BRPI0614338A2 - plantas de algodão tolerantes a herbicida e processos para a identificação das mesmas - Google Patents

Abstract

PLANTAS DE ALGODãO TOLERANTES A HERBICIDA E PROCESSOS PARA A IDENTIFICAçãO DAS MESMAS. A invenção fornece plantas de algodão transgênicas específicas, material de planta e sementes, caracterizados pelo fato de que estes produ- tos carregam um evento de transformação específico em uma localização específica no genoma do algodão. São também fornecidas ferramentas que permitem a identificação rápida e não equivocada do evento em amostras biológicas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTAS DEALGODÃO TOLERANTES A HERBICIDA E PROCESSOS PARA A IDENTI-FICAÇÃO DAS MESMAS".

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a plantas de algodão, materiais vegetaise sementes transgênicos, caracterizados por carregarem um evento detransformação específico, particularmente pela presença de um gene quecodifica uma proteína que confere tolerância a herbicida, em uma localiza-ção específica no genoma do algodão. As plantas de algodão da invençãose combinam com o fenótipo tolerante a herbicida com um desempenho a-gronômico, uma estabilidade genética e uma capacidade de se adaptarem abases genéticas diferentes equivalentes à da linhagem de algodão nãotransformada na ausência de pressão de ervas daninhas. Esta invenção for-nece ainda métodos e estojos para a identificação da presença de materialde planta que compreende especificamente o evento de transformação EE-GH3 em amostras biológicas.

Fundamento da Invenção

A expressão fenotípica de um transgene em uma planta é de-terminada tanto pela estrutura do próprio gene quanto por sua localização nogenoma da planta. Ao mesmo tempo a presença do transgene (em um DNAestranho) em localizações diferentes no genoma influenciará no fenótipo ge-ral da planta de maneiras diferentes. A introdução agronômica e industrialbem-sucedida de uma característica interessante comercialmente em umaplanta através da manipulação genética pode ser um procedimento demora-do dependente de fatores diferentes. A transformação e a regeneração reaisde plantas transformadas geneticamente constituem apenas a primeira emuma série de etapas de seleção, que incluem a caracterização genética ex-tensiva, o cruzamento e a avaliação nos testes de campo, levando eventu-almente à seleção de um evento de elite.

A fibra de algodão é a fibra têxtil isolada mais importante em to-do o mundo. Aproximadamente 3,2 bilhões de ares (80 milhões de acres) dealgodão são colhidos anualmente ao longo do globo terrestre. O algodão é aquinta planta de cultivo mais importante nos EUA em termos de produção40,47 ares (acre), com mais de 0,6 bilhões de ares (15 milhões de acres)plantados em 2000. As espécies daninhas primárias para o algodão são Ipo-moea sp. (ipoméia), Amaranthus spp. (carurú), Cyperus spp. (tiririca), Xan-thium spp. (cardo) e Sorghum spp. (arroz-bravo). Antes da introdução deherbicidas para folhas abertas que poderiam ser utilizados em um campo decultivo de algodão, os cultivadores utilizavam aplicações pós-emergênciadiretas de herbicidas não seletivos tomando cuidado para não entrar emcontato com as plantas de cultivo em crescimento. Como isso requer umadiferença na altura entre as ervas daninhas e a planta de cultivo, isto nemsempre é possível. Especialmente para o algodão pequeno, esta prática édemorada e potencialmente prejudicial à planta de cultivo.

A identificação não equivocada de um evento de elite está setornando crescentemente importante em vista de discussões sobre os NovosAlimentos/Produtos Alimentícios, a segregação de OGM e produtos que nãosão OGM e a identificação de material de propriedade. De forma ideal, talmétodo de identificação é tanto rápido quanto simples, sem a necessidadede uma estrutura de laboratório extensiva. Além disso, o método deve forne-cer resultados que permitem a determinação não equivocada do evento deelite sem a interpretação técnica, mas que seja interrompido sob exame mi-nucioso de um perito se necessário. As ferramentas específicas para uso naidentificação do evento de elite EE-GH3 em amostras biológicas são descri-tas aqui.

EE-GH3 foi identificado como um evento de elite partindo deuma população de plantas de algodão no desenvolvimento de algodão(Gossypium hirsutum) resistente ao herbicida N-fosfonometilglicina e sais domesmo, também conhecidos como glifosato. As plantas de algodão transgê-nicas continham um gene quimérico conferindo tolerância ao glifosato, com-preendendo um gene epsps modificado de Zea mays que codifica a 5-enol-piruvilquicimato-3-fosfato sintase (EPSPS) tolerante ao glifosato (como des-crito na Patente U.S. N2 6.566.587) sob o controle de um promotor que podeser expresso em plantas (como descrito na Patente U.S. N- 5.491.288 ou naPatente U.S. N2 5.792.930).

As plantas de algodão que compreendem um gene de tolerânciaao glifosato foram divulgadas na técnica. Entretanto, nenhuma das descri-ções das técnicas anteriores se encaixa no ensinamento ou sugere a pre-sente invenção.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a uma planta de algodão ou se-mente transgênica, células ou tecidos da mesma, que compreende, integra-do de forma estável em seu genoma, um cassete de expressão que com-preende um gene de tolerância a herbicida que compreende a seqüênciacodificadora do gene epsps (como descrito no Exemplo 1.1 contido aqui),que é tolerante a herbicida, na ausência de pressão por ervas daninhas,possui um desempenho agronômico que é substancialmente equivalente aoda linhagem isogênica não transgênica. Sob a pressão por ervas daninhas eo tratamento apropriado com glifosato, a planta terá um fenótipo agronômicosuperior comparado com o da planta não transgênica.

Em uma modalidade da invenção a planta de algodão ou semen-te, células ou tecidos da mesma compreendem o evento de elite EE-GH3.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se a umaplanta, semente de algodão transgênica, células ou tecidos da mesma, cujoDNA genômico é caracterizado pelo fato de que, quando analisado em umprotocolo de identificação pela PCR como descrito aqui, utilizando dois inici-adores direcionados para a região flanqueadora a 5' ou a 3' de EE-GH3 e doDNA estranho, respectivamente, produz um fragmento que é específico paraEE-GH3. Os iniciadores podem ser direcionados contra a região flanqueado-ra a 5' dentro da SEQ ID NO: 1 e ao DNA estranho respectivamente de for-ma que os iniciadores que compreendem ou que consistem na seqüência denucleotídeos da SEQ ID NO: 3 e da SEQ ID NO: 11 respectivamente e pro-duzem um fragmento de DNA entre 300 e 360 pb, preferencialmente de a-proximadamente 334 pb.

A semente de referência do evento de elite da invenção foi de-positada na ATCC sob número de acesso PTA-6878. Uma modalidade dainvenção é a semente que compreende o evento de elite EE-GH3 deposita-do na forma do número de acesso da ATTC PTA-6878, que será cultivadaem uma planta de algodão resistente ao glifosato. A semente do número dedepósito na ATCC PTA-xxxx, que é um lote de sementes de pelo menos a-proximadamente 95% de grãos transgênicos homozigotos em relação aotransgene, compreendendo o evento de elite da invenção, que será cultivadaem plantas tolerantes ao glifosato. A semente pode ser plantada e as plantascrescentes podem ser tratadas com glifosato como descrito aqui para a ob-tenção de plantas 100% tolerantes ao glifosato, que compreendem o eventode elite da invenção. A invenção refere-se ainda a células, tecidos, progê-nies e descendentes de uma planta que compreende o evento de elite dainvenção crescida partindo da semente depositada na ATCC possuindo onúmero de acesso PTA-6878. A invenção refere-se ainda a plantas que po-dem ser obtidas através da propagação e/ou do cruzamento com uma plantade algodão que compreende o evento de elite da invenção crescida partindoda semente depositada na ATCC possuindo o número de acesso PTA-6878.

A invenção refere-se ainda a um método para a identificação deuma planta transgênica ou células ou tecidos da mesma, que compreende oevento de elite EE-GH3 cujo método se baseia na identificação da presençadas seqüências de DNA de caracterização ou dos aminoácidos codificadospor tais seqüências de DNA na planta, células ou tecidos transgênicos. Deacordo com uma modalidade preferida da invenção, tais seqüências de DNAde caracterização são seqüências de 15 pb, preferencialmente de 20 pb,mais preferencialmente de 30 pb ou mais preferencialmente que compreen-dem o sítio de inserção do evento, isto é, tanto uma parte do DNA estranhoquanto uma parte do genoma de algodão (a região flanqueadora a 5' ou a 3')contígua ao mesmo, permitindo a identificação específica do evento de elite.

A presente invenção refere-se ainda a métodos para a identifica-ção do evento de elite EE-GH3 em amostras biológicas, cujos métodos sebaseiam em iniciadores ou sondas que reconhecem especificamente a se-qüência flanqueadora a 5' e/ou a 3' de EE-GH3.

Mais especificamente, a invenção refere-se a um método quecompreende a amplificação de uma seqüência de um ácido nucléico presen-te nas amostras biológicas, utilizando uma reação em cadeia da polimerasecom pelo menos dois iniciadores, dos quais um reconhece a região flanque-adora a 5' ou a 3' de EE-GH3 e o outro que reconhece uma seqüência den-tro do DNA estranho, preferencialmente para a obtenção de um fragmentode DNA entre 100 e 500 pb. Os iniciadores podem reconhecer uma seqüên-cia dentro da região flanqueadora a 5' de EE-GH3 (SEQ ID N2: 1, partindoda posição 1 até a posição 732) ou dentro da região flanqueadora a 3' deEE-GH3 (complemento da SEQ ID N2: 2 partindo da posição 431 até a posi-ção 654) e uma seqüência dentro do DNA estranho (complemento da SEQID N2: 1 partindo da posição 733 até 1214 ou da SEQ ID N2: 2 partindo daposição 1 até a posição 430), respectivamente. O iniciador que reconhece aregião flanqueadora a 5' pode compreender a seqüência de nucleotídeos daSEQ ID N2: 3 e o iniciador que reconhece uma seqüência dentro do DNAestranho pode compreender a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N2: 11descrita aqui.

A presente invenção refere-se mais especificamente a um méto-do para a identificação do evento de elite EE-GH3 em amostras biológicas,cujo método compreende a amplificação de uma seqüência de um ácido nu-cléico presente em uma amostra biológica, utilizando uma reação em cadeiada polimerase com dois iniciadores que possuem a seqüência de nucleotí-deos da SEQ ID N2: 3 e da SEQ ID N2: 11 respectivamente, para a obtençãode um fragmento de DNA de aproximadamente 334 pb.

A presente invenção refere-se ainda às seqüências flanqueado-ras específicas de EE-GH3 descritas aqui, que podem ser utilizadas para odesenvolvimento de métodos de identificação específicos para EE-GH3 emamostras biológicas. Mais particularmente, a invenção refere-se às regiõesflanqueadoras a 5' e/ou a 3' de EE-GH3 que podem ser utilizadas para odesenvolvimento de iniciadores e sondas específicos como é adicionalmentedescrito aqui. A invenção refere-se ainda a métodos de identificação em re-lação à presença de EE-GH3 em amostras biológicas com base no uso detais iniciadores ou sondas específicas. Qs iniciadores podem consistir emuma seqüência de nucleotídeos de 17 até aproximadamente 200 nucleotí-deos consecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID N2:1 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 732 ou do complemento daseqüência de nucleotídeos de SEQ ID 2 partindo do nucleotídeo 431 até onucleotídeo 654 combinado com iniciadores que consistem de uma seqüên-cia de nucleotídeos de 17 até aproximadamente 200 nucleotídeos consecuti-vos selecionados do complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ IDN2: 1 partindo do nucleotídeo 733 até o nucleotídeo 1214 ou da seqüênciade nucleotídeos da SEQ ID N2: 2 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo430. Os iniciadores podem compreender ainda estas seqüências de nucleo-tídeos localizadas em sua extremidade a 3' extrema e compreender aindaseqüências não relacionadas ou seqüências derivadas das seqüências denucleotídeos mencionadas, mas que compreendem pareamentos errados.

A invenção refere-se ainda a estojos para a identificação do e-vento de elite EE-GH3 em amostras biológicas, os ditos estojos compreen-dendo pelo menos um iniciador ou sonda que reconhece especificamente aregião flanqueadora a 5' ou a 3' de EE-GH3.

O estojo da invenção pode compreender, em adição a um inicia-dor que reconhece especificamente a região flanqueadora a 5' ou a 3' deEE-GH3, um segundo iniciador que reconhece especificamente uma se-qüência dentro do DNA estranho de EE-GH3, para uso em um protocolo deidentificação pela PCR. Os estojos da invenção podem compreender pelomenos dois iniciadores específicos, dos quais um reconhece uma seqüênciadentro da região flanqueadora a 5' de EE-GH3 e o outro que reconhece umaseqüência dentro do DNA estranho. O iniciador que reconhece a região flan-queadora a 5' pode compreender a seqüência de nucleotídeos da SEQ IDN2: 3 e o iniciador que reconhece o transgene pode compreender a seqüên-cia de nucleotídeos da SEQ ID N2: 11 ou qualquer outro iniciador como des-crito aqui.

A invenção refere-se ainda a um estojo para a identificação doevento de elite EE-GH3 em amostras biológicas, o dito estojo compreenden-do os iniciadores da PCR que possuem a seqüência de nucleotídeos daSEQ ID Ne: 3 e da SEQ ID N2: 11 para uso no protocolo de identificação pelaPCR de EE-GH3 descrito aqui.

A invenção refere-se ainda a um estojo para a identificação doevento de elite EE-GH3 em amostras biológicas, cujo estojo compreendeuma sonda específica que possui uma seqüência que corresponde (ou écomplementar a) uma seqüência que possui entre 80% e 100% de identida-de de seqüência com uma região específica de EE-GH3. Preferencialmentea seqüência da sonda corresponde a uma região específica que compreen-de parte de uma região flanqueadora a 5' ou a 3' de EE-GH3. Mais preferen-cialmente a sonda específica possui (ou é complementar a) uma seqüênciaque possui entre 80% e 100% de identidade de seqüência com a seqüênciaentre o nucleotídeo 712 até 753 da SEQ ID N2: 1 ou da SEQ ID N2: 2 partin-do do nucleotídeo 410 até 451.

De acordo com um outro aspecto da invenção, são divulgadasseqüências de DNA que compreendem o sítio de inserção do evento e ocomprimento suficiente de polinucleotídeos tanto do DNA genômico do algo-dão quanto do DNA estranho (transgene), de forma a serem úteis como ini-ciador ou sonda para a detecção de EE-GH3. Tais seqüências podem com-preender pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico do algodão e umnúmero similar de nucleotídeos do DNA estranho (transgene) de EE-GH3com as mesmas em cada lado do sítio de inserção respectivamente. Maispreferencialmente, tais seqüências de DNA compreendem pelo menos 9 nu-cleotídeos do DNA genômico do algodão e um número similar de nucleotí-deos do DNA estranho contíguo ao sítio de inserção na SEQ ID NO: 1 ou naSEQ ID NO: 2.

Os métodos e os estojos abrangidos pela presente invenção po-dem ser utilizados para finalidades diferentes tais como, mas não limitadasàs seguintes: para a identificação da presença ou da ausência de EE-GH3nas plantas, material de planta ou em produtos tais como, mas não limitadosa produtos para alimentação ou alimentícios (frescos ou processados) com-preendendo ou derivados de material de planta; adicionalmente ou alternati-vamente, os métodos e os estojos da presente invenção podem ser utiliza-dos para a identificação de material de planta transgênico com a finalidadede segregação entre material transgênico e não transgênico; adicionalmenteou alternativamente, os métodos e os estojos da presente invenção podemser utilizados para determinar a qualidade (isto é, a porcentagem de materialpuro) de material de planta que compreende EE-GH3.

A invenção refere-se ainda a regiões flanqueadoras a 5' e/ou a3' de EE-GH3 assim como aos iniciadores e as sondas específicos desen-volvidos partindo das seqüências flanqueadoras a 5' e/ou a 3' de EE-GH3.

Breve Descrição dos Desenhos

Não é pretendido que os Exemplos a seguir limitem a invençãonas modalidades específicas descritas, podem ser entendidos em associa-ção com a Figura em anexo, incorporada aqui como referência, em que:

A Fig. 1: representa esquematicamente a relação entre as se-qüências de nucleotídeos e os iniciadores citados, barra em preto: DNA es-tranho; barra clara: DNA de origem planta; os números sob as barras repre-sentam as posições dos nucleotídeos; (c) refere-se ao complemento da se-qüência de nucleotídeos indicada.

A Fig. 2: representa os resultados obtidos através do protocolode Identificação pela PCR desenvolvido para EE-GH3. Carregamento daseqüência no gel: Faixa 1: Marcador de peso molecular ("escada" de 100pb); faixas 2 até 4: amostras de DNA de plantas de algodão que compreen-de o evento transgênico EE-GH3; faixas 5 até 8: amostras de DNA de plan-tas de algodão transgênicas que não compreendem o evento de elite EE-GH3, mas que compreendem um gene de tolerância ao glifosato similar; fai-xas 9 até 11: amostras de DNA de plantas de algodão transgênicas que nãocompreendem o evento de elite EE-GH3 e que não compreendem um genede tolerância ao glifosato; faixa 12: amostra de DNA de controle provenienteda planta de algodão do tipo selvagem; faixa 13: sem controle do DNA mol-de; faixa 14: marcador de peso molecular.

A Fig. 3: representa os resultados obtidos através do protocolode PCR de classificação de zigosidade desenvolvido para EE-GH3. Carre-gamento da seqüência no gel: Faixa 1: Marcador de peso molecular ("esca-da" de 100 pb); faixas 2, 4, 6, 7 e 8: amostras de DNA de plantas de algodãoque compreendem o evento transgênico EE-GH3 na forma homozigota; fai-xas 3 e 5: amostras de DNA de plantas de algodão que compreendem o e-vento transgênico EE-GH3 na forma heterozigota; faixas 9 e 10: amostra deDNA de controle proveniente de planta de algodão do tipo selvagem; faixa11: sem controle do DNA molde; faixa 12: marcador de peso molecular.

Descrição Detalhada

A incorporação de uma molécula de DNA recombinante no ge-noma da planta resulta tipicamente da transformação de uma célula ou deum tecido. O sítio particular de incorporação é geralmente determinado pelaintegração "aleatória".

O DNA introduzido no genoma da planta como um resultado datransformação de uma célula ou um tecido planta com um DNA recombinan-te ou "DNA de transformação" e que se origina de tal DNA de transformaçãoé referido posteriormente aqui como "DNA estranho" compreendendo um oumais "transgenes". "DNA planta" no contexto da presente invenção irá sereferir ao DNA que se origina da planta que é transformada. O DNA plantaserá geralmente encontrado no mesmo lócus gênico na planta do tipo selva-gem correspondente. O DNA estranho pode ser caracterizado pela Iocaliza-ção e pela configuração no sítio de incorporação da molécula de DNA re-combinante no genoma da planta. O sítio no genoma da planta em que umDNA recombinante foi inserido é também referido como o "sítio de inserção"ou o "sítio alvo". A inserção do DNA recombinante no genoma da planta po-de estar associada com uma deleção do DNA planta, referida como "deleçãodo sítio alvo". Uma "região flanqueadora" ou uma "seqüência flanqueadora"como utilizado aqui refere-se a uma seqüência de pelo menos 20 pb, prefe-rencialmente pelo menos 50 pb e até 5000 pb de DNA diferente do DNA in-troduzido, preferencialmente o DNA do genoma da planta que fica localizadoimediatamente a montante de e contíguo a ou imediatamente a jusante de econtíguo ao DNA estranho. Os procedimentos de transformação que levam àintegração aleatória do DNA estranho resultarão em transformantes com re-giões flanqueadoras diferentes, que são características e exclusivas paracada transformante. Quando o DNA recombinante for introduzido em umaplanta através do cruzamento tradicional, seu sítio de inserção no genomada planta ou suas regiões flanqueadoras geralmente não serão alteradas.

Uma "região de inserção", como utilizado, aqui refere-se à região que cor-responde à região de pelo menos 40 pb, preferencialmente pelo menos 100pb e até 10000 pb, abrangida pela seqüência que compreende a região flan-queadora a montante e/ou a jusante de um DNA estranho no genoma daplanta. Levando em consideração diferenças menores causadas por muta-ções dentro de uma espécie, uma região de inserção manterá, após o cru-zamento em uma planta da mesma espécie, pelo menos 85%, preferencial-mente 90%, mais preferencialmente 95% e mais preferencialmente 100% deidentidade de seqüência com a seqüência que compreende as regiões flan-queadoras a montante e a jusante do DNA estranho na planta obtida origi-nalmente partindo da transformação.

É definido como um lócus gênico (artificial) um evento que, comoum resultado da engenharia genética, carrega um transgene que compreen-de pelo menos uma cópia de um gene de interesse. Os status alélicos típi-cos de um evento são a presença ou a ausência do DNA estranho. Um e-vento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do transgene. No ní-vel genético, um evento é parte da constituição genética de uma planta. Nonível molecular, um evento pode ser caracterizado pelo mapa de restrição(por exemplo, como é determinado por Southern blotting), pelas seqüênciasflanqueadoras a montante e/ou a jusante do transgene, a localização demarcadores moleculares e/ou a configuração molecular do transgene. Ge-ralmente, a transformação de uma planta com um DNA de transformaçãoque compreende pelo menos um gene de interesse leva a uma populaçãode transformantes que compreende um grande número de eventos separa-dos, dos quais cada um é exclusivo.

Um evento de elite, como utilizado aqui, é um evento que é sele-cionado de um grupo de eventos, obtidos através da transformação com omesmo DNA de transformação ou através do retrocruzamento com plantasobtidas através de tal transformação, com base na expressão e na estabill·dade do(s) transgene(s) e sua compatibilidade com características agronô-micas ótimas da planta que o compreende. Assim, os critérios para a sele-ção do evento de elite são um ou mais, preferencialmente dois ou mais, van-tajosamente todos os seguintes:

a) Que a presença do DNA estranho não comprometa outrascaracterísticas desejadas da planta, tais como as que refere-sem ao desem-penho agronômico ou ao valor comercial;

b) Que o evento seja caracterizado por uma configuração mole-cular bem definida que é herdada de forma estável e para a qual ferramen-tas apropriadas para o controle de identidade possam ser desenvolvidas;

c) Que o(s) gene(s) de interesse exiba(m) uma expressão feno-típica espacial e temporal correta, apropriada e estável, tanto na condiçãoheterozigota (ou hemizigota) quanto homozigota do evento, em um nível a -ceitável comercialmente em uma faixa de condições ambientais em que asplantas que carregam provavelmente serão expostas no uso agronômiconormal.

É preferido que o DNA estranho esteja associado com uma po-sição no genoma da planta que permita a fácil introgressão nas estruturasgenéticas básicas comerciais desejadas.

O status de um evento como um evento de elite é confirmadoatravés da introgressão do evento de elite em estruturas genéticas básicasrelevantes diferentes e da observação da conformidade com um, dois outodos os critérios, por exemplo, a), b) e c) acima.

Um "evento de elite" refere-se assim a um lócus gênico quecompreende um DNA estranho, que responde aos critérios descritos anteri-ormente. Uma planta, um material de planta ou uma progênie tal como assementes pode compreender um ou mais eventos de elite em seu genoma.

As ferramentas desenvolvidas para a identificação de um eventode elite ou da planta, do material de planta que compreende um evento deelite ou dos produtos que compreendem o material de planta que compreen-de o evento de elite se baseiam nas características genômicas específicasdo evento de elite, tal como, um mapa de restrição da região genômica quecompreende o DNA estranho, os marcadores moleculares ou a seqüênciada(s) região(ões) flanqueador(as) do DNA estranho.

Uma vez que uma ou ambas as regiões flanqueadoras do DNAestranho foram seqüenciadas, podem ser desenvolvidos os iniciadores e assondas que reconhecem especificamente esta(s) seqüência(s) no ácido nu-cléico (DNA ou RNA) de uma amostra através de uma técnica de biologiamolecular. Por exemplo, pode ser desenvolvido um método de PCR para aidentificação do evento de elite em amostras biológicas (tais como amostrasde plantas, material de planta ou produtos que compreendem material deplanta). Tal PCR se baseia em pelo menos dois "iniciadores" específicos umque reconhece uma seqüência dentro da região flanqueadora ã 5' ou a 3' doevento de elite e o outro que reconhece uma seqüência dentro do DNA es-tranho. Os iniciadores possuem preferencialmente uma seqüência entre 15 e35 nucleotídeos que sob condições de PCR otimizadas "reconhecem especi-ficamente" uma seqüência dentro da região flanqueadora a 5' ou a 3' do e-vento de elite e do DNA estranho do evento de elite respectivamente, deforma que um fragmento específico ("fragmento de integração" ou ampliconde discriminação) é amplificado partindo de uma amostra de ácido nucléicoque compreende o evento de elite. Isto significa que apenas o fragmento deintegração direcionado e nenhuma outra seqüência no genoma da planta ouno DNA estranho, é amplificado sob as condições otimizadas de PCR.

Os iniciadores da PCR adequados para a invenção podem seros seguintes:

- oligonucleotídeos que variam de comprimento de 17 nt atéaproximadamente 200 nt, que compreendem uma seqüência de nucleotí-deos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20nucleotídeos consecutivos selecionada da seqüência flanqueadora a 5'(SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 732) em sua ex-tremidade a 3' (iniciadores que reconhecem as seqüências flanqueadoras a 5'); ou

- oligonucleotídeos que variam de comprimento de 17 nt atéaproximadamente 200 nt, que compreendem uma seqüência de nucleotí-deos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20nucleotídeos consecutivos, selecionada da seqüência flanqueadora a 3'(complemento da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431 até o nucleotí-deo 654) em sua extremidade a 3' (iniciadores que reconhecem as seqüên-cias flanqueadoras a 3'); ou

- oligónucleotídeos que variam de comprimento de 17 nt atéaproximadamente 200 nt, que compreendem uma seqüência de nucleotí-deos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20nucleotídeos selecionada das seqüências de DNA inseridas (complementoda SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 733 até o nucleotídeo 1214) em suaextremidade a 3' (iniciadores que reconhecem o DNA estranho) ou

- oligonucleotídeos que variam de comprimento de 17 nt atéaproximadamente 200 nt, que compreendem uma seqüência de nucleotí-deos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20nucleotídeos selecionada das seqüências de DNA inseridas (SEQ ID No 2partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 430)

Os iniciadores podem, evidentemente, ser mais longos que os17 nucleotídeos consecutivos mencionados e podem, por exemplo, ter 20,21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt de comprimento ou até mesmo mais Ion-go. Os iniciadores podem consistir inteiramente da seqüência de nucleotí-deos selecionada das seqüências de nucleotídeos mencionadas das se-qüências flanqueadoras e das seqüências do DNA estranho. Entretanto, aseqüência de nucleotídeos dos iniciadores em sua extremidade a 5' (isto é,fora dos 17 nucleotídeos consecutivos localizados a 3') é menos crítica. As-sim, a seqüência a 5' dos iniciadores pode consistir em uma seqüência denucleotídeos selecionada das seqüências flanqueadoras ou do DNA estra-nho, quando apropriado, mas pode conter vários (por exemplo, 1, 2, 5, 10)pareamentos errados). A 5' seqüência dos iniciadores podem ainda consistirinteiramente de uma seqüência de nucleotídeos não relacionada com as se-qüências flanqueadoras ou do DNA estranho, tal como, por exemplo, umaseqüência de nucleotídeos que representa os sítios de reconhecimento deenzimas de restrição. Tais seqüências não relacionadas ou seqüências deDNA flanqueadoras com pareamentos errados não devem preferencialmenteser mais longas que 100, mais preferencialmente não ser mais longas que50 ou ainda 25 nucleotídeos.

Além disso, os iniciadores adequados podem compreender ouconsistir de uma seqüência de nucleotídeos em sua extremidade a 3' abran-gendo a região de união entre as seqüências derivadas do DNA planta e asseqüências do DNA estranho (localizada nos nucleotídeos 732-733 na SEQID N2: 1 e nos nucleotídeos 430-431 na SEQ ID N-: 2) contanto que os 17nucleotídeos consecutivos localizados a 3' mencionados não sejam deriva-dos exclusivamente das seqüências do DNA estranho ou derivadas da plan-ta na SEQ ID N2: 1 ou 2.

Será ainda imediatamente evidente ao perito na técnica que ospares de iniciadores da PCR selecionados apropriadamente não devem tam-bém compreender seqüências complementares uma às outras.

Para a finalidade da invenção, o "complemento de uma seqüên-cia de nucleotídeos representada na SEQ ID N2: X" é a seqüência de nucleo-tídeos que pode ser derivada da seqüência de nucleotídeos representadaatravés da substituição dos nucleotídeos pelo seu nucleotídeo complementarde acordo com as regras de Chargaff (AoT; G<=>C) e lendo a seqüência nadireção 5' para 3', isto é, na direção oposta da seqüência de nucleotídeosrepresentada.

Os exemplos de iniciadores adequados são as seqüências deoligonucleotídeos da SEQ ID No 3 (iniciadores que reconhecem a seqüênciaflanqueadora a 5'), da SEQ ID No 4, da SEQ ID No 5, da SEQ ID No 6 (inici-adores que reconhecem o DNA estranho para uso com os iniciadores quereconhecem a seqüência flanqueadora a 5'), da SEQ ID No 7, da SEQ ID No8, da SEQ ID No 9 (iniciadores que reconhecem o DNA estranho para usocom os iniciadores que reconhecem a seqüência flanqueadora a 3') ou daSEQ ID No 10 (iniciadores que reconhecem a seqüência flanqueadora a 3').

Outros exemplos de iniciadores de oligonucleotídeo adequadoscompreendem em sua extremidade a 3' as seqüências a seguir ou consis-tem de tais seqüências:a. iniciadores que reconhecem a seqüência flanqueadora a 5':

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 258 até o nucleotídeo 277

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 310 até o nucleotídeo 329

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 311 até o nucleotídeo 330

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 507 até o nucleotídeo 526

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 616 até o nucleotídeo 635

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 256 até o nucleotídeo 275

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 259 até o nucleotídeo 277

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 260 até o nucleotídeo 279

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 309 até o nucleotídeo 329

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 310 até o nucleotídeo 330

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 311 até o nucleotídeo 329

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 312 até o nucleotídeo 330

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 436 até o nucleotídeo 455

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 34 até o nucleotídeo 53

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 130 até o nucleotídeo 148

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 139 até o nucleotídeo 158

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 256 até o nucleotídeo 277

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 259 até o nucleotídeo 279

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 260 até o nucleotídeo 277

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 261 até o nucleotídeo 279

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 266 até o nucleotídeo 285

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 308 até o nucleotídeo 329

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 309 até o nucleotídeo 330

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 312 até o nucleotídeo 329

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 313 até o nucleotídeo 330

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 435 até o nucleotídeo 455

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 501 até o nucleotídeo 518

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 509 até o nucleotídeo 526

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 513 até o nucleotídeo 532

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 528 até o nucleotídeo 547

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 529 até o nucleotídeo 547

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 602 até o nucleotídeo 621

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 21 até o nucleotídeo 40

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 35 até o nucleotídeo 54

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 129 até o nucleotídeo 149

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 134 até o nucleotídeo 153

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 138 até o nucleotídeo 158

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 140 até o nucleotídeo 158

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 150 até o nucleotídeo 169

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 186 até o nucleotídeo 205

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 254 até o nucleotídeo 275

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 258 até o nucleotídeo 279

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 262 até o nucleotídeo 279

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 434 até o nucleotídeo 455

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 512 até o nucleotídeo 532

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 515 até o nucleotídeo 532

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 530 até o nucleotídeo 547

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 22 até o nucleotídeo 40

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 32 até o nucleotídeo 53

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 34 até o nucleotídeo 54

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 82 até o nucleotídeo 99

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 128 até o nucleotídeo 149

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 135 até o nucleotídeo 153

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 137 até o nucleotídeo 158

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 141 até o nucleotídeo 158

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 141 até o nucleotídeo 161

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 168 até o nucleotídeo 187

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 185 até o nucleotídeo 205

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 187 até o nucleotídeo 205

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 264 até o nucleotídeo 285

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 511 até o nucleotídeo 532

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 522 até o nucleotídeo 541

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 527 até o nucleotídeo 547

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 19 até o nucleotídeo 40

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 22 até o nucleotídeo 43

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-5 cleotídeo 23 até o nucleotídeo 40

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 33 até o nucleotídeo 54

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 132 até o nucleotídeo 153

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 136 até o nucleotídeo 153

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 140 até o nucleotídeo 161

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 150 até o nucleotídeo 171

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 169 até o nucleotídeo 188

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 169 até o nucleotídeo 187

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 171 até o nucleotídeo 189

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 173 até o nucleotídeo 193

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 184 até o nucleotídeo 205

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 188 até o nucleotídeo 205

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 521 até o nucleotídeo 541

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 523 até o nucleotídeo 541

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 602 até o nucleotídeo 623

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 97 até o nucleotídeo 118

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 168 até o nucleotídeo 188

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 170 até o nucleotídeo 187

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 170 até o nucleotídeo 188

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 172 até o nucleotídeo 189

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 172 até o nucleotídeo 193

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 520 até o nucleotídeo 541

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 91 até o nucleotídeo 110

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 167 até o nucleotídeo 188

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 171 até o nucleotídeo 188

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 176 até o nucleotídeo 197

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 90 até o nucleotídeo 110

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 92 até o nucleotídeo 110

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 300 até o nucleotídeo 319

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 89 até o nucleotídeo 110

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 93 até o nucleotídeo 110

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 298 até o nucleotídeo 319

b. iniciadores que reconhecem a seqüência do DNA estranho pa-ra uso com os iniciadores que reconhecem a seqüência flanqueadora a 5':

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 897 até o nucleotídeo 916

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 1010 até o nucleotídeo 1029

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No

1 partindo do nucleotídeo 897 até o nucleotídeo 914

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 899 até o nucleotídeo 916

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No

1 partindo do nucleotídeo 949 até o nucleotídeo 966

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 1010 até o nucleotídeo 1028

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 1008 até o nucleotídeo 1027

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No

1 partindo do nucleotídeo 1010 até o nucleotídeo 1029

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 861

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No

-1 partindo do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 860

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No

-1 partindo do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 862

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No

-1 partindo do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 859

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No

1 partindo do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 863

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 920 até o nucleotídeo 939

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 920 até o nucleotídeo 937

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 1004 até o nucleotídeo 1023

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 1004 até o nucleotídeo 1024

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 1004 até o nucleotídeo 1021

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No1 partindo do nucleotídeo 1004 até o nucleotídeo 1025

c. iniciadores que reconhecem a seqüência flanqueadora a 3':

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No2 partindo do nucleotídeo 432 até o nucleotídeo 453

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No2 partindo do nucleotídeo 421 até o nucleotídeo 442

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No2 partindo do nucleotídeo 433 até o nucleotídeo 452

- o complemento da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No2 partindo do nucleotídeo 433 até o nucleotídeo 453

d. iniciadores que reconhecem a seqüência do DNA estranho pa-ra uso com os iniciadores que reconhecem a seqüência flanqueadora a 3':

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 1 até o nucleotídeo 20

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 18 até o nucleotídeo 37

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 20 até o nucleotídeo 39

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 14 até o nucleotídeo 33

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 17 até o nucleotídeo 37- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 19 até o nucleotídeo 37

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 21 até o nucleotídeo 40

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 21 até o nucleotídeo 39

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 50 até o nucleotídeo 67

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 71 até o nucleotídeo 90

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 74 até o nucleotídeo 93

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 96 até o nucleotídeo 115

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 13 até o nucleotídeo 33

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 15 até o nucleotídeo 33

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 16 até o nucleotídeo 37

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 19 até o nucleotídeo 39

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 20 até o nucleotídeo 37

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 20 até o nucleotídeo 40

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 22 até o nucleotídeo 39

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 22 até o nucleotídeo 40

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 28 até o nucleotídeo 47<table>table see original document page 25</column></row><table>- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 41 até o nucleotídeo 59

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 42 até o nucleotídeo 59

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 69 até o nucleotídeo 90

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 71 até o nucleotídeo 91

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 72 até o nucleotídeo 93

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 73 até o nucleotídeo 91

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 73 até o nucleotídeo 90

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 74 até o nucleotídeo 94

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 94 até o nucleotídeo 115

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 189 até o nucleotídeo 208

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 339 até o nucleotídeo 359

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 341 até o nucleotídeo 359

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 358 até o nucleotídeo 377

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 366 até o nucleotídeo 385

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 424 até o nucleotídeo 445

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 26 até o nucleotídeo 47- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 30 até o nucleotídeo 47

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 36 até o nucleotídeo 56

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 38 até o nucleotídeo 56

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 39 até o nucleotídeo 59

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 41 até o nucleotídeo 60

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 70 até o nucleotídeo 91

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 73 até o nucleotídeo 94

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 74 até o nucleotídeo 91

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 338 até o nucleotídeo 359

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 342 até o nucleotídeo 359

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 357 até o nucleotídeo 377

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 359 até o nucleotídeo 377

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 367 até o nucleotídeo 385

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 367 até o nucleotídeo 386

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 35 até o nucleotídeo 56

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 38 até o nucleotídeo 59- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 356 até o nucleotídeo 377

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 360 até o nucleotídeo 377

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 364 até o nucleotídeo 385

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 366 até o nucleotídeo 386

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 368 até o nucleotídeo 385

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 368 até o nucleotídeo 386

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 407 até o nucleotídeo 428

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 40 até o nucleotídeo 61

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 365 até o nucleotídeo 384

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 369 até o nucleotídeo 386

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 422 até o nucleotídeo 443

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 367 até o nucleotídeo 387

- a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 366 até o nucleotídeo 387

Como utilizado aqui, "a seqüência de nucleotídeos da SEQ IDNo. Z partindo da posição X até a posição Y" indica a seqüência de nucleotí-deos que inclui ambos os pontos extremos de nucleotídeos.

Preferencialmente, o fragmento de integração possui um com-primento entre 50 e 500 nucleotídeos, mais preferencialmente entre 100 e350 nucleotídeos. Qs iniciadores específicos podem ter uma seqüência queé entre 80 e 100% idêntica a uma seqüência dentro da região flanqueadoraa 5' ou a 3' do evento de elite e do DNA estranho do evento de elite, respec-tivamente, contanto que os pareamentos errados ainda permitam a identifi-cação específica do evento de elite com estes iniciadores sob condições o-timizadas da PCR. A faixa de pareamentos que podem ser permitidos, entre-tanto, pode ser facilmente determinada experimentalmente e é conhecidapor um perito na técnica.

A tabela a seguir exemplifica os tamanhos de amplicons de DNAesperados (ou fragmentos de integração) com pares selecionados de inícia-dores da PCR.

<table>table see original document page 29</column></row><table>

A detecção dos fragmentos de integração pode ocorrer de váriasmaneiras, por exemplo, através de uma estimativa de tamanho após a análi-se em gel. Os fragmentos de integração também podem ser diretamente se-qüenciados. Outros métodos específicos em relação às seqüências para adetecção de fragmentos de DNA amplificados também são conhecidos natécnica.

Uma vez que a seqüência dos iniciadores e sua localização rela-tiva no genoma são exclusivas para o evento de elite, a amplificação dofragmento de integração ocorrerá apenas em amostras biológicas que com-preendem (o ácido nucléico de) o evento de elite. Preferencialmente, quandouma PCR é realizada para a identificação da presença de EE-GH3 em a -mostras desconhecidas, é incluído um controle de um conjunto de iniciado-res com o qual um fragmento dentro de um "gene de "housekeeping" da es-pécie planta do evento pode ser amplificado. Os genes de "housekeeping"são genes que são expressos na maior parte dos tipos celulares e que estãorelacionados às atividades metabólicas básicas comuns a todas as células.

Preferencialmente, o fragmento amplificado partindo do gene de manuten-ção da casa é um fragmento que é maior que o fragmento de integraçãoamplificado. Dependendo das amostras que serão analisadas, outros contro-les podem ser incluídos.

Os protocolos padronizados de PCR são descritos na técnica, talcomo no "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2- Edi-ção, 1999). As condições ótimas para a PCR, incluindo a seqüência dos ini-ciadores específicos, são especificadas em um "protocolo de identificaçãopela PCR" para cada evento de elite. É, entretanto, entendido que pode sernecessário que um número de parâmetros no protocolo de identificação pelaPCR seja ajustado a condições de laboratório específicas e pode ser modifi-cado ligeiramente para a obtenção de resultados similares. Por exemplo, ouso de um método diferente para a preparação de DNA pode requerer o a-juste, por exemplo, da quantidade de iniciadores, da polimerase e das condi-ções de anelamento utilizadas. Similarmente, a seleção de outros iniciadorespode determinar outras condições ótimas para o protocolo de identificaçãopela PCR. Estes ajustes serão, entretanto, evidentes a um perito na técnicae estão, além disso, detalhados nos manuais de aplicação da PCR atuais talcomo um citado acima.

Alternativamente, os iniciadores específicos podem ser utilizadospara a amplificação de um fragmento de integração que pode ser utilizadocomo uma "sonda específica" para a identificação de EE-GH3 em amostrasbiológicas. O contato do ácido nucléico de uma amostra biológica, com asonda, sob condições que permitem a hibridização da sonda com seu frag-mento correspondente no ácido nucléico, resulta na formação de um híbridode ácido nucléico/sonda. A formação deste híbrido pode ser detectada (porexemplo, através da marcação do ácido nucléico ou da sonda), em que aformação deste híbrido indica a presença de EE-GH3. Tais métodos de iden-tificação baseados na hibridização com uma sonda específica (sobre umveículo em fase sólida ou em solução) foram descritos na técnica. A sondaespecífica é preferencialmente uma seqüência que, sob condições otimiza-das, se hibridiza especificamente com uma região dentro de uma regiãoflanqueadora a 5' ou a 3' do evento de elite e preferencialmente compreen-dendo ainda parte do DNA estranho contíguo com a mesma (referida poste-riormente aqui como "região específica"). Preferencialmente, a sonda espe-cífica compreende uma seqüência entre 50 e 500 pb, preferencialmente de-100 até 350 pb que é pelo menos 80%, preferencialmente entre 80 e 85%,mais preferencialmente entre 85 e 90%, especialmente preferencialmenteentre 90 e 95%, mais preferencialmente entre 95% e 100% idêntica (oucomplementar) à seqüência de nucleotídeos de uma região específica. Pre-ferencialmente, a sonda específica compreenderá uma seqüência de apro-ximadamente 15 até aproximadamente 100 nucleotídeos contíguos idênticos(ou complementares) a uma região específica do evento de elite.

Os oligonucleotídeos adequados como iniciadores da PCR paraa detecção do evento de elite EE-GH3 também podem ser utilizados para odesenvolvimento de um protocolo baseado na PCR para determinar o statusde zigosidade do evento de elite. Para esta finalidade, dois iniciadores quereconhecem o lócus do tipo selvagem são planejados de tal forma que sãodirecionados um ao outro e possuem o sítio de inserção localizado entre osiniciadores. Estes iniciadores podem ser iniciadores que reconhecem especi-ficamente as seqüências flanqueadoras a 5' e a 3' contidas dentro da SEQID NO 1 ou 2, respectivamente. Este conjunto de iniciadores, junto com umterceiro iniciador complementar às seqüências de DNA de transformação edirecionado para um do DNA flanqueador, permite a amplificação pela PCRdiagnostica do lócus específico de EE-GH3, assim como do lócus do tiposelvagem. Se a planta for homozigota em relação ao lócus transgênico ou aolócus do tipo selvagem correspondente, a PCR diagnostica dará origem aum único produto da PCR típico, preferencialmente típico em comprimento,para o lócus transgênico ou do tipo selvagem. Se a planta for hemizogotaem relação ao lócus transgênico, dois produtos da PCR específicos aos lóciaparecerão, refletindo a amplificação do lócus tanto transgênico quanto dotipo selvagem.

Além disso, métodos de detecção específicos para o evento deelite EE-GH3 que diferem dos métodos de amplificação baseados na PCRtambém podem ser desenvolvidos utilizando a informação de seqüência es-pecífica ao evento de elite fornecida aqui. Tais métodos de detecção alternati-vos incluem métodos de detecção da amplificação de sinal linear baseados naclivagem invasiva de estruturas de ácidos nucléicos particulares, também co-nhecidos como a tecnologia InvaderTM, (como descrito, por exemplo, na PatenteU.S. N2 5.985.557 "Invasive Cleavage of Ácidos nucléicos", 6.001.567 "Detecti-on of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage", incorporadasaqui como referência). Para esta finalidade, a seqüência alvo pode ser hibri-dizada com um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucléico marcado quecompreende a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu-cleotídeo 733 até o nucleotídeo 750 ou seu complemento ou a dita sonda deácido nucléico marcada que compreende a seqüência de nucleotídeos daSEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 413 até o nucleotídeo 430 ou seucomplemento e é adicionalmente hibridizada com um segundo oligonucleotí-deo de ácido nucléico que compreende a seqüência de nucleotídeos da SEQID No 1 partindo do nucleotídeo 715 até o nucleotídeo 732 ou seu comple-mento ou a dita sonda de ácido nucléico marcada que compreende a se-qüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431 até onucleotídeo 448 ou seu complemento, em que os primeiro e segundo oligo-nucleotídeos se sobrepõem em pelo menos um nucleotídeo. A estrutura emdúplex ou em triplex que é produzida através dessa hibridização permite aclivagem seletiva da sonda com uma enzima (Cleavase®) deixando a se-qüência alvo intacta. A sonda marcada clivada é subseqüentemente detec-tada, potencialmente através de uma etapa intermediária que resulta emuma amplificação adicional de sinal.

Um "estojo" como utilizado aqui refere-se a um conjunto de rea-gentes com a finalidade de realizar o método da invenção, mais particular-mente, a identificação do evento de elite EE-GH3 em amostras biológicas oua determinação do status de zigosidade do material de planta que contémEE-GH3. Mais particularmente, uma modalidade preferida do estojo da in-venção compreende pelo menos um ou dois iniciadores específicos, comodescrito anteriormente, para a identificação do evento de elite ou três inicia-dores específicos para a determinação do status de zigosidade. Opcional-mente, o estojo pode compreender ainda qualquer outro reagente descritoaqui no protocolo de identificação pela PCR. Alternativamente, de acordocom uma outra modalidade desta invenção, o estojo pode compreender umasonda específica, como descrito anteriormente, que se hibridiza especifica-mente com o ácido nucléico de amostras biológicas para a identificação dapresença de EE-GH3 nas mesmas. Opcionalmente, o estojo pode compre-ender ainda qualquer outro reagente (tal como, mas não limitado ao tampãode hibridização, à marcação) para a identificação de EE-GH3 em amostrasbiológicas, utilizando a sonda específica.

O estojo da invenção pode ser utilizado e seus componentespodem ser especificamente ajustados, com a finalidade de controle de quali-dade (por exemplo, pureza de lotes de sementes), para a detecção da pre-sença ou da ausência do evento de elite no material de planta ou de materialque compreende ou é derivado do material de planta, tal como, mas não li-mitado a alimentos ou produtos alimentícios.

Como utilizado aqui, "identidade de seqüência" em relação àsseqüências de nucleotídeos (DNA ou RNA), refere-se ao número de posi-ções com nucleotídeos indênticos dividido pelo número de nucleotídeos namais curta das duas seqüências. O alinhamento das duas seqüências denucleotídeos é realizado através do algoritmo de Wilbur e Lipmann (Wilbur eLipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80: 726) utilizando um tamanhode janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeose uma penalidade de espaço de 4. A análise auxiliada por computador e ainterpretação de dados de seqüências, incluindo o alinhamento de seqüênciascomo descrito anteriormente, podem, por exemplo, ser convenientemente rea-Iizadas utilizando o pacote de software de análise de seqüências do Gene-ties Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology center).

As seqüências são indicadas como "essencialmente similares" quando taisseqüências possuírem uma identidade de seqüência de pelo menos aproxi-madamente 75%, particularmente pelo menos aproximadamente 80%, maisparticularmente pelo menos aproximadamente 85%, muito particularmenteaproximadamente 90%, especialmente aproximadamente 95%, mais especi-almente aproximadamente 100%. É evidente que quando é dito que as se-qüências de RNA são essencialmente similares ou possuem um certo graude identidade de seqüência com as seqüências de DNA, a timidina (T) naseqüência de DNA é considerada equivalente à uracila (U) na seqüência de RNA.

O termo "iniciador" como utilizado aqui abrange qualquer ácidonucléico que seja capaz de iniciar a síntese de um ácido nucléico nascenteem um processo dependente de molde, tal como PCR. Tipicamente, os inici-adores são oligonucleotídeos de 10 até 30 nucleotídeos, mas seqüênciasmais longas podem ser empregadas. Os iniciadores podem ser fornecidosna forma de filamento duplo, embora a forma de filamento simples seja pre-ferida. As sondas podem ser utilizadas como iniciadores, mas são planeja-das para se ligarem ao DNA ou ao RNA alvo e não precisam ser utilizadasem um processo de amplificação.

O termo "reconhecimento" como utilizado aqui quando refere-sea iniciadores específicos, refere-se ao fato de que os iniciadores específicosse hibridizam especificamente a uma seqüência de ácido nucléico no eventode elite sob as condições apresentadas no método (tais como as condiçõesdo protocolo de identificação pela PCR), em que a especificidade é determi-nada pela presença de controles positivos e negativos.

O termo "hibridização" como utilizado aqui quando refere-se asonda específicas, refere-se ao fato de que a sonda se liga a uma regiãoespecífica na seqüência de ácido nucléico do evento de elite sob condiçõesde estringência padronizadas. As condições de estringência padronizada,como utilizado aqui, refere-sem às condições para hibridização descritas a-qui ou às condições de hibridização convencionais como descrito por Sam-brook e outros, 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda E-dição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que, por exemplo, podemcompreender as etapas a seguir: 1) imobilização dos fragmentos de DNAgenômico planta em um filtro, 2) pré-hibridização do filtro durante 1 até 2horas a 42°C em 50% de formamida, 5 X SSPE, 2 X reagente de Denhardt e0,1% de SDS ou durante 1 até 2 horas a 68°C em 6 X SSC, 2 X reagente deDenhardt e 0,1% SDS, 3) adição da sonda de hibridização que foi marcada,4) incubação durante 16 até 24 horas, 5) lavagem do filtro durante 20 min àtemperatura ambiente em 1X SSC, 0,1% de SDS, 6) lavagem do filtro trêsvezes durante 20 min cada a 68°C em 0,2 X SSC, 0,1 % de SDS e 7) exposi-ção do filtro durante 24 até 48 horas a um filme de raio X a -70°C com umatela de intensificação.

Como utilizado aqui, uma amostra biológica é uma amostra deuma planta, material de planta ou produtos que compreendem material deplanta. É pretendido que o termo "planta" abranja tecidos de plantas de al-godão (Gossypium hirsitum), em qualquer estágio de maturidade, assim co-mo quaisquer células, tecidos ou órgãos tirados ou derivados de qualquer talplanta, incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores,raízes, células isoladas, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ouprotoplastos. "Material de planta", como utilizado aqui refere-se ao materialque é obtido ou derivado de uma planta. Os produtos que compreendemmaterial de planta refere-sem a alimentos, produtos alimentícios ou outrosprodutos que são produzidos utilizando material de planta ou que podem sercontaminados por material de planta. É entendido que, no contexto da pre-sente invenção, tais amostras biológicas são testadas em relação à presen-ça de ácidos nucléicos específicos para EE-GH3, implicando a presença deácidos nucléicos nas amostras. Assim, os métodos referidos aqui para a i-dentificação do evento de elite EE-GH3 em amostras biológicas, refere-semà identificação em amostras biológicas de ácidos nucléicos que compreen-dem o evento de elite.

Como utilizado aqui "compreendendo" deve ser interpretado co-mo especificando a presença das características, dos números inteiros, dasetapas, dos reagentes ou dos componentes citados como referido, mas nãoimpede a presença ou a adição de uma ou mais características, númerosinteiros, etapas ou componentes ou grupos dos mesmos. Assim, por exem-plo, um ácido nucléico ou uma proteína que compreende uma seqüência denucleotídeos ou de aminoácidos, pode compreender mais nucleotídeos ouaminoácidos que os realmente citados, isto é, podem estar embutidos emum ácido nucléico ou em uma proteína maior. Um gene quimérico que com-preende uma seqüência de DNA que é funcionalmente ou estruturalmentedefinida, pode compreender seqüências adicionais de DNA etc.

A presente invenção refere-se ainda ao desenvolvimento de umevento de elite EE-GH3 no algodão nas plantas que compreendem este e-vento, na progênie obtida partindo destas plantas e nas células vegetais ouno material de planta derivado deste evento. As plantas que compreendem oevento de elite EE-GH3 foram obtidas como descrito no exemplo 1.

As plantas de algodão ou o material de planta que compreendeEE-GH3 pode ser identificado de acordo com o protocolo de identificaçãopela PCR descrito para EE-GH3 no Exemplo 2. Sucintamente, o DNA genô-mico do algodão presente na amostra biológica é amplificado pela PCR utili-zando um iniciador que reconhece especificamente uma seqüência dentroda seqüência flanqueadora a 5' ou a 3' de EE-GH3 tal como o iniciador coma seqüência da SEQ ID NO: 3 e um iniciador que reconhece uma seqüênciano DNA estranho, tal como o iniciador com a seqüência da SEQ ID NO: 11.

Os iniciadores de DNA que amplificam parte de uma seqüência endógena doalgodão são utilizados como o controle positivo para a amplificação pelaPCR. Se após a amplificação pela PCR, o material fornecer um fragmentodo tamanho esperado, o material contém o material de planta de uma plantade algodão que carrega o evento de elite EE-GH3.

As plantas que carregam EE-GH3 são caracterizadas por suatolerância ao glifosato, que no contexto da presente invenção inclui tais plan-tas que são tolerantes ao herbicida Glifosato. As plantas que carregam EE-GH3 são também caracterizadas por possuírem características agronômicasque podem ser comparadas com as das variedades disponíveis comercial-mente de algodão nos EUA, na ausência de pressão por ervas daninhas euso de glifosato para o controle de ervas daninhas. Foi observado que apresença de um DNA estranho na região de inserção do genoma da plantade algodão descrita aqui, confere características fenotípicas e molecularesparticularmente interessantes às plantas que compreendem este evento.

A presente invenção fornece ainda o DNA genômico que com-preende o evento de elite EE-GH3, como definido aqui, que pode ser utiliza-do como material de referência nos estojos de identificação.

Os exemplos a seguir descrevem a identificação do evento deelite EE-GH3 e o desenvolvimento de ferramentas para a identificação espe-cífica do evento de elite EE-GH3 em amostras biológicas.

A não ser que seja citado de outra maneira, todas as técnicas doDNA recombinante são realizadas de acordo com os protocolos padroniza-dos como descrito em Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Labo-ratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NYe nos Volumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Protocols in Mole-cular Biology, Current Protocols, USA. Os materiais e os métodos padroni-zados para o trabalho molecular em plantas são descritos em Plant Molecu-lar Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy publicado por BIOS Scientific Pu-blications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications, Reino Unido.

Na descrição e nos exemplos, é feita referência às seqüências aseguir:

SEQ ID No. 1: seqüência de nucleotídeos que compreende uma regiãoflanqueadora a 5' de EE-GH3

SEQ ID No. 2: seqüência de nucleotídeos que compreende uma regiãoflanqueadora a 3' de EE-GH3

SEQ ID No. 3: iniciador GH1043

SEQ ID No. 4: iniciador SB327

SEQ ID No. 5: iniciador MAE080

SEQ ID No. 6: iniciador MAE081

SEQ ID No. 7: iniciador MAE078

SEQ ID No. 8: iniciador MAE070

SEQ ID No. 9: iniciador MAE071

SEQ ID No. 10: iniciador MAE121SEQ ID No. 11: iniciador GHI044

SEQ ID No. 12: iniciador 1 para a amplificação do fragmento de controle

SEQ ID No. 13: iniciador 2 para a amplificação do fragmento de controle

Exemplos

1. Identificação do evento de elite EE-GH3

O algodão resistente a herbicida foi desenvolvido através datransformação do algodão com um vetor que compreende a seqüência codifi-cadora de um gene epsps modificado que codifica uma enzima EPSPS toleran-te ao glifosato, sob o controle de um promotor de um gene de histona comodescrito na Patente U.S. N- 5.491.288 ou na Patente U.S. N- 5.792.930.

O evento de elite EE-GH3 foi selecionado com base em um pro-cedimento de seleção extensivo baseado na boa expressão e estabilidadedo gene de resistência ao herbicida e foi avaliada a sua compatibilidade comcaracterísticas agronômicas ótimas tais como altura da planta, altura do nó,retenção de cápsula, suporte, vigor, comprimento de fibra, resistência defibra e rendimento de fibra de algodão.

O evento selecionado foi introduzido em bases genéticas fun-damentais comerciais diferentes e os resultados de testes de campo em lo-calizações diferentes foram comparados. As plantas foram borrifadas com oherbicida utilizando tratamentos diferentes.

Nenhum dano visível como um resultado da aplicação de herbi-cida foi alguma vez observado após a aplicação independentemente da taxaou do estágio de desenvolvimento no momento da aplicação. Não havia efei-tos prejudiciais sobre a morfologia ou a forma de crescimento de plantas pe-la aplicação do herbicida.

Além disso, o evento possuía morfologia normal de folha, flor ecápsula, excelente fertilidade e não exibia doença ou susceptibilidade anor-mal a insetos em várias bases genéticas fundamentais. Durante a introgres-são nas várias bases genéticas fundamentais não foram observados quais-quer problemas ou anormalidades aberrantes.

2. Identificação das regiões flanqueadoras do evento de eliteEE-GH3A seqüência das regiões flanqueadoras do DNA estranho no e-vento de elite EE-GH3 foi determinada utilizando o método de PCR entrela-çada assimétrica térmica (TAIL) descrito por Liu e outros (1995, Plant J. 8(3):457-463). Este método utiliza três iniciadores aninhados em reações suces-sivas junto com um iniciador degenerado arbitrário mais curto de forma queas eficiências relativas de amplificação de produtos específicos e não espe-cíficos possam ser termicamente controladas. Os iniciadores específicos fo-ram selecionados para o anelamento com a borda do DNA estranho e base-ados em suas condições de anelamento. Uma pequena quantidade (5 jjL) deprodutos da PCR secundários e terciários não purificados foi analisada emum gel de agarose a 1%. O produto terciário da PCR foi purificado e se-qüenciado.

2.1. Região flanqueadora à direita (5')

O fragmento identificado como compreendendo a região flan-queadora a 5' obtido através do método de TAIL-PCR foi seqüenciado (SEQID N2: 1). A seqüência entre os nucleotídeos 1 e 732 corresponde ao DNAplanta, enquanto que a seqüência entre os nucleotídeos 733 e 1214 corres-ponde ao DNA estranho.

2.2. Região flanqueadora à esquerda (3')

O fragmento identificado como compreendendo a região flan-queadora a 3' obtido através do método de TAIL-PCR foi seqüenciado (SEQID N-: 2). A seqüência entre os nucleotídeos 1 e 430 corresponde ao DNAestranho, enquanto que a seqüência entre os nucleotídeos 431 e 654 cor-responde ao DNA planta.

3. Desenvolvimento de um protocolo de identificação pela rea-ção em Cadeia da Polimerase para EE-GH3

3.1. Iniciadores

Foram desenvolvidos iniciadores específicos que reconhecemseqüências dentro do evento de elite. Mais particularmente, foi desenvolvidoum iniciador que reconhece uma seqüência dentro da região flanqueadora a5' de EE-GH3. Foi então selecionado um segundo iniciador dentro da se-qüência do DNA estranho de forma que os iniciadores abrangessem umaseqüência de aproximadamente 334 nucleotídeos. Foi descoberto que osiniciadores a seguir forneciam resultados particularmente claros e que podi-am ser reproduzidos em uma reação da PCR sobre o DNA de EE-GH3:

GHI043: 5'-TTC.AgC.CgC.CAT.TgA.TgA.Ag-3' (SEQ ID No.: 3)(alvo: DNA planta)

GH1044: 5'-gTg.TAT.CCA.TgC.CTC.gAC.TC-3' (SEQ ID No.: 11)(alvo: DNA do inserto)

Os iniciadores de marcação que se direcionam a uma seqüênciaendógena são preferencialmente incluídos no coquetel da PCR. Estes inicia-dores servem como um controle interno em amostras desconhecidas e nocontrole positivo de DNA. Um resultado positivo com o par de iniciadoresendógenos demonstra que há DNA abundante de qualidade adequada napreparação de DNA genômico para um produto da PCR que será gerado. Osiniciadores endógenos foram selecionados para reconhecer um gene de"housekeeping" no algodão:

GHI001: 5'-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3' (SEQ ID No.: 12)GHI002: 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3' (SEQ ID No.: 13)

3.2. Fragmentos amplificados

Os fragmentos amplificados esperados na reação da PCR são:

Para o par de iniciadores GHI001-GHI002: 445 pb (controle endógeno)

Para o par de iniciadores GHI043-GHI044: 334 pb (evento de elite EE-GH3)

3.3. DNA Molde

O DNA molde foi preparado partindo de uma punção de folha deacordo com Edwards e outros (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991).Quando se utiliza o DNA preparado com outros métodos, deve ser feita umacorrida de teste utilizando quantidades diferentes do molde. Geralmente 50ng do DNA genômico molde produzem os melhores resultados.

3.4. Controles positivo e negativo atribuídos

Para evitar falsos positivos ou negativos, foi determinado que oscontroles positivo e negativo a seguir deviam ser incluídos em uma corridade PCR:

Controle do Master Mix (controle negativo de DNA). Esta é umaPCR em que nenhum DNA é adicionado na reação. Quando no resultadoesperado não for observado qualquer produto da PCR isto indica que o co-quetel da PCR não estava contaminado com o DNA alvo.

Um controle positivo de DNA (amostra de DNA genômico co-nhecido por conter as seqüências transgênicas). A amplificação bem-sucedida deste controle positivo demonstra que a PCR foi corrida sob condi-ções que permitem a amplificação das seqüências alvo.

- Um controle do DNA do tipo selvagem. Esta é uma PCR emque o DNA molde fornecido é o DNA genômico preparado partindo de umaplanta não transgênica. Quando no resultado esperado não for observadaamplificação de um produto da PCR do transgene, mas sim a amplificaçãodo produto da PCR endógeno, isto indica que não ocorre amplificação dabase fundamental de transgene detectável em uma amostra de DNA genômico.

3.5. Condições da PCR

Foram obtidos resultados ótimos sob as condições a seguir:

- o mix da PCR para reações de 25 pL contém:2,5 uL de DNA molde

2,5 uL de 10x Tampão de Amplificação (fornecido pelo fabricantecom a Taq polimerase)

0,5 uL de 10 mM de dNTP's0,5 uL de GHI001 (10 pmols/^iL)0,5 nL de GHI002 (10 pmols/^L)0,25 uL de GHI044 (10 pmols/(iL)0,25 uL de GHI043 (10 pmols/^iL)0,1 uL de Taq DNA polimerase (5 unidades/nL)água até 25 ^L

- o perfil de termociclagem a ser seguido para resultados ótimos é oseguinte:

<table>table see original document page 41</column></row><table>2 min a 72°C

Durante 5 ciclos

Seguidos por: 30 s a 92°C

30 s a 57°C

1 min a 72°C

Durante 25 ciclos

Seguidos por: 10 minutos a 72°C

3.6. Análise em gel de agarose

Para visualizar de forma ótima os resultados da PCR foi deter-minado que entre 10 e 20 ^iL das amostras da PCR devem ser aplicados emum gel de agarose a 1,5% (tampão Tris-borato) com um marcador de pesomolecular apropriado (por exemplo, "escada" de 100 pb PHARMACIA).

3.7. Validação dos resultados

Foi determinado que os dados provenientes de amostras deDNA de plantas transgênicas dentro de uma única corrida de PCR e um úni-co coquetel de PCR não deveriam ser aceitáveis a não ser que 1) o controlepositivo de DNA exibisse os produtos da PCR esperados (fragmentos trans-gênicos e endógenos), 2) o controle negativo de DNA fosse negativo em re-lação à amplificação pela PCR (nenhum fragmento) e 3) o controle de DNAdo tipo selvagem exibisse o resultado esperado (amplificação do fragmentoendógeno).

Quando o Protocolo de Identificação pela PCR for seguido paraEE-GH3 como descrito anteriormente, faixas exibindo quantidades visíveisdos produtos da PCR transgênicos e endógenos dos tamanhos esperadosindicam que a planta correspondente da qual o DNA genômico molde foipreparado, herdou o evento de elite EE-GH3. As faixas que não exibemquantidades visíveis de qualquer um dos produtos da PCR transgênicos eexibindo quantidades visíveis do produto da PCR endógeno, indicam que aplanta correspondente da qual o DNA genômico molde foi preparado, nãocompreende o evento de elite. As faixas que não exibem quantidades visí-veis dos produtos da PCR endógenos e transgênicos indicam que a qualida-de e/ou a quantidade do DNA genômico não permitiu que um produto daPCR fosse gerado. Estas plantas não podem ser classificadas. A preparaçãodo DNA genômico deve ser repetida e uma nova corrida da PCR, com oscontroles apropriados, tem que ser realizada.

3.8. Uso do protocolo de PCR descriminante para a identificaçãode EE-GH3

Antes de tentar verificar amostras desconhecidas, uma corridade teste, com todos os controles apropriados, tem que ser realizada. O pro-tocolo desenvolvido poderia requerer a otimização em relação aos compo-nentes que podem diferir entre laboratórios (preparação do DNA molde, TaqDNA polimerase, qualidade dos iniciadores, dNTP's, termociclador etc.).

A amplificação da seqüência endógena desempenha uma fun-ção no protocolo. Deve-se atingir condições de PCR e de termociclagem queamplificam quantidades equimolares da seqüência tanto endógena quantotransgênica em um molde de DNA genômico transgênico conhecido. Sempreque o fragmento endógeno alvo não for amplificado ou sempre que as se-qüências alvo não forem amplificadas com as mesmas intensidades de colo-ração com brometo de etídio, como julgado através da eletroforese em gelde agarose, pode ser necessária a otimização das condições da PCR.

O material foliar de um número de plantas de algodão, das quaisalgumas compreendendo EE-GH3, foi testado de acordo com o protocolodescrito anteriormente. As amostras do evento de elite EE-GH3 e do algo-dão do tipo selvagem foram tomadas como os controles positivo e negativo,respectivamente.

A Figura 2 ilustra o resultado obtido com o protocolo de identifi-cação pela PCR do evento de elite para EE-GH3 em um número de amos-tras de plantas de algodão. Foi observado que as amostras nas faixas 2 até4 contêm o evento de elite uma vez que a banda de 334 pb é detectada, en-quanto que as amostras nas faixas 5 até 12 não compreendem EE-GH3. Asfaixas 5 até 11 compreendem outros eventos de elite do algodão (incluindoplantas que compreendem genes quiméricos diferentes de tolerância ao gli-fosato), a faixa 12 representa um controle de algodão não transgênico; afaixa 13 representa a amostra do controle negativo (água) e as faixas 1 e 14representam o Marcador de Peso Molecular ("escada" de 100 pb).

4. Uso de um fragmento de integração específico como umasonda para a detecção de material compreendendo EE-GH3

Um fragmento de integração específico de EE-GH3 é obtido a-través da amplificação pela PCR utilizando os iniciadores específicosGHI043 (SEQ ID No. 3) e GHI044 (SEQ ID No. 11) ou através da síntesequímica e é marcado. Este fragmento de integração é utilizado como umasonda específica para a detecção de EE-GH3 em amostras biológicas. Oácido nucléico é extraído das amostras de acordo com procedimentos pa-dronizados. Este ácido nucléico é então colocado em contato com a sondaespecífica sob condições de hibridização que são otimizadas para permitir aformação de um híbrido. A formação do híbrido é então detectada para indi-car a presença do ácido nucléico de EE-GH3 na amostra. Opcionalmente, oácido nucléico nas amostras é amplificado utilizando os iniciadores específi-cos antes do contato com a sonda específica. Alternativamente, o ácido nu-cléico é marcado antes do contato com a sonda específica ao invés do frag-mento de integração. Opcionalmente, a sonda específica é ligada a um car-reador sólido (tal como, mas não limitado a um filtro, uma tira ou esferas),antes do contato com as amostras.

5. Protocolo para a determinação baseada na PCR do status dezigosidade do material de planta de algodão com EE-GH3

5.1. Iniciadores

Dois iniciadores que reconhecem as seqüências de nucleotídeosdo lócus do tipo selvagem antes da inserção do evento de elite, foram plane-jados de tal maneira que são direcionados um ao outro e possuem o sítio deinserção no meio. Este conjunto de iniciadores, junto com um terceiro inicia-dor complementar às seqüências do DNA estranho e direcionado para oDNA flanqueador, permite a amplificação simultânea pela PCR do lócus EE-GH3 assim como do lócus do tipo selvagem.

Foi observado que os iniciadores a seguir fornecem resultadosparticularmente claros e que podem ser reproduzidos em uma reação daPCR de classificação da zigosidade no DNA de EE-GH3:GHI043: 5'-TTC.AgC.CgC.CAT.TgA.TgA.Ag-3' (SEQ ID No.: 3)(alvo: DNA planta da seqüência flanqueadora a 3')

GH1044: 5'-gTg.TAT.CCA.TgC.CTC.gAC.TC-3* (SEQ ID No.: 11)(alvo: DNA do inserto)

MAE121: 5'-CCA.TTC.CgA.TCA.TCg.AgT.Tg-3' (SEQ ID No.: 10)(alvo: DNA planta da seqüência flanqueadora a 5')

5.2. Fragmentos amplificados

Os fragmentos amplificados esperados na reação da PCR são:

Para o par de iniciadores GHI043-MAE121: 454 pb (correspondendo aoamplication do lócus do tipo selvagem)

Para o par de iniciadores GHI043-GHI044: 334 pb (Evento de Elite EE-GH3)

5.3. DNAMoIde

O DNA molde foi preparado partindo de uma punção foliar deacordo com Edwards e outros (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991).

Quando se utiliza um DNA preparado com outros métodos, deve ser feitauma corrida de teste utilizando quantidades diferentes do molde. Geralmente50 ng do DNA genômico de molde fornecem os melhores resultados.

5.4. Controles positivo e negativo atribuídos

Para evitar falsos positivos ou negativos, é aconselhável que oscontroles positivo e negativo a seguir devam ser incluídos em uma corrida dePCR:

- Controle do Master Mix (controle negativo do DNA). Esta é umaPCR em que nenhum DNA é adicionado na reação. Quando no resultadoesperado não forem observados produtos da PCR, isto indica que o coquetelda PCR não estava contaminado com o DNA alvo.

- Um controle positivo do DNA (amostra de DNA genômico co-nhecida por conter as seqüências transgênicas). A amplificação bem-sucedida deste controle positivo demonstra que a PCR foi corrida sob condi-ções que permitem a amplificação de seqüências alvo.

- Um controle do DNA do tipo selvagem. Esta é uma PCR emque o DNA molde fornecido é o DNA genômico preparado partindo de umaplanta não transgênica. Quando no resultado esperado não for observadaamplificação de um produto da PCR de transgene, mas sim a amplificaçãodo produto da PCR endógeno, isto indica que não há amplificação da basefundamental do transgene detectável em uma amostra de DNA genômico.

5.5. Condições da PCR

Resultados ótimos foram obtidos sob as condições a seguir:

- o mix da PCR para reações de 25 μΙ_ contém:χ μΙ_ de DNA molde (150 ng)

2,5 μΙ_ de 10x Tampão de Amplificação (fornecido pelo fabricantecom a Taq polimerase)

0,5 μΙ_ de 10 mM de dNTP's

1,5 μΙ_ de GHI043 (10 pmols^L)1,0 μΙ_ de GHI044 (10 pmols/μΙ.)0,5 μΙ- de MAE121 (10 pmols^L)0,1 μΙ_ de Taq DNA polimerase (5 unidades/μΙ.)água até 25 μΙ_

- o perfil de termiciclagem que será seguido para resultados óti-mos é o seguinte:

<table>table see original document page 46</column></row><table>

5.6. Análise em gel de agarose

Para visualizar de forma ótima os resultados da PCR foi deter-minado que entre 10 e 20μΙ_ das amostras da PCR devem ser aplicados emum gel de agarose a 1,5% (tampão Tris-borato) com um marcador de pesomolecular apropriado (por exemplo, "escada" de 100 pb PHARMACIA).5.7. Validação dos resultados

Os dados das amostras de DNA de plantas transgênicas dentrode uma única corrida de PCR e um único Master Mix da PCR não serão a-ceitos a não ser que:

- o controle positivo exiba os produtos da PCR esperados(amplificação do alvo transgênico)

o controle de DNA positivo do tipo selvagem exiba o resulta-do esperado (amplificação do alvo do tipo selvagem).

- o controle negativo seja negativo para a amplificação pelaPCR (nenhum fragmento).

As faixas que exibem quantidades visíveis do produto da PCRtransgênico do tamanho esperado e que não exibem quantidades visíveis doproduto da PCR do tipo selvagem, indicam que a planta correspondente daqual o molde de DNA genômico foi preparado, é homozigota em relação aocassete de gene transgênico.

As faixas que exibem quantidades visíveis dos produtos da PCRtransgênicos e do tipo selvagem dos tamanhos esperados, indicam que aplanta correspondente da qual o DNA genômico molde foi preparado, é he-mizigota em relação ao cassete de gene transgênico. As faixas que não exi-bem quantidades visíveis do produto da PCR transgênico e que exibemquantidades visíveis do produto da PCR do tipo selvagem, indicam que aplanta correspondente da qual o DNA genômico molde foi preparado, nãoherdou a seqüência transgênica analisada e é assim homozigota em relaçãoao lócus do tipo selvagem.

As faixas que não exibem quantidades visíveis dos produtos daPCR transgênicos e do tipo selvagem, indicam que a qualidade e/ou a quan-tidade do DNA genômico não permitiu que um produto da PCR fosse gera-do. Estas plantas não podem ser classificadas. A preparação do DNA genô-mico deve ser repetida e uma nova corrida da PCR, com os controles apro-priados, tem que ser realizada.

5.8. Uso do protocolo de classificação da zigosidade para a iden-tificação do status de zigosidade em plantas contendo EE-GH3.A Figura 3 ilustra o resultado obtido com a PCR de classificaçãoda zigosidade em relação a EE-GH3 em um número de amostras de plantasde algodão. Foi observado que as amostras nas faixas 2 até 8 continham ofragmento da PCR (334 pb) característico para o evento de elite EE-GH3,enquanto que as amostras nas faixas 3, 5, 9 e 10 até 12 continham o frag-mento característico em relação à presença do lócus do tipo selvagem. Asfaixas 2, 4, 6, 7 e 8 contêm, portanto, EE-GH3 na forma homozigota, as fai-xas 3 e 5 contêm EE-GH3 na forma hemizigota e a faixa 9 contém o lócus dotipo selvagem na forma homozigota (azigota em relação a EE-GH3). A faixarepresenta um controle de algodão não transgênico; a faixa 11 representaa amostra de controle negativo (água) e as faixas 1 e 12 representam o Mar-cador de Peso Molecular ("escada" de 100 pb).

6. Introgressão de EE-GH3 em cultivares preferidos

O evento de elite EE-GH3 é introduzido através do retrocruza-mento repetido em cultivares de algodão comerciais tais como, mas não limi-tados a FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 e FM958,FM989, FM958, FM832, FM991, FM819, FM800, FM960, FM966, FM981,FM5035, FM5044, FM5045, FM5013, FM5015, FM5017ou FM5024.

É observado que a introgressão do evento de elite nestes culti-vares não influencia significativamente qualquer uma das características fe-notípicas ou agronômicas desejáveis destes cultivares (nenhum obstáculode ligação) enquanto a expressão do transgene, que é determinada pelatolerância ao glufosinato, satisfaz os níveis aceitáveis comercialmente, istoconfirma o status do evento EE-GH3 como um evento de elite.

Como utilizado nas reivindicações abaixo, a não ser que sejaclaramente indicado de outra maneira, é pretendido que o termo "planta" a-branja tecidos vegetais, em qualquer estágio de maturidade, assim comoquaisquer células, tecidos ou órgãos tirados ou derivados de qualquer talplanta, incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores,raízes, células isoladas, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ouprotoplastos.

A semente de referência compreendendo o evento de elite EE-GH3 foi depositada como EE-GH3 na ATCC (10801 University Blvd., Ma-nassas, VA 20110-2209) em 19 de julho de 2005, sob o número de acessoda ATCC PTA-6878.

Como utilizado nas reivindicações abaixo, a não ser que sejaclaramente indicado de outra maneira, é pretendido que o termo "planta" a-branja tecidos vegetais, em qualquer estágio de maturidade, assim comoquaisquer células, tecidos ou órgãos tirados ou derivados de qualquer talplanta, incluindo sem limitação quaisquer sementes, folhas, caules, flores,raízes, células isoladas, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ouprotoplastos.

É pretendido que a descrição anterior da invenção seja ilustrati-va e não limitante.

Várias alterações ou modificações nas modalidades descritaspodem ocorrer aos peritos na técnica. Estas podem ser feitas sem sair doespírito ou do âmbito da invenção.

Claims (40)

1. Processo para a identificação do evento de elite EE-GH3 emamostras biológicas, cujo processo compreende a detecção de uma regiãoespecífica de EE-GH3 com um iniciador ou uma sonda específica que reco-nhece especificamente a região flanqueadora a 5' ou a 3' de EE-GH3.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, o dito processo aamplificação de um fragmento de DNA entre 100 e 500 pb de um ácido nu-cléico presente nas ditas amostras biológicas utilizando uma reação em ca-deia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, um dos ditos iniciado-res reconhecendo a região flanqueadora a 5' de EE-GH3, a dita região flan-queadora a 5' possuindo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 par-tindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 732 ou a região flanqueadora a 3'de EE-GH3, a dita região flanqueadora a 3' possuindo a seqüência de nu-cleotídeos do complemento da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431 até-o nucleotídeo 654, o outro iniciador dos ditos iniciadores reconhecendo umaseqüência dentro do DNA estranho que possui a seqüência de nucleotídeosdo complemento da SEQ ID No. 1 partindo do nucleotídeo 733 até o nucleo-tídeo 1214 ou a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 1 até o nucleotídeo 430.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o dito ini-ciador que reconhece a região flanqueadora a 5' consiste em uma seqüênciade nucleotídeos de 17 até 200 nucleotídeos consecutivos selecionada daseqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1 até onucleotídeo 732 ou o dito iniciador que reconhece a região flanqueadora a 3'de EE-GH3 consiste em uma seqüência de nucleotídeos de 17 até 200 nu-cleotídeos consecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeos do com-plemento da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431 até o nucleotídeo 654e o dito iniciador que reconhece uma seqüência dentro do DNA estranhoconsiste em 17 até 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da seqüênciade nucleotídeos do complemento da SEQ ID No. 1 partindo do nucleotídeo-733 até o nucleotídeo 1214 ou da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No-2 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 430.

4. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o dito ini-ciador que reconhece a região flanqueadora a 5' compreende em sua extre-midade a 3' extrema uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 17 nu-cleotídeos consecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeos da SEQID No 1 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 732 ou o dito iniciadorque reconhece a região flanqueadora a 3' de EE-GH3 compreende em suaextremidade a 3' extrema uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 17nucleotídeos consecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeos docomplemento da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431 até o nucleotídeo- 654 e o dito iniciador que reconhece uma seqüência dentro do DNA estranhocompreende em sua extremidade a 3' pelo menos 17 nucleotídeos consecu-tivos selecionados da seqüência de nucleotídeos do complemento da SEQID No. 1 partindo do nucleotídeo 733 até o nucleotídeo 1214 ou da seqüên-cia de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleo-tídeo 430.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que os ditosiniciadores compreendem a seqüência da SEQ ID No. 3 e da SEQ ID No. 11,respectivamente.

6. Processo da reivindicação 5, cujo processo compreende aamplificação de um fragmento de aproximadamente 334 pb utilizando o pro-tocolo de identificação de EE-GH3.

7. Estojo para a identificação do evento de elite EE-GH3 em a-mostras biológicas, o dito estojo compreendendo um iniciador que reconhe-ce a região flanqueadora a 5' de EE-GH3, a dita região flanqueadora a 5'possuindo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleo-tídeo 1 até o nucleotídeo 732 ou um iniciador que reconhece a região flan-queadora a 3' de EE-GH3, a dita região flanqueadora a 3' possuindo a se-qüência de nucleotídeos do complemento da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 431 até o nucleotídeo 654 e um iniciador que reconhece uma se-qüência dentro do DNA estranho, o dito DNA estranho possuindo a seqüên-cia de nucleotídeos do complemento da SEQ ID No. 1 partindo do nucleotí-deo 733 até o nucleotídeo 1214 ou a seqüência de nucleotídeos da SEQ IDNo 2 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 430.

8. Estojo de acordo com a reivindicação 7, em que o dito inicia-dor que reconhece a região flanqueadora a 5' consiste em uma seqüênciade nucleotídeos de 17 até 200 nucleotídeos consecutivos selecionada daseqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1 até onucleotídeo 732 ou o dito iniciador que reconhece a região flanqueadora a 3'de EE-GH3 consiste em uma seqüência de nucleotídeos de 17 até 200 nu-cleotídeos consecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeos do com-plemento da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431 até o nucleotídeo 654e o dito iniciador que reconhece uma seqüência dentro do DNA estranhoconsiste em 17 até 200 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüên-cia de nucleotídeos do complemento da SEQ ID No. 1 partindo do nucleotí-deo 733 até o nucleotídeo 1214 ou da seqüência de nucleotídeos da SEQ IDNo 2 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 430.

9. Estojo de acordo com a reivindicação 7, em que o dito inicia-dor que reconhece a região flanqueadora a 5' compreende em sua extremi-dade a 3' extrema uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleo-tídeos consecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeos da SEQ IDNo 1 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 732 ou o dito iniciador quereconhece a região flanqueadora a 3' de EE-GH3 compreende em sua ex-tremidade a 3' extrema uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 17nucleotídeos consecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeos docomplemento da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431 até o nucleotídeo- 654 e o dito iniciador que reconhece uma seqüência dentro do DNA estranhocompreende em sua extremidade a 3' pelo menos 17 nucleotídeos consecu-tivos selecionados da seqüência de nucleotídeos do complemento da SEQID No. 1 partindo do nucleotídeo 733 até o nucleotídeo 1214 ou da seqüên-cia de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleo-tídeo 430.

10. Estojo de acordo com a reivindicação 7, que compreende uminiciador que consiste na seqüência da SEQ ID No. 3 e um iniciador queconsiste na seqüência da SEQ ID No. 11.

11. Iniciador adequado para uso em uma detecção específica deEE-GH3, que possui uma seqüência que, sob condições de detecção otimi-zadas reconhece especificamente uma seqüência dentro da região flanque-adora a 5' ou a 3' de EE-GH3, a dita região flanqueadora a 5' possuindo aseqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1 até onucleotídeo 732 e a dita região flanqueadora a 3' possuindo a seqüência denucleotídeos do complemento da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431até o nucleotídeo 654.

12. Iniciador de acordo com a reivindicação 11, em que o ditoiniciador consiste em uma seqüência de nucleotídeos de 17 até 200 nucleo-tídeos consecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeos da SEQ IDNo 1 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 732 ou da seqüência denucleotídeos de 17 até 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da se-qüência de nucleotídeos do complemento da SEQ ID No 2 partindo do nu-cleotídeo 431 até o nucleotídeo 654.

13. Iniciador de acordo com a reivindicação 11, em que o ditoiniciador compreende em sua extremidade a 3' extrema uma seqüência denucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionada daseqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1 até onucleotídeo 732 ou uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 17 nu-cleotídeos consecutivos selecionada da seqüência de nucleotídeos do com-plemento da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431 até o nucleotídeo654.

14. Iniciador que compreende em sua extremidade a 3' extremaa seqüência da SEQ ID No. 3.

15. Iniciador que compreende em sua extremidade a 3' extremaa seqüência da SEQ ID No. 11.

16. Processo de acordo com a reivindicação 1, cujo processocompreende a hibridização de um ácido nucléico de amostras biológicascom uma sonda específica para EE-GH3.

17. Processo da reivindicação 16, em que a seqüência da ditasonda específica possui pelo menos 80% de identidade de seqüência comuma seqüência que compreende parte da seqüência flanqueadora a 5' ou daseqüência flanqueadora a 3' de EE-GH3 e a seqüência do DNA estranhocontígua à mesma.

18. Processo da reivindicação 17, em que a seqüência da ditasonda específica possui pelo menos 80% de identidade de seqüência com aSEQ ID No. 1 partindo do nucleotídeo 712 até 753 ou SEQ ID No. 2 partindodo nucleotídeo 410 até 451 ou o complemento das ditas seqüências.

19. Estojo para a identificação evento de elite EE-GH3 em amos-tras biológicas, o dito estojo compreendendo uma sonda específica, capazde se hibridizar especificamente com uma região específica de EE-GH3.

20. Estojo da reivindicação 19, em que a seqüência da dita son-da específica possui pelo menos 80% de identidade de seqüência com umaseqüência que compreende parte da seqüência flanqueadora a 5' ou da se-qüência flanqueadora a 3' de EE-GH3 e a seqüência do DNA estranho con-tígua à mesma.

21. Estojo da reivindicação 20, em que a seqüência da dita son-da específica possui pelo menos 80% de identidade de seqüência com aSEQ ID No. 1 partindo do nucleotídeo 712 até 753 ou com a SEQ ID No. 2partindo do nucleotídeo 410 até 451 ou com o complemento das ditas se-qüências.

22. Sonda específica para a identificação do evento de elite EE-GH3 em amostras biológicas.

23. Sonda da reivindicação 22, que possui pelo menos 80% deidentidade de seqüência com uma seqüência que compreende parte da se-qüência flanqueadora a 5' ou da seqüência flanqueadora a 3' de EE-GH3 e aseqüência do DNA estranho contígua com a mesma ou o complemento damesma.

24. Sonda da reivindicação 23 que possui pelo menos 80% deidentidade de seqüência com a SEQ ID No. 1 partindo do nucleotídeo 712até 753 ou com a SEQ ID No. 2 partindo do nucleotídeo 410 até 451 ou ocomplemento das ditas seqüências.

25. Sonda específica para a identificação do evento de elite EE-GH3 em amostras biológicas, a seqüência sendo essencialmente similar àSEQ ID No. 1 partindo do nucleotídeo 712 até 753 ou à SEQ ID No. 2 partin-do do nucleotídeo 410 até 451 ou ao complemento das ditas seqüências.

26. Processo para a confirmação da pureza das sementes, cujoprocesso compreende a detecção de uma região específica de EE-GH3 comum iniciador ou uma sonda específica que reconhece especificamente a re-gião flanqueadora a 5' ou a 3' de EE-GH3, nas amostras de sementes.

27. Processo para a seleção de sementes em relação à presen-ça de EE-GH3, cujo processo compreende a detecção de uma região espe-cífica de EE-GH3 com um iniciador ou uma sonda específica que reconheceespecificamente a região flanqueadora a 5' ou a 3' de EE-GH3, em amostrasde lotes de sementes.

28. Processo para a determinação do status de zigosidade deuma planta, material de planta ou semente que compreende o evento deelite EE-GH3, o dito processo compreendendo a amplificação de fragmentosde DNA entre 100 e 500 pb de um ácido nucléico presente nas ditas amos-tras biológicas utilizando uma reação em cadeia da polimerase com pelomenos três iniciadores, um dos ditos iniciadores reconhecendo a região flan-queadora a 5' de EE-GH3, a dita região flanqueadora a 5' possuindo a se-qüência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1 até onucleotídeo 732, um segundo dos ditos iniciadores reconhecendo especifi-camente a região flanqueadora a 3' de EE-GH3, a dita região flanqueadora a 3' possuindo a seqüência de nucleotídeos do complemento da SEQ ID No 2partindo do nucleotídeo 431 até o nucleotídeo 654, um terceiro dos ditos ini-ciadores reconhecendo uma seqüência dentro do DNA estranho que possuia seqüência de nucleotídeos do complemento da SEQ ID No. 1 partindo donucleotídeo 733 até o nucleotídeo 1214 ou a seqüência de nucleotídeos daSEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 430.

29. Processo de acordo com a reivindicação 28, em que o ditoprimeiro iniciador compreende a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 3,o dito segundo iniciador compreende a seqüência da SEQ ID No 10 e o ditoterceiro iniciador compreende a seqüência da SEQ ID No 11.

30. Processo de detecção da presença do evento de elite EE-GH3 em amostras biológicas através da hibridização com uma sonda de á-cido nucléico marcada substancialmente complementar em que a proporçãode sonda:ácido nucléico alvo é amplificada através do reciclo da seqüênciade ácido nucléico alvo, o dito processo compreendendo:a) a hibridização da dita seqüência de ácido nucléico alvo comum primeiro oligonucleotídeo de ácido nucléico que compreende a seqüên-cia de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 733 até o nu-cleotídeo 750 ou seu complemento ou o dito primeiro oligonucleotídeo deácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 413 até o nucleotídeo 430 ou seu complemento;b) a hibridização da dita seqüência de ácido nucléico alvo comum segundo oligonucleotídeo de ácido nucléico que compreende a seqüên-cia de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 715 até o nu-cleotídeo 732 ou seu complemento ou a dita sonda de ácido nucléico mar-cada compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindodo nucleotídeo 431 até o nucleotídeo 448 ou seu complemento, em que osditos primeiro e segundo oligonucleotídeos se sobrepõem em pelo menosum nucleotídeo e em que o dito primeiro ou o dito segundo oligonucleotídeoé marcado para ser a dita sonda de ácido nucléico marcada;c) a clivagem apenas da sonda marcada dentro do duplex son-da:seqüência de ácido nucléico alvo com uma enzima que leva à clivagemseletiva da sonda resultando na dissociação do duplex, deixando a seqüên-cia alvo intacta;d) o reciclo da seqüência de ácido nucléico alvo através da repe-tição das etapas (a) até (c); ee) a detecção da sonda marcada clivada, determinando assim apresença da dita seqüência de ácido nucléico alvo.

31. Planta de algodão transgênica ou células, partes, sementeou progênie da mesma, cada uma compreendendo o evento de elite EE-GH3 em seu genoma, a semente de referência compreendendo o dito even-to que foi depositado na ATCC sob o número de depósito PTA-6878.

32. Planta de algodão transgênica, semente, células, partes ouprogênie da reivindicação 31, cujo DNA genômico, quando analisado utili-zando o protocolo de identificação do evento de Elite para EE-GH3 com doisiniciadores compreendendo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID 3 e aSEQ ID 11 respectivamente, fornece um fragmento de DNA de aproximada-mente 334 pb.

33. Semente que compreende o evento de elite EE-GH3 deposi-tado na ATCC sob o número de depósito PTA-6878 ou derivados do mesmo.

34. Planta de algodão ou uma parte da mesma ou semente damesma obtida partindo da semente como definida na reivindicação 33.

35. Planta de algodão ou semente, células ou tecidos da mes-ma, cada um compreendendo o evento de elite EE-GH3 em seu genoma,obtidos através da propagação e/ou do cruzamento com uma planta de al-godão cultivada partindo da semente depositada na ATCC sob o número dedepósito PTA-6878.

36. Semente de algodão que compreende o evento de elite EE-GH3, a semente de referência compreendendo o dito evento que foi deposi-tada na ATCC sob o número de depósito PTA-6878.

37. Planta de algodão transgênica, célula ou tecido, que com-preende o evento de elite EE-GH3, produzida partindo da semente comodefinida na reivindicação 36.

38. Processo para a produção de uma planta ou de uma semen-te de algodão que compreende o evento de elite EE-GH3 que compreende ocruzamento de uma planta como definida em qualquer uma das reivindica-ções 31 até 37, com uma outra planta de algodão e o plantio da sementeobtida partindo do dito cruzamento.

39. DNA genômico de algodão que compreende o evento de eli-te EE-GH3.

40. DNA genômico produzido partindo de uma planta, célula deplanta ou semente de algodão como definida em qualquer uma das reivindi-cações 31 até 37.