CN101238217A - 耐受除草剂的棉花植物和用于鉴定其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特异性转基因棉花植物、植物材料和种子，其特征在于这些产物在棉花基因组的特定位置上具有特定的转化事件。也提供了允许在生物样品中快速和明确地鉴定所述事件的工具。

Description

耐受除草剂的棉花植物和用于鉴定其的方法
发明领域
本发明涉及转基因棉花植物，植物材料和种子，其特征在于：在棉花基因组的特定位置包含特定的转化事件，特别是通过存在编码赋予除草剂耐受性的蛋白质的基因。本发明的棉花植物将除草剂耐受性表型和在缺乏杂草压力的情况下等同于非转化棉花株系的农艺性状、遗传稳定性和对不同遗传背景的适应性结合在一起。本发明还提供了用于鉴定包含特定转化事件EE-GH3的植物材料在生物样品中存在的方法和试剂盒。
发明背景
通过基因本身的结构和通过其在植物基因组中的定位确定转基因在植物中的表型表达。同时，转基因(在外源DNA中)在基因组中不同位置上的存在将以不同方式影响植物的整体表型。通过遗传操作在农艺学上或工业上成功导入具有商业益处的性状可以是漫长的过程，这取决于不同的因素。遗传转化的植物的实际转化和再生只是一系列选择步骤的第一步，所述选择步骤包括广泛的遗传表征、育种和大田实验的评估，最终导致原种事件(elite event)的选择。
棉花纤维是世界上单一最重要的织物。每年全球收获大约8千万英亩的棉花。在美国，按照面积产量，棉花是第五大作物，2000年种植的棉花超过1500万英亩。主要的棉花杂草物种是番薯属物种(Ipomoea SP.)(牵牛花))、苋属物种(Amaranthus spp.)(苋))、莎草属物种(Cyperusspp.)(nutsedge))、苍耳属物种(Xanthium spp.)(苍耳)和高梁属物种(Sorghumspp.)(约翰逊草)。在可以用于生长中的棉花田的阔叶除草剂引入前，种植者利用非选择性除草剂直接、萌芽后施用，同时注意不让除草剂接触生长中的作物植物。因为这要求杂草和作物高度的差异，所以并不总是可行的。特别是对于小的棉花，该种实践费时，并且潜在地伤害作物。
考虑到对新食品/饲料的讨论、GMO和非GMO产品的分离和私有材料的鉴定，原种事件的明确鉴定变得日益重要。理想状况下，该鉴定方法既快速又简单，无需大量的实验室装置。此外，所述方法应当提供允许原种事件的明确鉴定而无需专业解释的结果，但如果需要所述方法应当在专业监督下继续。本文描述了用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的特定工具。
在开发对除草剂N-膦酰甲基甘氨酸和其盐(也称为草甘磷)具有抗性的棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))中，已将EE-GH3鉴定为转基因棉花植物群体的原种事件。转基因棉花植物包含赋予对草甘磷的耐受性的嵌合基因，该嵌合基因包含受到植物中表达的启动子(如在US 5,491,288或US5,792,930中所描述的)调控的经修饰的来自玉米(Zea mays)的编码耐受草甘磷的5-烯醇-pyruvylshikimate-3-磷酸合酶(EPSPS)的epsps基因(如美国专利6,566,587中所描述的)。
本领域已公开了包含草甘磷耐受性基因的棉花植物。然而，现有技术领域公开内容不能教导或提示本发明。
发明概述
本发明涉及包含稳定地整合入其基因组的表达盒的转基因棉花植物或其种子、细胞或组织，所述表达盒包含含有epsps基因的编码序列的除草剂耐受性基因(如本文实施例1.1中所描述的)，所述转基因棉花植物或其种子、细胞或组织是除草剂耐受性的，并且在杂草压力不存在的情况下具有基本上与非转基因的纯合系相同的农艺表现。在杂草的压力下和合适的草甘磷处理下，所述植物与非转基因植物相比，将具有更优的农艺学表型。
在本发明的一个实施方案中，棉花植物或其种子、细胞或组织包含原种事件EE-GH3。
更具体地，本发明涉及转基因棉花植物、其种子、细胞或组织，其基因组DNA的特征在于以下事实，即当在本文描述的PCR鉴定方案中分析时，使用分别针对EE-GH3的5’或3’侧翼区域和外源DNA的两种引物，产生了对于EE-GH3是特异性的片段。引物可分别针对SEQ ID NO：1的5’侧翼区域和外源DNA，例如分别包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11的核苷酸序列或分别由所述核苷酸序列组成，从而产生300至360bp，优选大约334bp的DNA片段。
包含本发明的原种事件的参照种子(Reference seed)已在登录号PTA-6878下保藏在ATCC。本发明的一个实施方案是以ATTC登录号PTA-6878保藏的包含原种事件EE-GH3的种子，所述将种子生长成抗草甘磷的棉花植物。ATCC保藏号PTA-xxxx的种子是由至少大约95％的对转基因纯合的转基因种子(kernel)组成的种子批，其包含本发明的原种事件，将生长成耐受草甘磷的植物。可播种种子并且可用本文描述的草甘磷处理生长的植物，从而获得100％的耐受草甘磷的植物，所述植物包含本发明的原种事件。本发明还涉及来自包含本发明的原种事件的植物的细胞、组织、后代和子代，所述植物由保藏在ATCC的具有登录号PTA-6878的种子生长而来。本发明另外涉及通过对包含本发明原种事件的棉花植物进行繁殖和/或育种可获得的植物，其中所述棉花植物由保藏在ATCC，具有登录号PTA-6878的种子长成。
本发明还涉及用于鉴定包含原种事件EE-GH3的转基因植物或其细胞或组织的方法，该方法基于鉴定特征DNA序列或由该DNA序列编码的氨基酸在转基因植物、细胞或组织中的存在。根据本发明的优选实施方案，此类特征DNA序列是15bp，优选20bp，最优选30bp或更多的序列，所述序列包含事件的插入位点即部分外源DNA和与其邻接的棉花基因组的部分(5’或3’侧翼区域)，从而允许原种事件的特异性鉴定。
本发明还涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的方法，该方法基于特异性识别EE-GH3的5’和/或3’侧翼序列的引物或探针。
更具体地，本发明涉及方法，该方法包括使用聚合酶链式反应和至少两种引物扩增存在于生物样品中的核酸序列，优选获得100至500bp的DNA片段，所述引物中的一种识别EE-GH3的5’或3’侧翼区域，另一种引物识别外源DNA中的序列。引物可分别识别EE-GH3的5’侧翼区域内的序列(SEQ ID No.1，从第1位至第732位)或EE-GH3的3’侧翼区域内的序列(SEQ ID No 2的从第431位至第654位的互补序列)以及外源DNA内的序列(SEQ ID No 1的从第733位至第1214位的互补序列或SEQ ID No2的从第1位至第430位)。识别5’侧翼区域的引物可包含SEQ ID No.3的核苷酸序列，识别外源DNA内的序列的引物可包含本文描述的SEQ ID No.11的核苷酸序列。
本发明更具体地涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的方法，该方法包括使用聚合酶链式反应和分别具有SEQ ID No.3和SEQ IDNo.11的核苷酸序列的两种引物扩增存在于生物样品中的核酸序列以获得大约334bp的DNA片段。
本发明还涉及本文描述的EE-GH3的特定侧翼序列，该序列可用于开发生物样品中的EE-GH3的特异性鉴定方法。更特别地，本发明涉及可用于开发本文另外描述的特异性引物和探针的EE-GH3的5’和/或3’侧翼区域。本发明还涉及用于鉴定生物样品中EE-GH3存在的鉴定方法，该方法基于此类特异性引物或探针的使用。引物可由17至大约200个连续核苷酸的核苷酸序列组成，所述连续核苷酸选自SEQ ID No 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列或SEQ ID 2的从核苷酸431至核苷酸654的核苷酸序列的互补序列，所述引物与下述引物组合，该下述引物由17至大约200个连续核苷酸的核苷酸序列组成，所述连续核苷酸选自SEQ ID No 1的从核苷酸733至核苷酸1214的核苷酸序列的互补序列或SEQ ID No 2的从核苷酸1至核苷酸430的核苷酸序列。引物也可在它们的末端3’端包含这些核苷酸序列，并且另外包含不相关的序列或来源于提及的核苷酸序列但包含错配的序列。
本发明还涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种特异性识别EE-GH3的5’或3’侧翼区域的引物或探针。
本发明的试剂盒，除了包含特异性识别EE-GH3的5’或3’侧翼区域的引物外，还可包含用于PCR鉴定方案的特异性识别EE-GH3的外源DNA内的序列的第二引物。本发明的试剂盒可包含至少两种特异性引物，所述引物中的一种识别EE-GH3的5’侧翼区域内的序列，所述引物中的另一种识别外源DNA内的序列。识别5’侧翼区域的引物可包含SEQ ID No.3的核苷酸序列，并且识别转基因的引物可包括SEQ ID No.11的核苷酸序列或本文描述的任何其他引物。
本发明还涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的试剂盒，所述试剂盒包括具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.11的核苷酸序列的PCR引物，以用于本文描述的EE-GH3PCR鉴定方案中。
本发明也涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的试剂盒，所述试剂盒包含特异性探针，所述探针具有这样的序列，其对应于与EE-GH3的特定区域具有80％至100％的序列同一性的序列(或与之互补)。优选探针的序列对应于包含EE-GH3的5’或3’侧翼区域的部分的特定区域。最优选特异性探针具有以下序列或与之互补，所述序列与SEQ ID No 1的核苷酸712至753之间的序列或SEQ ID No.2的从核苷酸410至451之间的序列具有80％至100％的序列同一性。
根据本发明的另一个方面，公开了DNA序列，所述DNA序列包含事件的插入位点和足够长度的棉花基因组DNA和外源DNA(转基因)的多核苷酸，从而用作引物或探针来检测EE-GH3。此类序列可包含棉花基因组DNA的至少9个核苷酸和相似数目的EE-GH3的外源DNA(转基因)的核苷酸，分别位于插入位点每侧。最优选，此类DNA序列包含棉花基因组DNA的至少9个核苷酸和相似数目的外源DNA的核苷酸，所述外源DNA邻接SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的插入位点。
本发明包括的方法和试剂盒可用于不同的目的例如但不限于下列：鉴定EE-GH3在植物、植物材料中或在包含植物材料或从植物材料产生的产品(例如但不限于食品或饲料产品(新鲜的或加工的))中的存在或不存在；另外或可选择地，为了分离转基因和非转基因材料，可使用本发明的方法和试剂盒鉴定转基因植物材料；另外或可选择地，本发明的的方法和试剂盒可用于确定包含EE-GH3的植物材料的质量(即百分比纯度的材料)。
本发明还涉及EE-GH35’和/或3’侧翼区域，以及从EE-GH3r 5’和/或或3’侧翼序列开发的特异性引物和探针。
附图概述
可结合附图理解不希望将本发明限定于描述的特定实施方案的下列实施例，所述附图在此引用作为参考，其中：
图1：图示了引用的核苷酸序列和引物之间的关系。黑色条块：外源DNA；浅色条块：来源于植物的DNA；条块下面的数字表示核苷酸位置；(c)是指指定的核苷酸序列的互补序列。
图2：表示通过针对EE-GH3开发的PCR鉴定方案获得的结果。将序列上样至凝胶上：泳道1：分子量标准参照(100bp梯)；泳道2至4：来自包含转基因事件EE-GH3的棉花植物的DNA样品；泳道5至8：来自不包含原种事件EE-GH3但包含相似的草甘磷耐受性基因的转基因棉花植物的DNA样品；泳道9至11：来自不包含原种事件EE-GH3也不包含草甘磷耐受性基因的转基因棉花植物的DNA样品；泳道12：来自野生型棉花植物的对照DNA样品；泳道13：无模板DNA对照；泳道14：分子量标准参照。
图3：表示通过针对EE-GH3开发的接合性评分PCR方案获得的结果。将序列上样至凝胶上：泳道1：分子量标准参照(100bp梯)；泳道2、4、6、7和8：来自包含纯合形式的转基因事件EE-GH3的棉花植物的DNA样品；泳道3和5：来自包含杂合形式的转基因事件EE-GH3的棉花植物的DNA样品；泳道9和10：来自野生型棉花植物的对照DNA样品；泳道11：无模板DNA的对照；泳道12：分子量标准参照。
详述
重组DNA分子掺入植物基因组中通常是由细胞或组织的转化引起的。掺入的特定位点通常归因于“随机”整合。
作为用重组DNA或“转化DNA”转化植物细胞或组织的结果被导入到植物基因组中，并且来源于该转化DNA的DNA本文称为“外源DNA”，其包含一个或多个“转基因”。本发明的上下文中的“植物DNA”是指来源于被转化的植物的DNA。通常在对应的野生型植物中的相同基因座中发现植物DNA。外源DNA的特征可在于植物基因组中掺入重组DNA分子的位点上的定位和构型。其中已插入重组DNA的植物基因组中的位点也称为“插入位点”或“靶位点”。重组DNA至植物基因组的插入可与植物DNA的缺失相关，称作“靶位点缺失”。本文使用的“侧翼区域”或“侧翼序列”是指与导入的DNA不同的至少20bp，优选至少50bp，和多至5000bp的DNA序列，优选来自植物基因组的位于外源DNA的紧上游并且与其邻接或位于外源DNA的紧下游并且与其邻接的DNA。导致外源DNA的随机整合的转化方法将产生具有不同侧翼区域的转化体，所述侧翼区域对于各转化体是特征性的和独特的。当通过常规杂交将重组DNA导入植物时，其在植物基因组中的插入位点或其侧翼区域通常不改变。本文所用的“插入区域”是指对应于由序列包含的至少40bp，优选至少100bp，和多至10000bp的区域的区域，所述序列包含在植物基因组中外源DNA的上游和/或下游侧翼区域。考虑到由于种内突变造成的微小差异，在杂交入相同种的植物后，插入区域将保持与序列至少85％，优选90％，更优选95％和最优选100％的序列同一性，所述序列包含在最初从转化获得的植物中外源DNA的上游和下游侧翼区域。
将事件定义为(人造的)基因座，即作为基因工程的结果，所述基因座携带包含至少一个拷贝的目的基因的转基因。事件的通常的等位基因状态是外源DNA的存在或不存在。事件在表型上的特征在于转基因的表达。在遗传水平上，事件是植物的遗传组成的部分。在分子水平上，事件的特征在于限制性图谱(例如如由Southern印迹确定的)，在于转基因的上游和/或下游侧翼序列、分子标记的位置和/或转基因的分子构型。通常使用包含至少一个目的基因的转化DNA转化植物导致产生包含大量单独的事件(其各自是独特的)的转化体的群体。
本文所用的原种事件是基于一个或多个转基因的表达和稳定性以及其与包含其的植物的最佳农艺特征的相容性，选自通过使用相同的转化DNA转化或通过与用该转化获得的植物回交获得的事件。因此原种事件选择的标准是下列标准中的一个或多个，优选两个或更多个，有利地所有标准：
a)外源DNA的存在不损害植物的其它期望特征，例如与农艺性状或商业价值有关的特征；
b)事件可以通过十分明确的分子构型来表征，所述分子构型能稳定遗传，并且针对其可开发用于身份控制(identity control)的恰当工具；
c)一个或多个目的基因，在事件的杂合(或半合子)和纯合条件中，在一定范围的环境条件(所述环境条件为其中携带事件的植物在正常的农学用途中可能接触到的环境条件)内以商业可接受的水平，表现出正确的、恰当的和稳定的空间和时间表型表达。
优选外源DNA与植物基因组中的如下位置相关，所述植物基因组位置允许容易地渐渗进入期望的商业遗传背景。
通过原种事件在不同相关遗传背景中的渐渗现象和所观察到的事件对上述一个、两个或所有标准(例如a)，b)和c))的符合可以证实作为原种事件的事件状态。
因此，“原种事件”指满足上述标准的包含外源DNA的基因座。植物、植物材料或后代例如种子可在其基因组中包含一个或多个原种事件。
开发用于鉴定原种事件或包含原种事件的植物、植物材料或包含含有原种事件的植物材料的产品的工具是基于原种事件的特定基因组特征，例如包含外源DNA的基因组区域的特定限制性图谱、分子标记或外源DNA的侧翼区域的序列。
一旦对外源DNA的一个或两个侧翼区域测序后，可通过分子生物学技术，开发特异性识别样品核酸(DNA或RNA)中的该(这些)序列的引物和探针。例如可开发鉴定生物样品(例如植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品)中的原种事件的PCR方法。此类PCR基于至少两种特异性“引物”，一种识别原种事件的5’或3’侧翼区域内的序列，另一种识别外源DNA内的序列。引物优选具有15至35个核苷酸的序列，所述序列在最优化的PCR条件下分别“特异性识别”原种事件的5’或3’侧翼区域内的序列和原种事件的外源DNA内的序列，从而从包含所述原种事件的核酸样品扩增特异性片段(“整合片段”或差异扩增子(discriminating amplicon))。这意味着只有被靶向的整合片段在最优化的PCR条件下被扩增，而无植物基因组或外源DNA中的其他序列。
适合用于本发明的PCR引物可以是下列：
-长度在17nt至大约200nt范围内的寡核苷酸，其在它们的3’端包含选自5’侧翼序列(SEQ ID No 1的从核苷酸1至核苷酸732)的至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列(识别5’侧翼序列的引物)；或
-长度在17nt至大约200nt范围内的寡核苷酸，其在它们的3’端包含选自3’侧翼序列(SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列)的至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列(识别3’侧翼序列的引物)；或
-长度在17nt至大约200nt范围内的寡核苷酸，其在它们的3’端包含选自插入的DNA序列(SEQ ID No 1的从核苷酸733至核苷酸1214的互补序列)的至少17个连续核苷酸，优选20个核苷酸的核苷酸序列(识别外源DNA的引物)；或
-长度在17nt至大约200nt范围内的寡核苷酸，其包含选自插入的DNA序列(SEQ ID No 2的从核苷酸1至核苷酸430)的至少17个连续核苷酸，优选20个核苷酸的核苷酸序列。
当然引物可以长于提及的17个连续核苷酸，并且可以是例如20、21、30、35、50、75、100、150、200nt长或甚至更长。引物可完全由选自所述的侧翼序列和外源DNA序列的核苷酸序列的核苷酸序列组成。然而，引物在它们5’端的核苷酸序列(即位于3’的17个连续核苷酸之外)不太重要。因此，引物的5’序列可由选自侧翼序列或外源DNA的核苷酸序列组成，根据需要，但可包含几个(例如1、2、5、10个)错配。引物的5’序列甚至可完全由与侧翼序列或外源DNA无关的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列例如代表限制性酶识别位点的核苷酸序列。这样的不相关序列或具有错配的侧翼DNA序列应当优选不长于100，更优选不长于50或甚至25个核苷酸。
此外，合适的引物可在它们的3’端包含跨越植物DNA来源的序列和外源DNA序列之间的连接区(位于SEQ ID No 1中的核苷酸732-733和SEQ ID No 2中的核苷酸430-431)的核苷酸序列或由其组成，条件是所述位于3’的17个连续核苷酸不仅仅来源于外源DNA或SEQ ID No 1或2中的来源于植物的序列。
对于本领域技术人员也立即清楚的是正确选择的PCR引物对不应当包含彼此互补的序列。
为了本发明的目的，“SEQ ID No：X中所示的核苷酸序列的互补序列”是可从所示核苷酸序列产生的，通过按照夏格夫法则(
Figure A20068002903400171
Figure A20068002903400172
)用它们的互补核苷酸替换所述核苷酸并以5’至3’方向(即以所示核苷酸序列的相反方向)读出的核苷酸序列。
合适的引物的实例是SEQ ID No 3(5’侧翼序列识别引物)、SEQ IDNo 4、SEQ ID No 5、SEQ ID No 6(与5’侧翼序列识别引物一起使用的外源DNA识别引物)、SEQ ID No 7、SEQ ID No 8、SEQ ID No 9(与3’侧翼序列识别引物一起使用的外源DNA识别引物)或SEQ ID No 10(3’侧翼序列识别引物)的寡核苷酸序列。
合适的寡核苷酸引物的其他实例在它们的3’端包含下列序列或由这些序列组成：
a.5’侧翼序列识别引物：
-SEQ ID No 1的从核苷酸258至核苷酸277的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸310至核苷酸329的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸311至核苷酸330的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸507至核苷酸526的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸616至核苷酸635的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸256至核苷酸275的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸259至核苷酸277的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸260至核苷酸279的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸309至核苷酸329的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸310至核苷酸330的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸311至核苷酸329的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸312至核苷酸330的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸436至核苷酸455的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸34至核苷酸53的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸130至核苷酸148的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸139至核苷酸158的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸256至核苷酸277的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸259至核苷酸279的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸260至核苷酸277的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸261至核苷酸279的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸266至核苷酸285的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸308至核苷酸329的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸309至核苷酸330的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸312至核苷酸329的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸313至核苷酸330的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸435至核苷酸455的核苷酸序列
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-SEQ ID No 1的从核苷酸23至核苷酸40的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸33至核苷酸54的核苷酸序列
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-SEQ ID No 1的从核苷酸140至核苷酸161的核苷酸序列
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-SEQ ID No 1的从核苷酸170至核苷酸187的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸170至核苷酸188的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸172至核苷酸189的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸172至核苷酸193的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸520至核苷酸541的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸91至核苷酸110的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸167至核苷酸188的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸171至核苷酸188的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸176至核苷酸197的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸90至核苷酸110的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸92至核苷酸110的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸300至核苷酸319的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸89至核苷酸110的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸93至核苷酸110的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸298至核苷酸319的核苷酸序列
b.与5’侧翼序列识别引物一起使用的外源DNA序列识别引物：
-SEQ ID No 1的从核苷酸897至核苷酸916的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸1010至核苷酸1029的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸897至核苷酸914的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸899至核苷酸916的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸949至核苷酸966的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸1010至核苷酸1028的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸1008至核苷酸1027的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸1010至核苷酸1029的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸842至核苷酸861的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸842至核苷酸860的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸842至核苷酸862的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸842至核苷酸859的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸842至核苷酸863的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸920至核苷酸939的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸920至核苷酸937的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸1004至核苷酸1023的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸1004至核苷酸1024的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸1004至核苷酸1021的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 1的从核苷酸1004至核苷酸1025的核苷酸序列的互补序列
c.3’侧翼序列识别引物：
-SEQ ID No 2的从核苷酸432至核苷酸453的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸421至核苷酸442的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸433至核苷酸452的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸433至核苷酸453的核苷酸序列的互补序列
d.与3’侧翼序列识别引物一起使用的外源DNA序列识别引物：
-SEQ ID No 2的从核苷酸1至核苷酸20的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸18至核苷酸37的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸20至核苷酸39的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸14至核苷酸33的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸17至核苷酸37的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸19至核苷酸37的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸21至核苷酸40的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸21至核苷酸39的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸50至核苷酸67的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸71至核苷酸90的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸74至核苷酸93的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸96至核苷酸115的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸13至核苷酸33的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸15至核苷酸33的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸16至核苷酸37的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸19至核苷酸39的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸20至核苷酸37的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸20至核苷酸40的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸22至核苷酸39的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸22至核苷酸40的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸28至核苷酸47的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸42至核苷酸61的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸70至核苷酸90的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸72至核苷酸92的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸72至核苷酸91的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸73至核苷酸93的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸75至核苷酸93的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸75至核苷酸94的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸340至核苷酸359的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸424至核苷酸443的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸16至核苷酸33的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸18至核苷酸39的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸19至核苷酸40的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸27至核苷酸47的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸29至核苷酸47的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸37至核苷酸56的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸40至核苷酸59的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸41至核苷酸59的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸42至核苷酸59的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸69至核苷酸90的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸71至核苷酸91的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸72至核苷酸93的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸73至核苷酸91的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸73至核苷酸90的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸74至核苷酸94的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸94至核苷酸115的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸189至核苷酸208的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸339至核苷酸359的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸341至核苷酸359的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸358至核苷酸377的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸366至核苷酸385的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸424至核苷酸445的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸26至核苷酸47的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸30至核苷酸47的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸36至核苷酸56的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸38至核苷酸56的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸39至核苷酸59的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸41至核苷酸60的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸70至核苷酸91的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸73至核苷酸94的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸74至核苷酸91的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸338至核苷酸359的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸342至核苷酸359的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸357至核苷酸377的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸359至核苷酸377的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸367至核苷酸385的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸367至核苷酸386的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸35至核苷酸56的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸38至核苷酸59的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸356至核苷酸377的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸360至核苷酸377的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸364至核苷酸385的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸366至核苷酸386的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸368至核苷酸385的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸368至核苷酸386的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸407至核苷酸428的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸40至核苷酸61的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸365至核苷酸384的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸369至核苷酸386的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸422至核苷酸443的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸367至核苷酸387的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的从核苷酸366至核苷酸387的核苷酸序列
如本文所用的，“SEQ ID No.Z的从位置X至位置Y的核苷酸序列”表示包括两个核苷酸终点的核苷酸序列。
优选，整合片段具有50至500个核苷酸，最优选100至350个核苷酸的长度。特异性引物可具有分别与原种事件的5’或3’侧翼区域和原种事件的外源DNA内的序列具有80至100％同一性的序列，条件是错配仍然允许在最优化的PCR条件下使用这些引物特异性鉴定原种事件。然而可允许的错配范围可容易地通过实验进行确定，并且是本领域技术人员已知的。
下表例举了使用选择的PCR引物对的预期的DNA扩增子(或整合片段)的大小。
  引物1   从位置   引物2   至位置   扩增子长度
  GHI043   528   SB327   829   302
  GHI043   528   MAE080   1028   501
  GHI043   528   MAE081   1214   687
  GHI043   528   GHI044   860   334
  MAE078   1   MAE121   654   654
  MAE070   96   MAE121   654   559
  MAE071   358   MAE121   654   297
可用不同的方式例如通过凝胶分析后的大小评估进行整合片段的检测。也可直接对整合片段测序。用于检测扩增的DNA片段的其他序列特异性方法在本领域也是已知的。
因为引物的序列和它们在基因组中的相对位置对于原种事件是独特的，因此整合片段的扩增将只在包含所述原种事件(的核酸)的生物样品中发生。优选当进行PCR以鉴定EE-GH3在未知样品中的存在时，对照包括成组的引物，使用所述引物可扩增事件的植物种的“持家基因”中的片段。持家基因是在大多数细胞类型中表达并且与所有细胞所共有的基础代谢活性相关的基因。优选，从持家基因扩增的片段是比扩增的整合片段更大的片段。根据被分析的样品，可包含其他对照。
在本领域内例如在“PCR Applications Manual”(Roche MolecularBiochemicals，第二版，1999)中描述了标准PCR方案。在原种事件的“PCR鉴定方案”中明确了用于PCR的最优条件，包括特异性引物的序列。然而要理解，PCR鉴定方案中的许多参数可能需要调整以适合具体的实验室条件，并且可稍作修饰以获得相似的结果。例如，用于制备DNA的不同方法的使用可以需要调整例如使用的引物的量、聚合酶和退火条件。类似地，其他引物的选择可确定用于PCR鉴定方案的其他最佳条件。然而这些调整对于本领域技术人员来说是显然的，并且在当前的PCR应用手册例如上面引述的手册中进一步详细描述。
可选择地，特异性引物可用于扩增整合片段，其可用作用于鉴定生物样品中的EE-GH3的“特异性探针”。在允许探针与其在核酸中对应的片段杂交的条件下，将生物样品的核酸与探针接触，导致核酸/探针杂交体的形成。可检测(例如标记核酸或探针)该杂交体的形成，其中该杂交体的形成表明EE-GH3的存在。已在本领域内描述了基于与特异性探针杂交(在固相载体上或在溶液中)的此类鉴定方法。特异性探针优选是在最优化的条件下与这样的区域特异性杂交的序列，所述区域在原种事件的5’或3’侧翼区域内并且优选也包含与其紧邻的外源DNA部分(本文称为“特定区域”)。优选，特异性探针包含50至500bp，优选100至350bp的序列，其与特定区域的核苷酸序列有至少80％，优选80至85％，更优选85至90％，尤其优选90至95％，最优选95％至100％的同一性(或与该特定区域的核苷酸序列互补)。优选，特异性探针将包含对原种事件的特定区域同一(或互补)的大约15至大约100个连续核苷酸的序列。
适合作为用于检测原种事件EE-GH3的PCR引物的寡核苷酸也可用于开发确定原种事件的接合性状态的基于PCR的方案。为此，以这样的方式设计两种识别野生型基因座的引物，以使它们相互指向对方并且使插入位点位于两个引物之间。这些引物可以是分别特异性识别SEQ ID NO 1或2中包含的5’和3’侧翼序列的引物。该组引物与对转化DNA序列互补并且针对侧翼DNA之一的第三引物一起，允许进行EE-GH3特异性基因座和wt基因座的诊断性PCR扩增。如果植物对于转基因基因座或对应的wt基因座是纯合的，那么诊断PCR将产生单PCR产物，其对于转基因或wt基因座是典型的，优选在长度上是典型的。如果植物对转基因基因座是半合子的，那么将出现两个基因座特异性PCR产物，反映了转基因基因座和wt基因座的扩增。
此外，也可使用本文提供的原种事件特异性序列信息开发与基于PCR的扩增方法不同的对于原种事件EE-GH3是特异性的检测方法。该可选择的检测方法包括基于特定核酸结构的侵入性切割的线性信号扩增检测法，也称作InvaderTM技术，(如在例如美国专利5,985,557“Invasive Cleavageof Nucleic Acids”、6,001,567“Detection of Nucleic Acid sequences byInvader Directed Cleavage”(本文引用作为参考)中描述的)。为此，靶序列可与标记的第一核酸寡核苷酸(所述寡核苷酸包含SEQ ID No 1的从核苷酸733至核苷酸750的核苷酸序列或其互补序列)或所述标记的核酸探针(所述探针包含SEQ ID No 2的从核苷酸413至核苷酸430的核苷酸序列或其互补序列)杂交，并且进一步与第二核酸寡核苷酸(所述寡核苷酸包含SEQ ID No 1的从核苷酸715至核苷酸732的核苷酸序列或其互补序列)或所述标记的核酸探针(所述探针包含SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸448的核苷酸序列或其互补序列)杂交，其中第一和第二寡核苷酸在至少一个核苷酸上重叠。由该杂交产生的双链体或三链体结构允许用酶选择性切割探针，从而使靶序列保持完整。然后，潜在地通过导致进一步信号扩增的中间步骤检测被切割的标记的探针。
本文使用的“试剂盒”是指用于进行本发明的方法，更具体地鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3或确定包含EE-GH3的植物材料的接合性状态的成套试剂。更具体地，本发明的试剂盒的优选实施方案包含至少一种或两种特异性引物如上述用于鉴定原种事件的引物，或用于确定接合性状态的三种特异性引物。任选地，试剂盒还可包含本文描述的用于PCR鉴定方案的任何其他试剂。可选择地，根据本发明的另一个实施方案，试剂盒可包含上述的特异性探针，所述探针与生物样品的核酸特异性杂交以鉴定其中EE-GH3的存在。任选地，试剂盒还可包含用于鉴定(使用特异性探针)生物样品中的EE-GH3的任何其他试剂(例如但不限于杂交缓冲液、标记)。
为了控制质量(例如，种子批的纯度)、检测原种事件在植物材料或包含植物材料的或从植物材料产生的材料(例如但不限于食品或饲料产品)中的存在或不存在，可使用本发明的试剂盒，并且可具体调整其组分。
如本文所用的，关于核苷酸序列(DNA或RNA)的“序列同一性”是指具有相同核苷酸的位置数目除以两个序列中较短序列的核苷酸数目。使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长和为4的空位罚分，通过Wilbur和Lipmann算法(Wilbur和Lipmann，1983，Proc.Nat.Acad.Sci.USA80：726)进行两个核苷酸序列的比对。可以例如使用Genetics ComputerGroup(GCG，University of Wisconsin Biotechnology center)的序列分析软件包常规地进行序列数据的计算机辅助分析和解释，包括本文描述的序列比对。当序列具有至少大约75％，特别地至少大约80％，更特别地至少大约85％，非常特别地大约90％，尤其是大约95％，更尤其地大约100％的序列同一性时，称为所述序列“基本上相似”。很清楚，当认为RNA序列基本上与DNA序列相似或具有与DNA序列一定程度的序列同一性时，DNA序列中的胸腺嘧啶核苷(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
本文使用的术语“引物”包括能够在模板依赖性的方法例如PCR中引发新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是10至30个核苷酸的寡核苷酸，但可使用更长的序列。可以双链形式提供引物，尽管单链形式是优选的。探针可用作引物，但被设计为结合靶DNA或RNA并且不需要被用于扩增方法。
本文所用的术语“识别”，当指特异性引物时，是指特异性引物在方法中提供的条件(例如PCR鉴定方案的条件)下与原种事件中的核酸序列特异性杂交的事实，其中通过阳性对照和阴性对照的存在确定特异性。
本文使用的术语“杂交”，当指特异性探针时，是指探针在标准的严格条件下结合原种事件中的核酸序列的特定区域的事实。本文使用的标准严格条件是指用于本文描述的杂交的条件或由Sambrook等人，1989(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbour Laboratory Press，NY)描述的常规杂交条件，其例如包括下列步骤：1)将植物基因组DNA片段固定在滤膜上，2)在42℃下，在50％甲酰胺、5×SSPE、2×Denhardt’s试剂和0.1％SDS中预杂交滤膜1至2小时，或在68℃下，在6×SSC、2×Denhardt’s试剂和0.1％SDS中预杂交1至2小时，3)加入已标记的杂交探针，4)温育16至24小时，5)在室温下在1×SSC、0.1％SDS中洗涤滤膜20分钟，6)在68℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤滤膜3次，每次20分钟，和7)在-70℃下使用增感屏将滤膜曝光于X射线胶片24至48小时。
如本文所用的，生物样品是植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品。术语“植物”希望包括处于任何成熟阶段的棉花(陆地棉)植物组织以及采自或来源于任何该植物的任何细胞、组织或器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。本文用到的“植物材料”是指从植物获得或来源于植物的材料。包含植物材料的产品涉及用植物材料生产或者可能被植物材料污染的食品，饲料或其它产品。要理解，在本发明的上下文中，就对于EE-GH3是特异性的核酸的存在(暗示核酸在样品中的存在)检测该生物样品。因此本文提及的用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的方法涉及在生物样品中鉴定包含原种事件的核酸。
这里所用的“包含”被解释为规定了所提到的特征、整数、步骤或成分的存在，但是不排除一个或多个特征，整数、步骤或成分或其组合的存在或添加。因此例如包含核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白质可包含比实际提到的核苷酸或氨基酸更多的核苷酸或氨基酸，即被包埋在更大的核酸或蛋白质中。包含功能或结构确定的DNA序列的嵌合基因可包含额外的DNA序列等。
本发明也涉及棉花中的原种事件EE-GH3的发育，涉及包含该事件的植物、从这些植物获得的后代，并且涉及从该事件产生的植物细胞或植物材料。包含原种事件EE-GH3的植物是通过实施例1中所描述的获得的。
可根据实施例2中针对EE-GH3所描述的PCR鉴定方案鉴定包含EE-GH3的棉花植物或植物材料。简而言之，使用特异性识别EE-GH3的5’或3’侧翼序列中的序列的引物(例如具有SEQ ID NO：3的序列的引物)和识别外源DNA中的序列的引物(例如具有SEQ ID NO：11的序列的引物)，通过PCR扩增存在于生物样品中的棉花基因组DNA。扩增内源棉花序列的部分的DNA引物用作PCR扩增的阳性对照。如果在PCR扩增后，材料产生预期大小的片段，那么材料包含来自具有原种事件EE-GH3的棉花植物的植物材料。
具有EE-GH3的植物的特征在于它们的草甘磷耐受性，在本发明的上下文中该耐受性包括植物耐受除草剂草甘磷。具有EE-GH3的植物的特征也在于具有这样的农艺性状，即该农艺性状在杂草压力不存在和使用草甘磷控制杂草的情况下与在美国可商购获得的棉花品种相当。已观察到本文描述的棉花基因组的插入区域中的外源DNA的存在给包含该事件的植物赋予特别有意义的表型和分子特征。
本发明也提供了包含本文定义的原种事件EE-GH3的基因组DNA，其可用作鉴定试剂盒中的参照材料。
下列实施例描述了原种事件EE-GH3的鉴定和用于特异性鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的工具的开发。
除非另外指出，按照Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA的第1和2卷中描述的标准方案进行所有重组DNA技术。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于由BIOS ScientificPublications Ltd (UK)和Blackwell Scientific Publications，UK出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)。
在描述和实施例中，参考下列序列：
SEQ ID No.1：包含EE-GH3的5’侧翼区域的核苷酸序列
SEQ ID No.2：包含EE-GH3的3’侧翼区域的核苷酸序列
SEQ ID No.3：引物GHI043
SEQ ID No.4：引物SB327
SEQ ID No.5：引物MAE080
SEQ ID No.6：引物MAE081
SEQ ID No.7：引物MAE078
SEQ ID No.8：引物MAE070
SEQ ID No.9：引物MAE071
SEQ ID No.10：引物MAE121
SEQ ID No.11：引物GHI044
SEQ ID No.12：用于对照片段扩增的引物1
SEQ ID No.13：用于对照片段扩增的引物2
实施例
1.原种事件EE-GH3的鉴定
通过用包含经修饰的epsps基因(编码耐受草甘磷的EPSPS酶)编码序列的载体转化棉花来开发抗除草剂的棉花，如US 5,491,288或US 5,792,930中描述的，所述基因受到组蛋白基因的启动子的控制。
基于广泛的选择方法选择原种事件EE-GH3，所述选择方法基于除草剂抗性基因的良好表达和稳定性以及其与最佳农艺特征的适应性，例如评估了植物高度，节高、棉铃保留(boll retention)、直立、茁壮长势(vigor)、纤维长度、纤维强度和棉绒产量。
将选择的事件导入不同的商业遗传背景，并且比较不同位置的田间试验的结果。使用不同的处理用除草剂对植物进行喷雾。
在应用时无论处于发育的任何程度或阶段，在应用后未观察到作为除草剂应用的结果的可见的损害。不存在由除草剂应用产生的对植物的形态或生长习性的有害效应。
此外，事件具有正常的叶、花和棉铃形态、优良的能育性并且在多个遗传背景中未显示疾病或异常的昆虫易感性。在渐渗到多个遗传背景期间，没有观察到异常问题或异常性。
2.原种事件EE-GH3的侧翼区域的鉴定
使用由Liu等人(1995，Plant J.8(3)：457-463)描述的热不对称交错(TAIL-)PCR法确定EE-GH3原种事件中侧接外源DNA的区域的序列。该方法在连续的反应中使用3种嵌套引物与较短的随意简并引物一起，从而可热控制特异性和非特异性产物的相对扩增效率。为了对外源DNA的边界退火并且根据它们的退火条件选择特异性引物。在1％琼脂糖凝胶上分析少量(5μl)未纯化的、二级和三级的PCR产物。纯化三级PCR产物并进行测序。
2.1.右(5’)侧翼区域
对通过TAIL-PCR法获得的鉴定为包含5’侧翼区域的片段进行测序(SEQ ID No.1)。核苷酸1和732之间的序列对应于植物DNA，而核苷酸733和1214之间的序列对应于外源DNA。
2.2.左(3’)侧翼区域
对通过TAIL-PCR法获得的鉴定为包含3’侧翼区域的片段进行测序(SEQ ID No.2)。核苷酸1和430之间的序列对应于外源DNA，而核苷酸431和654之间的序列对应于植物DNA。
3.EE-GH3的聚合酶链式反应鉴定方案的开发
3.1.引物
开发了识别原种事件内的序列的特异性引物。更具体地，开发识别EE-GH3的5’侧翼区域内的序列的引物。然后在外源DNA的序列内选择第二引物以使引物横跨大约334个核苷酸的序列。发现下列引物在对EE-GH3DNA的PCR反应中产生特别清楚和可重复的结果：
GHI043：
5’-TTC.AgC.CgC.CAT.TgA.TgA.Ag-3’(SEQ ID No.：3)
(靶：植物DNA)
GHI044：
5’-gTg.TAT.CCA.TgC.CTC.gAC.TC-3’(SEQ ID No.：11)
(靶：插入DNA)
靶向内源序列的引物优选包含在PCR混合物中。这些引物在未知样品和DNA阳性对照中用作内部对照。使用内源引物对的阳性结果证明在基因组DNA制品中存在足够量的充足DNA用于待产生的PCR产物。选择识别棉花中的持家基因的内源引物：
GHI001：
5’-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3’(SEQ ID No.：12)
GHI002：
5’-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3’(SEQ ID No.：13)
3.2.扩增的片段
PCR反应中预期的扩增片段是：
对于引物对GHI001-GHI002：445bp(内源对照)
对于引物对GHI043-GHI044：334bp(EE-GH3原种事件)
3.3.模板DNA
按照Edwards等人(Nucleic Acid Research，19，第1349页，1991)从叶片打孔制备模板DNA。当使用用其他方法制备的DNA时，应当进行使用不同量的模板的测试。通常50ng的基因组模板DNA产生最佳结果。
3.4.指定的阳性和阴性对照
为了避免假阳性或阴性，决定下列阳性和阴性对照应当包括在PCR运行中：
-主混合物对照(DNA阴性对照)。这是其中未向反应中加入DNA的PCR。当观察到预期的结果(无PCR产物)时，这表明PCR混合物未被靶DNA污染。
-DNA阳性对照(已知包含转基因序列的基因组DNA样品)。该阳性对照的成功扩增证明在允许靶序列扩增的条件下进行PCR。
-野生型DNA对照。这是其中提供的模板DNA是从非转基因植物中制备的基因组DNA的PCR。当观察到预期的结果：没有转基因PCR产物的扩增但有内源PCR产物的扩增时，这证明在基因组DNA样品中没有可检测的转基因背景扩增。
3.5.PCR条件
在下列条件下获得最佳结果：
-用于25μl反应的PCR混合物包含：
2.5μl模板DNA
2.5μl 10×扩增缓冲液(由厂商与Taq聚合酶一起提供)
0.5μl I0mM dNTP
0.5μl GHI001(10p摩尔/μl)
0.5μl GHI002(10p摩尔/μl)
0.25μl GHI044(10p摩尔/μl)
0.25μl GHI043(10p摩尔/μl)
0.1μl Taq DNA聚合酶(5个单位/μl)
加水至25μl
-为获得最佳结果进行的热循环模式(thermocycling profile)如下：
在95℃下进行4分钟
然后：在95℃下进行1分钟
在57℃下进行1分钟
在72℃下进行2分钟
进行5个循环
然后：在92℃下进行30秒
在57℃下进行30秒
在72℃下进行1分钟
进行25个循环
然后：在72℃下进行10分钟
3.6.琼脂糖凝胶分析
为最佳地显示PCR的结果，决定应当将10至20μl的PCR产物用于使用合适的分子量标准参照(例如100bp梯的PHARMACIA)的1.5％琼脂糖凝胶(Tris硼酸缓冲液)上。
3.7.结果的验证
除非1)DNA阳性对照显示预期的PCR产物(转基因片段和内源片段)，2)DNA阴性对照对于PCR扩增是阴性的(无片段)和3)野生型DNA对照显示预期的结果(内源片段的扩增)，那么决定不应该接受来源于单个PCR运行和单个PCR混合物的转基因植物DNA样品的数据。。
当进行如上所述的针对EE-GH3的PCR鉴定方案时，显示可见量的预期大小的转基因PCR产物和内源PCR产物的泳道表明从其中制备基因组模板DNA的对应的植物已遗传EE-GH3原种事件。未显示可见量的任一种转基因PCR产物但显示可见量的内源PCR产物的泳道表明从其中制备基因组模板DNA的对应植物不包含原种事件。不显示可见量的内源PCR产物和转基因PCR产物的泳道表明基因组DNA的质量和/或数量不允许产生PCR产物。这些植物不能被计算在内。应当重新制备基因组DNA并且必须进行新的具有合适对照的PCR运行。
3.8.区别PCR方案鉴定EE-GH3的用途
在试图筛选未知物之前，应当进行具有所有合适对照的检测。开发的方案可能需要在实验室之间不同的组成部分(模板DNA制品、Taq DNA聚合酶、引物的质量、dNTP、热循环仪等)的优化。
内源序列的扩增在方案中起着至关重要的作用。必须获得在已知转基因基因组DNA模板中扩增等摩尔量的内源序列和转基因序列的PCR和热循环条件。在使用相同的溴化乙锭染色强度下，如通过琼脂糖凝胶电泳所判断的，只要被靶向的内源片段不被扩增或只要被靶向的序列不被扩增时，则可能需要PCR条件的优化。
按照上述方案检测来自许多棉花植物的叶材料(其中一些包含EE-GH3)。来自原种事件EE-GH3的样品和来自棉花野生型的样品分别用作阳性和阴性对照。
图2说明了对许多棉花植物样品使用针对EE-GH3的原种事件PCR鉴定方案获得的结果。发现泳道2至4中的样品包含原种事件，因为检测到334bp的条带，而泳道5至12中的样品不包含EE-GH3。泳道5至11包含其他棉花原种事件(包括包含不同草甘磷耐受性嵌合基因的植物)，泳道12代表非转基因棉花对照；泳道13代表阴性对照(水)样品，泳道1和14分子量标准参照(100bp的梯)。
4.特异性整合片段作为检测包含EE-GH3的材料的探针的用途
使用特异性引物GHI043(SEQ ID No.3)和GHI044(SEQ ID No.11)通过PCR扩增或通过化学合成获得EE-GH3的特异性整合片段，并对其进行标记。将该整合片段用作检测生物样品中的EE-GH3的特异性探针。按照标准方法从样品提取核酸。然后在经最优化以允许形成杂交体的杂交条件下将该核酸与特异性探针接触。然后检测杂交体的形成以表明样品中EE-GH3核酸的存在。任选地，在与特异性探针接触之前使用特异性引物扩增样品中的核酸。可选择地，在与特异性探针而不是整合片段接触之前标记核酸。任选地，在与样品接触之前，将特异性探针附着至固体载体(例如但不限于滤膜、条带或小珠)。
5.用于EE-GH3棉花植物材料的接合性状态的基于PCR的确定方案
5.1.引物
在插入原种事件之前识别野生型基因座的核苷酸序列的两种引物被以这样的方式设计，从而使它们相互指向对方并在它们之间具有插入位点。该引物组与对外源DNA序列互补并且指向侧翼DNA的第三引物一起允许对EE-GH3基因座和wt基因座同时进行PCR扩增。
发现下列引物在对EE-GH3DNA的接合性评分PCR反应中产生特别清楚和可重复的结果：
GHI043：
5’-TTC.AgC.CgC.CAT.TgA.TgA.Ag-3’(SEQ ID No.：3)
(靶：3’侧翼序列植物DNA)
GHI044：
5’-gTg.TAT.CCA.TgC.CTC.gAC.TC-3’(SEQ ID No.：11)
(靶：插入DNA)
MAE121：
5’-CCA.TTC.CgA.TCA.TCg.AgT.Tg-3’(SEQ ID No.：10)
(靶：5’侧翼序列植物DNA)
5.2.扩增的片段
PCR反应预期的扩增片段是：
对于引物对GHI043-MAE121：454bp(对应于wt基因座的扩增)
对于引物对GHI043-GHI044：334bp(EE-GH3原种事件)
5.3.模板DNA
按照Edwards等人(Nucleic Acid Research，19，第1349页，1991)从叶片打孔制备模板DNA。当使用用其他方法制备的DNA时，应当进行使用不同量的模板的测试。通常50ng的基因组模板DNA产生最佳结果。
5.4.指定的阳性和阴性对照
为了避免假阳性或阴性，建议下列阳性和阴性对照应当包括在PCR运行中：
-主混物对照(DNA阴性对照)。这是其中未向反应中加入DNA的PCR。当观察到预期的结果(无PCR产物)时，这表明PCR混合物未被靶DNA污染。
-DNA阳性对照(已知包含转基因序列的基因组DNA样品)。该阳性对照的成功扩增证明在允许靶序列扩增的条件下进行PCR。
-野生型DNA对照。这是其中提供的模板DNA是从非转基因植物中制备的基因组DNA的PCR。当观察到预期的结果：没有转基因PCR产物的扩增但有内源PCR产物的扩增时，这证明在基因组DNA样品中没有可检测的转基因背景扩增。
5.5.PCR条件
在下列条件下获得最佳结果：
-用于25μl反应的PCR混合物包含：
xμl模板DNA(150ng)
2.5μl 10×扩增缓冲液(由厂商与Taq聚合酶一起提供)
0.5μl 10mM dNTP
1.5μl GH I043(10p摩尔/μl)
1.0μl GHI044(10p摩尔/μl)
0.5μl MAE121(10p摩尔/μl)
0.1μl Taq DNA聚合酶(5个单位/μl)
水达到25μl
-为获得最佳结果进行热循环模式如下：
在95℃下进行4分钟
然后：在95℃下进行1分钟
在57℃下进行1分钟
在72℃下进行2分钟
进行5个循环
然后：在92℃下进行30秒
在57℃下进行30秒
在72℃下进行1分钟
进行25个循环
然后：在72℃下进行10分钟
5.6.琼脂糖凝胶分析
为最佳地显示PCR的结果，决定应当将10至20μl的PCR产物用于具有合适的分子量标准参照(例如100bp梯的PHARMACIA)的1.5％琼脂糖凝胶(Tris硼酸缓冲液)上。
5.7.结果的验证
如果不是：
-DNA阳性对照显示预期的PCR产物(转基因靶的扩增)
-野生型阳性DNA对照显示预期的结果(野生型靶的扩增)，
-阴性对照对于PCR扩增是阴性的(无片段)
那么不接受来自单个PCR运行和单个PCR主混合物中的转基因植物DNA样品的数据。
显示可见量的预期大小的转基因PCR产物和未显示可见量的野生型PCR产物的泳道表明从其中制备基因组DNA模板的对应的植物对于转基因基因盒是纯合的。
显示可见量的预期大小的转基因PCR产物和野生型PCR产物的泳道表明从其中制备基因组模板DNA的对应植物对于转基因基因盒是半合子的。不显示可见量的转基因PCR产物但显示可见量的野生型PCR产物的泳道表明从其中制备基因组模板DNA的对应植物没有遗传被测定的转基因序列，因此对于野生型基因座是纯合的。
不显示可见量的转基因PCR产物和野生型PCR产物的泳道表明基因组DNA的质量和/或数量不允许产生PCR产物。不能将这些植物计算在内。应当重新制备基因组DNA并且进行新的具有合适对照的PCR反应。
5.8.接合性评分方案用于鉴定包含EE-GH3的植物中的接合性状态的用途。
图3说明了对许多棉花植物样品使用针对EE-GH3的接合性评分PCR获得的结果。发现泳道2至8中的样品包含以原种事件EE-GH3为特征的PCR片段(334bp)，而泳道3、5、9和10至12中的样品包含以wt基因座存在为特征的片段。因而泳道2、4、6、7和8包含纯合形式的EE-GH3，泳道3和5包含半合子形式的EE-GH3，泳道9包含纯合形式的wt基因座(对于EE-GH3是不成对的)。泳道10代表非转基因棉花对照；泳道11代表阴性对照(水)样品，泳道1和12代表分子量标准参照(100bp的梯)。
6.EE-GH3向优选栽培种的渐渗作用
通过重复回交来将原种事件EE-GH3导入商业棉花栽培种，所述栽培种例如但不限于FM5013、FM5015、FM5017、FM989、FM832、FM966和FM958、FM989、FM958、FM832、FM991、FM819、FM800、FM960、FM966、FM981、FM5035、FM5044、FM5045、FM5013、FM5015、FM5017或FM5024中。
观察到原种事件向这些栽培种的渐渗不显著影响这些栽培种的任何所需表型或农艺性状(无连锁拖累(linkage drag))，同时如由草丁膦(glufosinate)耐受性所确定的，转基因的表达满足商业可接受的水平。这证实了事件EE-GH3作为原种事件的状态。
如下面的权利要求中使用的，除非另外明确指出，术语“植物”希望包括处于任何成熟阶段的植物组织以及采自或来源于任何该植物的任何细胞、组织或器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。
在2005年7月19日，将包含原种事件EE-GH3的参照种子在ATCC登录号PTA-6878下作为EE-GH3保藏在ATCC(10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)。
如下面的权利要求中使用的，除非另外明确指出，术语“植物”希望包括处于任何成熟阶段的植物组织以及采自或来源于任何该植物的任何细胞、组织或器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。
本发明的上述描述希望是举例说明而不非限制。对于本领域技术人员可存在所述实施方案中的各种变化或修改。可进行这些变化或修改而不背离本发明的精神或范围。
序列表
<110>拜尔生物科学公司(Bayer BioScience N.V.)
<120>耐受除草剂的棉花植物和用于鉴定其的方法
<130>BCS 05-2011
<150>EP05076826.6
<151>2005-08-08
<150>US60/707,067
<151>2005-08-10
<160>13
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>1214
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>包含EE-GH3的5’侧翼序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(732)
<223>植物DNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(733)..(1214)
<223>插入DNA
<400>1
ccacgtcaaa gaattcacgt acccaattca ggtccctatg aaccggagat aaccaaaatt    60
accaaattag acctaatcaa aacggtgtta ccagagttgg acgtcgtacc gacgactgga   120
tcggggatta gtgggtccca ggcgtattca tgcacgagct ggcgcaatga ggccgcgaga   180
tttaaagccc gagaagggta caaagggaag gaggctttgt taattatggt ggggagagaa   240
gtgacgaaat gagtgaggga gtggagggtg gaatctgagt gattgaaaga gagagaagag   300
gaaggaaatg ggagtttgga ggaggaaagg agaggggaaa gagaggaaaa gaagggtttg   360
aaagagaaga gagaagagga taaaggaggg aaggagagga gtgttttgga ggaagaaatg   420
agggttttga gatagggatt tgggtcttgg agatggagaa gtggatttaa gtctattagg   480
agaacaatgc gttgggtttt gctgtagttt gggaatgggt ctatggcttc agccgccatt   540
gatgaagaat gaagaaactg caaagctttt atttagttga aaataaatag acacaaatca   600
agccacagtt tgattgcaca gacaatggag aaaggtagag aaaagggtaa gaaaatatat   660
aaaaataaaa gaattgaagt tagaagaaga agagatcaaa ggaacaaata cacttggaac   720
gacttcgttt taggctccat ggcgatcgct acgtatctag aattcctgca ggtcgagtcg   780
cgacgtacgt tcgaacaatt ggttttaaaa gcttgcatgc ctgcaggtcg aggagaaata   840
tgagtcgagg catggataca ctaagttccc ctgaagtgag catgatcttt gatgctgaga   900
tgattcccag agcaagatag tttgtgctgc aagtgacaca attgtaatga aaccaccact   960
caacgaattt acttgtggct ttgacatgtc gtgtgctctg tttgtatttg tgagtgccgg  1020
ttggtaatta tttttgttaa tgtgatttta aaacctctta tgtaaatagt tactttatct  1080
attgaagtgt gttcttgtgg tctatagttt ctcaaaggga aattaaaatg ttgacatccc  1140
atttacaatt gataacttgg tatacacaaa ctttgtaaat ttggtgatat ttatggtcga  1200
aagaaggcaa tacc                                                    1214
<210>2
<211>654
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>包含EE-GH3的3’侧翼序列的核苷酸序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(430)
<223>插入DNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(431)..(654)
<223>植物DNA
<400>2
cacgatggat gaggataacg aaagggcggt tcctatgtcc gggaaagttc ccgtagaaga    60
caatgagcaa agctactgaa acgcggacac gacgtcgcat tggtacggat atgagttaaa   120
ccgactcaat tcctttatta agacataaac cgattttggt taaagtgtaa cagtgagctg   180
atataaaacc gaaacaaacc ggtacaagtt tgattgagca acttgatgac aaacttcaga   240
attttggtta ttgaatgaaa atcatagtct aatcgtaaaa aatgtacaga agaaaagcta   300
gagcagaaca aagattctat attctggttc caatttatca tcgctttaac gtccctcaga   360
tttgatcggg ctgcaggaat taaacgcccg ggcacgtggg atcctctaga gtcgacggcc   420
gagtactggc gcgaagtggg aagtggcggc aaaacacaaa aaagtataag tgaaagtaca   480
atttagttac tcaacttaaa aaagatataa aatgattaat aagctattta aaacttttca   540
tttaagttat taaaacatgt tagagttttt atttaaatta atggactgtt aaatttaatt   600
ttttaagaaa gttcatctaa caagctccaa gcaacaactc gatgatcgga atgg         654
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物GHI043
<400>3
ttcagccgcc attgatgaag                        20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物SB327
<400>4
gacctgcagg catgcaagct                        20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物MAE080
<400>5
attaccaacc ggcactcaca                        20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物MAE081
<400>6
ggtattgcct tctttcgacc                        20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物MAE078
<400>7
cacgatggat gaggataacg                        20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物MAE070
<400>8
cgcattggta cggatatgag                        20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物MAE071
<400>9
agatttgatc gggctgcagg                        20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物MAE121
<400>10
ccattccgat catcgagttg                        20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物GHI044
<400>11
gtgtatccat gcctcgactc                        20
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物GHI001
<400>12
aacctaggct gctgaaggag c                      21
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>寡核苷酸引物GH002
<400>13
caactcctcc agtcatctcc g                      21

Claims (40)

1. 用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的方法，该方法包括使用特异性识别EE-GH3的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GH3特定区域。
2. 权利要求1的方法，所述方法包括使用聚合酶链式反应和至少两种引物从存在于所述生物样品中的核酸扩增100至500bp之间的DNA片段，所述引物中的一种识别EE-GH3的5’侧翼区域或EE-GH3的3’侧翼区域，所述5’侧翼区域具有SEQ ID No 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列，所述3’侧翼区域具有SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一种引物识别外源DNA内的序列，所述外源DNA具有SEQ ID No.1的从核苷酸733至核苷酸1214的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 2的从核苷酸1至核苷酸430的核苷酸序列。
3. 权利要求2的方法，其中所述识别5’侧翼区域的引物由17至200个连续核苷酸的核苷酸序列组成，所述连续核苷酸选自SEQ ID No 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列，或所述识别EE-GH3的3’侧翼区域的引物由17至200个连续核苷酸的核苷酸序列组成，所述连续核苷酸选自SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列的核苷酸序列，并且所述识别外源DNA内的序列的引物由17至200个连续核苷酸组成，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.1的从核苷酸733至核苷酸1214的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 2的从核苷酸1至核苷酸430的核苷酸序列。
4. 权利要求2的方法，其中所述识别5’侧翼区域的引物在其末端3’端包含至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ IDNo 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列，或所述识别EE-GH3的3’侧翼区域的引物在其末端3’端包含至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列的核苷酸序列，并且所述识别外源DNA内的序列的引物在其3’端包含至少17个连续核苷酸，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.1的从核苷酸733至核苷酸1214的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 2的从核苷酸1至核苷酸430的核苷酸序列。
5. 权利要求4的方法，其中所述引物分别包含SEQ ID No.3和SEQID No.11的序列。
6. 权利要求5的方法，该方法包括使用EE-GH3鉴定方案扩增大约334bp的片段。
7. 用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的试剂盒，所述试剂盒包含一种识别EE-GH3的5’侧翼区域的引物或一种识别EE-GH3的3’侧翼区域的引物，以及一种识别外源DNA内序列的引物，所述5’侧翼区域具有SEQ ID No 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列，所述3’侧翼区域具有SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列的核苷酸序列，所述外源DNA具有SEQ ID No.1的从核苷酸733至核苷酸1214的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 2的从核苷酸1至核苷酸430的核苷酸序列。
8. 权利要求7的试剂盒，其中所述识别5’侧翼区域的引物由17至200个连续核苷酸的核苷酸序列组成，所述连续核苷酸选自SEQ ID No 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列，或所述识别EE-GH3的3’侧翼区域的引物由17至200个连续核苷酸的核苷酸序列组成，所述连续核苷酸选自SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列的核苷酸序列，并且所述识别外源DNA内的序列的引物由17至200个连续核苷酸组成，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.1的从核苷酸733至核苷酸1214的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 2的从核苷酸1至核苷酸430的核苷酸序列。
9. 权利要求7的试剂盒，其中所述识别5’侧翼区域的引物在其末端3’端包含至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ IDNo 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列，或所述识别EE-GH3的3’侧翼区域的引物在其末端3’端包含至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列的核苷酸序列，并且所述识别外源DNA内的序列的引物在其3’端包含至少17个连续核苷酸，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.1的从核苷酸733至核苷酸1214的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 2的从核苷酸1至核苷酸430的核苷酸序列。
10. 权利要求7的试剂盒，其包括由SEQ ID No.3的序列组成的引物和由SEQ ID No.11的序列组成的引物。
11. 适合用于EE-GH3特异性检测的引物，所述引物具有在最优化的检测条件下特异性识别EE-GH3的5’或3’侧翼区域内的序列的序列，所述5’侧翼区域具有SEQ ID No 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列并且所述3’侧翼区域具有SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列的核苷酸序列。
12. 权利要求11的引物，其中所述引物由选自SEQ ID No 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列组成。
13. 权利要求11的引物，其中所述引物在其末端3’端包含选自SEQ IDNo 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，或选自SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列。
14. 在其末端3’端包含SEQ ID No.3的序列的引物。
15. 在其末端3’端包含SEQ ID No.11的序列的引物。
16. 权利要求1的方法，该方法包括将生物样品的核酸与EE-GH3的特异性探针杂交。
17. 权利要求16的方法，其中所述特异性探针的序列与这样的序列具有至少80％的序列同一性，所述序列包含EE-GH3的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列。
18. 权利要求17的方法，其中所述特异性探针的序列与SEQ ID No.1的从核苷酸712至753或SEQ ID No.2的从核苷酸410至451或所述序列的互补序列具有至少80％的序列同一性。
19. 用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GH3的试剂盒，所述试剂盒包含能够与EE-GH3的特定区域特异性杂交的特异性探针。
20. 权利要求19的试剂盒，其中所述特异性探针的序列与这样的序列具有至少80％的序列同一性，所述序列包含包EE-GH3的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列。
21. 权利要求20的试剂盒，其中所述特异性探针的序列与SEQ ID No.1的从核苷酸712至753或SEQ ID No.2的从核苷酸410至451或所述序列的互补序列具有至少80％的序列同一性。
22. 用于鉴定生物样品中原种事件EE-GH3的特异性探针。
23. 权利要求22的探针，其与这样的序列或其互补序列具有至少80％的序列同一性，所述序列包含EE-GH3的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列。
24. 权利要求23的探针，其与SEQ ID No.1的从核苷酸712至753或SEQ ID No.2的从核苷酸410至451或所述序列的互补序列具有至少80％的序列同一性。
25. 用于鉴定生物样品中原种事件EE-GH3的特异性探针，所述序列与SEQ ID No.1的从核苷酸712至753或SEQ ID No.2的从核苷酸410至451或所述序列的互补序列基本相似。
26. 用于确认种子样品中种子纯度的方法，该方法包括使用特异性识别EE-GH3的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GH3的特定区域。
27. 用于在种子批的样品中就EE-GH3的存在筛选种子的方法，该方法包括使用特异性识别EE-GH3的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GH3的特定区域。
28. 用于确定包含原种事件EE-GH3的植物、植物材料或种子的接合性状态的方法，所述方法包括使用聚合酶链式反应和至少三种引物从存在于所述生物样品中的核酸扩增100至500bp之间的DNA片段，所述引物中的一种识别EE-GH3的5’侧翼区域，所述5’侧翼区域具有SEQ ID No 1的从核苷酸1至核苷酸732的核苷酸序列，所述引物的第二种特异性识别EE-GH3的3’侧翼区域，所述3’侧翼区域具有SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸654的互补序列的核苷酸序列，所述引物的第三种识别外源DNA内的序列，所述外源DNA具有SEQ ID No.1的从核苷酸733至核苷酸1214的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 2的从核苷酸1至核苷酸430的核苷酸序列。
29. 权利要求28的方法，其中所述第一引物包含SEQ ID No 3的核苷酸序列，所述第二引物包含SEQ ID No 10的序列，并且所述第三引物包含SEQ ID No 11的序列。
30. 检测原种事件EE-GH3在生物样品中存在的方法，所述方法通过与基本上互补的标记的核酸探针杂交，其中通过靶核酸序列的再循环来扩增探针∶靶核酸的比例，所述方法包括：
a)使所述靶核酸序列与第一核酸寡核苷酸杂交，所述第一核酸寡核苷酸包含SEQ ID No 1的从核苷酸733至核苷酸750的核苷酸序列或其互补序列或所述第一核酸寡核苷酸包含SEQ ID No 2的从核苷酸413至核苷酸430的核苷酸序列或其互补序列；
b)将所述靶核酸序列与第二核酸寡核苷酸杂交，所述第二核酸寡核苷酸包含SEQ ID No 1的从核苷酸715至核苷酸732的核苷酸序列或其互补序列或所述标记的核酸探针包含SEQ ID No 2的从核苷酸431至核苷酸448的核苷酸序列或其互补序列，其中所述第一和第二寡核苷酸通过至少1个核苷酸重叠并且其中将所述第一或所述第二寡核苷酸标记为所述标记的核酸探针；
c)使用引起选择性探针切割从而导致双链体解离的酶来只切割探针：靶核酸序列双链体中的标记的探针，从而使靶序列保持完整；
d)通过重复步骤(a)至(c)再循环靶核酸序列；和
e)检测被切割的标记的探针，从而确定所述靶核酸序列的存在。
31. 转基因棉花植物或其细胞、部分、种子或后代，其各自在其基因组中包含原种事件EE-GH3，其中包含所述事件的参照种子在保藏号PTA-6878下保藏在ATCC。
32. 权利要求31的转基因棉花植物、种子、细胞、部分或后代，其基因组DNA，当使用EE-GH3的原种事件鉴定方案和两种分别包含SEQID 3和SEQ ID 11的核苷酸序列的引物分析时，产生大约334bp的DNA片段。
33. 包含原种事件EE-GH3的种子或来源于其的衍生物，所述种子在保藏号PTA-6878下保藏在ATCC。
34. 从权利要求33的种子获得的棉花植物或其部分或来源于其的种子。
35. 棉花植物或其种子、细胞或组织，其各自在其基因组中包含原种事件EE-GH3，其是通过这样的棉花植物的繁殖和/或育种获得的，所述棉花植物从在保藏号PTA-6878下保藏在ATCC的种子生长而来。
36. 包含原种事件EE-GH3的棉花种子，其中包含所述事件的参照种子在保藏号PTA-6878下保藏在ATCC。
37. 从权利要求36的种子产生的包含原种事件EE-GH3的转基因棉花植物、细胞或组织。
38. 用于产生包含原种事件EE-GH3的棉花植物或种子的方法，其包括将根据权利要求31至37中任一项的植物与另一种棉花植物杂交，并且种植从所述杂交获得的种子。
39. 包含原种事件EE-GH3的棉花基因组DNA。
40. 从根据权利要求31至37中任一项的棉花植物、植物细胞或种子产生的基因组DNA。
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