ES2654294T3 - Plantas de algodón tolerantes a herbicidas y métodos para identificar las mismas - Google Patents
Plantas de algodón tolerantes a herbicidas y métodos para identificar las mismas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2654294T3 ES2654294T3 ES06762978.2T ES06762978T ES2654294T3 ES 2654294 T3 ES2654294 T3 ES 2654294T3 ES 06762978 T ES06762978 T ES 06762978T ES 2654294 T3 ES2654294 T3 ES 2654294T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleotide
- seq
- sequence
- nucleotide sequence
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Una planta de algodón transgénica tolerante a glifosato, o células, partes, semillas o descendencia de la misma, que comprenden cada uno un evento selecto en su genoma, comprendiendo dicho evento selecto un ADN foráneo que comprende un gen quimérico que comprende la secuencia codificante de un gen epsps modificado de Zea mays que codifica una enzima EPSPS tolerante a glifosato, bajo el control de un promotor expresable en plantas de un gen de histona, y en la que dicho evento selecto comprende - la SEQ ID NO: 1, estando los nucleótidos 1-732 de la SEQ ID NO: 1 inmediatamente en dirección 5' de y contiguos a dicho ADN foráneo y siendo los nucleótidos 733-1214 de la SEQ ID NO: 1 el ADN foráneo y - la SEQ ID NO: 2, estando los nucleótidos 431-654 de la SEQ ID NO: 2 inmediatamente en dirección 3' de y contiguos a dicho ADN foráneo, y siendo los nucleótidos 1 a 430 de la SEQ ID NO: 2 el ADN foráneo en la que dicho evento selecto está comprendido en la semilla de referencia depositada en la ATCC con el n.º de depósito PTA-6878, el ADN genómico de dicha planta de algodón, o células, partes, semilla o descendencia de la misma cuando se analiza en un protocolo de identificación por PCR con dos cebadores que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 11 respectivamente, produce un fragmento de ADN de 334 pb.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Plantas de algodón tolerantes a herbicidas y métodos para identificar las mismas Campo de la invención
Esta invención se refiere a plantas transgénicas de algodón, materiales vegetales y semillas, caracterizados por albergar un evento de transformación específico, particularmente por la presencia de un gen que codifica una proteína que confiere tolerancia a herbicidas, en una localización específica en el genoma del algodón. Las plantas de algodón de la invención combinan el fenotipo tolerante a herbicidas con un rendimiento agronómico, estabilidad genética y adaptabilidad a diferentes fondos genéticos equivalentes a la línea de algodón no transformada en ausencia de presión de malas hierbas. Esta invención proporciona además métodos y kits para identificar la presencia de material vegetal que comprende específicamente el evento de transformación EE-GH3 en muestras biológicas.
Antecedentes de la invención
La expresión fenotípica de un transgén en una planta se determina tanto por la estructura del propio gen como por su localización en el genoma de la planta. Al mismo tiempo, la presencia del transgén (en un ADN foráneo) en diferentes localizaciones en el genoma influirá en el fenotipo global de la planta de diferentes maneras. La introducción agronómica o industrialmente satisfactoria de un rasgo comercialmente interesante en una planta por manipulación genética puede ser un procedimiento largo que depende de diferentes factores. La transformación real y regeneración de plantas transformadas genéticamente es únicamente lo primero en una serie de etapas de selección, que incluyen la caracterización genética extensa, el cultivo selectivo y la evaluación en ensayos de campo, que dan lugar finalmente a la selección de un evento selecto.
La fibra de algodón es el único textil más importante en todo el mundo. Se recogen aproximadamente 80 millones de acres de algodón anualmente en todo el mundo. El algodón es el quinto cultivo mayor en los Estados Unidos en términos de producción por acre, con más de 15 millones de acres plantados en 2000. Las especies de malas hierbas principales para el algodón son Ipomoea sp. (enredadera), Amaranthus spp. (verdolaga), Cyperus spp. (coquillo), Xanthium spp. (bardana) y Sorghum spp. (sorgo de Alepo).
Antes de la introducción de herbicidas de hoja ancha, que pudieran usarse en un campo de algodón en cultivo, los agricultores usaban aplicaciones dirigidas posteriores a la germinación de herbicidas no selectivos teniendo cuidado de que no contactaran con las plantas de cultivo en crecimiento. Como esto requiere una diferencia en la altura entre las malas hierbas y el cultivo, esto no siempre es posible. Especialmente para algodón pequeño, esta práctica consume mucho tiempo y daña potencialmente el cultivo.
La identificación inequívoca de un evento selecto está llegando a ser cada vez más importante en vista de las discusiones sobre novedosos alimentos/piensos, la segregación de GMO y productos no GMO y la identificación de material patentado. De forma ideal, dicho método de identificación es tanto rápido como simple, sin la necesidad de un entorno de laboratorio extenso. Además, el método debe proporcionar resultados que permitan la determinación inequívoca del evento selecto sin interpretación por expertos, pero que se mantendrían bajo el escrutinio por expertos si fuera necesario. En este documento se describen herramientas específicas para su uso en la identificación del evento selecto EE-GH3 en muestras biológicas.
EE-GH3 se ha identificado como un evento selecto de una población de plantas transgénicas de algodón en el desarrollo de algodón (Gossypium hirsutum) resistente al herbicida N-fosfonometilglicina y sales de la misma, también conocido como glifosato. Las plantas transgénicas de algodón contenían un gen quimérico que confiere tolerancia a glifosato, que comprende un gen epsps modificado de Zea mays que codifica 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato (como se describe en la patente de Estados Unidos 6.566.587) bajo el control de un promotor expresable en plantas (como se describe en el documento US 5.491.288 o el documento US 5.792.930).
En la técnica se han divulgado plantas de algodón que comprenden un gen de tolerancia a glifosato. Sin embargo, ninguna de las divulgaciones de la técnica anterior muestra o sugiere la presente invención.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a una planta transgénica de algodón, o semilla, células o tejidos de la misma, como se define a continuación, que comprende, integrado de forma estable en su genoma, un casete de expresión que comprende un gen de tolerancia a herbicidas que comprende la secuencia codificante del gen epsps (como se describe en el ejemplo 1.1 de este documento), que es tolerante a herbicidas y, en ausencia de presión de malas hierbas, tiene un rendimiento agronómico que es sustancialmente equivalente a la línea isogénica no transgénica. Bajo presión de malas hierbas y el tratamiento apropiado con glifosato, la planta tendrá un fenotipo agronómico superior en comparación con la planta no transgénica.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
De acuerdo con la invención, la planta de algodón o semilla, células o tejidos de la misma comprende el evento selecto EE-GH3. Específicamente, la presente invención se refiere a una planta transgénica de algodón tolerante a glifosato o células, partes, semilla o descendencia de la misma, que comprenden cada uno un evento selecto en su genoma, comprendiendo dicho evento selecto un ADN foráneo que comprende un gen quimérico que comprende la secuencia codificante de un gen epsps modificado de Zea mays que codifica una enzima EPSPS tolerante a glifosato, bajo el control de un promotor expresable en plantas de un gen de histona, y donde dicho evento selecto comprende
- la SEQ ID NO: 1, estando los nucleótidos 1-732 de la SEQ ID NO: 1 inmediatamente en dirección 5' y contiguos a dicho ADN foráneo y siendo los nucleótidos 733-1214 de la SEQ ID NO: 1 el ADN foráneo y
- la SEQ ID NO: 2, estando los nucleótidos 431-654 de la SEQ ID NO: 2 inmediatamente en dirección 3' y contiguos a dicho ADN foráneo, y siendo los nucleótidos 1 a 430 de la SEQ ID NO: 2 el ADN foráneo
donde dicho evento selecto está comprendido en la semilla de referencia depositada en la ATCC con el número de depósito PTA-6878,
el ADN genómico de dicha planta de algodón o células, partes, semilla o descendencia de la misma, cuando se analiza en un protocolo de identificación por PCR con dos cebadores que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No: 3 y la SEQ ID NO: 11, respectivamente, produce un fragmento de ADN de 334 pb.
La semilla de referencia que comprende el evento selecto de la invención se ha depositado en la ATCC con el número de acceso PTA-6878. Una realización de la invención es la semilla que comprende el evento selecto EE-GH3 depositada como el número de acceso a la ATTC PTA-6878, que se convertirá en una planta de algodón resistente a glifosato. La semilla del número de depósito de la ATCC PTA-6878, que es un lote de semillas que consiste en al menos aproximadamente un 95% de granos transgénicos homocigóticos para el transgén, que comprende el evento selecto de la invención, que se convertirá en plantas tolerantes a glifosato. La semilla puede sembrarse y las plantas en crecimiento pueden tratarse con glifosato como se describe en este documento para obtener un 100% de plantas tolerantes a glifosato, que comprenden el evento selecto de la invención. La invención se refiere además a células, tejidos, descendencia y descendientes de una planta que comprende el evento selecto de la invención que ha crecido a partir de la semilla depositada en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-6878, y que comprende el evento selecto de la invención. La invención se refiere además a plantas que se pueden obtener por propagación y/o cruce con una planta e algodón que comprende el evento selecto de la invención cultivada a partir de la semilla depositada en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-6878 y que comprende el evento selecto de la invención.
En este documento se divulga un método para identificar una planta transgénica, o células o tejidos de la misma, que comprenden el evento selecto EE-GH3, estando basado dicho método en la identificación de la presencia de secuencias de ADN caracterizantes o aminoácidos codificados por dichas secuencias de ADN en la planta transgénica, células o tejidos. Dichas secuencias de ADN caracterizantes pueden ser secuencias de 15 pb preferiblemente 20 pb, mucho más preferiblemente 30 pb o más que comprenden el sitio de inserción del evento, es decir, tanto una parte de ADN foráneo como una parte del genoma del algodón (la región flanqueante 5' o 3') contiguo al mismo, que permite la identificación específica del evento selecto.
La invención también se refiere a un método para identificar la presencia de un evento selecto en una planta transgénica de algodón resistente a glifosato, o células, partes, semilla o descendencia de la misma de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método amplificar un fragmento de ADN entre 100 y 500 pb de un ácido nucleico presente en una muestra biológica de la planta, células, partes, semilla o descendencia de la misma, usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, reconociendo uno de dichos cebadores la región flanqueante 5' del evento selecto especificado en la reivindicación 1, teniendo dicha región flanqueante 5' la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 1 al nucleótido 732 o la región flanqueante 3' de dicho evento selecto, teniendo dicha región flanqueante 3' la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 431 al nucleótido 654, reconociendo el otro cebador de dichos cebadores una secuencia dentro del ADN foráneo que tiene la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 733 al nucleótido 1214 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 430.
Dicho método de la invención usa una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de los cuales reconoce la región flanqueante 5' o 3' de EE-GH3, el otro de los cuales reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo, para obtener un fragmento de ADN entre 100 y 500 pb. Los cebadores reconocen una secuencia dentro de la región flanqueante 5' de EE-GH3 (SEQ ID NO: 1, de la posición 1 a la posición 732) o dentro de la región flanqueante 3' de EE-GH3 (complemento de la SEQ ID NO: 2 de la posición 431 a la posición 654) y una secuencia dentro del ADN foráneo (complemento de la SEQ ID NO: 1 de la posición 733 a 1214 o la SEQ ID No: 2 de la posición 1 a la posición 430), respectivamente. El cebador que reconoce la región flanqueante 5' puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 y el cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 descrita en este documento.
La presente invención, por tanto, se refiere más específicamente a un método para identificar el evento selecto EE-GH3 en una planta transgénica de algodón resistente a glifosato, o células, partes, semilla o descendencia de la misma, comprendiendo dicho método amplificar una secuencia de ácido nucleico presente en una muestra biológica
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de la planta, células, partes, semillas y descendencia de la misma, usando una reacción en cadena de la polimerasa con dos cebadores que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 11, respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 334 pb.
También se divulgan en este documento las secuencia flanqueantes específicas de EE-GH3 descrito en este documento, que pueden usarse para desarrollar métodos de identificación específicos para EE-GH3 en muestras biológicas. Dichas secuencias flanqueantes incluyen las regiones flanqueantes 5' y/o 3' de EE-GH3 que pueden usarse para el desarrollo de cebadores y sondas específicos como se describe adicionalmente en este documento. Los métodos de identificación para la presencia de EE-GH3 en muestras biológicas pueden basarse en el uso de dichos cebadores y sondas específicos. Los cebadores pueden consistir en una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 1 al nucleótido 732 o el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 431 al nucleótido 654 combinada con cebadores que consisten en una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionados del complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 733 al nucleótido 1214 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 430. Los cebadores también pueden comprender estas secuencias de nucleótidos localizadas en su extremo 3' final, y comprenden además secuencias no relacionadas o secuencias derivadas de las secuencias de nucleótidos mencionadas, pero que comprenden emparejamientos incorrectos.
La invención se refiere además a un kit para identificar la presencia del evento selecto EE-GH3 en una planta transgénica de algodón resistente a glifosato, o células, partes, semilla o descendencia de la misma, comprendiendo dicho kit un cebador que reconoce la región flanqueante 5' del evento selecto especificado en la reivindicación 1, teniendo dicha región flanqueante 5' la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 1 al nucleótido 732 o un cebador que reconoce la región flanqueante 3' de dicho evento selecto, teniendo dicha región flanqueante 3' la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 431 al nucleótido 654, y un cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo, teniendo dicho ADN foráneo la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 733 al nucleótido 1214 o la secuencia de nucleótidos de la SeQ ID NO: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 430.
El cebador que reconoce la región flanqueante 5' puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 y el cebador que reconoce el transgén puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 o cualquier otro cebador como se describe en este documento.
La invención, por tanto, se refiere además a un kit para identificar la presencia del evento selecto EE-GH3 en una planta transgénica de algodón resistente a glifosato, o células, partes, semilla o descendencia de la misma, comprendiendo dicho kit los cebadores de PCR que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 11 para su uso en el protocolo de identificación por PCR de EE-GH3 descrito en este documento.
También se divulga en este documento un kit para identificar el evento selecto EE-GH3 en muestras biológicas, comprendiendo dicho kit una sonda específica que tiene una secuencia que corresponde (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre un 80% y un 100% de identidad de secuencia con una región especifica de EE-GH3. Preferiblemente, la secuencia de la sonda corresponde a una región específica que comprende parte de la región flanqueante 5' o 3' de EE-GH3. Mucho más preferiblemente, la sonda específica tiene (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre un 80% y un 100% de identidad de secuencia con la secuencia entre el nucleótido 712 a 753 de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 del nucleótido 410 a 451.
También se divulgan en este documento secuencias de ADN que comprenden el sitio de inserción del evento y una longitud suficiente de polinucleótidos tanto del ADN genómico del algodón como del ADN foráneo (transgén), para que sea útil como cebador o sonda para la detección de EE-GH3. Dichas secuencias pueden comprender al menos 9 nucleótidos del ADN genómico del algodón y una cantidad similar de nucleótidos del ADN foráneo (transgén) de EE-GH3 con ello en cada lado del sitio de inserción, respectivamente. Mucho más preferiblemente, dichas secuencias de ADN comprenden al menos 9 nucleótidos del ADN genómico del algodón y una cantidad similar de nucleótidos del ADN foráneo, contiguos al sitio de inserción de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
Los métodos y kits abarcados por la presente invención pueden usarse con diferentes fines tales como, aunque sin limitación, los siguientes: para identificar la presencia o ausencia de EE-GH3 en plantas, material vegetal o en productos tales como, aunque sin limitación, productos alimenticios o de pienso (frescos o procesados) que comprenden o derivan de material vegetal; de forma adicional o alternativa, los métodos y kits de la presente invención pueden usarse para identificar material vegetal transgénico con fines de segregación entre el material transgénico y no transgénico; de forma adicional o alternativa, los métodos y kits de la presente invención pueden usarse para determinar la calidad (es decir, porcentaje de material puro) del material vegetal que comprende EE-GH3.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes ejemplos, que no están destinados a limitar la invención a las realizaciones específicas descritas,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
pueden entenderse junto con las figuras adjuntas, incorporadas en este documento por referencia en que:
Figura 1: representa esquemáticamente la relación entre las secuencias de nucleótidos y cebadores citados.
Barra negra: ADN foráneo; barra clara: ADN de origen vegetal; las cifras bajo las barras representan las posiciones de los nucleótidos; (c) se refiere al complemento de la secuencia de nucleótidos indicada.
Figura 2: representa los resultados obtenidos por el protocolo de identificación por PCR desarrollado para EE-GH3. Secuencia de carga del gel: carril 1: marcador de peso molecular (escala de 100 pb); carriles 2 a 4: muestras de ADN de plantas de algodón que comprenden el evento transgénico EE-GH3; carriles 5 a 8: muestras de ADN de plantas transgénicas de algodón que no comprenden el evento selecto EE-GH3, pero que comprenden un gen similar de tolerancia a glifosato; carriles 9 a 11: muestras de ADN de plantas transgénicas de algodón que no comprenden el evento selecto EE-GH3, y que no comprenden un gen de tolerancia a glifosato; carril 12: muestra de ADN de control de una planta de algodón de tipo silvestre; carril 13: ADN de control que no es molde; carril 14: marcador de peso molecular.
Figura 3: representa los resultados obtenidos por el protocolo de PCR de valoración de la cigosidad desarrollado para EE-GH3. Secuencia de carga del gel: carril 1: marcador de peso molecular (escala de 100 pb); carriles 2, 4, 6, 7 y 8: muestras de ADN de plantas de algodón que comprenden el evento transgénico EE-GH3 en forma homocigótica; carriles 3 y 5: muestras de ADN de plantas de algodón que comprende el evento transgénico EE-GH3 en forma heterocigótica; carriles 9 y 10: muestra de ADN de control de una planta de algodón de tipo silvestre; carril 11: ADN de control que no es molde; carril 12: marcador de peso molecular.
Descripción detallada
La incorporación de una molécula de ADN recombinante en el genoma de la planta típicamente provoca la transformación de una célula o tejido. El sitio particular de incorporación habitualmente se debe a integración "aleatoria".
El ADN introducido en el genoma de la planta como resultado de la transformación de una célula o tejido vegetal con un ADN recombinante o "ADN transformante", y que se origina a partir de dicho ADN transformante se menciona a partir de ahora en este documento como "ADN foráneo" que comprende uno o más "transgenes". "ADN de la planta" en el contexto de la presente invención se referirá a ADN que se ha originado de la planta que se transforma. El ADN de la planta habitualmente se encontrará en el mismo locus genético en la planta de tipo silvestre correspondiente. El ADN foráneo puede caracterizarse por la localización y la configuración en el sitio de incorporación de la molécula de ADN recombinante en el genoma de la planta. El sitio en el genoma de la planta donde se ha insertado un ADN recombinante también se menciona como "sitio de inserción" o "sitio diana". La inserción del ADN recombinante en el genoma de la planta puede asociarse con una eliminación de ADN de la planta, mencionado como "eliminación de sitio diana". Una "región flanqueante" o "secuencia flanqueante" como se usa en este documento se refiere a una secuencia de al menos 20 pb, preferiblemente al menos 50 pb y hasta 5000 pb de ADN diferente del ADN introducido, preferiblemente ADN del genoma de la planta que está localizado inmediatamente en dirección 5' y contiguo a o inmediatamente en dirección 3' y contiguo al ADN foráneo. Los procedimientos de transformación que dan lugar a la integración aleatoria del ADN foráneo producirán transformantes con diferentes regiones flanqueantes, que son características y únicas para cada transformante. Cuando el ADN recombinante se introduce en una planta a través de cruce tradicional, su sitio de inserción en el genoma de la planta, o sus regiones flanqueantes, generalmente no se cambiarán. Una "región de inserción", como se usa en este documento, se refiere a la región correspondiente a la región de al menos 40 pb, preferiblemente al menos 100 pb y hasta 10 000 pb, abarcada por la secuencia que comprende la región flanqueante en dirección 5' y/o en dirección 3' de un ADN foráneo en el genoma de la planta. Teniendo en consideración las mínimas diferencias debidas a mutaciones dentro de una especie, una región de inserción retendrá, tras cruzarse con una planta de la misma especie, al menos un 85%, preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95% y mucho más preferiblemente un 100% de identidad de secuencia con la secuencia que comprende las regiones flanqueantes en dirección 5' y en dirección 3' del ADN foráneo en la planta originalmente obtenida de la transformación.
Un evento se define como un locus genético (artificial) que, como resultado de ingeniería genética, porta un transgén que comprende al menos una copia de un gen de interés. Los estados alélicos típicos de un evento son la presencia o ausencia del ADN foráneo. Un evento se caracteriza fenotípicamente por la expresión del transgén. A nivel genético, un evento es parte de la composición genética de una planta. A nivel molecular, un evento puede caracterizarse por el mapa de restricción (por ejemplo, determinado por transferencia de Southern), por las secuencias flanqueantes en dirección 5' y/o en dirección 3' del transgén, la localización de los marcadores moleculares y/o la configuración molecular del transgén. Habitualmente, la transformación de una planta con un ADN transformante que comprende al menos un gen de interés da lugar a una población de transformantes que comprenden una multitud de eventos diferentes, cada uno de los cuales es único.
Un evento selecto, como se usa en este documento, es un evento que se selecciona de un grupo de eventos, obtenidos por transformación con el mismo ADN transformante o por retrocruzamiento con plantas obtenidas por dicha transformación, basándose en la expresión y la estabilidad del transgén o transgenes y su compatibilidad con
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
las características agronómicas óptimas de la planta que comprende los mismos. Por tanto, los criterios para la selección de un evento selecto son uno o más, preferiblemente dos o más de forma ventajosa todos los siguientes:
a) que la presencia del ADN foráneo no compromete otras características deseadas de la planta, tales como las relacionadas con el rendimiento agronómico o el valor comercial;
b) que el evento se caracteriza por una configuración molecular bien definida que se hereda de forma estable y para la que pueden desarrollarse herramientas apropiadas para el control de la identidad;
c) que el gen o genes de interés muestran una expresión fenotípica espacial y temporal correcta, apropiada y estable, tanto en condiciones heterocigóticas (o hemicigóticas) y homocigóticas del evento, a un nivel comercialmente aceptable en una gama de condiciones ambientales en que las plantas que portan el evento probablemente quedan expuestas en uso agronómico normal.
Se prefiere que el ADN foráneo se asocie con una posición en el genoma de la planta que permita la fácil introgresión en fondos genéticos comerciales deseados.
El estado de un evento como evento selecto se confirma por introgresión del evento selecto en diferentes fondos genéticos relevantes y observando el cumplimiento de uno, dos o todos los criterios, por ejemplo, a), b) y c) anteriores.
Un "evento selecto", por tanto, se refiere a un locus genético que comprende un ADN foráneo, que responde a los criterios descritos anteriormente. Una planta, material vegetal o descendencia tal como semillas puede comprender uno o más eventos selectos en su genoma.
Las herramientas desarrolladas para identificar un evento selecto o la planta, material vegetal que comprende un evento selecto o productos que comprenden material vegetal que comprende el evento selecto se basan en las características genómicas específicas del evento selecto, tales como, un mapa de restricción específico de la región genómica que comprende el ADN foráneo, marcadores moleculares o la secuencia de la región o regiones flanqueantes del ADN foráneo.
Una vez se ha secuenciado una o ambas regiones flanqueantes del ADN foráneo, pueden desarrollarse cebadores y sondas que reconocen específicamente esta o estas secuencias en el ácido nucleico (ADN o ARN) de una muestra mediante una técnica de biología molecular. Por ejemplo, puede desarrollarse un método de PCR para identificar el evento selecto en muestras biológicas (tales como muestras de plantas, material vegetal o productos que comprenden material vegetal). Dicha PCR se basa en al menos dos "cebadores" específicos, reconociendo uno, una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento selecto y reconociendo el otro una secuencia dentro del ADN foráneo. Los cebadores preferiblemente tienen una secuencia entre 15 y 35 nucleótidos que en condiciones optimizadas de PCR "reconocen específicamente" una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento selecto y el ADN foráneo del evento selecto respectivamente, de modo que se amplifica un fragmento específico ("fragmento de integración" o amplicón de discriminación) a partir de una muestra de ácido nucleico que comprende el evento selecto. Esto significa que se amplifica únicamente el fragmento de integración diana, y no otra secuencia en el genoma de la planta o el aDn foráneo, en condiciones optimizadas de PCR.
Los cebadores de PCR adecuados para la invención pueden ser los siguientes:
- oligonucleótidos que varían de longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de
nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 20 nucleótidos consecutivos
seleccionados de la secuencia flanqueante 5' (SEQ ID NO: 1 del nucleótido 1 al nucleótido 732) en su extremo 3' (cebadores que reconocen las secuencias flanqueantes 5'); o
- oligonucleótidos que varían de longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de
nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 20 nucleótidos consecutivos,
seleccionados de la secuencia flanqueante 3' (complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 431 al nucleótido 654) en su extremo 3' (cebadores que reconocen las secuencias flanqueantes 3'); o
- oligonucleótidos que varían de longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 20 nucleótidos seleccionados de las secuencias de ADN insertadas (complemento de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 733 al nucleótido 1214) en su extremo 3' (cebadores que reconocen el ADN foráneo) o
- oligonucleótidos que varían de longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 20 nucleótidos seleccionados de las secuencias de ADN insertadas (SEQ ID NO: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 430)
Por supuesto, los cebadores pueden ser más largos de los 17 nucleótidos consecutivos mencionados, y pueden ser de, por ejemplo, 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt de longitud o incluso más largos. Los cebadores pueden consistir completamente en la secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos mencionada de secuencias flanqueantes y secuencias de ADN foráneo. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de los cebadores en su extremo 5' (es decir, fuera de los 17 nucleótidos consecutivos localizados en 3') es menos crucial. Por tanto, la secuencia 5' de los cebadores puede consistir en una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias flanqueantes o ADN foráneo, según lo apropiado, pero puede contener varios emparejamientos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
incorrectos (por ejemplo, 1, 2, 5, 10 emparejamientos incorrectos). La secuencia 5' de los cebadores puede incluso consistir completamente en una secuencia de nucleótidos no relacionada con las secuencias flanqueantes o el ADN foráneo, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que representa sitios de reconocimiento por enzimas de restricción. Dichas secuencias no relacionadas o secuencias de ADN flanqueantes con emparejamientos incorrectos preferiblemente no deben de ser más largas de 100, más preferiblemente más largas de 50 o incluso de 25 nucleótidos.
Además, los cebadores adecuados pueden comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos en su extremo 3' que abarca la región de unión entre las secuencias derivas del ADN de la planta y las secuencias de ADN foráneo (localizada en los nucleótidos 732-733 en las SEQ ID NO: 1 y los nucleótidos 430-431 en la SEQ ID NO: 2) con la condición de que los 17 nucleótidos consecutivos localizados en 3' mencionados no deriven exclusivamente del ADN foráneo o las secuencias derivadas de la planta en la SEQ ID NO: 1 o 2.
También quedará muy claro para los expertos en la materia que los pares de cebadores de PCR seleccionados apropiadamente tampoco deben comprender secuencias complementarias entre sí.
Para los fines de la invención, el "complemento de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO: X" es la secuencia de nucleótidos que puede obtenerse de la secuencia de nucleótidos representada remplazando los nucleótidos a través de su nucleótido complementario de acuerdo con las normas de Chargaff (AoT; GoC) y leyendo la secuencia en la dirección 5' a 3', es decir, en dirección opuesta de la secuencia de nucleótidos representada.
Los ejemplos de cebadores adecuados son las secuencia oligonucleotídicas de la SEQ ID NO: 3 (cebadores que reconocen la secuencia flanqueante 5'), la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 (cebadores que reconocen el ADN foráneo para su uso con los cebadores que reconocen la secuencia flanqueante 5'), la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 (cebadores que reconocen el ADN foráneo para su uso con los cebadores que reconocen la secuencia flanqueante 3') o la SEQ ID NO: 10 (cebadores que reconocen la secuencia flanqueante 3').
Otros ejemplos de cebadores oligonucleotídicos adecuados comprenden en su extremo 3' las siguientes secuencias
o consisten en dichas secuencias:
a. cebadores que reconocen la secuencia flanqueante 5':
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 00 LO CM al nucleótido 277
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 310 al nucleótido 329
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 311 al nucleótido 330
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 507 al nucleótido 526
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 616 al nucleótido 635
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 256 al nucleótido 275
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 259 al nucleótido 277
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 260 al nucleótido 279
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 309 al nucleótido 329
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 310 al nucleótido 330
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 311 al nucleótido 329
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 312 al nucleótido 330
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 436 al nucleótido 455
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 34 al nucleótido 53
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 130 al nucleótido 148
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 139 al nucleótido 158
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 256 al nucleótido 277
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 259 al nucleótido 279
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 260 al nucleótido 277
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 261 al nucleótido 279
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 266 al nucleótido 285
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 308 al nucleótido 329
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 309 al nucleótido 330
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 312 al nucleótido 329
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 313 al nucleótido 330
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 435 al nucleótido 455
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 501 al nucleótido 518
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 509 al nucleótido 526
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 513 al nucleótido 532
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 528 al nucleótido 547
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 529 al nucleótido 547
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 602 al nucleótido 621
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 21 al nucleótido 40
- la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 35 al nucleótido 54
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 129 al nucleótido 149
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 134 al nucleótido 153
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 138 al nucleótido 158
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 140 al nucleótido 158
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 150 al nucleótido 169
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 186 al nucleótido 205
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 254 al nucleótido 275
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 258 al nucleótido 279
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 262 al nucleótido 279
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 434 al nucleótido 455
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 512 al nucleótido 532
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 515 al nucleótido 532
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 530 al nucleótido 547
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 22 al nucleótido 40
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 32 al nucleótido 53
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 34 al nucleótido 54
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 82 al nucleótido 99
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 128 al nucleótido 149
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 135 al nucleótido 153
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 137 al nucleótido 158
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 141 al nucleótido 158
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 141 al nucleótido 161
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 168 al nucleótido 187
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 185 al nucleótido 205
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 187 al nucleótido 205
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 264 al nucleótido 285
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 511 al nucleótido 532
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 522 al nucleótido 541
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 527 al nucleótido 547
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 19 al nucleótido 40
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 22 al nucleótido 43
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 23 al nucleótido 40
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 33 al nucleótido 54
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 132 al nucleótido 153
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 136 al nucleótido 153
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 140 al nucleótido 161
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 150 al nucleótido 171
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 169 al nucleótido 188
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 169 al nucleótido 187
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 171 al nucleótido 189
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 173 al nucleótido 193
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 184 al nucleótido 205
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 188 al nucleótido 205
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 521 al nucleótido 541
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 523 al nucleótido 541
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 602 al nucleótido 623
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 97 al nucleótido 118
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 168 al nucleótido 188
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 170 al nucleótido 187
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 170 al nucleótido 188
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 172 al nucleótido 189
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 172 al nucleótido 193
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 520 al nucleótido 541
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 91 al nucleótido 110
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 167 al nucleótido 188
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 171 al nucleótido 188
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 176 al nucleótido 197
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 90 al nucleótido 110
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 92 al nucleótido 110
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 300 al nucleótido 319
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 89 al nucleótido 110
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 93 al nucleótido 110
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :1 del nucleótido 298 al nucleótido 319
b. cebadores que reconocen la secuencia de ADN foránea para su uso con cebadores que reconocen la secuencia flanqueante 5':
- el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 897 al nucleótido 916
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- cebadores que reconocen la secuencia flanqueante 3':
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
- - el
- complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO
d. cebadores que reconocen la secuencia de ADN forán flanqueante 3'
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 1 al nucleótido 20
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 18 al nucleótido 37
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 20 al nucleótido 39
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 14 al nucleótido 33
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 17 al nucleótido 37
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 19 al nucleótido 37
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 21 al nucleótido 40
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 21 al nucleótido 39
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 50 al nucleótido 67
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 71 al nucleótido 90
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 74 al nucleótido 93
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 96 al nucleótido 115
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 13 al nucleótido 33
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 15 al nucleótido 33
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 16 al nucleótido 37
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 19 al nucleótido 39
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 20 al nucleótido 37
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 20 al nucleótido 40
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 22 al nucleótido 39
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 22 al nucleótido 40
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 28 al nucleótido 47
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 42 al nucleótido 61
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 70 al nucleótido 90
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 72 al nucleótido 92
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 72 al nucleótido 91
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 73 al nucleótido 93
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 75 al nucleótido 93
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 75 al nucleótido 94
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 340 al nucleótido 359
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 424 al nucleótido 443
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 16 al nucleótido 33
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 18 al nucleótido 39
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 19 al nucleótido 40
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 27 al nucleótido 47
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 29 al nucleótido 47
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 37 al nucleótido 56
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 40 al nucleótido 59
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 41 al nucleótido 59
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 42 al nucleótido 59
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 69 al nucleótido 90
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 71 al nucleótido 91
1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del 1 del
nucleótido 1010 al nucleótido 1029 nucleótido 897 al nucleótido 914 nucleótido 899 al nucleótido 916 nucleótido 949 al nucleótido 966 nucleótido 1010 al nucleótido 1028 nucleótido 1008 al nucleótido 1027 nucleótido 1010 al nucleótido 1029 nucleótido 842 al nucleótido 861 nucleótido 842 al nucleótido 860 nucleótido 842 al nucleótido 862 nucleótido 842 al nucleótido 859 nucleótido 842 al nucleótido 863 nucleótido 920 al nucleótido 939 nucleótido 920 al nucleótido 937 nucleótido 1004 al nucleótido 1023 nucleótido 1004 al nucleótido 1024 nucleótido 1004 al nucleótido 1021 nucleótido 1004 al nucleótido 1025
2 del nucleótido 432 al nucleótido 453 2 del nucleótido 421 al nucleótido 442 2 del nucleótido 433 al nucleótido 452 2 del nucleótido 433 al nucleótido 453 ea para su uso con cebadores que reconocen la secuencia
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 72 al nucleótido 93
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 73 al nucleótido 91
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 73 al nucleótido 90
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 74 al nucleótido 94
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 94 al nucleótido 115
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 189 al nucleótido 208
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 339 al nucleótido 359
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 341 al nucleótido 359
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 358 al nucleótido 377
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 366 al nucleótido 385
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 424 al nucleótido 445
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 26 al nucleótido 47
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 30 al nucleótido 47
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 36 al nucleótido 56
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 38 al nucleótido 56
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 39 al nucleótido 59
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 41 al nucleótido 60
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 70 al nucleótido 91
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 73 al nucleótido 94
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 74 al nucleótido 91
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 338 al nucleótido 359
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 342 al nucleótido 359
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 357 al nucleótido 377
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 359 al nucleótido 377
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 367 al nucleótido 385
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 367 al nucleótido 386
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 35 al nucleótido 56
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 38 al nucleótido 59
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 356 al nucleótido 377
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 360 al nucleótido 377
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 364 al nucleótido 385
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 366 al nucleótido 386
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 368 al nucleótido 385
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 368 al nucleótido 386
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 407 al nucleótido 428
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 40 al nucleótido 61
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 365 al nucleótido 384
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 369 al nucleótido 386
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 422 al nucleótido 443
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 367 al nucleótido 387
- - la
- secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO :2 del nucleótido 366 al nucleótido 387
Como se usa en este documento, "la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: Z de la posición X a la posición Y" indica la secuencia de nucleótidos que incluye ambos nucleótidos finales.
Preferiblemente, el fragmento de integración tiene una longitud entre 50 y 500 nucleótidos, mucho más preferiblemente entre 100 y 350 nucleótidos. Los cebadores específicos pueden tener una secuencia que es entre un 80 y un 100% idéntica a una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento selecto y el ADN foráneo del evento selecto, respectivamente, con la condición de que los emparejamientos incorrectos aún permitan la identificación específica del evento selecto con estos cebadores en condiciones de PCR optimizadas. El intervalo de emparejamientos incorrectos permisible, sin embargo, puede determinarse fácilmente de forma experimental y es conocido para los expertos en la materia.
La siguiente tabla ejemplifica los tamaños de amplicones de ADN esperados (o fragmentos de integración) con pares seleccionados de cebadores de PCR.
- Cebador 1
- De la posición Cebador 2 Hasta la posición Longitud del amplicón
- GHI043
- 528 SB327 829 302
- GHI043
- 528 MAE080 1028 501
- GHI043
- 528 MAE081 1214 687
- GHI043
- 528 GHI044 860 334
- MAE078
- 1 MAE121 654 654
- MAE070
- 96 MAE121 654 559
- MAE071
- 358 MAE121 654 297
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La detección de fragmentos de integración puede producirse de diversas maneras, por ejemplo, mediante estimación del tamaño después de análisis en gel. Los fragmentos de integración también pueden secuenciarse directamente. También se conocen en la técnica otros métodos específicos de secuencia para la detección de fragmentos de ADN amplificados.
Como la secuencia de los cebadores y su ubicación relativa en el genoma son únicas para el evento selecto, la amplificación del fragmento de integración se producirá únicamente en muestras biológicas que comprenden (el ácido nucleico de) el evento selecto. Preferiblemente, cuando se realiza para PCR para identificar la presencia de EE-GH3 en muestras desconocidas, se incluye un control de un conjunto de cebadores con que puede amplificarse un fragmento dentro de un "gen constitutivo" de la especie de planta del evento. Los genes constitutivos son genes que se expresan en la mayoría de tipos celulares y que están relacionados con actividades metabólicas básicas comunes a todas las células. Preferiblemente, el fragmento amplificado del gen constitutivo es un fragmento que es más grande que el fragmento de integración amplificado. Dependiendo de las muestras a analizar, pueden incluirse otros controles.
Se describen protocolos convencionales de PCR en la técnica, tal como en "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2.a Edición, 1999). Las condiciones óptimas para la PCR, incluyendo la secuencia de los cebadores específicos, se especifican en un "protocolo de identificación por PCR" para cada evento selecto. Se entiende, sin embargo, que puede que varios parámetros en el protocolo de identificación por PCR tengan que ajustarse a condiciones de laboratorio específicas, y pueden modificarse ligeramente para obtener resultados similares. Por ejemplo, el uso de un método diferente para la preparación de ADN puede requerir el ajuste de, por ejemplo, la cantidad de cebadores, polimerasa y condiciones de hibridación usadas. Asimismo, la selección de otros cebadores puede dictaminar otras condiciones óptimas para el protocolo de identificación por PCR. Estos ajustes, sin embargo, serán evidentes para los expertos en la materia y, además, se detallan en los manuales actuales de aplicación de PCR tales como el citado anteriormente.
Como alternativa, pueden usarse cebadores específicos para amplificar un fragmento de integración que pueda usarse como "sonda específica" para identificar EE-GH3 en muestras biológicas. El contacto del ácido nucleico de una muestra biológica con la sonda, en condiciones que permitan la hibridación de la sonda con su fragmento correspondiente en el ácido nucleico, provoca la formación de un híbrido de ácido nucleico/sonda. La formación de este híbrido puede detectarse (por ejemplo, marcando el ácido nucleico o sonda), mediante lo cual la formación de este hibrido indica la presencia de EE-GH3. Dichos métodos de identificación basados en hibridación con una sonda específica (ya sea en un soporte en fase sólida o en solución) se han descrito en la técnica. La sonda específica es preferiblemente una secuencia que, en condiciones optimizadas, hibrida específicamente con una región dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento selecto y que preferiblemente también comprende parte del ADN foráneo contiguo a la misma (a partir de ahora en este documento mencionada como "región específica"). Preferiblemente, la sonda específica comprende una secuencia entre 50 y 500 pb, preferiblemente de 100 a 350 pb que es al menos un 80%, preferiblemente entre un 80% y un 85%, más preferiblemente entre un 85% y un 90%, especialmente preferiblemente entre un 90% y un 95%, mucho más preferiblemente entre un 95% y un 100% idéntica (o complementaria) a la secuencia de nucleótidos de una región específica. Preferiblemente, la sonda específica comprenderá una secuencia de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 nucleótidos contiguos idénticos (o complementarios) a una región específica del evento selecto.
Los oligonucleótidos adecuados como cebadores de PCR para la detección del evento selecto EE-GH3 también pueden usarse para desarrollar un protocolo basado en PCR para determinar el estado de cigosidad del evento selecto. Para este fin, se diseñan dos cebadores que reconocen el locus de tipo silvestre de tal manera que estén dirigidos uno hacia el otro y tengan el sitio de inserción localizado entre los cebadores. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente las secuencias flanqueantes 5' y 3' contenidas dentro de la SEQ ID NO: 1 o 2, respectivamente. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador complementario a secuencias de ADN transformantes y dirigidos hacia uno del ADN flanqueante, permiten la amplificación por PCR de diagnóstico del locus específico de EE-GH3, así como del locus wt. Si la planta es homocigótica para el locus transgénico o el correspondiente locus wt, la PCR de diagnóstico dará lugar a un único producto de PCR típico, preferiblemente típico en longitud, para el locus transgénico o wt. Si la planta es hemicigótica para el locus transgénico, aparecerán dos productos de PCR específicos de locus, que reflejan la amplificación del locus transgénico y también del locus wt.
Además, también pueden desarrollarse métodos de detección específicos para el evento selecto EE-GH3 que difieren de los métodos de amplificación basados en PCR usando la información de secuencia específica del evento selecto proporcionada en este documento. Dichos métodos de detección alternativos incluyen métodos de detección de amplificación de señal lineal basados en escisión invasiva de estructuras de ácido nucleico particulares, también conocida como tecnología InvaderTM (como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 5.985.557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6.001.567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage, incorporada en este documento por referencia). Para este fin, la secuencia diana puede hibridarse con un primer oligonucleótido de ácido nucleico marcado que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 733 hasta el nucleótido 750 o su complemento o dicha sonda de ácido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 413 al nucleótido 430 o su complemento y se hibrida
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
adicionalmente con un segundo oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 715 al nucleótido 732 o su complemento o dicha sonda de ácido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 de nucleótido 431 al nucleótido 448 o su complemento, donde el primer y segundo oligonucleótido solapan en al menos un nucleótido. La estructura dúplex o triple que se produce por esta hibridación permite la escisión de la sonda selectiva con una enzima (Cleavase®) que deja la secuencia diana intacta. La sonda marcada escindida posteriormente se detecta, potencialmente mediante una etapa intermedia que provoca la amplificación adicional de la señal.
Un "kit" como se usa en este documento se refiere a un conjunto de reactivos con el fin de realizar el método de la invención, más particularmente, la identificación del evento selecto EE-GH3 en muestras biológicas o la determinación del estado de cigosidad de material vegetal que contiene EE-GH3. Más particularmente, una realización preferida del kit de la invención comprende cebadores específicos, como se describe anteriormente para la identificación del evento selecto, o tres cebadores específicos para la determinación del estado de cigosidad. Opcionalmente, el kit puede comprender además cualquier otro reactivo descrito en este documento en el protocolo de identificación por PCR. Como alternativa, el kit puede comprender una sonda específica, como se describe anteriormente, que hibrida específicamente con el ácido nucleico de muestras biológicas para identificar la presencia de EE-GH3 en las mismas. Opcionalmente el kit puede comprender además cualquier otro reactivo (tal como, aunque sin limitación, tampón de hibridación, marcador) para la identificación de EE-GH3 en muestra biológicas, usando la sonda específica.
El kit de la invención puede usarse, y sus componentes pueden ajustarse específicamente, con fines de control de calidad (por ejemplo, pureza de lotes de semillas), detección de la presencia o ausencia del evento selecto el material vegetal o material que comprende o derivado de material vegetal, tal como, aunque sin limitación, productos alimenticios o de pienso.
Como se usa en este documento, "identidad de secuencia" con respecto a secuencias de nucleótidos (ADN o ARN), se refiere al número de posiciones con nucleótidos idénticos dividido por el número de nucleótidos en la más corta de las dos secuencias. La alineación de las dos secuencias de nucleótidos se realiza por el algoritmo de Wilbur y Lipmann (Wilbur y Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726) usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una penalización por hueco de 4. El análisis asistido por ordenador y la interpretación de los datos de secuencia, incluyendo la alineación de secuencia como se describe anteriormente, puede realizarse convenientemente, por ejemplo, usando el paquete de software de análisis de secuencia del Genetics Computer Group (GCG, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin). Las secuencias se indican como "esencialmente similares" cuando dichas secuencias tienen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 75%, particularmente al menos aproximadamente un 80%, más particularmente al menos aproximadamente un 85%, de forma bastante particular de aproximadamente un 90%, especialmente de aproximadamente 95%, más especialmente de aproximadamente un 100%. Está claro que cuando se dice que las secuencias de ARN son esencialmente similares o tienen un cierto grado de identidad de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN.
El término "cebador" como se usa en este documento abarca cualquier ácido nucleico que sea capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente de molde, tal como PCR. Típicamente, los cebadores son oligonucleótidos de 10 a 30 nucleótidos, pero pueden emplearse secuencias más largas. Pueden proporcionarse cebadores en forma bicatenaria, aunque se prefiere la forma monocatenaria. Pueden usarse sondas como cebadores, pero están diseñadas para unirse al ADN o ARN diana y no necesitan usarse en un proceso de amplificación.
El término "reconocimiento", como se usa en este documento, cuando se refiere a cebadores específicos, se refiere al hecho de que los cebadores específicos hibridan específicamente con una secuencia de ácido nucleico en el evento selecto en las condiciones expuestas en el método (tales como las condiciones del protocolo de identificación por PCR), mediante lo cual se determina la especificidad por la presencia de controles positivos y negativos.
El término "hibridación", como se usa en este documento, cuando se refiere a sondas específicas, se refiere al hecho de que la sonda se une a una región específica en la secuencia de ácido nucleico del evento selecto en condiciones de rigurosidad convencionales. Las condiciones de rigurosidad convencionales, como se usa en este documento se refieren a las condiciones para la hibridación descrita en este documento o a las condiciones convencionales de hibridación como se describe por Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que, por ejemplo, pueden comprender las siguientes etapas: 1) inmovilización de fragmentos de ADN genómico de la planta en un filtro, 2) prehibridación del filtro durante 1 a 2 horas a 42°C en formamida al 50%, SSPE 5 X, reactivo de Denhardt2X y SDS al 0,1%, o durante 1 a 2 horas a 68°C en SSC 6 X, reactivo de Denhardt2X y SDS al 0,1%, 3) adición de la sonda de hibridación que se ha marcado, 4) incubación durante 16 a 24 horas, 5) lavado del filtro durante 20 min a temperatura ambiente en SSC 1 X, SDS al 0,1%, 6) lavado del filtro tres veces durante 20 min cada una a 68°C en SSC 0,2 X, SDS al 0,1%, y 7) exposición del filtro durante 24 a 48 horas a películas de rayos-X a -70°C con un cribado de intensificación.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Como se usa en este documento, una muestra biológica es una muestra de una planta, material vegetal o productos que comprenden material vegetal. El término "planta" pretende abarcar tejidos vegetales de algodón (Gossypium hirsutum), en cualquier fase de madurez, así como cualquier célula, tejido u órgano recogido o derivado de cualquier planta, incluyendo sin limitación, cualquier semilla, hoja, tallo, flor, raíz, células individuales, gametos, cultivos celulares, cultivos tisulares o protoplastos. "Material vegetal", como se usa en este documento, se refiere a material que se obtiene o deriva de una planta. Los productos que comprenden materia vegetal se refieren a alimentos, piensos u otros productos que se producen usando material vegetal o pueden contaminarse por material vegetal. Se entiende que, en el contexto de la presente invención, dichas muestras biológicas se ensayan para la presencia de ácidos nucleicos específicos para EE-GH3, lo que implica la presencia de ácidos nucleicos en las muestras. Por tanto, los métodos mencionados en este documento para identificar el evento selecto EE-GH3 en muestras biológicas, se refieren a la identificación en muestras biológicas de ácidos nucleicos que comprenden el evento selecto.
Como se usa en este documento, "que comprende" debe interpretarse como especificando la presencia de las características, enteros, etapas, reactivos o componentes indicados que se mencionan, pero no imposibilita la presencia o adición de una o más características, enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. Por tanto, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los realmente citados, es decir, están incluidos en un ácido nucleico o proteína más grande. Un gen quimérico que comprende una secuencia de ADN que está funcional o estructuralmente definida, puede comprender secuencias de ADN adicionales, etc.
Como resultado del desarrollo de un evento selecto EE-GH3 en algodón, la invención también se refiere a las plantas que comprenden este evento, la descendencia obtenida de estas plantas y a las células vegetales o material vegetal derivado de este evento. Las plantas que comprenden el evento selecto EE-GH3 se obtuvieron como se describe en el ejemplo 1.
Las plantas de algodón o material vegetal que comprende EE-GH3 pueden identificarse de acuerdo con el protocolo de identificación por PCR descrito para EE-GH3 en el ejemplo 2. En resumen, el ADN genómico de algodón presente en la muestra biológica se amplifica por PCR usando un cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro de la secuencia flanqueante 5' o 3' de EE-GH3 tal como el cebador con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, y un cebador que reconoce una secuencia en el ADN foráneo, tal como el cebador con la secuencia de la SEQ ID NO: 11. Los cebadores de ADN que amplifican parte de una secuencia de algodón endógena se usan como control positivo para a amplificación por PCR. Si tras la amplificación por PCR el material produce un fragmento del tamaño esperado, el material contiene material vegetal de una planta de algodón que alberga el evento selecto EE-GH3.
Las plantas que albergan EE-GH3 se caracterizan por su tolerancia a glifosato, que en el contexto de la presente invención incluye que las plantas son tolerantes al herbicida glifosato. Las plantas que albergan EE-GH3 también pueden caracterizarse por tener características agronómicas que son comparables a variedades disponibles en el mercado de algodón en Estados Unidos, en ausencia de presión por malas hierbas y uso de glifosato para el control de malas hierbas. Se ha observado que la presencia de un ADN foráneo en la región de inserción del genoma de la planta de algodón descrito en este documento confiere características fenotípicas y moleculares particularmente interesantes a las plantas que comprenden este evento.
El ADN genómico que comprende el evento selecto EE-GH3, como se define en este documento, puede usarse como material de referencia en kits de identificación.
Los siguientes ejemplos describen la identificación del evento selecto EE-GH3 y el desarrollo de herramientas para la identificación específica del evento selecto EE-GH3 en muestras biológicas.
Salvo que se indique de otro modo, todas las técnicas de ADN recombinantes se realizan de acuerdo con protocolos convencionales como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY y en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE. UU. Los materiales y métodos convencionales para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications, RU.
En la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias:
- SEQ ID NO
- 1
- SEQ ID NO
- : 2:
- SEQ ID NO
- : 3:
- SEQ ID NO
- : 4:
- SEQ ID NO
- : 5:
- SEQ ID NO
- 6
- SEQ ID NO
- : 7:
secuencia de nucleótidos que comprende una región flanqueante 5' de EE-GH3
secuencia de nucleótidos que comprende una región flanqueante 3' de EE-GH3
cebador GHI043
cebador SB327
cebador MAE080
cebador MAE081
cebador MAE078
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
- SEQ ID NO
- 8:
- SEQ ID NO
- : 9:
- SEQ ID NO
- 10:
- SEQ ID NO
- 11:
- SEQ ID NO
- 12:
- SEQ ID NO
- 13:
cebador MAE070 cebador MAE071 cebador MAE121 cebador GHI044
cebador 1 para la amplificación del fragmento de control cebador 2 para la amplificación del fragmento de control
Ejemplos
1. Identificación del evento selecto EE-GH3
Se desarrolló algodón resistente a herbicidas por transformación de algodón con un vector que comprende la secuencia codificante de un gen epsps modificado que codifica una enzima epsps tolerante a glifosato, bajo el control de un promotor de un gen histona como se describe en el documento US 5.491.288 o el documento US 5.792.930.
El evento selecto EE-GH3 se seleccionó basándose en un procedimiento de selección amplia basado en la buena expresión y estabilidad del gen de resistencia a herbicida y se evaluó su compatibilidad con características agronómicas óptimas tales como altura de la planta, la altura hasta el nudo, la retención de la baga, postura, vigor, longitud de fibras, resistencia de las fibras y producción de pelusa.
El evento seleccionado se introdujo en diferentes fondos genéticos comerciales, y se compararon los resultados de los ensayos de campo en diferentes localizaciones. Las plantas se pulverizaron con el herbicida usando diferentes tratamientos.
No se observaron nunca daños visibles como resultado de la aplicación de herbicida después de la aplicación independientemente de la tasa o fase del desarrollo en el momento de la aplicación. No hubo efectos perjudiciales sobre la morfología o el hábito de crecimiento de las plantas por la aplicación de herbicida.
Además, el evento obtuvo una morfología foliar, floral y de las bagas normal, una excelente fertilidad y no mostró enfermedades o susceptibilidad anómala a insectos en múltiples fondos genéticos. Durante la introgresión en múltiples fondos genéticos, no se observaron problemas aberrantes o anomalías.
2. Identificación de las regiones flanqueantes del evento selecto EE-GH3
Se determinó la secuencia de las regiones que flanquean el ADN foráneo en el evento selecto EE-GH3 usando el método de PCR entrelazado asimétrica térmica (TAIL-) descrito por Liu et al. (1995, Plant J. 8(3):457-463). Este método utiliza tres cebadores internos en reacciones sucesivas junto con un cebador degenerado arbitrario más corto de modo que pudieran controlarse de forma térmica las eficacias de amplificación relativa de los productos específicos y no específicos. Los cebadores específicos se seleccionaron para su hibridación al límite del ADN foráneo y basándose en sus condiciones de hibridación. Se analizó una pequeña cantidad (5 jl) de productos de PCR no purificados, secundarios y terciarios en un gel de agarosa al 1%. El producto de PCR terciario se purificó y secuenció.
2.1. Región flanqueante derecha (5')
Se secuenció el fragmento identificado como que comprende la región flanqueante 5' obtenida por el método de TAIL-PCR (SEQ ID NO: 1). La secuencia entre el nucleótido 1 y 732 corresponde al ADN de la planta, mientras que la secuencia entre el nucleótido 733 y 1214 corresponde al ADN foráneo.
2.2. Región flanqueante izquierda (3')
Se secuenció el fragmento identificado como que comprende la región flanqueante 3' obtenida por el método de TAIL-PCR (SEQ ID NO: 2). La secuencia entre el nucleótido 1 a 430 corresponde al ADN foráneo, mientras que la secuencia entre el nucleótido 431 y 654 corresponde al ADN de la planta.
3. Desarrollo de un protocolo de identificación por reacción en cadena de la polimerasa para EE-GH3
3.1. Cebadores
Se desarrollaron cebadores específicos que reconocen secuencias dentro del evento selecto. Más particularmente, se desarrolló un cebador que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' de EE-GH3. Entonces se seleccionó un segundo cebador dentro de la secuencia del ADN foráneo de modo que los cebadores abarcarán una secuencia de aproximadamente 334 nucleótidos. Se encontró que los siguientes cebadores daban resultados particularmente claros y reproducibles en una reacción de PCR sobre ADN EE-GH3:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
GHI043: 5'-TTC.AgC.CgC.CAT.TgA.TgA.Ag-3' (SEQ ID NO: 3)
(diana: ADN de la planta)
GHI044: 5'-gTg.TAT.CCA.TgC.CTC.gAC.TC-3' (SEQ ID NO: 11)
(diana: ADN de inserto)
Los cebadores dirigidos a la secuencia endógena se incluyen preferiblemente en el cóctel de PCR. Estos cebadores sirven como control interno en muestras desconocidas y en el control positivo de ADN. Un resultado positivo con el par de cebadores endógenos demuestra que hay ADN abundante de calidad adecuada en la preparación de ADN genómico para generar un producto de PCR. Se seleccionaron los cebadores endógenos que reconocen un gen constitutivo en algodón:
GHI001: 5'-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3' (SEQ ID NO: 12)
GHI002: 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3' (SEQ ID NO: 13)
3.2. Fragmentos amplificados
Los fragmentos amplificados esperados en la reacción de PCR son:
Para el par de cebadores GHI001-GHI002: 445 pb (control endógeno)
Para el par de cebadores GHI043-GHI044: 334 pb (evento selecto EE-GH3)
3.3. ADN molde
Se preparó ADN molde a partir de una perforación foliar de acuerdo con Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Cuando se usa ADN preparado con otros métodos, debe hacerse un ensayo ejecutado utilizando diferentes cantidades de molde. Habitualmente 50 ng de ADN molde genómico produce los mejores resultados.
3.4. Controles positivos y negativos asignados
Para evitar los falsos positivos o negativos, se determinó que deben incluirse los siguientes controles positivos y negativos en una ejecución de PCR:
- Control de mezcla maestra (control negativo de ADN). Esta es una PCR en la que no se añade ADN a la reacción. Cuando se observa el resultado esperado, sin productos de PCR, esto indica que el cóctel de PCR no estaba contaminado con ADN diana.
- Un control positivo de ADN (muestra de ADN genómico que se sabe que contiene las secuencias transgénicas). La amplificación satisfactoria de este control positivo demuestra que la PCR se ejecutaba en condiciones que permiten la amplificación de las secuencias diana.
- Un control de ADN de tipo silvestre. Esta es una PCR en que el ADN molde proporcionado es ADN genómico preparado a partir de una planta no transgénica. Cuando se observa el resultado esperado, ausencia de amplificación de un producto de PCR transgénico, pero amplificación de producto de PCR endógeno, esto indica que hay una amplificación de fondo transgénico detectable en una muestra de ADN genómico.
3.5. Condiciones de PCR
Se obtuvieron resultados óptimos en las siguientes condiciones:
- la mezcla de PCR para reacciones de 25 pl contiene:
2.5 pl de ADN molde
2.5 pl de tampón de amplificación 10 x (suministrado por el fabricante con la polimerasa Taq)
0,5 pl de dNTP 10 mM
0,5 pl de GHI001 (10 pmoles/pl)
0,5 pl de GHI002 (10 pmoles/pl)
0,25 pl de GHI044 (10 pmoles/pl)
0,25 pl de GHI043 (10 pmoles/pl)
0,1 pl de ADN polimerasa Taq (5 unidades/pl) agua hasta 25 pl
- el perfil de termociclado a seguir para resultados óptimos es el siguiente:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Seguido por:
Seguido por:
Seguido por:
3.6. Análisis en gel de agarosa
4 min a 95°C
1 min a 950C
1 min a 57°C
2 min a 72°C Durante 5 ciclos
30 s a 92°C 30 s a 57°C 1 min a 72°C Durante 25 ciclos
10 minutos a 72°C
Para visualizar de forma óptima los resultados de la PCR, se determinó que deben aplicarse entre 10 y 20 |jl de las muestras de PCR en un gel de agarosa al 1,5% (tampón Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo, escala de 100 pb PHARMACIA).
3.7. Validación de los resultados
Se determinó que los datos de muestras de ADN de plantas transgénicas dentro de una única ejecución de PCR y un único cóctel de PCR no deben ser aceptables salvo que 1) el control positivo de ADN muestre los productos de PCR esperados (fragmentos transgénicos y endógenos), 2) el control negativo de ADN sea negativo para la amplificación por PCR (sin fragmentos) y 3) el control de ADN de tipo silvestre muestre el resultado esperado (amplificación del fragmento endógeno)
Cuando se sigue el protocolo de identificación por PCR para EE-GH3 como se describe anteriormente, los carriles que muestran cantidades visibles de los productos de PCR transgénicos y endógenos de los tamaños esperados, indican que la planta correspondiente de la que se preparó el ADN molde genómico ha heredado el evento selecto EE-GH3. Los carriles que no muestran cantidades visibles de los productos de PCR transgénicos y que muestran cantidades visibles del producto de PCR endógeno, indica que la planta correspondiente de la que se preparó el ADN molde genómico no comprende el evento selecto. Los carriles que no muestran cantidad visibles de los productos de PCR endógenos y transgénicos indican que la calidad y/o cantidad del ADN genómico no permitía generar un producto de PCR. Estas plantas no pueden valorarse. La preparación de ADN genómico debe repetirse y tiene que realizarse una nueva ejecución de PCR, con los controles apropiados.
3.8. Uso de protocolo de PCR de discriminación para identificar EE-GH3
Antes de intentar cribar muestras desconocidas, tiene que realizarse una ejecución de ensayo con todos los controles apropiados. El protocolo desarrollado podría requerir la optimización de los componentes que pueden diferir entre laboratorios (preparación de ADN molde, aDn polimerasa Taq, calidad de los cebadores, dNTP, termociclador, etc.).
La amplificación de la secuencia endógena desempeña una función clave en el protocolo. Se tienen que obtener las condiciones de PCR y termociclado que amplifican cantidades equimolares tanto de la secuencia endógena como de la secuencia transgénica en un molde de aDn genómico transgénico conocido. Siempre que el fragmento endógeno diana no se amplifique o siempre que las secuencias diana no se amplifiquen con las mismas intensidades de tinción con bromuro de etidio, que se juzga por electroforesis en gel de agarosa, puede requerirse optimización de las condiciones de PCR.
Se ensayó material foliar de varias plantas de algodón, algunas de las cuales comprendían EE-GH3, de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Se recogieron muestras del evento selecto EE-GH3 y de algodón de tipo silvestre como controles positivos y negativos, respectivamente.
La figura 2 ilustra el resultado obtenido con el protocolo de identificación por PCR del evento selecto para EE-GH3 sobre varias muestras de plantas de algodón. Se encontró que las muestras en los carriles 2 a 4 contenían el evento selecto ya que se detecta la banda de 334 pb, mientras que las muestras en los carriles 5 a 12 no comprenden EE-GH3. Los carriles 5 a 11 comprenden otros eventos selectos de algodón (incluyendo plantas que comprenden diferentes genes quiméricos de tolerancia a glifosato), el carril 12 representa un control de algodón no transgénico; el carril 13 representa la muestra de control negativo (agua) y los carriles 1 y 14 representan el marcador de peso molecular (escala de 100 pb).
4. Uso de un fragmento de integración especifico como sonda para la detección de material que comprende EE-GH3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Se obtiene un fragmento de integración especifico de EE-GH3 por amplificación por PCR usando los cebadores específicos GHI043 (SEQ ID NO: 3) y GHI044 (SEQ ID NO: 11) o por síntesis química y se marca. Este fragmento de integración se usa como sonda específica para la detección de EE-GH3 en muestras biológicas. Se extrae el ácido nucleico de las muestras de acuerdo con procedimientos convencionales. Este ácido nucleico entonces se pone en contacto con la sonda específica en condiciones de hibridación que se optimizan para permitir la formación de un híbrido. La formación del híbrido entonces se detecta para indicar la presencia del ácido nucleico EE-GH3 en la muestra. Opcionalmente, el ácido nucleico en las muestras se amplifica usando los cebadores específicos antes del contacto con la sonda específica. Como alternativa, el ácido nucleico se marca antes del contacto con la sonda específica en lugar del fragmento de integración. Opcionalmente, la sonda específica se une a un soporte sólido (tal como, aunque sin limitación, un filtro, una tira, o microesferas), antes del contacto con las muestras.
5. Protocolo para la determinación basada en PCR del estado de cigosidad de material vegetal de algodón EE-GH3
5.1. Cebadores
Se diseñaron dos cebadores que reconocen las secuencias de nucleótidos del locus de tipo silvestre antes de la inserción del evento selecto, de tal manera que estuvieran dirigidos uno hacia el otro y tuvieran el sitio de inserción entremedias. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador complementario a las secuencias de ADN foráneo y dirigido hacia el ADN flanqueante, permite la amplificación simultánea por PCR del locus EE-GH3, así como del locus wt.
Se descubrió que los siguientes cebadores dan resultados particularmente claros y reproducibles en una reacción de PCR de valoración de cigosidad sobre ADN EE-GH3:
GHI043: 5'-TTC.AgC.CgC.CAT.TgA.TgA.Ag-3'
(diana: ADN vegetal de la secuencia flanqueante 3')
GHI044: 5'-gTg.TAT.CCA.TgC.CTC.gAC.TC-3'
(diana: ADN de inserto)
MAE121: 5-CCA.TTC.CgA.TCATCg.AgT.Tg-3'
(diana: ADN vegetal de la secuencia flanqueante 5')
5.2. Fragmentos amplificados
Los fragmentos amplificados esperados en la reacción de PCR son:
Para el par de cebadores GHI043-MAE121: 454 pb (correspondiente a la amplificación del locus wt)
Para el par de cebadores GHI043-GHI044: 334 pb (evento selecto EE-GH3)
5.3. ADN molde
Se preparó ADN molde a partir de una perforación foliar de acuerdo con Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Cuando se usa ADN preparado con otros métodos, debe hacerse un desarrollo de ensayo que utilice diferentes cantidades de molde. Habitualmente 50 ng de ADN molde genómico produce los mejores resultados.
5.4. Controles positivos y negativos asignados
Para evitar los falsos positivos o negativos, es aconsejable que se incluyan los siguientes controles positivos y negativos en una ejecución de PCR:
- Mezcla maestra de control (control negativo de ADN). Esta es una PCR en que no se añade ADN a la reacción. Cuando se observa el resultado esperado, sin productos de PCR, esto indica que el cóctel de PCR no estaba contaminado con el ADN diana.
- Un control positivo de ADN (muestra de ADN genómico que se sabe que contiene las secuencias transgénicas). La amplificación satisfactoria de este control positivo demuestra que la PCR se ejecutó en condiciones que permiten la amplificación de las secuencias diana.
- Un control de ADN de tipo silvestre. Esta es una PCR en que el ADN molde proporcionado es ADN genómico preparado de una planta no transgénica. Cuando se observa el resultado esperado, ausencia de amplificación de un producto de pCr transgénico, pero amplificación del producto de PCR endógeno, esto indica que no hay amplificación del fondo transgénico detectable en una muestra de ADN genómico.
(SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 10)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
5.5. Condiciones de PCR
Los resultados óptimos se obtuvieron en las siguientes condiciones:
- la mezcla de PCR para reacciones de 25 |jl contiene:
x jl de ADN molde (150 ng)
2.5 jl de tampón de amplificación 10 x (suministrado por el fabricante con la polimerasa Taq) 0,5 jl de dNTP 10 nM
1.5 jl de GHI043 (10 pmoles/jl)
1,0 jl de GHI044 (10 pmoles/jl)
0,5 jl de MAE121 (10 pmoles/jl)
0,1 jl de ADN polimerasa Taq (5 unidades/jl) agua hasta 25 jl
- el perfil de termociclado a seguir para los resultados óptimos es el siguiente:
4 min a 95°C
1 min a 95°C
1 min a 57°C
2 min a 72°C Durante 5 ciclos
30 s a 92°C 30 s a 57°C 1 min a 72°C Durante 25 ciclos
10 minutes a 72°C
5.6. Análisis en gel de agarosa
Seguido por:
Seguido por:
Seguido por:
Para visualizar de forma óptima los resultados de la PCR se determinó que deben aplicarse entre 10 y 20 jl de las muestras de PCR en un gel de agarosa al 1,5% (tampón Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo, escala de 100 pb PHARMACIA).
5.7. Validación de los resultados
Los datos de las muestras de ADN vegetal transgénico dentro de una única ejecución de PCR y una única mezcla maestra de PCR no serán aceptables salvo que:
- el control positivo muestre los productos de PCR esperados (amplificación de diana transgénica)
- el control de ADN positivo de tipo silvestre muestre el resultado esperado (amplificación de la diana de tipo silvestre).
- el control negativo sea negativo para la amplificación por PCR (sin fragmentos).
Los carriles que muestran cantidades visibles del producto de PCR transgénico del tamaño esperado y que no muestran cantidades visibles del producto de PCR de tipo silvestre, indican que la planta correspondiente de la que se preparó el molde de ADN genómico es homocigótica para el casete del gen transgénico.
Los carriles que muestran cantidades visibles de los productos de PCR transgénicos y de tipo silvestre de los tamaños esperados, indican que la planta correspondiente de la que se preparó el ADN molde genómico es hemicigótica para el casete del gen transgénico. Los carriles que no muestran cantidades visibles del producto de PCR transgénico y que muestran cantidades visibles del producto de PCR de tipo silvestre, indican que la planta correspondiente de la que se preparó el ADN molde genómico no ha heredado la secuencia transgénica ensayada y, por tanto, es homocigótica para el locus de tipo silvestre.
Los carriles que no muestran cantidades visibles de productos de PCR transgénicos y de tipo silvestre, indican que la calidad y/o cantidad del ADN genómico no permitían la generación de un producto de PCR. Estas plantas no pueden valorarse. La preparación del ADN genómico debe repetirse y tiene que realizarse una nueva ejecución de PCR, con los controles apropiados.
5.8. Uso del protocolo de valoración de cigosidad para la identificación del estado de cigosidad en plantas que contienen EE-GH3.
Claims (8)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Una planta de algodón transgénica tolerante a glifosato, o células, partes, semillas o descendencia de la misma, que comprenden cada uno un evento selecto en su genoma,comprendiendo dicho evento selecto un ADN foráneo que comprende un gen quimérico que comprende la secuencia codificante de un gen epsps modificado de Zea mays que codifica una enzima EPSPS tolerante a glifosato, bajo el control de un promotor expresable en plantas de un gen de histona, y en la que dicho evento selecto comprende- la SEQ ID NO: 1, estando los nucleótidos 1-732 de la SEQ ID NO: 1 inmediatamente en dirección 5' de y contiguos a dicho ADN foráneo y siendo los nucleótidos 733-1214 de la SEQ ID NO: 1 el ADN foráneo y- la SEQ ID NO: 2, estando los nucleótidos 431-654 de la SEQ ID NO: 2 inmediatamente en dirección 3' de y contiguos a dicho ADN foráneo, y siendo los nucleótidos 1 a 430 de la SEQ ID NO: 2 el ADN foráneoen la que dicho evento selecto está comprendido en la semilla de referencia depositada en la ATCC con el n.° de depósito PTA-6878,el ADN genómico de dicha planta de algodón, o células, partes, semilla o descendencia de la misma cuando se analiza en un protocolo de identificación por PCR con dos cebadores que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 11 respectivamente, produce un fragmento de ADN de 334 pb.
- 2. Un método para identificar la presencia de un evento selecto en una planta de algodón transgénica resistente a glifosato, o células, partes, semilla o descendencia de la misma especificadas en la reivindicación 1, comprendiendo dicho métodoamplificar un fragmento de ADN entre 100 y 500 pb de un ácido nucleico presente en una muestra biológica de la planta, células, partes, semilla o descendencia de la misma, usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores,reconociendo uno de dichos cebadores la región flanqueante 5' del evento selecto especificado en la reivindicación 1,teniendo dicha región flanqueante 5' la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 1 al nucleótido 732 o la región flanqueante 3' de dicho evento selecto,teniendo dicha región flanqueante 3' la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 431 al nucleótido 654,reconociendo el otro cebador de dichos cebadores una secuencia dentro del ADN foráneo que tiene la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 733 al nucleótido 1214 o la secuencia de nucleótidos de la SeQ ID NO: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 430.
- 3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho cebador que reconoce la región flanqueante 5' consiste en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 1 al nucleótido 732 o dicho cebador que reconoce la región flanqueante 3' de dicho evento selecto consiste en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 431 al nucleótido 654,y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo consiste en 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 733 al nucleótido 1214 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 430o en el que dicho cebador que reconoce la región flanqueante 5' comprende en su extremo 3' final una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 1 al nucleótido 732o dicho cebador que reconoce a región flanqueante 3' de dicho evento selecto comprende en su extremo 3' final una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 431 al nucleótido 654,y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo comprende en su extremo 3' al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 733 al nucleótido 1214 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 430.
- 4. El método de la reivindicación 3, en el que dichos cebadores comprenden la secuencia de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 11, respectivamente.
- 5. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 2, 3 o 4 para el cribado de semillas para la presencia de dicho evento selecto.
- 6. Un kit para identificar la presencia de un evento selecto en una planta de algodón transgénica resistente a glifosato, o células, partes, semilla o descendencia de la misma especificadas en la reivindicación 1, comprendiendo dicho kit un cebador que reconoce la región flanqueante 5' del evento selecto especificado en la reivindicación 1, teniendo dicha región flanqueante 5' la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 1 al nucleótido 732o un cebador que reconoce la región flanqueante 3' de dicho evento selecto, teniendo dicho región flanqueante 3' la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 431 al nucleótido 654,510152025y un cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo,teniendo dicho ADN foráneo la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 733 al nucleótido 1214 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 430.
- 7. El kit de la reivindicación 6, en el que dicho cebador que reconoce la región flanqueante 5' consiste en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 1 al nucleótido 732o dicho cebador que reconoce la región flanqueante 3' de dicho evento selecto consiste en una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 431 al nucleótido 654,y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo consiste en 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 733 al nucleótido 1214o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 430o en el que dicho cebador que reconoce la región flanqueante 5' comprende en su extremo 3' final una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 1 al nucleótido 732o dicho cebador que reconoce la región flanqueante 3' de dicho evento selecto comprende en su extremo 3' final una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 431 al nucleótido 654,y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro el ADN foráneo comprende en su extremo 3' al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 733 al nucleótido 1214o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 430.
- 8. El kit de la reivindicación 7, que comprende un cebador que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 3 y un cebador que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 11.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP05076826 | 2005-08-08 | ||
| EP05076826 | 2005-08-08 | ||
| US70706705P | 2005-08-10 | 2005-08-10 | |
| US707067P | 2005-08-10 | ||
| PCT/EP2006/007711 WO2007017186A1 (en) | 2005-08-08 | 2006-08-01 | Herbicide tolerant cotton plants and methods for identifying same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2654294T3 true ES2654294T3 (es) | 2018-02-13 |
Family
ID=39921119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06762978.2T Active ES2654294T3 (es) | 2005-08-08 | 2006-08-01 | Plantas de algodón tolerantes a herbicidas y métodos para identificar las mismas |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7932439B2 (es) |
| EP (2) | EP2295587A1 (es) |
| CN (1) | CN101238217B (es) |
| AR (2) | AR054901A1 (es) |
| AU (1) | AU2006278778B2 (es) |
| BR (1) | BRPI0614338B1 (es) |
| ES (1) | ES2654294T3 (es) |
| MX (1) | MX2008001839A (es) |
| WO (1) | WO2007017186A1 (es) |
| ZA (1) | ZA200800909B (es) |
Families Citing this family (300)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA200800909B (en) * | 2005-08-08 | 2009-08-26 | Bayer Bioscience Nv | Herbicide tolerant cotton plants and methods for identifying same |
| WO2008151780A1 (en) * | 2007-06-11 | 2008-12-18 | Bayer Bioscience N.V. | Insect resistant cotton plants comprising elite event ee-gh6 and methods for identifying same |
| CA2733134A1 (en) | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Bayer Bioscience N.V. | Methods for plant fiber characterization and identification |
| NZ600375A (en) | 2009-11-23 | 2014-10-31 | Bayer Cropscience Nv | Herbicide tolerant soybean plants and methods for identifying same |
| RS58739B1 (sr) | 2009-11-23 | 2019-06-28 | Basf Agricultural Solution Seed Us Llc | Elitni događaj ee-gm3 i postupci i kompleti za identifikaciju takvog događaja u biološkim uzorcima |
| RS55986B1 (sr) | 2010-01-22 | 2017-09-29 | Bayer Ip Gmbh | Akaricidne i/ili insekticidne kombinacije aktivnih supstanci |
| CN101792813B (zh) * | 2010-04-07 | 2012-11-14 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 鉴别转抗除草剂棉花llcotton25转化体的pcr方法 |
| US9206137B2 (en) | 2010-11-15 | 2015-12-08 | Bayer Intellectual Property Gmbh | N-Aryl pyrazole(thio)carboxamides |
| BR112013012966A2 (pt) | 2010-11-29 | 2016-08-23 | Bayer Ip Gmbh | iminas alfa, beta - insaturadas |
| MX2013005356A (es) | 2010-12-01 | 2013-07-05 | Bayer Ip Gmbh | Uso de fluopyram para combatir nematodos en cultivos. |
| EP2460407A1 (de) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe |
| CN103403185A (zh) * | 2010-12-29 | 2013-11-20 | 陶氏益农公司 | 测定整装样品中的接合性的方法 |
| JP2014513061A (ja) | 2011-03-10 | 2014-05-29 | バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー | 処理された種子の種子安全性を保護するためのリポキト−オリゴ糖化合物の使用 |
| CN109221124A (zh) | 2011-03-23 | 2019-01-18 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 活性化合物组合 |
| US20140051575A1 (en) | 2011-04-08 | 2014-02-20 | Juergen Benting | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| MX346208B (es) | 2011-04-22 | 2017-03-09 | Bayer Ip Gmbh | Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado de (tio)carboxamida y un compuesto fungicida. |
| EP2720543B1 (en) | 2011-06-14 | 2018-08-22 | Bayer CropScience AG | Use of an enaminocarbonyl compound in combination with a biological control agent |
| US9265252B2 (en) | 2011-08-10 | 2016-02-23 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives |
| CN107287234A (zh) | 2011-08-22 | 2017-10-24 | 拜尔作物科学公司 | 修饰植物基因组的方法和手段 |
| EP2561759A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-02-27 | Bayer Cropscience AG | Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth |
| MX347562B (es) | 2011-09-12 | 2017-05-03 | Bayer Ip Gmbh | Derivados fungicidas de 3-fenil[(heterociclilmetoxi)imino]metil}-1 ,2,4-oxadiazol-5(4h)-ona sustituidos en 4. |
| CA2848622A1 (en) | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2-isoxazoline-3-carboxylates for improving plant yield |
| CN108552186A (zh) | 2011-09-16 | 2018-09-21 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 苯基吡唑啉-3-甲酸酯类用于提高植物产量的用途 |
| BR112014006217B1 (pt) | 2011-09-16 | 2019-01-15 | Bayer Intellectual Property Gmbh | utilização de acilsulfonamidas para melhorar o rendimento de plantas,método para induzir respostas de regulação de crescimento em plantas úteis ou plantas de cultura e composição. |
| AU2012320554B2 (en) | 2011-10-04 | 2017-11-09 | Bayer Intellectual Property Gmbh | RNAi for the control of fungi and oomycetes by inhibiting saccharopine dehydrogenase gene |
| US9617286B2 (en) | 2011-11-21 | 2017-04-11 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicide N-[(trisubstitutedsilyl)methyl]-carboxamide derivatives |
| BR112014013031A2 (pt) | 2011-11-30 | 2017-06-13 | Bayer Ip Gmbh | composto, composição fungicida e método para o controle dos fungos |
| CA2859467C (en) | 2011-12-19 | 2019-10-01 | Bayer Cropscience Ag | Use of anthranilic acid diamide derivatives for pest control in transgenic crops |
| EP2797891B1 (en) | 2011-12-29 | 2015-09-30 | Bayer Intellectual Property GmbH | Fungicidal 3-[(pyridin-2-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-one derivatives |
| CN104039769B (zh) | 2011-12-29 | 2016-10-19 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 杀真菌的3-[(1,3-噻唑-4-基甲氧基亚氨基)(苯基)甲基]-2-取代的-1,2,4-噁二唑-5(2h)-酮衍生物 |
| US20150011389A1 (en) | 2012-01-25 | 2015-01-08 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active Compound Combinations Containing Fluopyram and Biological Control Agent |
| MX350563B (es) | 2012-01-25 | 2017-09-11 | Bayer Ip Gmbh | Combinaciones de compuestos activos que contienen fluopiram, bacillus y un agente de control biologico. |
| PE20141735A1 (es) | 2012-02-27 | 2014-11-12 | Bayer Ip Gmbh | Combinaciones de compuestos activos |
| WO2013139949A1 (en) | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield |
| EP2836489B1 (en) | 2012-04-12 | 2016-06-29 | Bayer Cropscience AG | N-acyl-2-(cyclo) alkylpyrrolidines and piperidines useful as fungicides |
| WO2013156560A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-n-[(trisubstitutedsilylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| EP2838893B1 (en) | 2012-04-20 | 2019-03-13 | Bayer Cropscience AG | N-cycloalkyl-n-[(heterocyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| WO2013167545A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-14 | Bayer Cropscience Ag | Pyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662364A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides |
| EP2662363A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides |
| EP2662360A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662362A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole indanyl carboxamides |
| BR112014027644A2 (pt) | 2012-05-09 | 2017-06-27 | Bayer Cropscience Ag | 5-halogenopirazol-indanil-carboxamidas |
| EP2662370A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides |
| EP2662361A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazol indanyl carboxamides |
| AR091104A1 (es) | 2012-05-22 | 2015-01-14 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida |
| CN108669088A (zh) | 2012-05-30 | 2018-10-19 | 拜耳作物科学股份公司 | 包含生物防治剂和选自细胞壁合成抑制剂的杀真菌剂的组合物 |
| US20150289514A1 (en) | 2012-05-30 | 2015-10-15 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and a fungicide selected from inhibitors of the respiratory chain at complex iii |
| JP6285423B2 (ja) | 2012-05-30 | 2018-02-28 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 生物農薬および殺虫剤を含む組成物 |
| PL2854548T4 (pl) | 2012-05-30 | 2019-04-30 | Bayer Cropscience Ag | Kompozycja zawierająca środek do kontroli biologicznej i środek grzybobójczy wybrany z metalaksylu- i metalalksylu-M |
| KR20150021502A (ko) | 2012-05-30 | 2015-03-02 | 바이엘 크롭사이언스 아게 | 생물학적 방제제 및 살곤충제를 포함하는 조성물 |
| PL2854550T3 (pl) | 2012-05-30 | 2019-01-31 | Bayer Cropscience Ag | Kompozycja zawierająca środek do kontroli biologicznej i środek grzybobójczy |
| EP2854551A1 (en) | 2012-05-30 | 2015-04-08 | Bayer Cropscience AG | Compositions comprising a biological control agent and a fungicide from the group consisting of inhibitors of the respiratory chain at complex i or ii. |
| EP3300603A3 (en) | 2012-05-30 | 2018-06-27 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| JP2015528017A (ja) | 2012-07-31 | 2015-09-24 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 殺有害生物性テルペン混合物及び殺虫剤を含んでいる組成物 |
| UY35035A (es) | 2012-09-14 | 2014-04-30 | Bayer Cropscience Ag | ?molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una enzima hppd, vector, célula huésped, semilla, planta, polipéptido, producto primario, métodos y usos?. |
| EP2719280A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-16 | Bayer CropScience AG | Use of N-phenylethylpyrazole carboxamide derivatives or salts thereof for resistance management of phytopathogenic fungi |
| CN105451556B (zh) | 2012-10-19 | 2017-11-14 | 拜尔农科股份公司 | 使用羧酰胺或硫代羧酰胺衍生物处理植物以抵抗对杀真菌剂具有抗性的真菌的方法 |
| AU2013333916B2 (en) | 2012-10-19 | 2017-05-25 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations comprising carboxamide derivatives |
| AU2013333846B2 (en) | 2012-10-19 | 2017-04-20 | Bayer Cropscience Ag | Method for enhancing tolerance to abiotic stress in plants using carboxamide or thiocarboxamide derivatives |
| WO2014060518A1 (en) | 2012-10-19 | 2014-04-24 | Bayer Cropscience Ag | Method of plant growth promotion using carboxamide derivatives |
| EP2735231A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-28 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| EA030236B1 (ru) | 2012-11-30 | 2018-07-31 | Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт | Тройные фунгицидные и пестицидные смеси |
| WO2014082950A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Ternary fungicidal mixtures |
| EP2925137A1 (en) | 2012-11-30 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Binary fungicidal or pesticidal mixture |
| CA2892701A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Binary pesticidal and fungicidal mixtures |
| MX2015006425A (es) | 2012-11-30 | 2015-08-14 | Bayer Cropscience Ag | Mezclas fungicidas binarias. |
| CN105163589A (zh) | 2012-12-03 | 2015-12-16 | 拜耳作物科学股份公司 | 包括生物防治剂及杀真菌剂的组合物 |
| CA2893027A1 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising biological control agents |
| BR112015012789A2 (pt) | 2012-12-03 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | composição que compreende um agente de controle biológico e um inseticida |
| ES2770775T3 (es) | 2012-12-03 | 2020-07-03 | Bayer Cropscience Ag | Procedimiento para el control de plagas aplicando una combinación de Paecilomyces lilacinus y Fluopyram |
| US9867377B2 (en) | 2012-12-03 | 2018-01-16 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| WO2014086753A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising biological control agents |
| WO2014086749A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| JP2015535531A (ja) | 2012-12-03 | 2015-12-14 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 生物農薬および殺菌剤を含む組成物 |
| AR093909A1 (es) | 2012-12-12 | 2015-06-24 | Bayer Cropscience Ag | Uso de ingredientes activos para controlar nematodos en cultivos resistentes a nematodos |
| AR093996A1 (es) | 2012-12-18 | 2015-07-01 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias |
| CN104995174A (zh) | 2012-12-19 | 2015-10-21 | 拜耳作物科学股份公司 | 二氟甲基-烟酰-四氢萘基胺 |
| WO2014124375A1 (en) | 2013-02-11 | 2014-08-14 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising gougerotin and a biological control agent |
| WO2014124369A1 (en) | 2013-02-11 | 2014-08-14 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising a streptomyces-based biological control agent and a fungicide |
| KR20150121040A (ko) | 2013-02-11 | 2015-10-28 | 바이엘 크롭사이언스 엘피 | 고제로틴 및 살곤충제를 포함하는 조성물 |
| US20140245475A1 (en) | 2013-02-27 | 2014-08-28 | Bayer Cropscience Lp | Cotton variety st 4946glb2 |
| UY35366A (es) | 2013-03-07 | 2014-10-31 | Athenix Corp | ?genes de toxina y métodos para su uso?. |
| BR112015026235A2 (pt) | 2013-04-19 | 2017-10-10 | Bayer Cropscience Ag | método para melhorar a utilização do potencial de produção de plantas transgênicas envolvendo a aplicação de um derivado de ftaldiamida |
| CN105307492B (zh) | 2013-04-19 | 2018-03-30 | 拜耳作物科学股份公司 | 二元杀虫或除虫混合物 |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| CN105636939B (zh) | 2013-06-26 | 2018-08-31 | 拜耳作物科学股份公司 | N-环烷基-n-[(二环基苯基)亚甲基]-(硫代)甲酰胺衍生物 |
| US10071967B2 (en) | 2013-12-05 | 2018-09-11 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | N-cycloalkyl-N-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives |
| CA2932484A1 (en) | 2013-12-05 | 2015-06-11 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | N-cycloalkyl-n-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives |
| EP2885970A1 (en) | 2013-12-21 | 2015-06-24 | Bayer CropScience AG | Fungicide compositions comprising compound I, at least one succinate dehydrogenase (SDH) inhibitor and at least one triazole fungicide |
| CA2942171C (en) | 2014-03-11 | 2023-05-09 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| WO2015160620A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and an insecticide |
| WO2015160618A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent |
| WO2015160619A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a fungicide |
| CN103947538A (zh) * | 2014-04-28 | 2014-07-30 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因方法 |
| EP3081085A1 (en) | 2015-04-14 | 2016-10-19 | Bayer CropScience AG | Method for improving earliness in cotton |
| EP3283476B1 (en) | 2015-04-13 | 2019-08-14 | Bayer Cropscience AG | N-cycloalkyl-n-(biheterocyclyethylene)-(thio)carboxamide derivatives |
| EP3097782A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-11-30 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents |
| KR20180043838A (ko) | 2015-09-11 | 2018-04-30 | 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 | Ｈｐｐｄ 변이체 및 사용 방법 |
| US10448611B2 (en) | 2016-04-11 | 2019-10-22 | Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc | Cotton variety FM 1911GLT |
| US9992943B2 (en) | 2016-04-11 | 2018-06-12 | Bayer Cropscience Lp | Cotton variety ST 4949GLT |
| US10010041B2 (en) | 2016-04-11 | 2018-07-03 | Bayer Cropscience Lp | Cotton variety ST 4848GLT |
| CN109937255B (zh) * | 2016-04-20 | 2024-03-15 | 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 | 原种事件ee-gh7以及用于在生物样品中鉴定该事件的方法和试剂盒 |
| BR112019001764A2 (pt) | 2016-07-29 | 2019-05-07 | Bayer Cropscience Ag | combinações de compostos ativos e métodos para proteção de material de propagação de plantas |
| AU2017365169B2 (en) | 2016-11-23 | 2022-07-21 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Axmi669 and Axmi991 toxin genes and methods for their use |
| BR112019011293A2 (pt) | 2016-12-19 | 2019-10-08 | Basf Se | compostos de fórmula i, intermediários, composição agroquímica, uso e método para combater fungos nocivos fitopatogênicos |
| WO2018136611A1 (en) | 2017-01-18 | 2018-07-26 | Bayer Cropscience Lp | Use of bp005 for the control of plant pathogens |
| CA3049775A1 (en) | 2017-01-18 | 2018-07-26 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Bp005 toxin gene and methods for its use |
| US20170150691A1 (en) | 2017-02-13 | 2017-06-01 | Bayer Cropscience Lp | Cotton variety st 5020glt |
| US20170150692A1 (en) | 2017-02-13 | 2017-06-01 | Bayer Cropscience Lp | Cotton variety fm 1953gltp |
| EP3585773B1 (en) | 2017-02-21 | 2021-04-07 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| BR112019018056A2 (pt) | 2017-03-07 | 2020-08-11 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, métodos para conferir tolerância e para controlar ervas daninhas, produto de utilidade e uso da sequência de nucleotídeos |
| US20200045974A1 (en) | 2017-04-07 | 2020-02-13 | Basf Se | Substituted Oxadiazoles for Combating Phytopathogenic Fungi |
| WO2018188962A1 (en) | 2017-04-11 | 2018-10-18 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| MX2019012543A (es) | 2017-04-21 | 2019-12-02 | Bayer Cropscience Lp | Metodo para mejorar la seguridad de los cultivos. |
| BR112019022137A2 (pt) | 2017-05-04 | 2020-05-12 | Basf Se | Usos de compostos, compostos da fórmula i, composição agroquímica e método para combater fungos nocivos fitopatogênicos |
| WO2018202491A1 (en) | 2017-05-04 | 2018-11-08 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018219797A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| US20200190043A1 (en) | 2017-06-19 | 2020-06-18 | Basf Se | 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamides for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019025250A1 (en) | 2017-08-04 | 2019-02-07 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| WO2019038042A1 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| EP3684761A1 (en) | 2017-09-18 | 2020-07-29 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019068811A1 (en) | 2017-10-06 | 2019-04-11 | Bayer Aktiengesellschaft | COMPOSITIONS COMPRISING FLUOPYRAM AND TIOXAZAFENE |
| BR112020008092A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-09-15 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| BR112020008096A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-11-03 | Basf Se | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| WO2019101511A1 (en) | 2017-11-23 | 2019-05-31 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| CN111655035A (zh) | 2017-11-30 | 2020-09-11 | 博瑞金股份有限公司 | 苯并氧杂硼杂环戊烯化合物和其制剂 |
| WO2019121143A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Substituted cyclopropyl derivatives |
| WO2019137995A1 (en) | 2018-01-11 | 2019-07-18 | Basf Se | Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
| BR112020013680A2 (pt) | 2018-01-29 | 2020-12-01 | BASF Agro B.V. | formulações agroquímicas, uso de formulações e método para controlar insetos |
| WO2019154665A1 (en) | 2018-02-07 | 2019-08-15 | Basf Se | New pyridine carboxamides |
| BR112020014817A2 (pt) | 2018-02-07 | 2020-12-08 | Basf Se | Uso dos compostos de fórmula i, compostos de fórmula i, composição, uso de um composto de fórmula i, método para o combate de fungos fitopatogênicos e semente |
| UA126830C2 (uk) | 2018-03-01 | 2023-02-08 | Басф Агро Б.В. | Фунгіцидні композиції мефентрифлуконазолу |
| US10470428B2 (en) | 2018-03-07 | 2019-11-12 | Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc | Cotton variety ST 5471GLTP |
| US20190274268A1 (en) | 2018-03-07 | 2019-09-12 | Bayer Cropscience Lp | Cotton variety st 5122glt |
| WO2019219464A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019224092A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Basf Se | Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides |
| US20210323950A1 (en) | 2018-06-04 | 2021-10-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Herbicidally active bicyclic benzoylpyrazoles |
| WO2020041200A1 (en) | 2018-08-18 | 2020-02-27 | Boragen Inc. | Solid forms of substituted benzoxaborole and compositions thereof |
| EP3613736A1 (en) | 2018-08-22 | 2020-02-26 | Basf Se | Substituted glutarimide derivatives |
| EP3628158A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-01 | Basf Se | Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide |
| EP3870581B1 (en) | 2018-10-23 | 2023-06-14 | Basf Se | Tricyclic pesticidal compounds |
| EP3643705A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Pesticidal compounds |
| EP3670501A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-24 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| MA54689B1 (fr) | 2019-01-11 | 2023-07-31 | Basf Se | Formes cristallines de 1-(1,2-diméthylpropyl)-n-éthyl-5-méthyl-n-pyridazine-4-yl-pyrazole-4-carboxamide |
| US11234407B2 (en) | 2019-02-12 | 2022-02-01 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Cotton variety FM 1621GL |
| EP3696177A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-19 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| US11284595B2 (en) | 2019-02-12 | 2022-03-29 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Cotton variety FM 2398GLTP |
| US11213003B2 (en) | 2019-02-12 | 2022-01-04 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Cotton variety ST 4550GLTP |
| US20220240508A1 (en) | 2019-05-10 | 2022-08-04 | Bayer Cropscience Lp | Active compound combinations |
| EP3769623A1 (en) | 2019-07-22 | 2021-01-27 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| CN113923987B (zh) | 2019-05-29 | 2024-10-01 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于防除动物害虫的介离子咪唑鎓化合物和衍生物 |
| WO2020244969A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | Pyridine derivatives and their use as fungicides |
| WO2020244970A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | New carbocyclic pyridine carboxamides |
| CN113993847A (zh) | 2019-06-06 | 2022-01-28 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀真菌的n-(吡啶-3-基)羧酰胺类 |
| EP3766879A1 (en) | 2019-07-19 | 2021-01-20 | Basf Se | Pesticidal pyrazole derivatives |
| AR119426A1 (es) | 2019-07-22 | 2021-12-15 | Bayer Ag | 5-amino pirazoles y triazoles como plaguicidas |
| TW202118391A (zh) | 2019-07-23 | 2021-05-16 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物（二） |
| EP4003974A1 (en) | 2019-07-23 | 2022-06-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| CA3149206A1 (en) | 2019-08-01 | 2021-02-04 | Bayer Cropscience Lp | Method of improving cold stress tolerance and crop safety |
| EP3701796A1 (en) | 2019-08-08 | 2020-09-02 | Bayer AG | Active compound combinations |
| EP4034656A1 (en) | 2019-09-26 | 2022-08-03 | Bayer Aktiengesellschaft | Rnai-mediated pest control |
| WO2021063735A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | New bicyclic pyridine derivatives |
| WO2021063736A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | Bicyclic pyridine derivatives |
| BR112022004761A2 (pt) | 2019-10-02 | 2022-06-21 | Bayer Ag | Combinações de compostos ativos compreendendo ácidos graxos |
| CN114867529B (zh) | 2019-10-09 | 2024-09-27 | 拜耳公司 | 作为农药的新的杂芳基三唑化合物 |
| AR120176A1 (es) | 2019-10-09 | 2022-02-02 | Bayer Ag | Compuestos de heteroarilo-triazol como pesticidas |
| KR20220098170A (ko) | 2019-11-07 | 2022-07-11 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 동물 해충 방제를 위한 치환된 술포닐 아미드 |
| WO2021097162A1 (en) | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Bayer Cropscience Lp | Beneficial combinations with paenibacillus |
| TW202134226A (zh) | 2019-11-18 | 2021-09-16 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| EP4061131A1 (en) | 2019-11-18 | 2022-09-28 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations comprising fatty acids |
| TW202136248A (zh) | 2019-11-25 | 2021-10-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| UY39058A (es) | 2020-01-31 | 2021-08-31 | Pairwise Plants Services Inc | Suppresión de la respuesta de evasión a la sombra en plantas |
| BR112022016400A2 (pt) | 2020-02-18 | 2022-10-25 | Bayer Ag | Compostos inovadores de heteroaril-triazol como pesticidas |
| EP3708565A1 (en) | 2020-03-04 | 2020-09-16 | Bayer AG | Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides |
| WO2021209490A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides |
| WO2021211926A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| MX2022013157A (es) | 2020-04-21 | 2022-11-16 | Bayer Ag | Derivados de heterociclos condensados sustituidos con 2-(het)arilo como plaguicidas. |
| EP3903581A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i |
| EP3903584A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv |
| CN115443267A (zh) | 2020-04-28 | 2022-12-06 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀害虫化合物 |
| EP3903583A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii |
| EP3903582A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii |
| US20230348392A1 (en) | 2020-05-06 | 2023-11-02 | Bayer Aktiengesellschaft | Pyridine (thio)amides as fungicidal compounds |
| TW202208347A (zh) | 2020-05-06 | 2022-03-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物 |
| CN115605462A (zh) | 2020-05-12 | 2023-01-13 | 拜耳公司（De） | 作为杀真菌化合物的三嗪和嘧啶(硫代)酰胺 |
| EP3909950A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-17 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| BR112022023550A2 (pt) | 2020-05-19 | 2023-01-03 | Bayer Cropscience Ag | (tio)amidas azabicíclicas como compostos fungicidas |
| US20210371873A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-02 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| BR112022024394A2 (pt) | 2020-06-04 | 2023-01-31 | Bayer Ag | Heterociclil pirimidinas e triazinas como novos fungicidas |
| US20230234945A1 (en) | 2020-06-10 | 2023-07-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Azabicyclyl-substituted heterocycles as fungicides |
| EP3945089A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-02 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v |
| WO2021249800A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| UY39278A (es) | 2020-06-17 | 2022-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para el control del tamaño del meristemo para la mejora de cultivos |
| JP2023532224A (ja) | 2020-06-18 | 2023-07-27 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 新規殺菌剤としてのオキサジアジニルピリダジン |
| WO2021255118A1 (en) | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| WO2021255091A1 (en) | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,3,4-oxadiazoles and their derivatives as fungicides |
| UY39275A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos |
| BR112022025710A2 (pt) | 2020-06-19 | 2023-03-07 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas e 1,3,4-oxadiazol piridinas como fungicidas |
| UY39276A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones. |
| EP3929189A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-29 | Bayer Animal Health GmbH | Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides |
| BR112022026904A2 (pt) | 2020-07-02 | 2023-01-24 | Bayer Ag | Derivados de heterocicleno como agentes de controle de pragas |
| EP3960727A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-02 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors vi |
| EP3939961A1 (en) | 2020-07-16 | 2022-01-19 | Basf Se | Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi |
| WO2022017836A1 (en) | 2020-07-20 | 2022-01-27 | BASF Agro B.V. | Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol |
| EP3970494A1 (en) | 2020-09-21 | 2022-03-23 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii |
| WO2022033991A1 (de) | 2020-08-13 | 2022-02-17 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022053453A1 (de) | 2020-09-09 | 2022-03-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022058327A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents |
| EP3974414A1 (de) | 2020-09-25 | 2022-03-30 | Bayer AG | 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| EP4236691A1 (en) | 2020-10-27 | 2023-09-06 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| WO2022090069A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Compositions comprising mefenpyr-diethyl |
| WO2022090071A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi |
| WO2022106304A1 (en) | 2020-11-23 | 2022-05-27 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| JP2024501464A (ja) | 2020-12-14 | 2024-01-12 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | スルホキシミン系殺虫剤 |
| EP3915971A1 (en) | 2020-12-16 | 2021-12-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides |
| WO2022129188A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides |
| WO2022129196A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| WO2022129190A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| CN116669554A (zh) | 2020-12-18 | 2023-08-29 | 拜耳公司 | 使用Dhodh抑制剂来防治作物中的抗性植物病原性真菌 |
| EP4036083A1 (de) | 2021-02-02 | 2022-08-03 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel |
| CN117441015A (zh) | 2021-02-11 | 2024-01-23 | 成对植物服务股份有限公司 | 用于修饰植物中细胞分裂素氧化酶水平的方法和组合物 |
| EP4043444A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-17 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| CN117203227A (zh) | 2021-02-25 | 2023-12-08 | 成对植物服务股份有限公司 | 用于修饰植物中根结构的方法和组合物 |
| WO2022207496A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| BR112023019400A2 (pt) | 2021-03-30 | 2023-12-05 | Bayer Ag | 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida |
| CA3217066A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Timothy H Anderson | Additives for enhancing the pesticidal effectiveness of pesticidal microorganisms |
| JP2024516278A (ja) | 2021-05-06 | 2024-04-12 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | アルキルアミド置換環付加イミダゾール類及び殺虫剤としてのそれらの使用 |
| TW202311258A (zh) | 2021-05-12 | 2023-03-16 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為除蟲劑之經2-(雜)芳基取代之稠合雜環衍生物 |
| EP4091451A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-11-23 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| JP2024519813A (ja) | 2021-05-18 | 2024-05-21 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 殺菌剤としての新規な置換ピリジン |
| US20240270727A1 (en) | 2021-05-18 | 2024-08-15 | Basf Se | New substituted pyridines as fungicide |
| WO2022243109A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Basf Se | New substituted quinolines as fungicides |
| AR126172A1 (es) | 2021-06-17 | 2023-09-27 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de factores de transcripción de la familia de factores reguladores del crecimiento en soja |
| UY39827A (es) | 2021-06-24 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento |
| MX2023014883A (es) | 2021-07-01 | 2024-02-12 | Pairwise Plants Services Inc | Metodos y composiciones para mejorar el desarrollo del sistema radicular. |
| EP4119547A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-18 | Basf Se | Triazole compounds for the control of invertebrate pests |
| KR20240042636A (ko) | 2021-08-02 | 2024-04-02 | 바스프 에스이 | (3-피리딜)-퀴나졸린 |
| CA3227653A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Wassilios Grammenos | (3-quinolyl)-quinazoline |
| EP4384626A1 (en) | 2021-08-12 | 2024-06-19 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| EP4384016A1 (en) | 2021-08-13 | 2024-06-19 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations and fungicide compositions comprising those |
| AR126798A1 (es) | 2021-08-17 | 2023-11-15 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar genes de histidina quinasa receptores de citoquinina en plantas |
| EP4140986A1 (en) | 2021-08-23 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| MX2024002386A (es) | 2021-08-25 | 2024-03-14 | Bayer Ag | Nuevos compuestos de pirazinil-triazol como pesticidas. |
| EP4140995A1 (en) | 2021-08-27 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4395531A1 (en) | 2021-08-30 | 2024-07-10 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement |
| EP4144739A1 (de) | 2021-09-02 | 2023-03-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| AR126938A1 (es) | 2021-09-02 | 2023-11-29 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento |
| EP4151631A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-22 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| US20230087522A1 (en) | 2021-09-21 | 2023-03-23 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for reducing pod shatter in canola |
| MX2024004057A (es) | 2021-10-04 | 2024-04-25 | Pairwise Plants Services Inc | Metodos para mejorar la fertilidad de la flor y el rendimiento de semillas. |
| AR127300A1 (es) | 2021-10-07 | 2024-01-10 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de la flor y el rendimiento de semillas |
| WO2023072670A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x |
| WO2023072671A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix |
| CN118541353A (zh) | 2021-11-03 | 2024-08-23 | 拜耳公司 | 作为杀真菌化合物的双(杂)芳基硫醚(硫代)酰胺 |
| WO2023099445A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds |
| EP4194453A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-14 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| AR127904A1 (es) | 2021-12-09 | 2024-03-06 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas |
| EP4198033A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-21 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4198023A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-21 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| AR128372A1 (es) | 2022-01-31 | 2024-04-24 | Pairwise Plants Services Inc | Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas |
| WO2023148031A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests in cotton |
| WO2023148028A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests |
| WO2023156402A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| WO2023168217A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| EP4238971A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-06 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| WO2023192838A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Early flowering rosaceae plants with improved characteristics |
| US20230357789A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-11-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight |
| WO2023205714A1 (en) | 2022-04-21 | 2023-10-26 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| WO2023215704A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance |
| WO2023213626A1 (en) | 2022-05-03 | 2023-11-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms |
| WO2023213670A1 (en) | 2022-05-03 | 2023-11-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine |
| US20230416767A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-12-28 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits |
| AR129709A1 (es) | 2022-06-27 | 2024-09-18 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar el escape a la sombra en plantas |
| AR129749A1 (es) | 2022-06-29 | 2024-09-25 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para controlar el tamaño del meristemo para el mejoramiento de cultivos |
| US20240002873A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2024028243A1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Basf Se | Pyrazolo pesticidal compounds |
| US20240043857A1 (en) | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| US20240060081A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| US20240090466A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-21 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| EP4342885A1 (en) | 2022-09-20 | 2024-03-27 | Basf Se | N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides |
| WO2024068517A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068519A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068518A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| EP4295688A1 (en) | 2022-09-28 | 2023-12-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combination |
| WO2024068520A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| EP4361126A1 (en) | 2022-10-24 | 2024-05-01 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xv |
| WO2024104815A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | Substituted benzodiazepines as fungicides |
| WO2024104822A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | Substituted tetrahydrobenzodiazepine as fungicides |
| WO2024104823A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | New substituted tetrahydrobenzoxazepine |
| WO2024104818A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | Substituted benzodiazepines as fungicides |
| EP4385326A1 (en) | 2022-12-15 | 2024-06-19 | Kimitec Biogorup | Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants |
| WO2024137438A2 (en) | 2022-12-19 | 2024-06-27 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Insect toxin genes and methods for their use |
| EP4389210A1 (en) | 2022-12-21 | 2024-06-26 | Basf Se | Heteroaryl compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2024165343A1 (en) | 2023-02-08 | 2024-08-15 | Basf Se | New substituted quinoline compounds for combatitng phytopathogenic fungi |
| US20240279673A1 (en) | 2023-02-16 | 2024-08-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants |
| US20240294933A1 (en) | 2023-03-02 | 2024-09-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants |
| WO2024186950A1 (en) | 2023-03-09 | 2024-09-12 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid signaling pathway genes for improving yield traits in plants |
| WO2024194038A1 (en) | 2023-03-17 | 2024-09-26 | Basf Se | Substituted pyridyl/pyrazidyl dihydrobenzothiazepine compounds for combatting phytopathogenic fungi |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2673642B1 (fr) | 1991-03-05 | 1994-08-12 | Rhone Poulenc Agrochimie | Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate. |
| US5846717A (en) | 1996-01-24 | 1998-12-08 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage |
| AU4106596A (en) * | 1994-11-14 | 1996-06-06 | National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine | Protective effects of mutated superantigens |
| FR2736926B1 (fr) | 1995-07-19 | 1997-08-22 | Rhone Poulenc Agrochimie | 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene |
| US5985557A (en) | 1996-01-24 | 1999-11-16 | Third Wave Technologies, Inc. | Invasive cleavage of nucleic acids |
| TR199900230T2 (xx) * | 1997-01-07 | 1999-05-21 | Calgene, Inc | Bitki ekspansin promoter sekanslar� |
| PL335892A1 (en) | 1997-03-26 | 2000-05-22 | Univ Cambridge Tech | Plants having modified growth cycle |
| AU8751898A (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-21 | Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro - Dlo) | Engineering nematode resistance in solanacae |
| US20080113342A1 (en) * | 1998-11-16 | 2008-05-15 | Monsanto Technology Llc | Plant Genome Sequence and Uses Thereof |
| ATE356880T1 (de) | 1999-10-29 | 2007-04-15 | Kosan Biosciences Inc | Rapamycin analoge |
| CN101353669A (zh) * | 1999-12-16 | 2009-01-28 | 孟山都技术有限公司 | 新型植物表达构建物 |
| FR2812883B1 (fr) * | 2000-08-11 | 2002-10-18 | Aventis Cropscience Sa | Utilisation d'inhibiteurs d'hppd comme agents de selection dans la transformation de plantes |
| EP1366070A2 (en) * | 2000-10-25 | 2003-12-03 | Monsanto Technology LLC | Cotton event pv-ghgt07(1445) and compositions and methods for detection thereof |
| FR2815969B1 (fr) * | 2000-10-30 | 2004-12-10 | Aventis Cropscience Sa | Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique |
| JP4454934B2 (ja) | 2001-01-26 | 2010-04-21 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション | 組換えクローニングを用いて効率のよいサイレンシング構築物を作製する方法および手段 |
| US6818807B2 (en) * | 2001-08-06 | 2004-11-16 | Bayer Bioscience N.V. | Herbicide tolerant cotton plants having event EE-GH1 |
| US20040171108A1 (en) * | 2003-02-07 | 2004-09-02 | Fisher Paul B. | Human excitatory amino acid transporter-2 gene promoter and uses thereof |
| CN1753998B (zh) * | 2003-02-12 | 2017-02-15 | 孟山都技术有限公司 | 棉花事件mon88913及其组合物和检测方法 |
| US7125976B2 (en) * | 2003-07-01 | 2006-10-24 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method of screening for agents inhibiting chloride intracellular channels |
| ZA200800909B (en) * | 2005-08-08 | 2009-08-26 | Bayer Bioscience Nv | Herbicide tolerant cotton plants and methods for identifying same |
-
2006
- 2006-08-01 ZA ZA200800909A patent/ZA200800909B/xx unknown
- 2006-08-01 MX MX2008001839A patent/MX2008001839A/es active IP Right Grant
- 2006-08-01 WO PCT/EP2006/007711 patent/WO2007017186A1/en active Application Filing
- 2006-08-01 AU AU2006278778A patent/AU2006278778B2/en active Active
- 2006-08-01 EP EP10075505A patent/EP2295587A1/en not_active Withdrawn
- 2006-08-01 US US11/997,925 patent/US7932439B2/en active Active
- 2006-08-01 ES ES06762978.2T patent/ES2654294T3/es active Active
- 2006-08-01 EP EP06762978.2A patent/EP1922409B1/en active Active
- 2006-08-01 CN CN200680029034.7A patent/CN101238217B/zh active Active
- 2006-08-01 BR BRPI0614338-5A patent/BRPI0614338B1/pt active IP Right Grant
- 2006-08-08 AR ARP060103443A patent/AR054901A1/es not_active Application Discontinuation
-
2011
- 2011-03-16 US US13/049,618 patent/US8501411B2/en active Active
-
2013
- 2013-07-01 US US13/932,670 patent/US9394566B2/en active Active
-
2017
- 2017-02-15 AR ARP170100365A patent/AR107621A2/es active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20110244456A1 (en) | 2011-10-06 |
| US20100050282A1 (en) | 2010-02-25 |
| AU2006278778A1 (en) | 2007-02-15 |
| BRPI0614338B1 (pt) | 2018-01-02 |
| US9394566B2 (en) | 2016-07-19 |
| EP1922409B1 (en) | 2017-11-08 |
| AU2006278778B2 (en) | 2011-12-01 |
| AR107621A2 (es) | 2018-05-16 |
| US7932439B2 (en) | 2011-04-26 |
| US20130316348A1 (en) | 2013-11-28 |
| EP1922409A1 (en) | 2008-05-21 |
| BRPI0614338A2 (pt) | 2011-03-22 |
| WO2007017186A1 (en) | 2007-02-15 |
| AR054901A1 (es) | 2007-07-25 |
| CN101238217A (zh) | 2008-08-06 |
| CN101238217B (zh) | 2016-01-20 |
| MX2008001839A (es) | 2008-04-09 |
| EP2295587A1 (en) | 2011-03-16 |
| ZA200800909B (en) | 2009-08-26 |
| US8501411B2 (en) | 2013-08-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2654294T3 (es) | Plantas de algodón tolerantes a herbicidas y métodos para identificar las mismas | |
| US10356996B2 (en) | Insect resistant cotton plants and methods for identifying same | |
| US8012689B2 (en) | Elite event A2407-12 and methods and kits for identifying such event in biological samples | |
| US8952142B2 (en) | Elite event A5547-127 and methods and kits for identifying such event in biological samples | |
| US9328390B2 (en) | Insect resistant cotton plants and methods for identifying same | |
| AU2002333260B2 (en) | Herbicide tolerant cotton plants and methods for producing and identifying same | |
| AU2002333260A1 (en) | Herbicide tolerant cotton plants and methods for producing and identifying same | |
| ES2836485T3 (es) | Plantas de algodón resistentes a insectos y procedimientos para identificar las mismas | |
| BR122017012106B1 (pt) | Dna genômico de algodão compreendendo o evento elite ee-gh3 |