％）を見出している。このうち、８８％の相同性を示したトマトについて、この遺伝子の変異がトマトの病原菌Oidium neolycopersiciに対して抵抗性をもたらすことが報告されている（非特許文献２）。しかし、上述したように、Erysiphe cichoracearumはタバコ特有の病原菌である。ゆえに、非特許文献２は、本発明をなんら示唆するものではない。
　（まとめ）
　以上のように、本発明の一実施形態に係る判定方法は、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、該タバコのゲノムＤＮＡにおいて、（ｉ）配列番号３に示す塩基配列からなる第一の遺伝子の第３０２３位及び第３０２４位に対応する塩基に第一の変異が生じており、（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなる第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基に第二の変異が生じていることを該抵抗性の指標とすることを特徴としている。
　上記判定方法では、第一の変異は、第一の遺伝子の第３０２３位から第３０２４位までに対応する塩基配列のＴＡへの置換であり、第二の変異は、第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基の欠失であってもよい。
　上記判定方法では、上記ゲノムＤＮＡが第一の変異及び第二の変異をホモ接合型で有しているときに、上記タバコが上記抵抗性を有していると判定してもよい。
　上記判定方法では、上記ゲノムＤＮＡから、第一の変異を含む連続した塩基配列又はその相補配列からなる第一のポリヌクレオチドを増幅し、増幅した第一のポリヌクレオチドを用いて第一の変異を検出する第一の検出工程と、上記ゲノムＤＮＡから、第二の変異を含む連続した塩基配列又はその相補配列からなる第二のポリヌクレオチドを増幅し、増幅した第二のポリヌクレオチドを用いて第二の変異を検出する第二の検出工程と、を包含してもよい。
　上記判定方法では、第一のポリヌクレオチドの長さは、２０塩基以上５０００塩基以下であり、第二のポリヌクレオチドの長さは、２０塩基以上５０００塩基以下であることが好ましい。
　また、本発明の他の実施形態に係る判定方法は、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、該タバコのゲノムＤＮＡにおいて、（ｉ）配列番号３に示す塩基配列からなる第一の遺伝子の下記（１）～（２０）に示す一つ以上の変異が生じており：（１）第４４４位の塩基がＣに置換；（２）第１０４９位と第１０５０位との間に配列番号１９に示す塩基配列が挿入；（３）第２２６５位から第２２６８位までの塩基が欠失；（４）第３０２３位から第３０２４位までの塩基配列がＴＡに置換；（５）第３４３０位から第３４３１位までの塩基が欠失；（６）第３５４７位の塩基が欠失；（７）第３５６２位の塩基がＴに置換；（８）第３５９８位と第３５９９位との間にＴＡが挿入；（９）第３６４１位と第３６４２位との間にＡが挿入；（１０）第３６９１位の塩基がＡに置換；（１１）第３６９５位の塩基がＴに置換；（１２）第３６９８位の塩基がＣに置換；（１３）第３７０７位の塩基がＣに置換；（１４）第３７７０位から第３７８４位までの塩基が欠失；（１５）第３７９０位の塩基がＣに置換；（１６）第３７９８位の塩基がＧに置換；（１７）第３８０７位から第３８１０位までの塩基が欠失；（１８）第３８４９位と第３８５０位との間に配列番号２０に示す塩基配列が挿入；（１９）第３８６４位の塩基がＧに置換；（２０）第４０９０位の塩基がＡに置換；（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなる第二の遺伝子の下記（２１）～（３３）に示す一つ以上の変異が生じていること：（２１）第９１６位の塩基がＡに置換；（２２）第１００６位の塩基がＣに置換；（２３）第１０４６位の塩基がＧに置換；（２４）第１０８１位の塩基がＡに置換；（２５）第１１１５位と第１１１６位との間にＡが挿入；（２６）第１１１６位と第１１１７位との間にＡが挿入；（２７）第１６６８位の塩基がＴに置換；（２８）第２１８９位の塩基がＡに置換；（２９）第２９８１位及び第２９８２位の塩基が欠失；（３０）第３６４８位の塩基がＣに置換；（３１）第３７０２位の塩基がＧに置換；（３２）第３８９４位の塩基がＧに置換；（３３）第３８９５位から第３８９６位の塩基が欠失；を該抵抗性の指標とすることを特徴としている。
　本発明のさらに他の実施形態に係る判定方法は、タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、該タバコにおいて、配列番号５に示す塩基配列（ただし、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）からなる第一のｍＲＮＡ、及び配列番号９に示す塩基配列（ただし、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）からなる第二のｍＲＮＡが検出されないことを該抵抗性の指標とすることを特徴としている。
　上記判定方法では、さらに、上記タバコにおいて、第一のｍＲＮＡのスプライシングバリアント、及び第二のｍＲＮＡのスプライシングバリアントを検出したことを上記抵抗性の指標とするものであってもよい。
　本発明の一実施形態に係る育種方法は、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコの育種方法であって、本発明の判定方法を用いて、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコを選抜する選抜工程を包含することを特徴としている。
　本発明の一実施形態に係るタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーは、タバコのゲノムＤＮＡにおける、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第一のポリヌクレオチドと、タバコのゲノムＤＮＡにおける、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第二のポリヌクレオチドと、を含んでいることを特徴としている。
　本発明の一実施形態に係るタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定キットは、タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第一のポリヌクレオチドを増幅するための第一のプライマーセットと、タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第二のポリヌクレオチドを増幅するための第二のプライマーセットと、を備えていることを特徴としている。
　本発明の一実施形態に係るタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定キットは、配列番号１に示す塩基配列における第３０９７位及び第３０９８位の塩基を含む１０塩基以上の連続した塩基配列若しくはその相補配列にハイブリダイズする第一のプローブと、配列番号２に示す塩基配列における第２９８２位及び第２９８３位の塩基を含む１０塩基以上の連続した塩基配列若しくはその相補配列にハイブリダイズする第二のプローブと、を備えていることを特徴としている。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は当該実施例によって限定されない。
　〔１．抵抗性品種と罹病性品種との配列比較〕
　抵抗性品種「つくば１号」及び罹病性品種「Ｐｅｔｉｔ　Ｈａｖａｎａ　ＳＲ１」（日本たばこ葉たばこ研究所所蔵、以下「ＳＲ１」と略す）のそれぞれの葉からＲＮＡ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡを調整し、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ―ｃＤＮＡ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ライフテクノロジー社）を用いて逆転写した。抵抗性品種「つくば１号」（日本たばこ葉たばこ研究所所蔵）のＢＡＣライブラリより本発明者らが独自に単離した第一の遺伝子（未発表）、及び第一の遺伝子に対応する第二の遺伝子（未発表）に対応するｃＤＮＡを、「つくば１号」及び「ＳＲ１」のそれぞれの葉から調製したＲＮＡの逆転写産物を鋳型とし、フォワードプライマー（５’－ＡＡＴＴＴＧＧＧＴＡＧＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＡＣＧＧ－３’配列番号１７）とリバースプライマー（５’－ＧＣＴＧＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＧ－３’：配列番号１８）を用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）により製造者の指示に従ってＰＣＲを行なうことで得た。得られたｃＤＮＡをＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてサブクローニングし、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
　Ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジー社）及びＤＮＡアナライザー３７３０ｘｌ（ライフテクノロジー社）を用いてそれぞれの塩基配列を決定したところ、図３～４に示すように、「つくば１号」の葉から調製した第一の遺伝子のｃＤＮＡ（図中、抵抗性１～３と示す：配列番号６～８）は全て、「ＳＲ１」の葉から調製した第一の遺伝子のｃＤＮＡ（図中、罹病製と示す。配列番号５）に対して塩基配列上の同じ位置から欠失又は挿入が生じたスプライシングバリアントであった。また、図５～６に示すように、「つくば１号」の葉から調製した第二の遺伝子のｃＤＮＡ（図中、抵抗性１～２と示す：配列番号１０～１１）は全て、「ＳＲ１」の葉から調製した第二の遺伝子のｃＤＮＡ（図中、罹病性と示す：配列番号９）に対して塩基配列上の同じ位置から欠失が生じたスプライシングバリアントであった。
　そこで、「国分」からErysiphe cichoracearumに対する抵抗性が導入された複数の抵抗性品種（「ＫｕｔｓａｇａＥ１」（１９６８年ローデシアのたばこ試験場より入手、日本たばこ葉たばこ研究所所蔵）、「つくば１号」）と、複数の罹病性品種（「Ｋ３２６」（日本たばこ葉たばこ研究所所蔵）、「Ｃｏｋｅｒ３１９」（日本たばこ葉たばこ研究所所蔵）、「Ｈｉｃｋｓ　Ｂｒｏａｄ　Ｌｅａｆ」（日本たばこ葉たばこ研究所所蔵））の葉からＧｅｎｔｒａ　Ｐｕｒｅｇｅｎｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、製造者の指示に従いゲノムＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（５’－ＡＡＴＴＴＧＧＧＴＡＧＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＡＣＧＧ－３’：配列番号１７）及びリバースプライマー（５’－ＧＣＴＧＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＧ－３’：配列番号１８）を用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより製造者の指示に従ってＰＣＲを行ない、第一の遺伝子及び第二の遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてサブクローニングし、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ及びＤＮＡアナライザー３７３０ｘｌを用いてそれぞれの塩基配列を決定して、第一の遺伝子及び第二の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較した。その結果、罹病性品種の第一の遺伝子における第７イントロン３’末端のスプライシング認識部位の塩基が「ＡＧ」であるのに対し、抵抗性品種の第一の遺伝子における対応する位置の塩基は「ＴＡ」であった。また、罹病性品種の第二の遺伝子における第６イントロン５’末端の５、６番目の塩基が「ＡＧ」であるのに対し、抵抗性品種の第一の遺伝子における対応する位置の塩基は欠失していた。
　〔２．ＤＮＡマーカーの開発〕
　１．において明らかになった変異箇所を利用してＤＮＡマーカーの開発を行った。
　（ＳＳＣＰ法）
　まず、抵抗性品種「つくば１号」、罹病性品種「Ｃｏｋｅｒ３１９」、及び抵抗性品種と罹病性品種との雑種第一代（Ｆ１）の幼苗からＧｅｎｔｒａ　Ｐｕｒｅｇｅｎｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔを用い、製造者の指示に従いゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの濃度を測定し、濃度を１０ｎｇ／ｕｌに調整した。
　抵抗性品種、罹病性品種及びＦ１から抽出したそれぞれのゲノムＤＮＡに対し、フォワードプライマー（５’－ＴＴＣＡＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣ－３’：配列番号１２）及びリバースプライマー（５’－ＡＣＴＧＣＴＣＴＡＴＴＧＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＧＧ－３’：配列番号１３）を用いてＰＣＲを行い、第一の遺伝子における上記変異箇所を含む連続した領域を増幅した。また、同じく抵抗性品種、罹病性品種及びＦ１から抽出したそれぞれのゲノムＤＮＡに対し、フォワードプライマー（５’－ＣＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＴＴＴＧＣＡＡＧＡＧ－３’：配列番号１４）及びリバースプライマー（５’－ＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣ－３’：配列番号１５）を用いてＰＣＲを行い、第二の遺伝子における上記変異箇所を含む連続した領域を増幅した。なお、フォワードプライマーには、それぞれＰＥＴ及びＦＡＭの蛍光標識を予め付しておいた。ＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、製造者の指示に従って行った。温度条件としては、９５℃で１５分間反応させた後、９４℃で３０秒間、６０℃で９０秒間及び７２℃で６０秒間のサイクルを４０サイクル繰り返し、その後７２℃で１０分間反応させた。
　得られたＰＣＲ産物について、ＤＮＡアナライザー３１３０ｘｌ（ライフテクノロジー社）を用い、製造者の指示及びE.Julio et al., Reducing the content of nornicotine in tobacco via targeted mutation breeding., Mol Breeding 21:369-381に従って、キャピラリー電気泳動によりＳＳＣＰ法により解析した。結果を図１に示す。
　図１に示すように、第一の遺伝子及び第二の遺伝子の両方について、抵抗性品種由来のＰＣＲ産物と罹病性品種由来のＰＣＲ産物との間でピークが異なっており、上記変異を検出し得ることが示された。また、上記変異がヘテロ接合型である場合（Ｆ１）には、２つのピークが検出されるため、共優性のＤＮＡマーカーとして利用可能であることが示された。
　（ＣＡＰＳ法）
　上述したように抵抗性品種及び罹病性品種から抽出したそれぞれのゲノムＤＮＡに対し、フォワードプライマー（５’－ＴＴＣＡＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣ－３’：配列番号１２）及びリバースプライマー（５’－ＴＧＡＣＡＧＴＡＴＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧ－３’：配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、第一の遺伝子における上記変異箇所を含む連続した領域を増幅した。また、同じく抵抗性品種及び罹病性品種から抽出したそれぞれのゲノムＤＮＡに対し、フォワードプライマー（５’－ＣＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＴＴＴＧＣＡＡＧＡＧ－３’：配列番号１４）及びリバースプライマー（５’－ＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣ－３’：配列番号１５）を用いてＰＣＲを行い、第二の遺伝子における上記多型部位を含む連続した領域を増幅した。ＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、製造者の指示に従って行った。温度条件としては、９５℃で１５分間反応させた後、９４℃で３０秒間、６０℃で９０秒間及び７２℃で６０秒間のサイクルを４０サイクル繰り返し、その後７２℃で１０分間反応させた。
　得られたＰＣＲ産物について制限酵素処理を行った。第二の遺伝子における上記多型部位を含む連続した領域を増幅したＰＣＲ産物については、ＢｆａＩ及びＢｃｉＴ１３０Ｉによって制限酵素処理した。ＢｆａＩは、抵抗性品種の上記変異箇所を含む配列を特異的に認識する制限酵素である。ＢｃｉＴ１３０Ｉは、罹病性品種の上記変異箇所を含む配列を特異的に認識する制限酵素である。また、第一の遺伝子における上記多型部位を含む連続した領域を増幅したＰＣＲ産物については、ＢｓｅＲＩにより制限酵素理した。ＢｓｅＲＩは、抵抗性品種の上記変異箇所を含む配列を特異的に認識する制限酵素である。制限酵素条件は、製造者の指示に従った。制限酵素処理後、ＱＩＡＸＥＬ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて電気泳動を行い、制限酵素処理による切断の有無を確認した。結果を図２に示す。
　図２に示すように、第一の遺伝子の変異箇所に関し、ＢｆａＩにより抵抗性品種由来のＰＣＲ産物のみが切断されて２本のバンドとなった。また、ＢｃｉＴ１３０Ｉにより罹病性品種由来のＰＣＲ産物のみが切断されて２本のバンドとなった。また、第二の遺伝子の変異箇所に関し、ＢｓｅＲＩにより抵抗性品種由来のＰＣＲ産物のみが切断されて２本のバンドとなった。このように、制限酵素処理により上記変異を検出し得ることが示された。また、これらの制限酵素は何れも特定のＰＣＲ産物を完全消化していたことから、共優性のＤＮＡマーカーとして利用可能であることが示された。
　〔３．ＤＮＡマーカーによる判定の検証〕
　「Ｃｏｋｅｒ３１９」（罹病性品種）、「つくば１号」（抵抗性品種）、「Ｃｏｋｅｒ３１９」×「つくば１号」のＦ１及びＦ２の集団の計１８６個体について、ＤＮＡマーカーによりErysiphe cichoracearumに対する抵抗性を判定し、従来法による判定結果と比較することにより、ＤＮＡマーカーによる判定を検証した。
　まず、上記１８６個体について、従来法によりErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の表現型を確認した。表現型の確認は、以下のように実施した。まず、播種後約４０日を経過した各個体の苗の葉面にErysiphe cichoracearum菌分生胞子の懸濁液を５×１０４個／ｍｌの濃度で均一に噴霧接種した。接種後の個体を２０℃～２３℃に制御した温室内で栽培し、葉に水がかからないように鉢底から給水した。接種３週間後、葉面を肉眼により調査し、病徴(菌叢)の認められなかった個体を抵抗性、病叢があった場合には罹病性と判定した。
　また、上記１８６個体について、〔２．ＤＮＡマーカー化〕の（ＳＳＣＰ）に記載した方法を実施し、第一の遺伝子及び第二の遺伝子の両方のＰＣＲ産物について、抵抗性品種が示すピークのみが検出される個体（ホモ接合型で、抵抗性を示す遺伝子型を有する個体）を抵抗性と判定した。結果、１８６個体中１２個体を抵抗性と判定した。そして、ＤＮＡマーカーにより抵抗性と判定された個体は、従来法により抵抗性の表現型を有すると判定された個体と一致した。また、χ２検定の結果、分離比は期待値である１：１５に適合していた。
　〔４．抵抗性品種と罹病性品種との配列の詳細な比較〕
　抵抗性品種「国分」及び罹病性品種「Ｋ３２６」の第一の遺伝子及び第二の遺伝子のゲノム遺伝子の塩基配列について遺伝子情報ソフトウェアＡＴＧＣ（株式会社ゼネティックス）を用いて詳細に比較した。図７～１１に示すように、第一の遺伝子については、抵抗性品種及び罹病性品種の間で、１３１塩基の、置換、欠失又は挿入が確認された。また、図１２～１７に示すように、第二の遺伝子については、抵抗性品種及び罹病性品種の間で、１４塩基の、置換、欠失又は挿入が確認された。これらの変異についても、ＤＮＡマーカーとして利用することが可能である。
　〔５．相補性試験〕
　抵抗性品種「国分」由来のErysiphe cichoracearumに対する抵抗性は劣性二因子であるから、抵抗性品種において罹病性品種由来の第一の遺伝子又は第二の遺伝子の何れかを発現させ、Erysiphe cichoracearumに対して罹病性になることを確認することにより、第一の遺伝子及び第二の遺伝子が、Erysiphe cichoracearumに対する抵抗性の原因遺伝子であることを実証した。
　（試験方法）
　３５Ｓプロモーター制御下で罹病性品種由来の第一の遺伝子又は第二の遺伝子を恒常的に発現させるコンストラクトを抵抗性品種「国分」に導入した。詳細には、まず、罹病性品種「ＢＹ４」の葉から抽出したＲＮＡを逆転写した。得られたｃＤＮＡを鋳型としてフォワードプライマー（５’－ＡＡＴＴＴＧＧＧＴＡＧＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＡＣＧＧ－３’：配列番号１７）及びリバースプライマー（５’－ＧＣＴＧＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＧ－３’：配列番号１８）を用いてＰＣＲを行ない、第一の遺伝子及び第二の遺伝子のｃＤＮＡを増幅した。得られた第一の遺伝子のｃＤＮＡ及び第二の遺伝子のｃＤＮＡをそれぞれ植物形質転換用高発現ベクターｐＲＩ ２０１－ＡＮ（タカラバイオ社）のマルチクローニングサイト１（ＭＣＳ１）に挿入した。構築したプラスミドをアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens(Rhizobium radiobacter) LBA4404）に導入し、得られた形質転換アグロバクテリウムを用いて抵抗性品種「国分」を形質転換することにより、第一の遺伝子が導入された形質転換体および第二の遺伝子が導入された形質転換体をそれぞれ得た。
　さらに、第一の遺伝子が導入された形質転換体および第二の遺伝子が導入された形質転換体それぞれの後代（Ｔ１）を作製した。当該後代から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてフォワードプライマー（５’－ＧＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＡ－３’：配列番号２１）及びリバースプライマー（５’－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣ－３’：配列番号２２）を用いたＰＣＲにより導入遺伝子の有無を確認し、導入遺伝子を保持している後代（遺伝子保持個体）、及び、導入遺伝子を保持していない後代（ヌル個体）を判別した。遺伝子保持個体及びヌル個体に対しErysiphe cichoracearum菌分生胞子の懸濁液を噴霧し、２週間後に目視により罹病性であるか抵抗性であるかを確認した。
　（結果）
　図１８及び図１９は、第一の遺伝子を高発現させるコンストラクトが導入された２系統の形質転換体の後代にErysiphe cichoracearum菌を接種した結果を示す図である。図１８は、植物体全体の写真を示すものであり、図１９は、葉の写真を各系統毎に示すものである。図１８及び図１９では、親品種である抵抗性品種「国分」に対して、同様にErysiphe cichoracearum菌を接種したものを対照として示している。図１８及び図１９に示すように、導入遺伝子（第一の遺伝子）を保持している後代（第一の遺伝子保持個体）では病徴が現れたが、導入遺伝子を保持していない後代（ヌル個体）では、親品種である抵抗性品種「国分」と同様に病徴が現れなかった。
　図２０～２３は、第二の遺伝子を高発現させるコンストラクトが導入された６系統の形質転換体の後代にErysiphe cichoracearum菌を接種した結果を示す図である。図２０は、植物体全体の写真を示すものであり、図２１は、葉面の拡大写真を示すものであり、図２２及び図２３は、葉の写真を各系統毎に示すものである。図２０～２３では、親品種である抵抗性品種「国分」に対して、同様にErysiphe cichoracearum菌を接種したものを対照として示している。図２０～２３に示すように、第一の遺伝子の場合と同様に、導入遺伝子（第二の遺伝子）を保持している後代（第二の遺伝子保持個体）では病徴が現れ、導入遺伝子を保持していない後代（ヌル個体）では、親品種である抵抗性品種「国分」と同様に病徴が現れなかった。
　これらの結果から、抵抗性品種において正常な（罹病性品種由来の）第一の遺伝子又は第二の遺伝子のどちらかを発現させることで抵抗性品種が罹病性となることが示される。そして、抵抗性品種「国分」のErysiphe cichoracearum に対する抵抗性は、配列番号３に示す塩基配列からなる第一の遺伝子の第３０２３位から第３０２４位までの塩基配列のＴＡへの置換と、配列番号４に示す塩基配列からなる第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位の塩基の欠失との両方の変異によって、正常な第一の遺伝子及び第二の遺伝子の翻訳産物が合成されないためにもたらされていると言える。
　また、以上の結果から、塩基の置換、欠失、挿入等の変異によって第一の遺伝子及び第二の遺伝子の両方が共に機能喪失した変異体タバコ、並びに、ＲＮＡｉ等の手法によって第一の遺伝子及び第二の遺伝子の両方が発現抑制された遺伝子組換えタバコは、Erysiphe cichoracearum に対する抵抗性を示す蓋然性が高い。換言すれば、タバコにおいて、第一の遺伝子及び第二の遺伝子の両方を同時に機能喪失又は発現抑制させることによって、Erysiphe cichoracearum に対する抵抗性を付与できる蓋然性が高い。
　〔６．アリル特異的ＰＣＲ法〕
　抵抗性品種「つくば１号」、罹病性品種「Ｃｏｋｅｒ３１９」、及び、抵抗性品種「つくば１号」と罹病性品種「Ｃｏｋｅｒ３１９」との雑種第一代（Ｆ１）からゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出した。
　そして、各ゲノムＤＮＡに対し、（ｉ）第一の変異の変異後の配列を含むポリヌクレオチド（第一のポリヌクレオチド）を増幅するためのＰＣＲ、（ｉｉ）第二の変異の変異後の配列を含むポリヌクレオチド（第二のポリヌクレオチド）を増幅するためのＰＣＲ、（ｉｉｉ）第一の変異の変異前の配列を含むポリヌクレオチド（第三のポリヌクレオチド）を増幅するためのＰＣＲ、及び、（ｉｖ）第二の変異の変異前の配列を含むポリヌクレオチド（第四のポリヌクレオチド）を増幅するためのＰＣＲを行った。
　なお、各ＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、製造者の指示に従って行った。温度条件としては、９５℃で１５分間反応させた後、９４℃で３０秒間、６０℃で２０秒間及び７２℃で３０秒間のサイクルを３５サイクル繰り返し、その後７２℃で１０分間反応させた。
　（第一のポリヌクレオチド（第一の変異のポジティブマーカー）を増幅するためのＰＣＲ）
　上記各ゲノムＤＮＡに対し、第一のプライマーセット（フォワードプライマー（５’－ＴＣＡＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣ－３’：配列番号２３）、及び、リバースプライマー（第一のプライマー、５’－ＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＧ－３’：配列番号２４））を用いたＰＣＲを行った。なお、上記リバースプライマー（第一のプライマー）の３’末端側の配列（３’末端から３～４残基目）は、配列番号１に示される塩基配列における第３０９７位のＴ及び第３０９８位のＡの相補配列である。
　（第二のポリヌクレオチド（第二の変異のポジティブマーカー）を増幅するためのＰＣＲ）
　上記各ゲノムＤＮＡに対し、第二のプライマーセット（フォワードプライマー（第二のプライマー、５’－ＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＴＡＧＴＣＴＣ－３’：配列番号２５）、及び、リバースプライマー（５’－ＡＣＣＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣ－３’：配列番号２６））を用いたＰＣＲを行った。なお、上記フォワードプライマー（第二のプライマー）の３’末端側の配列（３’末端から２～３残基目）は、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８３位のＴ及び第２９８２位のＣの配列である。
　（第三のポリヌクレオチド（第一の変異のネガティブマーカー）を増幅するためのＰＣＲ）
　上記各ゲノムＤＮＡに対し、第三のプライマーセット（フォワードプライマー（５’－ＴＣＡＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣ－３’：配列番号２３）、及び、リバースプライマー（第三のプライマー、５’－ＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＡＡＴＧＴＧＣＣＴＧ－３’：配列番号２７））を用いたＰＣＲを行った。なお、上記リバースプライマー（第三のプライマー）の３’末端側の配列（３’末端から２～３残基目）は、配列番号３に示す第一の遺伝子の第３０２３位のＡ及び第３０２４位のＧの相補配列である。
　（第四のポリヌクレオチド（第二の変異のネガティブマーカー）を増幅するためのＰＣＲ）
　上記各ゲノムＤＮＡに対し、第四のプライマーセット（フォワードプライマー（第四のプライマー、５’－ＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＴＡＧＴＣＡＧＴ－３’：配列番号２８）、及び、リバースプライマー（５’－ＡＣＣＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＣ－３’：配列番号２６））を用いたＰＣＲを行った。なお、上記フォワードプライマー（第四のプライマー）の３’末端側の配列（３’末端から２～３残基目）は、配列番号４に示す第２９８２位のＧ及び第二の遺伝子の第２９８１位のＡの配列である。
　続いて、得られた各ＰＣＲ産物についてＱＩＡｘｃｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて電気泳動を行い、増幅の有無を確認した。結果を図２４に示す。
　図２４に示すように、抵抗性品種のゲノムＤＮＡを鋳型としたとき及び雑種第一代のゲノムＤＮＡを鋳型としたときに、第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドが増幅された。また、罹病性品種のゲノムＤＮＡを鋳型としたとき及び雑種第一代のゲノムＤＮＡを鋳型としたときに、第三のポリヌクレオチド及び第四のポリヌクレオチドが増幅された。
　このように、ゲノムＤＮＡに第一の変異を有する個体からのみ、第一のポリヌクレオチドが増幅され、ゲノムＤＮＡに第二の変異を有する個体からのみ、第二のポリヌクレオチドが増幅され、ゲノムＤＮＡに第一の変異が生じていない個体からのみ、第三のポリヌクレオチドが増幅され、ゲノムＤＮＡに第二の変異が生じていない個体からのみ、第四のポリヌクレオチドが増幅された。これにより、上述した四種類のＰＣＲの増幅産物が、共優性のＤＮＡマーカーとして利用可能であることが示された。
　本発明は、タバコの育種に利用可能である。

Claims (13)

  1. 　タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、
    　該タバコのゲノムＤＮＡにおいて、
    　（ｉ）配列番号３に示す塩基配列からなる第一の遺伝子の第３０２３位及び第３０２４位に対応する塩基に第一の変異が生じており、
    　（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなる第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基に第二の変異が生じていること
    　を該抵抗性の指標とすることを特徴とする判定方法。
  2. 　第一の変異は、第一の遺伝子の第３０２３位から第３０２４位までに対応する塩基配列のＴＡへの置換であり、
    　第二の変異は、第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基の欠失であることを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
  3. 　上記ゲノムＤＮＡが第一の変異及び第二の変異をホモ接合型で有しているときに、上記タバコが上記抵抗性を有していると判定することを特徴とする請求項１又は２に記載の判定方法。
  4. 　上記ゲノムＤＮＡから、第一の変異を含む連続した塩基配列又はその相補配列からなる第一のポリヌクレオチドを増幅し、増幅した第一のポリヌクレオチドを用いて第一の変異を検出する第一の検出工程と、
    　上記ゲノムＤＮＡから、第二の変異を含む連続した塩基配列又はその相補配列からなる第二のポリヌクレオチドを増幅し、増幅した第二のポリヌクレオチドを用いて第二の変異を検出する第二の検出工程と、を包含することを特徴とする請求項１～３の何れか一項に記載の判定方法。
  5. 　第一のポリヌクレオチドの長さは、２０塩基以上５０００塩基以下であり、第二のポリヌクレオチドの長さは、２０塩基以上５０００塩基以下であることを特徴とする請求項４に記載の判定方法。
  6. 　タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、
    　該タバコのゲノムＤＮＡにおいて、
    　（ｉ）配列番号３に示す塩基配列からなる第一の遺伝子の下記（１）～（２０）に示す一つ以上の変異が生じており：
    　（１）第４４４位の塩基がＣに置換；
    　（２）第１０４９位と第１０５０位との間に配列番号１９に示す塩基配列が挿入；
    　（３）第２２６５位から第２２６８位までの塩基が欠失；
    　（４）第３０２３位から第３０２４位までの塩基配列がＴＡに置換；
    　（５）第３４３０位から第３４３１位までの塩基が欠失；
    　（６）第３５４７位の塩基が欠失；
    　（７）第３５６２位の塩基がＴに置換；
    　（８）第３５９８位と第３５９９位との間にＴＡが挿入；
    　（９）第３６４１位と第３６４２位との間にＡが挿入；
    　（１０）第３６９１位の塩基がＡに置換；
    　（１１）第３６９５位の塩基がＴに置換；
    　（１２）第３６９８位の塩基がＣに置換；
    　（１３）第３７０７位の塩基がＣに置換；
    　（１４）第３７７０位から第３７８４位までの塩基が欠失；
    　（１５）第３７９０位の塩基がＣに置換；
    　（１６）第３７９８位の塩基がＧに置換；
    　（１７）第３８０７位から第３８１０位までの塩基が欠失；
    　（１８）第３８４９位と第３８５０位との間に配列番号２０に示す塩基配列が挿入；
    　（１９）第３８６４位の塩基がＧに置換；
    　（２０）第４０９０位の塩基がＡに置換；
    　（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなる第二の遺伝子の下記（２１）～（３３）に示す一つ以上の変異が生じていること：
    　（２１）第９１６位の塩基がＡに置換；
    　（２２）第１００６位の塩基がＣに置換；
    　（２３）第１０４６位の塩基がＧに置換；
    　（２４）第１０８１位の塩基がＡに置換；
    　（２５）第１１１５位と第１１１６位との間にＡが挿入；
    　（２６）第１１１６位と第１１１７位との間にＡが挿入；
    　（２７）第１６６８位の塩基がＴに置換；
    　（２８）第２１８９位の塩基がＡに置換；
    　（２９）第２９８１位及び第２９８２位の塩基が欠失；
    　（３０）第３６４８位の塩基がＣに置換；
    　（３１）第３７０２位の塩基がＧに置換；
    　（３２）第３８９４位の塩基がＧに置換；
    　（３３）第３８９５位から第３８９６位の塩基が欠失；
    　を該抵抗性の指標とすることを特徴とする判定方法。
  7. 　タバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定方法であって、
    　該タバコにおいて、配列番号５に示す塩基配列（ただし、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）からなる第一のｍＲＮＡ、及び配列番号９に示す塩基配列（ただし、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）からなる第二のｍＲＮＡが検出されないことを該抵抗性の指標とすることを特徴とする判定方法。
  8. 　さらに、上記タバコにおいて、第一のｍＲＮＡのスプライシングバリアント、及び第二のｍＲＮＡのスプライシングバリアントを検出したことを上記抵抗性の指標とすることを特徴とする請求項７に記載の判定方法。
  9. 　Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコの育種方法であって、
    　請求項１～８の何れか一項に記載の判定方法を用いて、Erysiphe cichoracearumに対して抵抗性のタバコを選抜する選抜工程を包含することを特徴とする育種方法。
  10. 　タバコのゲノムＤＮＡにおける、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第一のポリヌクレオチドと、
    　タバコのゲノムＤＮＡにおける、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第二のポリヌクレオチドと、を含んでいることを特徴とするタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定用ＤＮＡマーカー。
  11. 　タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第一のポリヌクレオチドを増幅するための第一のプライマーセットと、
    　タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第二のポリヌクレオチドを増幅するための第二のプライマーセットと、を備えていることを特徴とするタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定キット。
  12. 　タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号３に示す第一の遺伝子の第３０２３位及び第３０２４位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第三のポリヌクレオチドを増幅するための第三のプライマーセットと、
    　タバコのゲノムＤＮＡから、配列番号４に示す第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基を含む２０塩基以上５０００塩基以下の連続した塩基配列又はその相補配列からなる第四のポリヌクレオチドを増幅するための第四のプライマーセットと、をさらに備え、
    　第一のプライマーセットは、配列番号１に示す第一の遺伝子の第３０９７位及び第３０９８位に対応する塩基配列又はその相補配列を含む第一のプライマーを備え、
    　第二のプライマーセットは、配列番号２に示す第二の遺伝子の第２９８２位及び第２９８３位に対応する塩基配列又はその相補配列を含む第二のプライマーを備え、
    　第三のプライマーセットは、配列番号３に示す第一の遺伝子の第３０２３位及び第３０２４位に対応する塩基配列又はその相補配列を含む第三のプライマーを備え、
    　第四のプライマーセットは、配列番号４に示す第二の遺伝子の第２９８１位及び第２９８２位に対応する塩基配列又はその相補配列を含む第四のプライマーを備えていることを特徴とする請求項１１に記載のタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定キット。
  13. 　配列番号１に示す塩基配列における第３０９７位及び第３０９８位の塩基を含む１０塩基以上の連続した塩基配列若しくはその相補配列にハイブリダイズする第一のプローブと、
    　配列番号２に示す塩基配列における第２９８２位及び第２９８３位の塩基を含む１０塩基以上の連続した塩基配列若しくはその相補配列にハイブリダイズする第二のプローブと、を備えていることを特徴とするタバコのErysiphe cichoracearumに対する抵抗性の判定キット。
PCT/JP2015/050544 2014-01-17 2015-01-09 タバコのＥｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍに対する抵抗性の判定方法及びその利用 WO2015108000A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014007280 2014-01-17
JP2014-007280 2014-01-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015108000A1 true WO2015108000A1 (ja) 2015-07-23

Family

ID=53542890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/050544 WO2015108000A1 (ja) 2014-01-17 2015-01-09 タバコのＥｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍに対する抵抗性の判定方法及びその利用

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2015108000A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029889A (zh) * 2020-09-03 2020-12-04 贵州省烟草科学研究院 一种检测烟草白粉病抗性基因型的多重pcr方法及其在育种中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008017706A1 (en) * 2006-08-10 2008-02-14 Basf Plant Science Gmbh Method of increasing resistance against soybean rust in transgenic plants
JP2009513152A (ja) * 2005-11-01 2009-04-02 ウニフェルジテイト・ユトレヒト・ホールディング・ベスローテン・フェンノートシャップ 耐病性植物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009513152A (ja) * 2005-11-01 2009-04-02 ウニフェルジテイト・ユトレヒト・ホールディング・ベスローテン・フェンノートシャップ 耐病性植物
WO2008017706A1 (en) * 2006-08-10 2008-02-14 Basf Plant Science Gmbh Method of increasing resistance against soybean rust in transgenic plants

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK 12 February 2011 (2011-02-12), "Definition: Nicotiana tabacum ML01 mRNA, partial cds", accession no. Q880609 *
KIM D. ET AL.: "The pepper MLO gene , CaML02, is involved in the susceptibility cell -death response and bacterial and oomycete proliferation", PLANT JOURNAL, vol. 72, no. 5, 2012, pages 43 - 855, XP055213078 *
SCHULZE-LEFERT P. ET AL.: "Closing the ranks to attack by powdery mildew", TRENDS PLANT SCIENCE, vol. 5, no. 8, 2000, pages 343 - 348, XP055213077 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112029889A (zh) * 2020-09-03 2020-12-04 贵州省烟草科学研究院 一种检测烟草白粉病抗性基因型的多重pcr方法及其在育种中的应用
CN112029889B (zh) * 2020-09-03 2023-11-14 贵州省烟草科学研究院 一种检测烟草白粉病抗性基因型的多重pcr方法及其在育种中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2013112559A1 (en) Cotton event pdab4468.19.10.3 detection method
BRPI0614338A2 (pt) plantas de algodão tolerantes a herbicida e processos para a identificação das mesmas
US11268102B2 (en) Compositions and methods for identifying and selecting brachytic locus in solanaceae
US20220025471A1 (en) Markers linked to reniform nematode resistance
AU2017203293A1 (en) Qtls associated with and methods for identifying whole plant field resistance to sclerotinia
AU2013205609A1 (en) Cotton event pDAB4468.18.07.1 detection method
WO2013112568A1 (en) Cotton event pdab4468.18.07.1 detection method
EP3447151A1 (en) Ho/ll canola with resistance to clubroot disease
US10378025B2 (en) Tomato yellow leaf curl virus resistance
CN112195268B (zh) 与栽培种来源抗桃绿蚜性状紧密连锁的分子标记、引物、应用及品种选育方法
US20220195537A1 (en) Methods and compositions to select and/or predict cotton plants resistant to fusarium race-4 resistance in cotton
WO2015108000A1 (ja) タバコのＥｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍに対する抵抗性の判定方法及びその利用
CN108707690B (zh) 与白肋烟控制基因共分离的分子标记及其应用
JP6876334B2 (ja) 形質転換感受性のオオムギの作出方法
JP2022046306A (ja) キク白さび病抵抗性を判定する方法、製造方法、分子マーカー、キク白さび病抵抗性関連遺伝子、キク白さび病抵抗性のキク属植物
JP3999254B2 (ja) 大麦縞萎縮病抵抗性に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーおよびその利用
CN111163630A (zh) 抗黄瓜花叶病毒的辣椒植物
EP3918911A1 (en) Marker generation by random mutagenesis in plants
KR102149256B1 (ko) 벼의 흰잎마름병 저항성 증진용 조성물
CN108728429B (zh) 金属蛋白酶ws1a在调控植物叶绿体代谢中的应用
CN108707596B (zh) 金属蛋白酶ws1b在调控植物叶绿体代谢中的应用
JP2017529861A (ja) トウモロコシ中の培養および形質転換と関連する遺伝子座
KR20230175355A (ko) 오이 모자이크 바이러스에 대한 저항성을 부여하는 신규 qtl
CN111748566A (zh) 栽培花生AhGPAT9A基因及其在改良种子含油量中的应用
CN115927715A (zh) 用于抗斑萎病烟草19号染色体背景筛选的引物组及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15737497

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15737497

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP