BR122017012106B1 - Dna genômico de algodão compreendendo o evento elite ee-gh3 - Google Patents

Abstract

A invenção fornece plantas de algodão transgênicas específicas, material de planta e sementes, caracterizados pelo fato de que estes produtos carregam um evento de transformação específico em uma localização específica no genoma do algodão. São também fornecidas ferramentas que permitem a identificação rápida e não equivocada do evento em amostras biológicas.

Description

[001] Dividido de PI0614338-5, depositado em 01.08.2006.

Campo da Invenção

[002] Esta invenção refere-se a plantas de algodão, materiais ve-getais e sementes transgênicos, caracterizados por carregarem um evento de transformação específico, particularmente pela presença de um gene que codifica uma proteína que confere tolerância a herbicida, em uma localização específica no genoma do algodão. As plantas de algodão da invenção se combinam com o fenótipo tolerante a herbicida com um desempenho agronômico, uma estabilidade genética e uma capacidade de se adaptarem a bases genéticas diferentes equivalentes à da linhagem de algodão não transformada na ausência de pressão de ervas daninhas. Esta invenção fornece ainda métodos e estojos para a identificação da presença de material de planta que compreende especificamente o evento de transformação EE-GH3 em amostras biológicas.

Fundamento da Invenção

[003] A expressão fenotípica de um transgene em uma planta é determinada tanto pela estrutura do próprio gene quanto por sua localização no genoma da planta. Ao mesmo tempo a presença do transgene (em um DNA exógeno) em localizações diferentes no genoma influenciará no fenótipo geral da planta de maneiras diferentes. A introdução agronômica e industrial bem-sucedida de uma característica interessante comercialmente em uma planta através da manipulação genética pode ser um procedimento demorado dependente de fatores diferentes. A transformação e a regeneração reais de plantas transformadas geneticamente constituem apenas a primeira em uma série de etapas de seleção, que incluem a caracterização genética extensi- va, o cruzamento e a avaliação nos testes de campo, levando eventualmente à seleção de um evento elite.

[004] A fibra de algodão é a fibra têxtil isolada mais importante em todo o mundo. Aproximadamente 3,2 bilhões de ares (80 milhões de acres) de algodão são colhidos anualmente ao longo do globo ter-restre. O algodão é a quinta planta de cultivo mais importante nos EUA em termos de produção 40,47 ares (acre), com mais de 0,6 bilhões de ares (15 milhões de acres) plantados em 2000. As espécies daninhas primárias para o algodão são Ipomoea sp. (ipoméia), Amaranthus spp. (carurú), Cyperus spp. (tiririca), Xanthium spp. (cardo) e Sorghum spp. (arroz-bravo). Antes da introdução de herbicidas para folhas abertas que poderiam ser utilizados em um campo de cultivo de algodão, os cultivadores utilizavam aplicações pós-emergência diretas de herbicidas não seletivos tomando cuidado para não entrar em contato com as plantas de cultivo em crescimento. Como isso requer uma diferença na altura entre as ervas daninhas e a planta de cultivo, isto nem sempre é possível. Especialmente para o algodão pequeno, esta prática é demorada e potencialmente prejudicial à planta de cultivo.

[005] A identificação não equivocada de um evento elite está se tornando crescentemente importante em vista de discussões sobre os Novos Alimentos/Produtos Alimentícios, a segregação de OGM e produtos que não são OGM e a identificação de material de propriedade. De forma ideal, tal método de identificação é tanto rápido quanto simples, sem a necessidade de uma estrutura de laboratório extensiva. Além disso, o método deve fornecer resultados que permitem a determinação não equivocada do evento elite sem a interpretação técnica, mas que seja interrompido sob exame minucioso de um perito se necessário. As ferramentas específicas para uso na identificação do evento elite EE-GH3 em amostras biológicas são descritas aqui.

[006] EE-GH3 foi identificado como um evento elite partindo de uma população de plantas de algodão no desenvolvimento de algodão (Gossypium hirsutum) resistente ao herbicida N-fosfonometilglicina e sais do mesmo, também conhecidos como glifosato. As plantas de algodão transgênicas continham um gene quimérico conferindo tolerância ao glifosato, compreendendo um gene epsps modificado de Zea mays que codifica a 5-enol-piruvilquicimato-3-fosfato sintase (EPSPS) tolerante ao glifosato (como descrito na Patente U.S. No 6.566.587) sob o controle de um promotor que pode ser expresso em plantas (como descrito na Patente U.S. No 5.491.288 ou na Patente U.S. No 5.792.930).

[007] As plantas de algodão que compreendem um gene de tole-rância ao glifosato foram divulgadas na técnica. Entretanto, nenhuma das descrições das técnicas anteriores se encaixa no ensinamento ou sugere a presente invenção.

Sumário da Invenção

[008] A presente invenção refere-se a uma planta de algodão ou semente transgênica, células ou tecidos da mesma, que compreende, integrado de forma estável em seu genoma, um cassete de expressão que compreende um gene de tolerância a herbicida que compreende a sequência codificadora do gene epsps (como descrito no Exemplo 1.1 contido aqui), que é tolerante a herbicida, na ausência de pressão por ervas daninhas, possui um desempenho agronômico que é substancialmente equivalente ao da linhagem isogênica não transgênica. Sob a pressão por ervas daninhas e o tratamento apropriado com glifosato, a planta terá um fenótipo agronômico superior comparado com o da planta não transgênica.

[009] Em uma modalidade da invenção a planta de algodão ou semente, células ou tecidos da mesma compreendem o evento elite EE-GH3.

[0010] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma planta, semente de algodão transgênica, células ou tecidos da mesma, cujo DNA genômico é caracterizado pelo fato de que, quando analisado em um protocolo de identificação pela PCR como descrito aqui, utilizando dois iniciadores direcionados para a região flanqueadora a 5’ ou a 3’ de EE-GH3 e do DNA exógeno, respectivamente, produz um fragmento que é específico para EE-GH3. Os iniciadores podem ser direcionados contra a região flanqueadora a 5’ dentro da SEQ ID NO: 1 e ao DNA exógeno respectivamente de forma que os iniciadores que compreendem ou que consistem na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 e da SEQ ID NO: 11 respectivamente e produzem um fragmento de DNA entre 300 e 360 pb, preferencialmente de aproximadamente 334 pb.

[0011] A semente de referência do evento elite da invenção foi de-positada na ATCC sob número de acesso PTA-6878. Uma modalidade da invenção é a semente que compreende o evento elite EE-GH3 depositado na forma do número de acesso da ATTC PTA-6878, que será cultivada em uma planta de algodão resistente ao glifosato. A semente do número de depósito na ATCC PTA-xxxx, que é um lote de sementes de pelo menos aproximadamente 95% de grãos transgênicos ho- mozigotos em relação ao transgene, compreendendo o evento elite da invenção, que será cultivada em plantas tolerantes ao glifosato. A semente pode ser plantada e as plantas crescentes podem ser tratadas com glifosato como descrito aqui para a obtenção de plantas 100% tolerantes ao glifosato, que compreendem o evento elite da invenção. A invenção refere-se ainda a células, tecidos, progênies e descendentes de uma planta que compreende o evento elite da invenção crescida partindo da semente depositada na ATCC possuindo o número de acesso PTA-6878. A invenção refere-se ainda a plantas que podem ser obtidas através da propagação e/ou do cruzamento com uma planta de algodão que compreende o evento elite da invenção crescida partindo da semente depositada na ATCC possuindo o número de acesso PTA-6878.

[0012] A invenção refere-se ainda a um método para a identificação de uma planta transgênica ou células ou tecidos da mesma, que compreende o evento elite EE-GH3 cujo método se baseia na identificação da presença das sequências de DNA de caracterização ou dos aminoácidos codificados por tais sequências de DNA na planta, células ou tecidos transgênicos. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, tais sequências de DNA de caracterização são sequências de 15 pb, preferencialmente de 20 pb, mais preferencialmente de 30 pb ou mais preferencialmente que compreendem o sítio de inserção do evento, isto é, tanto uma parte do DNA exógeno quanto uma parte do genoma de algodão (a região flanqueadora a 5’ ou a 3’) contígua ao mesmo, permitindo a identificação específica do evento elite.

[0013] A presente invenção refere-se ainda a métodos para a iden-tificação do evento elite EE-GH3 em amostras biológicas, cujos métodos se baseiam em iniciadores ou sondas que reconhecem especificamente a sequência flanqueadora a 5’ e/ou a 3’ de EE-GH3.

[0014] Mais especificamente, a invenção refere-se a um método que compreende a amplificação de uma sequência de um ácido nu- cléico presente nas amostras biológicas, utilizando uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, dos quais um reconhece a região flanqueadora a 5’ ou a 3’ de EE-GH3 e o outro que reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno, preferencialmente para a obtenção de um fragmento de DNA entre 100 e 500 pb. Os iniciadores podem reconhecer uma sequência dentro da região flanque- adora a 5’ de EE-GH3 (SEQ ID No: 1, partindo da posição 1 até a posição 732) ou dentro da região flanqueadora a 3’ de EE-GH3 (complemento da SEQ ID No: 2 partindo da posição 431 até a posição 654) e uma sequência dentro do DNA exógeno (complemento da SEQ ID No: 1 partindo da posição 733 até 1214 ou da SEQ ID No: 2 partindo da posição 1 até a posição 430), respectivamente. O iniciador que reco-nhece a região flanqueadora a 5’ pode compreender a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 3 e o iniciador que reconhece uma se-quência dentro do DNA exógeno pode compreender a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 11 descrita aqui.

[0015] A presente invenção refere-se mais especificamente a um método para a identificação do evento elite EE-GH3 em amostras biológicas, cujo método compreende a amplificação de uma sequência de um ácido nucléico presente em uma amostra biológica, utilizando uma reação em cadeia da polimerase com dois iniciadores que possuem a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 3 e da SEQ ID No: 11 respectivamente, para a obtenção de um fragmento de DNA de aproximadamente 334 pb.

[0016] A presente invenção refere-se ainda às sequências flan- queadoras específicas de EE-GH3 descritas aqui, que podem ser utilizadas para o desenvolvimento de métodos de identificação específicos para EE-GH3 em amostras biológicas. Mais particularmente, a invenção refere-se às regiões flanqueadoras a 5’ e/ou a 3’ de EE-GH3 que podem ser utilizadas para o desenvolvimento de iniciadores e sondas específicos como é adicionalmente descrito aqui. A invenção refere-se ainda a métodos de identificação em relação à presença de EE-GH3 em amostras biológicas com base no uso de tais iniciadores ou sondas específicas. Os iniciadores podem consistir em uma sequência de nu- cleotídeos de 17 até aproximadamente 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 1 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 732 ou do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID 2 partindo do nucleotídeo 431 até o nucleotídeo 654 combinado com iniciadores que consistem de uma sequência de nucleotídeos de 17 até aproximadamente 200 nucleotí- deos consecutivos selecionados do complemento da sequência de nu- cleotídeos da SEQ ID No: 1 partindo do nucleotídeo 733 até o nucleotí- deo 1214 ou da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 2 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 430. Os iniciadores podem compreender ainda estas sequências de nucleotídeos localizadas em sua extremidade a 3’ extrema e compreender ainda sequências não relacionadas ou sequências derivadas das sequências de nucleotídeos mencionadas, mas que compreendem pareamentos errados.

[0017] A invenção refere-se ainda a estojos para a identificação do evento elite EE-GH3 em amostras biológicas, os ditos estojos compreendendo pelo menos um iniciador ou sonda que reconhece especificamente a região flanqueadora a 5’ ou a 3’ de EE-GH3.

[0018] O estojo da invenção pode compreender, em adição a um iniciador que reconhece especificamente a região flanqueadora a 5’ ou a 3’ de EE-GH3, um segundo iniciador que reconhece especificamente uma sequência dentro do DNA exógeno de EE-GH3, para uso em um protocolo de identificação pela PCR. Os estojos da invenção podem compreender pelo menos dois iniciadores específicos, dos quais um reconhece uma sequência dentro da região flanqueadora a 5’ de EE- GH3 e o outro que reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno. O iniciador que reconhece a região flanqueadora a 5’ pode compreender a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 3 e o iniciador que re-conhece o transgene pode compreender a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 11 ou qualquer outro iniciador como descrito aqui.

[0019] A invenção refere-se ainda a um estojo para a identificação do evento elite EE-GH3 em amostras biológicas, o dito estojo compreendendo os iniciadores da PCR que possuem a sequência de nucleo- tídeos da SEQ ID No: 3 e da SEQ ID No: 11 para uso no protocolo de identificação pela PCR de EE-GH3 descrito aqui.

[0020] A invenção refere-se ainda a um estojo para a identificação do evento elite EE-GH3 em amostras biológicas, cujo estojo compreende uma sonda específica que possui uma sequência que corresponde (ou é complementar a) uma sequência que possui entre 80% e 100% de identidade de sequência com uma região específica de EE- GH3. Preferencialmente a sequência da sonda corresponde a uma região específica que compreende parte de uma região flanqueadora a 5’ ou a 3’ de EE-GH3. Mais preferencialmente a sonda específica possui (ou é complementar a) uma sequência que possui entre 80% e 100% de identidade de sequência com a sequência entre o nucleotí- deo 712 até 753 da SEQ ID No: 1 ou da SEQ ID No: 2 partindo do nu- cleotídeo 410 até 451.

[0021] De acordo com um outro aspecto da invenção, são divulga-das sequências de DNA que compreendem o sítio de inserção do evento e o comprimento suficiente de polinucleotídeos tanto do DNA genômico do algodão quanto do DNA exógeno (transgene), de forma a serem úteis como iniciador ou sonda para a detecção de EE-GH3. Tais sequências podem compreender pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico do algodão e um número similar de nucleotídeos do DNA exógeno (transgene) de EE-GH3 com as mesmas em cada lado do sítio de inserção respectivamente. Mais preferencialmente, tais sequências de DNA compreendem pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico do algodão e um número similar de nucleotídeos do DNA exógeno contíguo ao sítio de inserção na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2.

[0022] Os métodos e os estojos abrangidos pela presente invenção podem ser utilizados para finalidades diferentes tais como, mas não limitadas às seguintes: para a identificação da presença ou da au-sência de EE-GH3 nas plantas, material de planta ou em produtos tais como, mas não limitados a produtos para alimentação ou alimentícios (frescos ou processados) compreendendo ou derivados de material de planta; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e os estojos da presente invenção podem ser utilizados para a identificação de material de planta transgênico com a finalidade de segregação entre material transgênico e não transgênico; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e os estojos da presente invenção podem ser utilizados para determinar a qualidade (isto é, a porcentagem de material puro) de material de planta que compreende EE-GH3.

[0023] A invenção refere-se ainda a regiões flanqueadoras a 5’ e/ou a 3’ de EE-GH3 assim como aos iniciadores e as sondas especí-ficos desenvolvidos partindo das sequências flanqueadoras a 5’ e/ou a 3’ de EE-GH3.

Breve Descrição dos Desenhos

[0024] Não é pretendido que os Exemplos a seguir limitem a in-venção nas modalidades específicas descritas, podem ser entendidos em associação com a Figura em anexo, incorporada aqui como referência, em que:

[0025] A Fig. 1: representa esquematicamente a relação entre as sequências de nucleotídeos e os iniciadores citados. barra em preto: DNA exógeno; barra clara: DNA de origem planta; os números sob as barras representam as posições dos nucleotídeos; (c) refere-se ao complemento da sequência de nucleotídeos indicada.

[0026] A Fig. 2: representa os resultados obtidos através do proto-colo de Identificação pela PCR desenvolvido para EE-GH3. Carrega-mento da sequência no gel: Faixa 1: Marcador de peso molecular ("escada" de 100 pb); faixas 2 até 4: amostras de DNA de plantas de algodão que compreende o evento transgênico EE-GH3; faixas 5 até 8: amostras de DNA de plantas de algodão transgênicas que não compreendem o evento elite EE-GH3, mas que compreendem um gene de tolerância ao glifosato similar; faixas 9 até 11: amostras de DNA de plantas de algodão transgênicas que não compreendem o evento elite EE-GH3 e que não compreendem um gene de tolerância ao glifosato; faixa 12: amostra de DNA de controle proveniente da planta de algodão do tipo selvagem; faixa 13: sem controle do DNA molde; faixa 14: marcador de peso molecular.

[0027] A Fig. 3: representa os resultados obtidos através do proto-colo de PCR de classificação de zigosidade desenvolvido para EE- GH3. Carregamento da sequência no gel: Faixa 1: Marcador de peso molecular ("escada" de 100 pb); faixas 2, 4, 6, 7 e 8: amostras de DNA de plantas de algodão que compreendem o evento transgênico EE- GH3 na forma homozigota; faixas 3 e 5: amostras de DNA de plantas de algodão que compreendem o evento transgênico EE-GH3 na forma heterozigota; faixas 9 e 10: amostra de DNA de controle proveniente de planta de algodão do tipo selvagem; faixa 11: sem controle do DNA molde; faixa 12: marcador de peso molecular.

Descrição Detalhada

[0028] A incorporação de uma molécula de DNA recombinante no genoma da planta resulta tipicamente da transformação de uma célula ou de um tecido. O sítio particular de incorporação é geralmente determinado pela integração "aleatória".

[0029] O DNA introduzido no genoma da planta como um resultado da transformação de uma célula ou um tecido planta com um DNA recombinante ou "DNA de transformação" e que se origina de tal DNA de transformação é referido posteriormente aqui como "DNA exógeno" compreendendo um ou mais "transgenes". "DNA planta" no contexto da presente invenção irá se referir ao DNA que se origina da planta que é transformada. O DNA planta será geralmente encontrado no mesmo lócus gênico na planta do tipo selvagem correspondente. O DNA exógeno pode ser caracterizado pela localização e pela configuração no sítio de incorporação da molécula de DNA recombinante no genoma da planta. O sítio no genoma da planta em que um DNA re- combinante foi inserido é também referido como o "sítio de inserção" ou o "sítio alvo". A inserção do DNA recombinante no genoma da planta pode estar associada com uma deleção do DNA planta, referida como "deleção do sítio alvo". Uma "região flanqueadora" ou uma "sequência flanqueadora" como utilizado aqui refere-se a uma sequência de pelo menos 20 pb, preferencialmente pelo menos 50 pb e até 5000 pb de DNA diferente do DNA introduzido, preferencialmente o DNA do genoma da planta que fica localizado imediatamente a montante de e contíguo a ou imediatamente a jusante de e contíguo ao DNA exógeno. Os procedimentos de transformação que levam à integração aleatória do DNA exógeno resultarão em transformantes com regiões flan- queadoras diferentes, que são características e exclusivas para cada transformante. Quando o DNA recombinante for introduzido em uma planta através do cruzamento tradicional, seu sítio de inserção no ge- noma da planta ou suas regiões flanqueadoras geralmente não serão alteradas. Uma "região de inserção", como utilizado, aqui refere-se à região que corresponde à região de pelo menos 40 pb, preferencialmente pelo menos 100 pb e até 10000 pb, abrangida pela sequência que compreende a região flanqueadora a montante e/ou a jusante de um DNA exógeno no genoma da planta. Levando em consideração diferenças menores causadas por mutações dentro de uma espécie, uma região de inserção manterá, após o cruzamento em uma planta da mesma espécie, pelo menos 85%, preferencialmente 90%, mais preferencialmente 95% e mais preferencialmente 100% de identidade de sequência com a sequência que compreende as regiões flanquea- doras a montante e a jusante do DNA exógeno na planta obtida originalmente partindo da transformação.

[0030] É definido como um lócus gênico (artificial) um evento que, como um resultado da engenharia genética, carrega um transgene que compreende pelo menos uma cópia de um gene de interesse. Os sta tus alélicos típicos de um evento são a presença ou a ausência do DNA exógeno. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela ex-pressão do transgene. No nível genético, um evento é parte da constituição genética de uma planta. No nível molecular, um evento pode ser caracterizado pelo mapa de restrição (por exemplo, como é determinado por Southern blotting), pelas sequências flanqueadoras a montante e/ou a jusante do transgene, a localização de marcadores moleculares e/ou a configuração molecular do transgene. Geralmente, a transformação de uma planta com um DNA de transformação que compreende pelo menos um gene de interesse leva a uma população de transformantes que compreende um grande número de eventos separados, dos quais cada um é exclusivo.

[0031] Um evento elite, como utilizado aqui, é um evento que é selecionado de um grupo de eventos, obtidos através da transforma-ção com o mesmo DNA de transformação ou através do retrocruza- mento com plantas obtidas através de tal transformação, com base na expressão e na estabilidade do(s) transgene(s) e sua compatibilidade com características agronômicas ótimas da planta que o compreende. Assim, os critérios para a seleção do evento elite são um ou mais, preferencialmente dois ou mais, vantajosamente todos os seguintes: a) Que a presença do DNA exógeno não comprometa ou-tras características desejadas da planta, tais como as que referem-se ao desempenho agronômico ou ao valor comercial; b) Que o evento seja caracterizado por uma configuração molecular bem definida que é herdada de forma estável e para a qual ferramentas apropriadas para o controle de identidade possam ser desenvolvidas; c) Que o(s) gene(s) de interesse exiba(m) uma expressão fenotípica espacial e temporal correta, apropriada e estável, tanto na condição heterozigota (ou hemizigota) quanto homozigota do evento, em um nível aceitável comercialmente em uma faixa de condições ambientais em que as plantas que carregam provavelmente serão expostas no uso agronômico normal.

[0032] É preferido que o DNA exógeno esteja associado com uma posição no genoma da planta que permita a fácil introgressão nas estruturas genéticas básicas comerciais desejadas.

[0033] O status de um evento como um evento elite é confirmado através da introgressão do evento elite em estruturas genéticas bási-cas relevantes diferentes e da observação da conformidade com um, dois ou todos os critérios, por exemplo, a), b) e c) acima.

[0034] Um "evento elite" refere-se assim a um lócus gênico que compreende um DNA exógeno, que responde aos critérios descritos anteriormente. Uma planta, um material de planta ou uma progênie tal como as sementes pode compreender um ou mais eventos de elite em seu genoma.

[0035] As ferramentas desenvolvidas para a identificação de um evento elite ou da planta, do material de planta que compreende um evento elite ou dos produtos que compreendem o material de planta que compreende o evento elite se baseiam nas características genô- micas específicas do evento elite, tal como, um mapa de restrição da região genômica que compreende o DNA exógeno, os marcadores moleculares ou a sequência da(s) região(ões) flanqueador(as) do DNA exógeno.

[0036] Uma vez que uma ou ambas as regiões flanqueadoras do DNA exógeno foram sequenciadas, podem ser desenvolvidos os iniciadores e as sondas que reconhecem especificamente esta(s) sequên- cia(s) no ácido nucléico (DNA ou RNA) de uma amostra através de uma técnica de biologia molecular. Por exemplo, pode ser desenvolvido um método de PCR para a identificação do evento elite em amostras biológicas (tais como amostras de plantas, material de planta ou produtos que compreendem material de planta). Tal PCR se baseia em pelo menos dois "iniciadores" específicos um que reconhece uma sequência dentro da região flanqueadora a 5’ ou a 3’ do evento elite e o outro que reconhece uma sequência dentro do DNA exógeno. Os iniciadores possuem preferencialmente uma sequência entre 15 e 35 nucleotídeos que sob condições de PCR otimizadas "reconhecem especificamente" uma sequência dentro da região flanqueadora a 5’ ou a 3’ do evento elite e do DNA exógeno do evento elite respectivamente, de forma que um fragmento específico ("fragmento de integração" ou amplicon de discriminação) é amplificado partindo de uma amostra de ácido nucléico que compreende o evento elite. Isto significa que apenas o fragmento de integração direcionado e nenhuma outra sequência no genoma da planta ou no DNA exógeno, é amplificado sob as condições otimizadas de PCR.

[0037] Os iniciadores da PCR adequados para a invenção podem ser os seguintes: - oligonucleotídeos que variam de comprimento de 17 nt até aproximadamente 200 nt, que compreendem uma sequência de nu- cleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência flan- queadora a 5’ (SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotí- deo 732) em sua extremidade a 3’ (iniciadores que reconhecem as sequências flanqueadoras a 5’); ou - oligonucleotídeos que variam de comprimento de 17 nt até aproximadamente 200 nt, que compreendem uma sequência de nu- cleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotídeos consecutivos, selecionada da sequência flan- queadora a 3’ (complemento da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431 até o nucleotídeo 654) em sua extremidade a 3’ (iniciadores que reconhecem as sequências flanqueadoras a 3’); ou - oligonucleotídeos que variam de comprimento de 17 nt até aproximadamente 200 nt, que compreendem uma sequência de nu- cleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotídeos selecionada das sequências de DNA inseridas (complemento da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 733 até o nu- cleotídeo 1214) em sua extremidade a 3’ (iniciadores que reconhecem o DNA exógeno) ou - oligonucleotídeos que variam de comprimento de 17 nt até aproximadamente 200 nt, que compreendem uma sequência de nu- cleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotídeos selecionada das sequências de DNA inseridas (SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 430)

[0038] Os iniciadores podem, evidentemente, ser mais longos que os 17 nucleotídeos consecutivos mencionados e podem, por exemplo, ter 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt de comprimento ou até mesmo mais longo. Os iniciadores podem consistir inteiramente da sequência de nucleotídeos selecionada das sequências de nucleotí- deos mencionadas das sequências flanqueadoras e das sequências do DNA exógeno. Entretanto, a sequência de nucleotídeos dos iniciadores em sua extremidade a 5’ (isto é, fora dos 17 nucleotídeos consecutivos localizados a 3’) é menos crítica. Assim, a sequência a 5’ dos iniciadores pode consistir em uma sequência de nucleotídeos selecionada das sequências flanqueadoras ou do DNA exógeno, quando apropriado, mas pode conter vários (por exemplo, 1, 2, 5, 10) parea- mentos errados). A 5’ sequência dos iniciadores podem ainda consistir inteiramente de uma sequência de nucleotídeos não relacionada com as sequências flanqueadoras ou do DNA exógeno, tal como, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que representa os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição. Tais sequências não relacionadas ou sequências de DNA flanqueadoras com pareamentos erra- dos não devem preferencialmente ser mais longas que 100, mais preferencialmente não ser mais longas que 50 ou ainda 25 nucleotídeos.

[0039] Além disso, os iniciadores adequados podem compreender ou consistir de uma sequência de nucleotídeos em sua extremidade a 3’ abrangendo a região de união entre as sequências derivadas do DNA planta e as sequências do DNA exógeno (localizada nos nucleo- tídeos 732-733 na SEQ ID No: 1 e nos nucleotídeos 430-431 na SEQ ID No: 2) contanto que os 17 nucleotídeos consecutivos localizados a 3’ mencionados não sejam derivados exclusivamente das sequências do DNA exógeno ou derivadas da planta na SEQ ID No: 1 ou 2.

[0040] Será ainda imediatamente evidente ao perito na técnica que os pares de iniciadores da PCR selecionados apropriadamente não devem também compreender sequências complementares uma às outras.

[0041] Para a finalidade da invenção, o "complemento de uma se-quência de nucleotídeos representada na SEQ ID No: X" é a sequência de nucleotídeos que pode ser derivada da sequência de nucleotídeos representada através da substituição dos nucleotídeos pelo seu nucle- otídeo complementar de acordo com as regras de Chargaff (A T; G ::C) e lendo a sequência na direção 5’ para 3’, isto é, na direção oposta da sequência de nucleotídeos representada.

[0042] Os exemplos de iniciadores adequados são as sequências de oligonucleotídeos da SEQ ID No 3 (iniciadores que reconhecem a sequência flanqueadora a 5’), da SEQ ID No 4, da SEQ ID No 5, da SEQ ID No 6 (iniciadores que reconhecem o DNA exógeno para uso com os iniciadores que reconhecem a sequência flanqueadora a 5’), da SEQ ID No 7, da SEQ ID No 8, da SEQ ID No 9 (iniciadores que reconhecem o DNA exógeno para uso com os iniciadores que reco-nhecem a sequência flanqueadora a 3’) ou da SEQ ID No 10 (iniciadores que reconhecem a sequência flanqueadora a 3’).

[0043] Outros exemplos de iniciadores de oligonucleotídeo ade-quados compreendem em sua extremidade a 3’ as sequências a se-guir ou consistem de tais sequências:

[0044] a. iniciadores que reconhecem a sequência flanqueadora a 5’:

[0045]- a sequência de nucleotídeos da SEQ D No 1 partindo do nucleotídeo 258 até o nucleotídeo 277

[0046] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 310 até o nucleotídeo 329

[0047] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 311 até o nucleotídeo 330

[0048] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 507 até o nucleotídeo 526

[0049] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 616 até o nucleotídeo 635

[0050] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 256 até o nucleotídeo 275

[0051] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 259 até o nucleotídeo 277

[0052] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 260 até o nucleotídeo 279

[0053] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 309 até o nucleotídeo 329

[0054] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 310 até o nucleotídeo 330

[0055] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 311 até o nucleotídeo 329

[0056] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 312 até o nucleotídeo 330

[0057] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 436 até o nucleotídeo 455

[0058] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 34 até o nucleotídeo 53

[0059] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 130 até o nucleotídeo 148

[0060] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 139 até o nucleotídeo 158

[0061] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 256 até o nucleotídeo 277

[0062] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 259 até o nucleotídeo 279

[0063] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 260 até o nucleotídeo 277

[0064] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 261 até o nucleotídeo 279

[0065] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 266 até o nucleotídeo 285

[0066] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 308 até o nucleotídeo 329

[0067] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 309 até o nucleotídeo 330

[0068] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 312 até o nucleotídeo 329

[0069] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 313 até o nucleotídeo 330

[0070] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 435 até o nucleotídeo 455

[0071] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 501 até o nucleotídeo 518

[0072] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 509 até o nucleotídeo 526

[0073] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 513 até o nucleotídeo 532

[0074] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 528 até o nucleotídeo 547

[0075] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 529 até o nucleotídeo 547

[0076] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 602 até o nucleotídeo 621

[0077] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 21 até o nucleotídeo 40

[0078] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 35 até o nucleotídeo 54

[0079] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 129 até o nucleotídeo 149

[0080] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 134 até o nucleotídeo 153

[0081] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 138 até o nucleotídeo 158

[0082] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 140 até o nucleotídeo 158

[0083] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 150 até o nucleotídeo 169

[0084] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 186 até o nucleotídeo 205

[0085] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 254 até o nucleotídeo 275

[0086] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 258 até o nucleotídeo 279

[0087] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 262 até o nucleotídeo 279

[0088] - a sequência de nucleotídeos da SEQ D No 1 partindo do nucleotídeo 434 até o nucleotídeo 455

[0089] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 512 até o nucleotídeo 532 No partindo do

[0090] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 515 até o nucleotídeo 532 No partindo do

[0091] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 530 até o nucleotídeo 547 No partindo do

[0092] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 22 até o nucleotídeo 40 No partindo do

[0093] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 32 até o nucleotídeo 53 No partindo do

[0094] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 34 até o nucleotídeo 54 No partindo do

[0095] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 82 até o nucleotídeo 99 No partindo do

[0096] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 128 até o nucleotídeo 149 No partindo do

[0097] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 135 até o nucleotídeo 153 No partindo do

[0098] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 137 até o nucleotídeo 158 No partindo do

[0099] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 141 até o nucleotídeo 158 No partindo do

[00100] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 141 até o nucleotídeo 161 No partindo do

[00101] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 168 até o nucleotídeo 187 No partindo do

[00102] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 185 até o nucleotídeo 205

[00103] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 187 até o nucleotídeo 205

[00104] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 264 até o nucleotídeo 285

[00105] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 511 até o nucleotídeo 532

[00106] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 522 até o nucleotídeo 541

[00107] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 527 até o nucleotídeo 547

[00108] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 19 até o nucleotídeo 40

[00109] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 22 até o nucleotídeo 43

[00110] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 23 até o nucleotídeo 40

[00111] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 33 até o nucleotídeo 54

[00112] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 132 até o nucleotídeo 153

[00113] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 136 até o nucleotídeo 153

[00114] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 140 até o nucleotídeo 161

[00115] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 150 até o nucleotídeo 171

[00116] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 169 até o nucleotídeo 188

[00117] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 169 até o nucleotídeo 187

[00118] - a sequência de nucleotídeos da SEQ D No 1 partindo do nucleotídeo 171 até o nucleotídeo 189

[00119] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 173 até o nucleotídeo 193 No partindo do

[00120] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 184 até o nucleotídeo 205 No partindo do

[00121] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 188 até o nucleotídeo 205 No partindo do

[00122] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 521 até o nucleotídeo 541 No partindo do

[00123] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 523 até o nucleotídeo 541 No partindo do

[00124] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 602 até o nucleotídeo 623 No partindo do

[00125] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 97 até o nucleotídeo 118 No partindo do

[00126] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 168 até o nucleotídeo 188 No partindo do

[00127] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 170 até o nucleotídeo 187 No partindo do

[00128] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 170 até o nucleotídeo 188 No partindo do

[00129] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 172 até o nucleotídeo 189 No partindo do

[00130] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 172 até o nucleotídeo 193 No partindo do

[00131] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 520 até o nucleotídeo 541 No partindo do

[00132] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 91 até o nucleotídeo 110

[00133] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 167 até o nucleotídeo 188

[00134] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 171 até o nucleotídeo 188

[00135] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 176 até o nucleotídeo 197

[00136] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 90 até o nucleotídeo 110

[00137] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 92 até o nucleotídeo 110

[00138] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 300 até o nucleotídeo 319

[00139] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 89 até o nucleotídeo 110

[00140] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 93 até o nucleotídeo 110

[00141] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 298 até o nucleotídeo 319

[00142] b. iniciadores que reconhecem a sequência do DNA exógeno para uso com os iniciadores que reconhecem a sequência flanque- adora a 5’:

[00143] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 897 até o nucleotídeo 916

[00144] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1010 até o nucleotídeo 1029

[00145] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 897 até o nucleotídeo 914

[00146] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 899 até o nucleotídeo 916

[00147] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 949 até o nucleotídeo 966

[00148] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1010 até o nucleotídeo 1028

[00149] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1008 até o nucleotídeo 1027

[00150] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1010 até o nucleotídeo 1029

[00151] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 861

[00152] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 860

[00153] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 862

[00154] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 859

[00155] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 842 até o nucleotídeo 863

[00156] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 920 até o nucleotídeo 939

[00157] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 920 até o nucleotídeo 937

[00158] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1004 até o nucleotídeo 1023

[00159] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1004 até o nucleotídeo 1024

[00160] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1004 até o nucleotídeo 1021

[00161] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 1004 até o nucleotídeo 1025

[00162] c. iniciadores que reconhecem a sequência flanqueadora a 3’:

[00163] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 432 até o nucleotídeo 453

[00164] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 421 até o nucleotídeo 442

[00165] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 433 até o nucleotídeo 452

[00166] - o complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 433 até o nucleotídeo 453

[00167] d. iniciadores que reconhecem a sequência do DNA exógeno para uso com os iniciadores que reconhecem a sequência flanque- adora a 3’:

[00168] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 20

[00169] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 18 até o nucleotídeo 37

[00170] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 20 até o nucleotídeo 39

[00171] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 14 até o nucleotídeo 33

[00172] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 17 até o nucleotídeo 37

[00173] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 19 até o nucleotídeo 37

[00174] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 21 até o nucleotídeo 40

[00175] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 21 até o nucleotídeo 39

[00176] - a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 50 até o nucleotídeo 67

[00177] - a sequência de nucleotídeos da SEQ D No 2 partindo do nucleotídeo 71 até o nucleotídeo 90

[00178] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 74 até o nucleotídeo 93 No 2 partindo do

[00179] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 96 até o nucleotídeo 115 No 2 partindo do

[00180] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 13 até o nucleotídeo 33 No 2 partindo do

[00181] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 15 até o nucleotídeo 33 No 2 partindo do

[00182] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 16 até o nucleotídeo 37 No 2 partindo do

[00183] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 19 até o nucleotídeo 39 No 2 partindo do

[00184] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 20 até o nucleotídeo 37 No 2 partindo do

[00185] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 20 até o nucleotídeo 40 No 2 partindo do

[00186] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 22 até o nucleotídeo 39 No 2 partindo do

[00187] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 22 até o nucleotídeo 40 No 2 partindo do

[00188] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 28 até o nucleotídeo 47 No 2 partindo do

[00189] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 42 até o nucleotídeo 61 No 2 partindo do

[00190] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 70 até o nucleotídeo 90 No 2 partindo do

[00191] - a sequência de nucleotídeos da SEQ No 2 partindo do nucleotídeo 72 até o nucleotídeo 92

[00192] - a sequência de nucleotídeos da SEQ D No 2 partindo do nucleotídeo 72 até o nucleotídeo 91

[00193] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 73 até o nucleotídeo 93 No 2 partindo do

[00194] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 75 até o nucleotídeo 93 No 2 partindo do

[00195] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 75 até o nucleotídeo 94 No 2 partindo do

[00196] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 340 até o nucleotídeo 359 No 2 partindo do

[00197] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 424 até o nucleotídeo 443 No 2 partindo do

[00198] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 16 até o nucleotídeo 33 No 2 partindo do

[00199] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 18 até o nucleotídeo 39 No 2 partindo do

[00200] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 19 até o nucleotídeo 40 No 2 partindo do

[00201] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 27 até o nucleotídeo 47 No 2 partindo do

[00202] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 29 até o nucleotídeo 47 No 2 partindo do

[00203] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 37 até o nucleotídeo 56 No 2 partindo do

[00204] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 40 até o nucleotídeo 59 No 2 partindo do

[00205] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 41 até o nucleotídeo 59 No 2 partindo do

[00206] - a sequência de nucleotídeos da SEQ No 2 partindo do nucleotídeo 42 até o nucleotídeo 59

[00207] - a sequência de nucleotídeos da SEQ D No 2 partindo do nucleotídeo 69 até o nucleotídeo 90

[00208] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 71 até o nucleotídeo 91 No 2 partindo do

[00209] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 72 até o nucleotídeo 93 No 2 partindo do

[00210] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 73 até o nucleotídeo 91 No 2 partindo do

[00211] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 73 até o nucleotídeo 90 No 2 partindo do

[00212] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 74 até o nucleotídeo 94 No 2 partindo do

[00213] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 94 até o nucleotídeo 115 No 2 partindo do

[00214] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 189 até o nucleotídeo 208 No 2 partindo do

[00215] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 339 até o nucleotídeo 359 No 2 partindo do

[00216] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 341 até o nucleotídeo 359 No 2 partindo do

[00217] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 358 até o nucleotídeo 377 No 2 partindo do

[00218] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 366 até o nucleotídeo 385 No 2 partindo do

[00219] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 424 até o nucleotídeo 445 No 2 partindo do

[00220] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 26 até o nucleotídeo 47 No 2 partindo do

[00221] - a sequência de nucleotídeos da SEQ No 2 partindo do nucleotídeo 30 até o nucleotídeo 47

[00222] - a sequência de nucleotídeos da SEQ D No 2 partindo do nucleotídeo 36 até o nucleotídeo 56

[00223] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 38 até o nucleotídeo 56 No 2 partindo do

[00224] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 39 até o nucleotídeo 59 No 2 partindo do

[00225] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 41 até o nucleotídeo 60 No 2 partindo do

[00226] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 70 até o nucleotídeo 91 No 2 partindo do

[00227] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 73 até o nucleotídeo 94 No 2 partindo do

[00228] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 74 até o nucleotídeo 91 No 2 partindo do

[00229] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 338 até o nucleotídeo 359 No 2 partindo do

[00230] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 342 até o nucleotídeo 359 No 2 partindo do

[00231] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 357 até o nucleotídeo 377 No 2 partindo do

[00232] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 359 até o nucleotídeo 377 No 2 partindo do

[00233] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 367 até o nucleotídeo 385 No 2 partindo do

[00234] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 367 até o nucleotídeo 386 No 2 partindo do

[00235] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 35 até o nucleotídeo 56 No 2 partindo do

[00236] - a sequência de nucleotídeos da SEQ No 2 partindo do nucleotídeo 38 até o nucleotídeo 59

[00237] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 356 até o nucleotídeo 377

[00238] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 360 até o nucleotídeo 377

[00239] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 364 até o nucleotídeo 385

[00240] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 366 até o nucleotídeo 386

[00241] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 368 até o nucleotídeo 385

[00242] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 368 até o nucleotídeo 386

[00243] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 407 até o nucleotídeo 428

[00244] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 40 até o nucleotídeo 61

[00245] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 365 até o nucleotídeo 384

[00246] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 369 até o nucleotídeo 386

[00247] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 422 até o nucleotídeo 443

[00248] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 367 até o nucleotídeo 387

[00249] - a sequência de nucleotídeos da SEQ nucleotídeo 366 até o nucleotídeo 387

[00250] Como utilizado aqui, "a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No. Z partindo da posição X até a posição Y" indica a sequência de nucleotídeos que inclui ambos os pontos extremos de nucleotídeos.

[00251] Preferencialmente, o fragmento de integração possui um comprimento entre 50 e 500 nucleotídeos, mais preferencialmente entre 100 e 350 nucleotídeos. Os iniciadores específicos podem ter uma sequência que é entre 80 e 100% idêntica a uma sequência dentro da região flanqueadora a 5’ ou a 3’ do evento elite e do DNA exógeno do evento elite, respectivamente, contanto que os pareamentos errados ainda permitam a identificação específica do evento elite com estes iniciadores sob condições otimizadas da PCR. A faixa de pareamentos que podem ser permitidos, entretanto, pode ser facilmente determinada experimentalmente e é conhecida por um perito na técnica.

[00252] A tabela a seguir exemplifica os tamanhos de amplicons de DNA esperados (ou fragmentos de integração) com pares selecionados de iniciadores da PCR.

[00253] A detecção dos fragmentos de integração pode ocorrer de várias maneiras, por exemplo, através de uma estimativa de tamanho após a análise em gel. Os fragmentos de integração também podem ser diretamente sequenciados. Outros métodos específicos em relação às sequências para a detecção de fragmentos de DNA amplificados também são conhecidos na técnica.

[00254] Uma vez que a sequência dos iniciadores e sua localização relativa no genoma são exclusivas para o evento elite, a amplificação do fragmento de integração ocorrerá apenas em amostras biológicas que compreendem (o ácido nucléico de) o evento elite. Preferencialmente, quando uma PCR é realizada para a identificação da presença de EE-GH3 em amostras desconhecidas, é incluído um controle de um conjunto de iniciadores com o qual um fragmento dentro de um "gene de "housekeeping" da espécie planta do evento pode ser amplificado. Os genes de "housekeeping" são genes que são expressos na maior parte dos tipos celulares e que estão relacionados às atividades metabólicas básicas comuns a todas as células. Preferencialmente, o fragmento amplificado partindo do gene de manutenção da casa é um fragmento que é maior que o fragmento de integração amplificado. De-pendendo das amostras que serão analisadas, outros controles podem ser incluídos.

[00255] Os protocolos padronizados de PCR são descritos na técnica, tal como no "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2a Edição, 1999). As condições ótimas para a PCR, incluindo a sequência dos iniciadores específicos, são especificadas em um "protocolo de identificação pela PCR" para cada evento elite. É, entretanto, entendido que pode ser necessário que um número de parâmetros no protocolo de identificação pela PCR seja ajustado a condições de laboratório específicas e pode ser modificado ligeiramente para a obtenção de resultados similares. Por exemplo, o uso de um método diferente para a preparação de DNA pode requerer o ajuste, por exemplo, da quantidade de iniciadores, da polimerase e das condições de anela- mento utilizadas. Similarmente, a seleção de outros iniciadores pode determinar outras condições ótimas para o protocolo de identificação pela PCR. Estes ajustes serão, entretanto, evidentes a um perito na técnica e estão, além disso, detalhados nos manuais de aplicação da PCR atuais tal como um citado acima.

[00256] Alternativamente, os iniciadores específicos podem ser utilizados para a amplificação de um fragmento de integração que pode ser utilizado como uma "sonda específica" para a identificação de EE- GH3 em amostras biológicas. O contato do ácido nucléico de uma amostra biológica, com a sonda, sob condições que permitem a hibri- dização da sonda com seu fragmento correspondente no ácido nucléi- co, resulta na formação de um híbrido de ácido nucléico/sonda. A formação deste híbrido pode ser detectada (por exemplo, através da marcação do ácido nucléico ou da sonda), em que a formação deste híbrido indica a presença de EE-GH3. Tais métodos de identificação baseados na hibridização com uma sonda específica (sobre um veículo em fase sólida ou em solução) foram descritos na técnica. A sonda específica é preferencialmente uma sequência que, sob condições otimizadas, se hibridiza especificamente com uma região dentro de uma região flanqueadora a 5’ ou a 3’ do evento elite e preferencialmente compreendendo ainda parte do DNA exógeno contíguo com a mesma (referida posteriormente aqui como "região específica"). Preferencialmente, a sonda específica compreende uma sequência entre 50 e 500 pb, preferencialmente de 100 até 350 pb que é pelo menos 80%, preferencialmente entre 80 e 85%, mais preferencialmente entre 85 e 90%, especialmente preferencialmente entre 90 e 95%, mais preferencialmente entre 95% e 100% idêntica (ou complementar) à sequência de nucleotídeos de uma região específica. Preferencialmente, a sonda específica compreenderá uma sequência de aproximadamente 15 até aproximadamente 100 nucleotídeos contíguos idênticos (ou complementares) a uma região específica do evento elite.

[00257] Os oligonucleotídeos adequados como iniciadores da PCR para a detecção do evento elite EE-GH3 também podem ser utilizados para o desenvolvimento de um protocolo baseado na PCR para determinar o status de zigosidade do evento elite. Para esta finalidade, dois iniciadores que reconhecem o lócus do tipo selvagem são planejados de tal forma que são direcionados um ao outro e possuem o sítio de inserção localizado entre os iniciadores. Estes iniciadores podem ser iniciadores que reconhecem especificamente as sequências flan- queadoras a 5’ e a 3’ contidas dentro da SEQ ID NO 1 ou 2, respectivamente. Este conjunto de iniciadores, junto com um terceiro iniciador complementar às sequências de DNA de transformação e direcionado para um do DNA flanqueador, permite a amplificação pela PCR diagnóstica do lócus específico de EE-GH3, assim como do lócus do tipo selvagem. Se a planta for homozigota em relação ao lócus transgênico ou ao lócus do tipo selvagem correspondente, a PCR diagnóstica dará origem a um único produto da PCR típico, preferencialmente típico em comprimento, para o lócus transgênico ou do tipo selvagem. Se a planta for hemizogota em relação ao lócus transgênico, dois produtos da PCR específicos aos lóci aparecerão, refletindo a amplificação do ló- cus tanto transgênico quanto do tipo selvagem.

[00258] Além disso, métodos de detecção específicos para o evento elite EE-GH3 que diferem dos métodos de amplificação baseados na PCR também podem ser desenvolvidos utilizando a informação de sequência específica ao evento elite fornecida aqui. Tais métodos de detecção alternativos incluem métodos de detecção da amplificação de sinal linear baseados na clivagem invasiva de estruturas de ácidos nu- cléicos particulares, também conhecidos como a tecnologia Inva- derTM, (como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No 5.985.557 "Invasive Cleavage of Ácidos nucléicos", 6.001.567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage", incorporadas aqui como referência). Para esta finalidade, a sequência alvo pode ser hibridizada com um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucléico marcado que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nucleotídeo 733 até o nucleotídeo 750 ou seu complemento ou a dita sonda de ácido nucléico marcada que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 413 até o nucleotídeo 430 ou seu complemento e é adicionalmente hibridi- zada com um segundo oligonucleotídeo de ácido nucléico que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 1 partindo do nu- cleotídeo 715 até o nucleotídeo 732 ou seu complemento ou a dita sonda de ácido nucléico marcada que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID No 2 partindo do nucleotídeo 431 até o nucle- otídeo 448 ou seu complemento, em que os primeiro e segundo oligo- nucleotídeos se sobrepõem em pelo menos um nucleotídeo. A estrutura em dúplex ou em triplex que é produzida através dessa hibridização permite a clivagem seletiva da sonda com uma enzima (Cleavase®) deixando a sequência alvo intacta. A sonda marcada clivada é subsequentemente detectada, potencialmente através de uma etapa intermediária que resulta em uma amplificação adicional de sinal.

[00259] Um "estojo" como utilizado aqui refere-se a um conjunto de reagentes com a finalidade de realizar o método da invenção, mais particularmente, a identificação do evento elite EE-GH3 em amostras biológicas ou a determinação do status de zigosidade do material de planta que contém EE-GH3. Mais particularmente, uma modalidade preferida do estojo da invenção compreende pelo menos um ou dois iniciadores específicos, como descrito anteriormente, para a identificação do evento elite ou três iniciadores específicos para a determinação do status de zigosidade. Opcionalmente, o estojo pode compreender ainda qualquer outro reagente descrito aqui no protocolo de identificação pela PCR. Alternativamente, de acordo com uma outra modalidade desta invenção, o estojo pode compreender uma sonda específica, como descrito anteriormente, que se hibridiza especificamente com o ácido nucléico de amostras biológicas para a identificação da presença de EE-GH3 nas mesmas. Opcionalmente, o estojo pode compreender ainda qualquer outro reagente (tal como, mas não limitado ao tampão de hibridização, à marcação) para a identificação de EE-GH3 em amostras biológicas, utilizando a sonda específica.

[00260] O estojo da invenção pode ser utilizado e seus componentes podem ser especificamente ajustados, com a finalidade de controle de qualidade (por exemplo, pureza de lotes de sementes), para a detecção da presença ou da ausência do evento elite no material de planta ou de material que compreende ou é derivado do material de planta, tal como, mas não limitado a alimentos ou produtos alimentícios.

[00261] Como utilizado aqui, "identidade de sequência" em relação às sequências de nucleotídeos (DNA ou RNA), refere-se ao número de posições com nucleotídeos indênticos dividido pelo número de nucleo- tídeos na mais curta das duas sequências. O alinhamento das duas sequências de nucleotídeos é realizado através do algoritmo de Wilbur e Lipmann (Wilbur e Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 726) utilizando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos e uma penalidade de espaço de 4. A análise auxiliada por computador e a interpretação de dados de sequências, incluindo o alinhamento de sequências como descrito anteriormente, podem, por exemplo, ser convenientemente realizadas utili-zando o pacote de software de análise de sequências do Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology center). As sequências são indicadas como "essencialmente similares" quando tais sequências possuírem uma identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 75%, particularmente pelo menos aproximadamente 80%, mais particularmente pelo menos aproximadamente 85%, muito particularmente aproximadamente 90%, especialmente aproxi-madamente 95%, mais especialmente aproximadamente 100%. É evidente que quando é dito que as sequências de RNA são essencialmente similares ou possuem um certo grau de identidade de sequência com as sequências de DNA, a timidina (T) na sequência de DNA é considerada equivalente à uracila (U) na sequência de RNA.

[00262] O termo "iniciador" como utilizado aqui abrange qualquer ácido nucléico que seja capaz de iniciar a síntese de um ácido nucléi- co nascente em um processo dependente de molde, tal como PCR. Tipicamente, os iniciadores são oligonucleotídeos de 10 até 30 nucleo- tídeos, mas sequências mais longas podem ser empregadas. Os iniciadores podem ser fornecidos na forma de filamento duplo, embora a forma de filamento simples seja preferida. As sondas podem ser utili-zadas como iniciadores, mas são planejadas para se ligarem ao DNA ou ao RNA alvo e não precisam ser utilizadas em um processo de amplificação.

[00263] O termo "reconhecimento" como utilizado aqui quando refere-se a iniciadores específicos, refere-se ao fato de que os iniciadores específicos se hibridizam especificamente a uma sequência de ácido nucléico no evento elite sob as condições apresentadas no método (tais como as condições do protocolo de identificação pela PCR), em que a especificidade é determinada pela presença de controles positivos e negativos.

[00264] O termo "hibridização" como utilizado aqui quando refere-se a sonda específicas, refere-se ao fato de que a sonda se liga a uma região específica na sequência de ácido nucléico do evento elite sob condições de estringência padronizadas. As condições de estringência padronizada, como utilizado aqui, refere-sem às condições para hibri- dização descritas aqui ou às condições de hibridização convencionais como descrito por Sambrook e outros, 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que, por exemplo, podem compreender as etapas a seguir: 1) imobilização dos fragmentos de DNA genômico planta em um filtro, 2) pré-hibridização do filtro durante 1 até 2 horas a 42°C em 50% de formamida, 5 X SSPE, 2 X reagente de Denhardt e 0,1% de SDS ou durante 1 até 2 horas a 68°C em 6 X SSC, 2 X reagen te de Denhardt e 0,1% SDS, 3) adição da sonda de hibridização que foi marcada, 4) incubação durante 16 até 24 horas, 5) lavagem do filtro durante 20 min à temperatura ambiente em 1X SSC, 0,1% de SDS, 6) lavagem do filtro três vezes durante 20 min cada a 68°C em 0,2 X SSC, 0,1% de SDS e 7) exposição do filtro durante 24 até 48 horas a um filme de raio X a - 70°C com uma tela de intensificação.

[00265] Como utilizado aqui, uma amostra biológica é uma amostra de uma planta, material de planta ou produtos que compreendem material de planta. É pretendido que o termo "planta" abranja tecidos de plantas de algodão (Gossypium hirsitum), em qualquer estágio de maturidade, assim como quaisquer células, tecidos ou órgãos tirados ou derivados de qualquer tal planta, incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células isoladas, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ou protoplastos. "Material de planta", como utilizado aqui refere-se ao material que é obtido ou derivado de uma planta. Os produtos que compreendem material de planta refe- re-sem a alimentos, produtos alimentícios ou outros produtos que são produzidos utilizando material de planta ou que podem ser contaminados por material de planta. É entendido que, no contexto da presente invenção, tais amostras biológicas são testadas em relação à presença de ácidos nucléicos específicos para EE-GH3, implicando a presença de ácidos nucléicos nas amostras. Assim, os métodos referidos aqui para a identificação do evento elite EE-GH3 em amostras biológicas, refere-sem à identificação em amostras biológicas de ácidos nu- cléicos que compreendem o evento elite.

[00266] Como utilizado aqui "compreendendo" deve ser interpretado como especificando a presença das características, dos números inteiros, das etapas, dos reagentes ou dos componentes citados como referido, mas não impede a presença ou a adição de uma ou mais ca- racterísticas, números inteiros, etapas ou componentes ou grupos dos mesmos. Assim, por exemplo, um ácido nucléico ou uma proteína que compreende uma sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos, pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos que os realmente citados, isto é, podem estar embutidos em um ácido nucléico ou em uma proteína maior. Um gene quimérico que compreende uma sequência de DNA que é funcionalmente ou estruturalmente definida, pode compreender sequências adicionais de DNA etc.

[00267] A presente invenção refere-se ainda ao desenvolvimento de um evento elite EE-GH3 no algodão nas plantas que compreendem este evento, na progênie obtida partindo destas plantas e nas células vegetais ou no material de planta derivado deste evento. As plantas que compreendem o evento elite EE-GH3 foram obtidas como descrito no exemplo 1.

[00268] As plantas de algodão ou o material de planta que compreende EE-GH3 pode ser identificado de acordo com o protocolo de identificação pela PCR descrito para EE-GH3 no Exemplo 2. Sucintamente, o DNA genômico do algodão presente na amostra biológica é amplificado pela PCR utilizando um iniciador que reconhece especificamente uma sequência dentro da sequência flanqueadora a 5’ ou a 3’ de EE-GH3 tal como o iniciador com a sequência da SEQ ID NO: 3 e um iniciador que reconhece uma sequência no DNA exógeno, tal como o iniciador com a sequência da SEQ ID NO: 11. Os iniciadores de DNA que amplificam parte de uma sequência endógena do algodão são utilizados como o controle positivo para a amplificação pela PCR. Se após a amplificação pela PCR, o material fornecer um fragmento do tamanho esperado, o material contém o material de planta de uma planta de algodão que carrega o evento elite EE-GH3.

[00269] As plantas que carregam EE-GH3 são caracterizadas por sua tolerância ao glifosato, que no contexto da presente invenção in- clui tais plantas que são tolerantes ao herbicida Glifosato. As plantas que carregam EE-GH3 são também caracterizadas por possuírem características agronômicas que podem ser comparadas com as das variedades disponíveis comercialmente de algodão nos EUA, na ausência de pressão por ervas daninhas e uso de glifosato para o controle de ervas daninhas. Foi observado que a presença de um DNA exógeno na região de inserção do genoma da planta de algodão descrita aqui, confere características fenotípicas e moleculares particularmente interessantes às plantas que compreendem este evento.

[00270] A presente invenção fornece ainda o DNA genômico que compreende o evento elite EE-GH3, como definido aqui, que pode ser utilizado como material de referência nos estojos de identificação.

[00271] Os exemplos a seguir descrevem a identificação do evento elite EE-GH3 e o desenvolvimento de ferramentas para a identificação específica do evento elite EE-GH3 em amostras biológicas.

[00272] A não ser que seja citado de outra maneira, todas as técnicas do DNA recombinante são realizadas de acordo com os protocolos padronizados como descrito em Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY e nos Volumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Os materiais e os métodos padronizados para o trabalho molecular em plantas são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications, Reino Unido.

[00273] Na descrição e nos exemplos, é feita referência às sequências a seguir: SEQ ID No. 1: sequência de nucleotídeos que compreende uma região flanqueadora a 5’ de EE-GH3 SEQ ID No. 2: sequência de nucleotídeos que compreende uma regi ão flanqueadora a 3’ de EE-GH3 SEQ ID No. 3: iniciador GHI043 SEQ ID No. 4: iniciador SB327 SEQ ID No. 5: iniciador MAE080 SEQ ID No. 6: iniciador MAE081 SEQ ID No. 7: iniciador MAE078 SEQ ID No. 8: iniciador MAE070 SEQ ID No. 9: iniciador MAE071 SEQ ID No. 10: iniciador MAE121 SEQ ID No. 11: iniciador GHI044 SEQ ID No. 12: iniciador 1 para a amplificação do fragmento de controle SEQ ID No. 13: iniciador 2 para a amplificação do fragmento de controle

Exemplos 1. Identificação do evento elite EE-GH3

[00274] O algodão resistente a herbicida foi desenvolvido através da transformação do algodão com um vetor que compreende a sequência codificadora de um gene epsps modificado que codifica uma enzima EPSPS tolerante ao glifosato, sob o controle de um promotor de um gene de histona como descrito na Patente U.S. No 5.491.288 ou na Patente U.S. No 5.792.930.

[00275] O evento elite EE-GH3 foi selecionado com base em um procedimento de seleção extensivo baseado na boa expressão e estabilidade do gene de resistência ao herbicida e foi avaliada a sua compatibilidade com características agronômicas ótimas tais como altura da planta, altura do nó, retenção de cápsula, suporte, vigor, comprimento de fibra, resistência de fibra e rendimento de fibra de algodão.

[00276] O evento selecionado foi introduzido em bases genéticas fundamentais comerciais diferentes e os resultados de testes de cam- po em localizações diferentes foram comparados. As plantas foram borrifadas com o herbicida utilizando tratamentos diferentes.

[00277] Nenhum dano visível como um resultado da aplicação de herbicida foi alguma vez observado após a aplicação independentemente da taxa ou do estágio de desenvolvimento no momento da aplicação. Não havia efeitos prejudiciais sobre a morfologia ou a forma de crescimento de plantas pela aplicação do herbicida.

[00278] Além disso, o evento possuía morfologia normal de folha, flor e cápsula, excelente fertilidade e não exibia doença ou susceptibilidade anormal a insetos em várias bases genéticas fundamentais. Durante a introgressão nas várias bases genéticas fundamentais não foram observados quaisquer problemas ou anormalidades aberrantes.

2. Identificação das regiões flanqueadoras do evento elite EE-GH3

[00279] A sequência das regiões flanqueadoras do DNA exógeno no evento elite EE-GH3 foi determinada utilizando o método de PCR entrelaçada assimétrica térmica (TAIL) descrito por Liu e outros (1995, Plant J. 8(3): 457-463). Este método utiliza três iniciadores aninhados em reações sucessivas junto com um iniciador degenerado arbitrário mais curto de forma que as eficiências relativas de amplificação de produtos específicos e não específicos possam ser termicamente controladas. Os iniciadores específicos foram selecionados para o anela- mento com a borda do DNA exógeno e baseados em suas condições de anelamento. Uma pequena quantidade (5 μL) de produtos da PCR secundários e terciários não purificados foi analisada em um gel de agarose a 1%. O produto terciário da PCR foi purificado e sequencia- do.

2.1. Região flanqueadora à direita (5’)

[00280] O fragmento identificado como compreendendo a região flanqueadora a 5’ obtido através do método de TAIL-PCR foi sequen- ciado (SEQ ID No: 1). A sequência entre os nucleotídeos 1 e 732 corresponde ao DNA planta, enquanto que a sequência entre os nucleotí- deos 733 e 1214 corresponde ao DNA exógeno.

2.2. Região flanqueadora à esquerda (3’)

[00281] O fragmento identificado como compreendendo a região flanqueadora a 3’ obtido através do método de TAIL-PCR foi sequen- ciado (SEQ ID No: 2). A sequência entre os nucleotídeos 1 e 430 corresponde ao DNA exógeno, enquanto que a sequência entre os nucle- otídeos 431 e 654 corresponde ao DNA planta.

3. Desenvolvimento de um protocolo de identificação pela reação em Cadeia da Polimerase para EE-GH3 3.1. Iniciadores

[00282] Foram desenvolvidos iniciadores específicos que reconhecem sequências dentro do evento elite. Mais particularmente, foi desenvolvido um iniciador que reconhece uma sequência dentro da região flanqueadora a 5’ de EE-GH3. Foi então selecionado um segundo iniciador dentro da sequência do DNA exógeno de forma que os iniciadores abrangessem uma sequência de aproximadamente 334 nucleo- tídeos. Foi descoberto que os iniciadores a seguir forneciam resultados particularmente claros e que podiam ser reproduzidos em uma reação da PCR sobre o DNA de EE-GH3: GHI043: 5’-TTC.AgC.CgC.CAT.TgA.TgA.Ag-3’ (SEQ ID No.: 3) (alvo: DNA planta) GHI044: 5’-gTg.TAT.CCA.TgC.CTC.gAC.TC-3’ (SEQ ID No.: 11) (alvo: DNA do inserto)

[00283] Os iniciadores de marcação que se direcionam a uma sequência endógena são preferencialmente incluídos no coquetel da PCR. Estes iniciadores servem como um controle interno em amostras desconhecidas e no controle positivo de DNA. Um resultado positivo com o par de iniciadores endógenos demonstra que há DNA abundan- te de qualidade adequada na preparação de DNA genômico para um produto da PCR que será gerado. Os iniciadores endógenos foram selecionados para reconhecer um gene de "housekeeping" no algodão: GHI001: 5’-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3’ (SEQ ID No.: 12) GHI002: 5’-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3’ (SEQ ID No.: 13)

3.2. Fragmentos amplificados

[00284] Os fragmentos amplificados esperados na reação da PCR são:

[00285] Para o par de iniciadores GHI001-GHI002: 445 pb (controle endógeno)

[00286] Para o par de iniciadores GHI043-GHI044: 334 pb (evento elite EE-GH3)

3.3. DNA Molde

[00287] O DNA molde foi preparado partindo de uma punção de folha de acordo com Edwards e outros (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Quando se utiliza o DNA preparado com outros métodos, deve ser feita uma corrida de teste utilizando quantidades diferentes do molde. Geralmente 50 ng do DNA genômico molde produzem os melhores resultados.

3.4. Controles positivo e negativo atribuídos

[00288] Para evitar falsos positivos ou negativos, foi determinado que os controles positivo e negativo a seguir deviam ser incluídos em uma corrida de PCR:

[00289] Controle do Master Mix (controle negativo de DNA). Esta é uma PCR em que nenhum DNA é adicionado na reação. Quando no resultado esperado não for observado qualquer produto da PCR isto indica que o coquetel da PCR não estava contaminado com o DNA alvo.

[00290] Um controle positivo de DNA (amostra de DNA genômico conhecido por conter as sequências transgênicas). A amplificação bem-sucedida deste controle positivo demonstra que a PCR foi corrida sob condições que permitem a amplificação das sequências alvo.

[00291] - Um controle do DNA do tipo selvagem. Esta é uma PCR em que o DNA molde fornecido é o DNA genômico preparado partindo de uma planta não transgênica. Quando no resultado esperado não for observada amplificação de um produto da PCR do transgene, mas sim a amplificação do produto da PCR endógeno, isto indica que não ocorre amplificação da base fundamental de transgene detectável em uma amostra de DNA genômico.

3.5. Condições da PCR

[00292] Foram obtidos resultados ótimos sob as condições a seguir: - o mix da PCR para reações de 25 μL contém: 2,5 μL de DNA molde 2,5 μL de 10x Tampão de Amplificação (fornecido pelo fabricante com a Taq polimerase) 0,5 μL de 10 mM de dNTP’s 0,5 μL de GHI001 (10 pmols/μL) 0,5 μL de GHI002 (10 pmols/μL) 0,25 μL de GHI044 (10 pmols/μL) 0,25 μL de GHI043 (10 pmols/μL) 0,1 μL de Taq DNA polimerase (5 unidades/μL) água até 25 μL - o perfil de termociclagem a ser seguido para resultados ótimos é o seguinte: 4 min a 95°C Seguidos por: 1 min a 95°C 1 min a 57°C 2 min a 72°C Durante 5 ciclos Seguidos por: 30 s a 92°C 30 s a 57°C 1 min a 72°C Durante 25 ciclos Seguidos por: 10 minutos a 72°C

3.6. Análise em gel de agarose

[00293] Para visualizar de forma ótima os resultados da PCR foi determinado que entre 10 e 20 μL das amostras da PCR devem ser aplicados em um gel de agarose a 1,5% (tampão Tris-borato) com um marcador de peso molecular apropriado (por exemplo, "escada" de 100 pb PHARMACIA).

3.7. Validação dos resultados

[00294] Foi determinado que os dados provenientes de amostras de DNA de plantas transgênicas dentro de uma única corrida de PCR e um único coquetel de PCR não deveriam ser aceitáveis a não ser que 1) o controle positivo de DNA exibisse os produtos da PCR esperados (fragmentos transgênicos e endógenos), 2) o controle negativo de DNA fosse negativo em relação à amplificação pela PCR (nenhum fragmento) e 3) o controle de DNA do tipo selvagem exibisse o resultado esperado (amplificação do fragmento endógeno).

[00295] Quando o Protocolo de Identificação pela PCR for seguido para EE-GH3 como descrito anteriormente, faixas exibindo quantidades visíveis dos produtos da PCR transgênicos e endógenos dos tamanhos esperados indicam que a planta correspondente da qual o DNA genômico molde foi preparado, herdou o evento elite EE-GH3. As faixas que não exibem quantidades visíveis de qualquer um dos produtos da PCR transgênicos e exibindo quantidades visíveis do produto da PCR endógeno, indicam que a planta correspondente da qual o DNA genômico molde foi preparado, não compreende o evento elite. As faixas que não exibem quantidades visíveis dos produtos da PCR endógenos e transgênicos indicam que a qualidade e/ou a quantidade do DNA genômico não permitiu que um produto da PCR fosse gerado. Estas plantas não podem ser classificadas. A preparação do DNA ge- nômico deve ser repetida e uma nova corrida da PCR, com os controles apropriados, tem que ser realizada.

3.8. Uso do protocolo de PCR descriminante para a identificação de EE-GH3

[00296] Antes de tentar verificar amostras desconhecidas, uma corrida de teste, com todos os controles apropriados, tem que ser realizada. O protocolo desenvolvido poderia requerer a otimização em relação aos componentes que podem diferir entre laboratórios (preparação do DNA molde, Taq DNA polimerase, qualidade dos iniciadores, dNTP’s, termociclador etc.).

[00297] A amplificação da sequência endógena desempenha uma função no protocolo. Deve-se atingir condições de PCR e de termoci- clagem que amplificam quantidades equimolares da sequência tanto endógena quanto transgênica em um molde de DNA genômico trans- gênico conhecido. Sempre que o fragmento endógeno alvo não for amplificado ou sempre que as sequências alvo não forem amplificadas com as mesmas intensidades de coloração com brometo de etídio, como julgado através da eletroforese em gel de agarose, pode ser necessária a otimização das condições da PCR.

[00298] O material foliar de um número de plantas de algodão, das quais algumas compreendendo EE-GH3, foi testado de acordo com o protocolo descrito anteriormente. As amostras do evento elite EE-GH3 e do algodão do tipo selvagem foram tomadas como os controles positivo e negativo, respectivamente.

[00299] A Figura 2 ilustra o resultado obtido com o protocolo de identificação pela PCR do evento elite para EE-GH3 em um número de amostras de plantas de algodão. Foi observado que as amostras nas faixas 2 até 4 contêm o evento elite uma vez que a banda de 334 pb é detectada, enquanto que as amostras nas faixas 5 até 12 não compreendem EE-GH3. As faixas 5 até 11 compreendem outros eventos de elite do algodão (incluindo plantas que compreendem genes quiméricos diferentes de tolerância ao glifosato), a faixa 12 representa um controle de algodão não transgênico; a faixa 13 representa a amostra do controle negativo (água) e as faixas 1 e 14 representam o Marcador de Peso Molecular ("escada" de 100 pb).

4. Uso de um fragmento de integração específico como uma sonda para a detecção de material compreendendo EE-GH3

[00300] Um fragmento de integração específico de EE-GH3 é obtido através da amplificação pela PCR utilizando os iniciadores específicos GHI043 (SEQ ID No. 3) e GHI044 (SEQ ID No. 11) ou através da síntese química e é marcado. Este fragmento de integração é utilizado como uma sonda específica para a detecção de EE-GH3 em amostras biológicas. O ácido nucléico é extraído das amostras de acordo com procedimentos padronizados. Este ácido nucléico é então colocado em contato com a sonda específica sob condições de hibridização que são otimizadas para permitir a formação de um híbrido. A formação do híbrido é então detectada para indicar a presença do ácido nucléico de EE-GH3 na amostra. Opcionalmente, o ácido nucléico nas amostras é amplificado utilizando os iniciadores específicos antes do contato com a sonda específica. Alternativamente, o ácido nucléico é marcado antes do contato com a sonda específica ao invés do fragmento de integração. Opcionalmente, a sonda específica é ligada a um carreador sólido (tal como, mas não limitado a um filtro, uma tira ou esferas), antes do contato com as amostras.

5. Protocolo para a determinação baseada na PCR do status de zigo- sidade do material de planta de algodão com EE-GH3 5.1. Iniciadores

[00301] Dois iniciadores que reconhecem as sequências de nucleo- tídeos do lócus do tipo selvagem antes da inserção do evento elite, foram planejados de tal maneira que são direcionados um ao outro e possuem o sítio de inserção no meio. Este conjunto de iniciadores, junto com um terceiro iniciador complementar às sequências do DNA exógeno e direcionado para o DNA flanqueador, permite a amplificação simultânea pela PCR do lócus EE-GH3 assim como do lócus do tipo selvagem.

[00302] Foi observado que os iniciadores a seguir fornecem resultados particularmente claros e que podem ser reproduzidos em uma reação da PCR de classificação da zigosidade no DNA de EE-GH3: GHI043: 5’-TTC.AgC.CgC.CAT.TgA.TgA.Ag-3’ (SEQ ID No.: 3) (alvo: DNA planta da sequência flanqueadora a 3’) GHI044: 5’-gTg.TAT.CCA.TgC.CTC.gAC.TC-3’ (SEQ ID No.: 11) (alvo: DNA do inserto) MAE121: 5’-CCA.TTC.CgA.TCA.TCg.AgT.Tg-3’ (SEQ ID No.: 10) (alvo: DNA planta da sequência flanqueadora a 5’)

5.2. Fragmentos amplificados

[00303] Os fragmentos amplificados esperados na reação da PCR são: Para o par de iniciadores GHI043-MAE121: 454 pb (correspon dendo ao amplication do lócus do tipo selvagem) Para o par de iniciadores GHI043-GHI044: 334 pb (Evento elite EE- GH3)

5.3. DNA Molde

[00304] O DNA molde foi preparado partindo de uma punção foliar de acordo com Edwards e outros (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Quando se utiliza um DNA preparado com outros métodos, deve ser feita uma corrida de teste utilizando quantidades diferentes do molde. Geralmente 50 ng do DNA genômico de molde fornecem os melhores resultados.

5.4. Controles positivo e negativo atribuídos

[00305] Para evitar falsos positivos ou negativos, é aconselhável que os controles positivo e negativo a seguir devam ser incluídos em uma corrida de PCR: - Controle do Master Mix (controle negativo do DNA). Esta é uma PCR em que nenhum DNA é adicionado na reação. Quando no resultado esperado não forem observados produtos da PCR, isto indica que o coquetel da PCR não estava contaminado com o DNA alvo. - Um controle positivo do DNA (amostra de DNA genômico conhecida por conter as sequências transgênicas). A amplificação bem-sucedida deste controle positivo demonstra que a PCR foi corrida sob condições que permitem a amplificação de sequências alvo. - Um controle do DNA do tipo selvagem. Esta é uma PCR em que o DNA molde fornecido é o DNA genômico preparado partindo de uma planta não transgênica. Quando no resultado esperado não for observada amplificação de um produto da PCR de transgene, mas sim a amplificação do produto da PCR endógeno, isto indica que não há amplificação da base fundamental do transgene detectável em uma amostra de DNA genômico.

5.5. Condições da PCR

[00306] Resultados ótimos foram obtidos sob as condições a seguir: - o mix da PCR para reações de 25 μL contém: x μL de DNA molde (150 ng) 2,5 μL de 10x Tampão de Amplificação (fornecido pelo fabricante com a Taq polimerase) 0,5 μL de 10 mM de dNTP’s 1,5 μL de GHI043 (10 pmols/μL) 1,0 μL de GHI044 (10 pmols/μL) 0,5 μL de MAE121 (10 pmols/μL) 0,1 μL de Taq DNA polimerase (5 unidades/μL) água até 25 μL - o perfil de termiciclagem que será seguido para resultados ótimos é o seguinte: 4 min a 95°C Seguidos por: 1 min a 95°C 1 min a 57°C 2 min a 72°C Durante 5 ciclos Seguidos por: 30 s a 92°C 30 s a 57°C 1 min a 72°C Durante 25 ciclos Seguidos por: 10 minutos a 72°C

5.6. Análise em gel de agarose

[00307] Para visualizar de forma ótima os resultados da PCR foi determinado que entre 10 e 20μL das amostras da PCR devem ser aplicados em um gel de agarose a 1,5% (tampão Tris-borato) com um marcador de peso molecular apropriado (por exemplo, "escada" de 100 pb PHARMACIA).

5.7. Validação dos resultados

[00308] Os dados das amostras de DNA de plantas transgênicas dentro de uma única corrida de PCR e um único Master Mix da PCR não serão aceitos a não ser que:

[00309] - o controle positivo exiba os produtos da PCR esperados (amplificação do alvo transgênico)

[00310] - o controle de DNA positivo do tipo selvagem exiba o resul tado esperado (amplificação do alvo do tipo selvagem).

[00311] - o controle negativo seja negativo para a amplificação pela PCR (nenhum fragmento).

[00312] As faixas que exibem quantidades visíveis do produto da PCR transgênico do tamanho esperado e que não exibem quantidades visíveis do produto da PCR do tipo selvagem, indicam que a planta correspondente da qual o molde de DNA genômico foi preparado, é homozigota em relação ao cassete de gene transgênico.

[00313] As faixas que exibem quantidades visíveis dos produtos da PCR transgênicos e do tipo selvagem dos tamanhos esperados, indicam que a planta correspondente da qual o DNA genômico molde foi preparado, é hemizigota em relação ao cassete de gene transgênico. As faixas que não exibem quantidades visíveis do produto da PCR transgênico e que exibem quantidades visíveis do produto da PCR do tipo selvagem, indicam que a planta correspondente da qual o DNA genômico molde foi preparado, não herdou a sequência transgênica analisada e é assim homozigota em relação ao lócus do tipo selvagem.

[00314] As faixas que não exibem quantidades visíveis dos produtos da PCR transgênicos e do tipo selvagem, indicam que a qualidade e/ou a quantidade do DNA genômico não permitiu que um produto da PCR fosse gerado. Estas plantas não podem ser classificadas. A preparação do DNA genômico deve ser repetida e uma nova corrida da PCR, com os controles apropriados, tem que ser realizada. 5.8. Uso do protocolo de classificação da zigosidade para a identificação do status de zigosidade em plantas contendo EE-GH3.

[00315] A Figura 3 ilustra o resultado obtido com a PCR de classificação da zigosidade em relação a EE-GH3 em um número de amostras de plantas de algodão. Foi observado que as amostras nas faixas 2 até 8 continham o fragmento da PCR (334 pb) característico para o evento elite EE-GH3, enquanto que as amostras nas faixas 3, 5, 9 e 10 até 12 continham o fragmento característico em relação à presença do lócus do tipo selvagem. As faixas 2, 4, 6, 7 e 8 contêm, portanto, EE- GH3 na forma homozigota, as faixas 3 e 5 contêm EE-GH3 na forma hemizigota e a faixa 9 contém o lócus do tipo selvagem na forma ho- mozigota (azigota em relação a EE-GH3). A faixa 10 representa um controle de algodão não transgênico; a faixa 11 representa a amostra de controle negativo (água) e as faixas 1 e 12 representam o Marcador de Peso Molecular ("escada" de 100 pb). 6. Introgressão de EE-GH3 em cultivares preferidos

[00316] O evento elite EE-GH3 é introduzido através do retrocru- zamento repetido em cultivares de algodão comerciais tais como, mas não limitados a FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 e FM958, FM989, FM958, FM832, FM991, FM819, FM800, FM960, FM966, FM981, FM5035, FM5044, FM5045, FM5013, FM5015, FM5017 ou FM5024.

[00317] É observado que a introgressão do evento elite nestes cultivares não influencia significativamente qualquer uma das características fenotípicas ou agronômicas desejáveis destes cultivares (nenhum obstáculo de ligação) enquanto a expressão do transgene, que é determinada pela tolerância ao glufosinato, satisfaz os níveis aceitáveis comercialmente. Isto confirma o status do evento EE-GH3 como um evento elite.

[00318] Como utilizado nas reivindicações abaixo, a não ser que seja claramente indicado de outra maneira, é pretendido que o termo "planta" abranja tecidos vegetais, em qualquer estágio de maturidade, assim como quaisquer células, tecidos ou órgãos tirados ou derivados de qualquer tal planta, incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células isoladas, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ou protoplastos.

[00319] A semente de referência compreendendo o evento elite EE- GH3 foi depositada como EE-GH3 na ATCC (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) em 19 de julho de 2005, sob o número de acesso da ATCC PTA-6878.

[00320] Como utilizado nas reivindicações abaixo, a não ser que seja claramente indicado de outra maneira, é pretendido que o termo "planta" abranja tecidos vegetais, em qualquer estágio de maturidade, assim como quaisquer células, tecidos ou órgãos tirados ou derivados de qualquer tal planta, incluindo sem limitação quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células isoladas, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ou protoplastos.

[00321] É pretendido que a descrição anterior da invenção seja ilustrativa e não limitante.

[00322] Várias alterações ou modificações nas modalidades descritas podem ocorrer aos peritos na técnica. Estas podem ser feitas sem sair do espírito ou do âmbito da invenção.

Claims (4)

1. DNA genômico de algodão, caracterizado pelo fato de que compreende um evento elite, em que o evento elite compreende: (a) um DNA exógeno compreendendo a sequência de SEQ ID No. 14, o referido DNA exógeno compreendendo um gene quimérico que compreende a sequência codificante de um gene epsps modificado de Zea mays que codifica uma enzima EPSPS tolerante a glifosato, sob o controle de um promotor que pode ser expresso em planta de um gene de histona, (b) uma sequência característica que consiste em SEQ ID NO: 1, os nucleotídeos 1-732 de SEQ ID NO: 1 sendo imediatamente a montante e contíguos com o referido DNA exógeno e os nucleotídeos 733-1214 de SEQ ID NO 1 sendo DNA exógeno; e (c) uma sequência característica que consiste em SEQ ID NO: 2, os nucleotídeos 431-654 de SEQ ID NO: 2 sendo imediatamente a jusante e contíguos com o referido DNA exógeno, e os nucleotídeos 1 a 430 de SEQ ID NO: 2 sendo DNA exógeno em que o referido evento elite está compreendido em semente de referência depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-6878.

2. DNA genômico de algodão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que está no genoma de uma planta, célula de planta ou semente de algodão.

3. DNA genômico de algodão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que está contido em uma planta, célula de planta ou semente de algodão.

4. DNA genômico, caracterizado pelo fato de que é produzido a partir de uma planta, célula de planta ou semente de algodão, em que a referida planta, célula de planta ou semente compreende um evento elite em seu genoma, em que o referido evento elite compreende: (a) um DNA exógeno compreendendo a sequência de SEQ ID No. 14, o referido DNA exógeno compreendendo um gene quimérico que compreende a sequência codificante de um gene epsps modificado de Zea mays que codifica uma enzima EPSPS tolerante a glifosato, sob o controle de um promotor que pode ser expresso em planta de um gene de histona, (b) uma sequência característica que consiste em SEQ ID NO: 1, os nucleotídeos 1-732 de SEQ ID NO: 1 sendo imediatamente a montante e contíguos com o referido DNA exógeno e os nucleotídeos 733-1214 de SEQ ID NO 1 sendo DNA exógeno; e (c) uma sequência característica que consiste em SEQ ID NO: 2, os nucleotídeos 431-654 de SEQ ID NO: 2 sendo imediatamente a jusante e contíguos com o referido DNA exógeno, e os nucleotídeos 1 a 430 de SEQ ID NO: 2 sendo DNA exógeno, em que o referido evento elite está compreendido em semente de referência depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-6878.