ES2836485T3 - Plantas de algodón resistentes a insectos y procedimientos para identificar las mismas - Google Patents

Abstract

Una planta, o célula, parte o semilla de algodón transgénica que controla insectos, comprendiendo cada una en su genoma un evento élite EE-GH6, comprendiendo dicho evento élite EE-GH6 un ADN forastero que comprende una secuencia codificante de un gen cry2Ae modificado operativamente enlazado a un péptido de tránsito de subunidades pequeñas de Rubisco bajo el control de un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y secuencias de nucleótidos que abarcan las regiones de unión entre secuencias de ADN derivadas de plantas y secuencias de ADN forastero que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 1 o SEQ ID 11 y SEQ ID 2; en la que dicho evento élite EE-GH6 está comprendido en la semilla de referencia depositada en la ATCC bajo el número de depósito PTA-8398, en la que la presencia de dicho evento élite EE-GH6 se caracteriza por la resistencia a insectos así como por la tolerancia al glufosinato.

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas de algodón resistentes a insectos y procedimientos para identificar las mismas

Campo de la invención

Esta invención se refiere a plantas, material vegetal y semillas de algodón transgénico, caracterizados por albergar un evento de transformación específico, particularmente por la presencia de un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a insectos, en una ubicación específica en el genoma del algodón. Las plantas de algodón de la invención combinan el fenotipo de resistencia a insectos con un comportamiento agronómico, estabilidad genética y adaptabilidad a diferentes antecedentes genéticos equivalentes a la línea de algodón no transformada en ausencia de insectos. Se describen además procedimientos y kits para identificar la presencia de material vegetal que comprenden específicamente el evento de transformación EE-GH6 en muestras biológicas.

Antecedentes de la invención

La expresión fenotípica de un transgén en una planta está determinada tanto por la estructura del propio gen como por su ubicación en el genoma de la planta. Al mismo tiempo, la presencia del transgén (en un ADN forastero) en diferentes lugares del genoma influirá en el fenotipo general de la planta de diferentes formas. La introducción exitosa desde el punto de vista agronómico o industrial de un rasgo comercialmente interesante en una planta mediante manipulación genética puede ser un procedimiento prolongado que depende de diferentes factores. La transformación y regeneración reales de plantas transformadas genéticamente son solo las primeras de una serie de etapas de selección, que incluyen una caracterización genética extensa, reproducción y evaluación en ensayos de campo, que eventualmente conducen a la selección de un evento élite.

La fibra de algodón es el único tejido más importante a nivel mundial. Aproximadamente 80 millones de acres de algodón se cosechan anualmente en todo el mundo. El algodón es el quinto cultivo más grande de los EE. UU. En términos de superficie cultivada, con más de 15 millones de acres plantados en 2000.

Las especies de insectos más dañinas que se alimentan de algodón son Helicoverpa zea (gusano espátula del maíz o gusano de la cápsula del algodón), Helicoverpa armigera (gusano de la cápsula americano) Heliothis virescens (gusano del cogollo del tabaco) y Helicoverpa punctigera.

La identificación inequívoca de un evento élite se está volviendo cada vez más importante en vista de los debates sobre Novedosos alimentos/piensos, la segregación de productos GMO y no GMO y la identificación de material patentado. Idealmente, tal procedimiento de identificación es tanto rápido como simple, sin la necesidad de una extensiva configuración de laboratorio. Adicionalmente, el procedimiento debe proporcionar resultados que permitan una determinación inequívoca del evento élite sin interpretación de expertos, pero que se mantengan bajo el escrutinio de expertos si es necesario. En este documento se describen herramientas específicas para su uso en la identificación del evento élite EE-GH6 en muestras biológicas.

Se ha identificado EE-GH6 como un evento élite de una población de plantas de algodón transgénicas en el desarrollo de algodón resistente a insectos (Gossypium hirsutum) que comprende un gen que codifica una proteína cristal insecticida de Bacillus thuringiensis. Las plantas de algodón transgénicas contienen un gen quimérico que codifica una proteína cristal insecticida Bt (como se describe en el documento WO02/057664) bajo el control de un promotor expresable en plantas.

Se han divulgado en la técnica plantas de algodón que comprenden un gen de resistencia a insectos. Sin embargo, ninguna de las divulgaciones de la técnica anterior enseña o sugiere la presente invención.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una planta de algodón transgénica, o semilla, células o tejidos de la misma, que comprende, integrado de manera estable en su genoma, un casete de expresión que comprende un gen de resistencia a insectos que comprende la secuencia codificante del gen cry2Ae (como se describe en el Ejemplo 1.1 de este documento), que es resistente a los insectos y, en ausencia de la presión de los insectos, tiene un rendimiento agronómico que es sustancialmente equivalente al de la línea isogénica no transgénica. Bajo la presión de los insectos, la planta tendrá un fenotipo agronómico superior en comparación con la planta no transgénica.

De acuerdo con la presente invención, la planta o semilla de algodón, sus células o tejidos comprenden el evento élite EE-GH6.

Se divulga más específicamente en este documento una planta, semilla, células o tejidos de algodón transgénico, cuyo ADN genómico se caracteriza por el hecho de que, cuando se analiza en un protocolo de identificación por PCR como se describe en este documento, se utilizan dos cebadores dirigidos a la región flanqueante 5' o 3' de EE-GH6 y el ADN forastero, respectivamente, produce un fragmento que es específico para EE-GH6. Los cebadores pueden estar dirigidos contra la región flanqueante 5' dentro de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID No 11 y el ADN forastero, respectivamente, tal como los cebadores que comprenden o consisten en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 7 respectivamente, y producen un fragmento de ADN de entre 100 y 700 pb, preferentemente de aproximadamente 197 pb. Los cebadores también pueden estar dirigidos contra la región flanqueante 3' dentro de la SEQ ID NO: 2 y el ADN forastero respectivamente, tal como los cebadores que comprenden o consisten en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 3 respectivamente, y producen un fragmento de ADN de entre 100 y 700 pb, preferentemente de aproximadamente 189 pb.

La semilla de referencia que comprende el evento élite de la invención se ha depositado en la ATCC bajo el número de acceso PTA-8398. Semilla que comprende el evento élite EE-GH6 depositada como número de acceso ATTC PTA-8398, que crecerá hasta convertirse en una planta de algodón resistente a insectos, particularmente Helicoverpa sp. o Heliothis sp. La semilla del número de depósito ATCC PTA-8398, es un lote de semillas que consiste en al menos aproximadamente un 95 % de granos transgénicos homocigotos para el transgén, que comprende el evento élite de la invención, que crecerá hasta convertirse en plantas resistentes a insectos, por lo que las plantas también son plantas tolerantes al glufosinato. La semilla se puede sembrar y las plantas en crecimiento se pueden tratar con glufosinato como se describe en este documento para obtener 100 % de plantas tolerantes al glufosinato, que comprende el evento élite de la invención. También se describen células, tejidos, progenie y descendientes de una planta que comprende el evento élite de la invención que crece a partir de la semilla depositada en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-8398, y plantas que se pueden obtener por propagación y/o reproducción con una planta de algodón. que comprende el evento élite de la invención que crece a partir de la semilla depositada en la ATCC que tiene el número de acceso PTA-8398. La invención también se refiere a plantas de algodón que comprenden el evento élite EE-GH6.

Se describe además un procedimiento para identificar una planta transgénica, o células o tejidos de la misma, que comprende el evento élite EE-GH6, procedimiento que se basa en identificar la presencia de secuencias de ADN caracterizantes o aminoácidos codificados por tales secuencias de ADN en la planta, células o tejidos transgénicos. Tales secuencias de ADN caracterizantes pueden ser secuencias de 15 pb, preferentemente 20 pb, lo más preferentemente 30 pb o más que comprenden el sitio de inserción del evento, es decir, tanto una parte de ADN forastero como una parte del genoma del algodón (ya sea la región flanqueante 5' o 3') contiguo al mismo, lo que permite la identificación específica del evento élite.

También se describen procedimientos para identificar el evento élite EE-GH6 en muestras biológicas, cuyos procedimientos se basan en cebadores o sondas que reconocen específicamente la secuencia flanqueante 5' y/o 3' de EE-GH6.

Más específicamente, se describe un procedimiento que comprende amplificar una secuencia de un ácido nucleico presente en muestras biológicas, usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de los cuales reconoce la región flanqueante 5' o 3' de EE-GH6, el otro que reconoce una secuencia dentro del ADN forastero, preferentemente para obtener un fragmento de ADN de entre 100 y 500 pb. Los cebadores pueden reconocer una secuencia dentro de la región flanqueante 5' de EE-GH6 (SEQ ID No. 1, desde la posición 1 a la posición 140 o la SEQ ID No 11 desde la posición 1 a la posición 463) o dentro de la región flanqueante 3' de EE-GH6 (complemento de la SEQ ID No 2 desde la posición 113 a la posición 438) y una secuencia dentro del ADN forastero (complemento de la SEQ ID No 1 desde la posición 141 a 192 o la SEQ ID No 2 desde la posición 1 a la posición 112), respectivamente. El cebador que reconoce la región flanqueante 5' puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 7 y el cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN forastero puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 5 descrita en este documento. El cebador que reconoce la región flanqueante 3' puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 3 o la SEQ ID No 6 y el cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN forastero puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 4 descrita en este documento.

También se describe en el presente documento un procedimiento para identificar el evento élite EE-GH6 en muestras biológicas, cuyo procedimiento comprende amplificar una secuencia de un ácido nucleico presente en una muestra biológica, usando una reacción en cadena de la polimerasa con dos cebadores que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 3 y la SEQ ID No. 4 respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 189 pb o con dos cebadores que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 5 y la SEQ ID No. 7 respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 197 pb.

También se diculgan las secuencias flanqueantes específicas de EE-GH6 descritas en el presente documento, que se pueden usar para desarrollar procedimientos de identificación específicos para EE-GH6 en muestras biológicas. Tales secuencias flanqueantes específicas también pueden usarse como material de control de referencia en ensayos de identificación. Más particularmente, se describen las regiones flanqueantes 5' y 3' de EE-GH6 que se pueden usar para el desarrollo de cebadores y sondas específicos como se describe adicionalmente en el presente documento. También son adecuadas como material de referencia moléculas de ácido nucleico, preferentemente de aproximadamente 180-200 pb, que comprenden la secuencia que puede amplificarse mediante cebadores que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 7 y la SEQ ID No. 5 o de la SEQ ID No. 4 y la SEQ ID No. 3.

Se divulgan procedimientos de identificación de la presencia de EE-GH6 en muestras biológicas basados en el uso de tales cebadores o sondas específicos. Los cebadores pueden consistir en una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No 1 desde el nucleótido 1 al nucleótido 140 o la SEQ ID No 11 desde la posición 1 a la posición 463 o el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID 2 del nucleótido 113 al nucleótido 438) combinado con cebadores que consisten en una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionados del complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No 1 del nucleótido 141 al nucleótido 192 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No 2 del nucleótido 1 al nucleótido 112. Los cebadores también pueden comprender estas secuencias de nucleótidos ubicadas en su extremo 3', y además comprenden secuencias no relacionadas o secuencias derivadas de las secuencias de nucleótidos mencionadas, pero que comprenden no coincidencias.

También se divulgan kits para identificar el evento élite EE-GH6 en muestras biológicas, comprendiendo dichos kits al menos un cebador o sonda que reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' de EE-GH6 o el reordenamiento específico dentro de la secuencia de ADN forastero en EE-GH6.

El kit puede comprender, además de un cebador que reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' de EE-GH6, un segundo cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro del ADN forastero de EE-GH6, para su uso en un protocolo de identificación por PCR. Los kits pueden comprender al menos dos cebadores específicos, uno de los cuales reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' de EE-GH6, y el otro reconoce una secuencia dentro del ADN forastero. El cebador que reconoce la región flanqueante 5' puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 3 y el cebador que reconoce el transgén puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 4 o cualquier otro cebador o combinación de cebador como se describe en este documento.

También se divulga un kit para identificar el evento élite EE-GH6 en muestras biológicas, comprendiendo dicho kit los cebadores de PCR que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 3 y la SEQ ID No. 4 para su uso en el protocolo de identificación por PCR de EE-GH6 descrito en este documento.

Se describe un kit para identificar el evento élite EE-GH6 en muestras biológicas, cuyo kit comprende una sonda específica que tiene una secuencia que corresponde (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80 % y 100 % de identidad de secuencia con una región específica de EE- GH6. Preferentemente, la secuencia de la sonda corresponde a una región específica que comprende parte de la región flanqueante 5' o 3' de EE-GH6. Lo más preferentemente, la sonda específica tiene (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre el 80 % y el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia entre los nucleótidos 120 a 160 de la SEQ ID No 1o la SEQ ID No 2 del nucleótido 102 a 123.

Se divulgan secuencias de ADN que comprenden el sitio de inserción del evento y una longitud suficiente de polinucleótidos tanto del ADN genómico del algodón como del ADN forastero (transgén), para que sean útiles como cebador o sonda para la detección de EE-GH6. Tales secuencias pueden comprender al menos 9 nucleótidos del ADN genómico del algodón y un número similar de nucleótidos del ADN forastero (transgén) de EE-GH6 con el mismo en cada lado del sitio de inserción, respectivamente. Lo más preferentemente, tales secuencias de ADN comprenden al menos 9 nucleótidos del ADN genómico del algodón y un número similar de nucleótidos del ADN forastero contiguo con el sitio de inserción en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.

Los procedimientos y kits descritos en este documento se pueden usar para diferentes propósitos, tales como, pero no limitados a los siguientes: identificar la presencia o ausencia de EE-GH6 en plantas, material vegetal o en productos tales como, pero no limitados a alimentos o piensos. productos (frescos o procesados) que comprenden o se derivan de material vegetal; adicional o alternativamente, los procedimientos y kits pueden usarse para identificar material vegetal transgénico con el propósito de segregar entre material transgénico y no transgénico; adicional o alternativamente, los procedimientos y kits pueden usarse para determinar la calidad (es decir, porcentaje de material puro) del material vegetal que comprende EE-GH6.

Se divulgan las regiones flanqueantes 5' y/o 3' de EE-GH6, así como los cebadores y sondas específicos desarrollados a partir de las secuencias flanqueantes 5' y/o 3' de EE-GH6.

La invención también se refiere a ADN genómico obtenido de plantas que comprenden el evento élite EE-GH6. Tal ADN genómico puede usarse como material de control de referencia en los ensayos de identificación descritos en este documento.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes Ejemplos, que no pretenden limitar la invención a las realizaciones específicas descritas, pueden entenderse junto con la figura adjunta, en la que:

Fig. 1: representa esquemáticamente la relación entre las secuencias de nucleótidos citadas y los cebadores, barra negra: ADN forastero; barra negra de rayas: reordenamiento en el ADN forastero específico para EE-GH6; barra clara: ADN de origen vegetal; barra clara de rayas: eliminación del objetivo de preinserción; flechas: cebadores de oligonucleótidos, las cifras debajo de las barras representan posiciones de nucleótidos; (c) se refiere al complemento de la secuencia de nucleótidos indicada; NA: no aplica.

Fig. 2: representa los resultados obtenidos por el protocolo de identificación por PCR desarrollado para EE-GH6. Secuencia de carga del gel: Carril 1: marcador de peso molecular (separador de 100 pb); carriles 2 a 5: muestras de ADN de plantas de algodón que comprenden el evento transgénico EE-GH6; carriles 6 y 7: muestras de ADN de plantas de algodón transgénicas que no comprenden el evento élite EE-GH6, pero que comprenden un gen similar de resistencia a insectos; carril 8: control de ADN sin plantilla; carril 9: marcador de peso molecular.

Fig. 3: representa los resultados obtenidos por el protocolo de PCR de puntuación de zigosidad desarrollado para EE-GH6. Secuencia de carga del gel: Carril 1: marcador de peso molecular (separador de 100 pb); carriles 2 y 3: muestras de ADN de plantas de algodón que comprenden el evento transgénico EE-GH6 en forma homocigota; carriles 4 a 6: muestras de ADN de plantas de algodón que comprenden el evento transgénico EE-GH6 en forma heterocigota; carril 7: muestra de ADN de control de una planta de algodón de tipo silvestre; carril 8: control de ADN sin plantilla; carril 9: marcador de peso molecular.

Descripción detallada

La incorporación de una molécula de ADN recombinante en el genoma de la planta resulta típicamente de la transformación de una célula o tejido. El sitio particular de incorporación usualmente se debe a una integración "aleatoria".

El ADN introducido en el genoma de la planta como resultado de la transformación de una célula vegetal o tejido con un ADN recombinante o "ADN transformante", y que se origina a partir de tal ADN transformante, se denomina en lo sucesivo "ADN forastero" que comprende uno o más "transgenes". "ADN vegetal" en el contexto de la presente invención se referirá al ADN que se origina en la planta que se transforma. El ADN de la planta se encontrará usualmente en el mismo locus genético en la planta de tipo silvestre correspondiente. El ADN forastero puede caracterizarse por la ubicación y la configuración en el sitio de incorporación de la molécula de ADN recombinante en el genoma de la planta. El sitio en el genoma de la planta donde se ha insertado un ADN recombinante también se denomina "sitio de inserción" o "sitio diana". La inserción del ADN recombinante en la región del genoma de la planta denominada "ADN de la planta de preinserción" puede asociarse con una eliminación del ADN de la planta, denominada "eliminación del sitio diana". Una "región flanqueante" o "secuencia flanqueante" como se usa en este documento se refiere a una secuencia de al menos 20 pb, preferentemente al menos 50 pb, y hasta 5000 pb de ADN diferente del ADN introducido, preferentemente ADN del genoma de la planta que es ubicado bien sea inmediatamente corriente arriba de y contiguo con o inmediatamente corriente debajo de y contiguo al ADN forastero. Los procedimientos de transformación que conducen a la integración aleatoria del ADN forastero darán como resultado transformantes con diferentes regiones flanqueantes, que son características y únicas para cada transformante. Cuando el ADN recombinante se introduce en una planta mediante cruzamiento tradicional, su sitio de inserción en el genoma de la planta o sus regiones flanqueantes generalmente no cambiarán. Una "región de inserción" como se usa en este documento se refiere a la región correspondiente a la región de al menos 40 pb, preferentemente al menos 100 pb, y hasta 10000 pb, abarcada por la secuencia que comprende la región flanqueante corriente arriba y/o corriente abajo de un ADN forastero en el genoma de la planta. Teniendo en cuenta las diferencias menores debidas a mutaciones dentro de una especie, una región de inserción retendrá, al cruzar en una planta de la misma especie, al menos el 85 %, preferentemente el 90 %, más preferentemente el 95 % y lo más preferentemente el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia que comprende las regiones flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del ADN forastero en la planta obtenida originalmente de la transformación.

Un evento se define como un locus genético (artificial) que, como resultado de la ingeniería genética, porta un transgén que comprende al menos una copia de un gen de interés. Los estados alélicos típicos de un evento son la presencia o ausencia del ADN forastero. Un evento se caracteriza fenotípicamente por la expresión del transgén. A nivel genético, un evento es parte de la constitución genética de una planta. A nivel molecular, un evento puede caracterizarse por el mapa de restricción (por ejemplo, como se determina por transferencia Southern), por las secuencias flanqueantes corriente arriba y/o corriente abajo del transgén, la ubicación de los marcadores moleculares y/o la configuración molecular del transgén. Usualmente, la transformación de una planta con un ADN transformante que comprende al menos un gen de interés conduce a una población de transformantes que comprende una multitud de eventos separados, cada uno de los cuales es único.

Un evento élite, como se usa en este documento, es un evento que se selecciona de un grupo de eventos, obtenido por transformación con el mismo ADN transformante o por retrocruzamiento con plantas obtenidas por tal transformación, basado en la expresión y estabilidad del transgen(s) y su compatibilidad con las características agronómicas óptimas de la planta que lo integra. Por lo tanto, los criterios para la selección de eventos de élite son uno o más, preferentemente dos o más, ventajosamente todos los siguientes:

a) que la presencia del ADN forastero no compromete otras características deseadas de la planta, tales como las relacionadas con el rendimiento agronómico o el valor comercial;

b) que el evento se caracteriza por una configuración molecular bien definida que se hereda de manera estable y para la cual se pueden desarrollar herramientas apropiadas para el control de identidad;

c) que los genes de interés muestran una expresión fenotípica espacial y temporal correcta, apropiada y estable, tanto en la condición heterocigota (o hemicigota) como en la homocigota del evento, a un nivel comercialmente aceptable en un intervalo de condiciones ambientales en las que es probable que las plantas portadoras del evento estén expuestas en un uso agronómico normal.

Se prefiere que el ADN forastero esté asociado con una posición en el genoma de la planta que permita una fácil introgresión en los antecedentes genéticos comerciales deseados.

El estatus de un evento como un evento élite se confirma mediante la introgresión del evento élite en diferentes antecedentes genéticos relevantes y observando el cumplimiento de uno, dos o todos los criterios, por ejemplo a), b) y c) anteriores.

Por lo tanto, un "evento élite" se refiere a un locus genético que comprende un ADN forastero, que responde a los criterios descritos anteriormente. Una planta, material vegetal o progenie, tal como semillas, puede comprender uno o más eventos de élite en su genoma.

Las herramientas desarrolladas para identificar un evento élite o la planta, material vegetal que comprende un evento élite, o productos que comprenden material vegetal que comprende el evento élite se basan en las características genómicas específicas del evento élite, tal como, un mapa de restricción específico de la región genómica que comprende el ADN forastero, marcadores moleculares o la secuencia de la región o regiones flanqueantes del ADN forastero.

Una vez que se han secuenciado una o ambas regiones flanqueantes del ADN forastero, se pueden desarrollar cebadores y sondas que reconozcan específicamente esta (estas) secuencia (s) en el ácido nucleico (ADN o ARN) de una muestra por medio de una técnica biológica molecular. Por ejemplo, se puede desarrollar un procedimiento de PCR para identificar el evento élite en muestras biológicas (tales como muestras de plantas, material vegetal o productos que comprenden material vegetal). Tal PCR se basa en al menos dos "cebadores" específicos, uno que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento élite y el otro que reconoce una secuencia dentro del ADN forastero. Los cebadores preferentemente tienen una secuencia de entre 15 y 35 nucleótidos que bajo condiciones de PCR optimizadas "reconocen específicamente" una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento élite y el ADN forastero del evento élite respectivamente, de tal manera que un fragmento específico ("fragmento de integración" o amplicón discriminante) se amplifica a partir de una muestra de ácido nucleico que comprende el evento élite. Esto significa que solo el fragmento de integración direccionado, y ninguna otra secuencia en el genoma de la planta o ADN forastero, se amplifica bajo condiciones de PCR optimizadas.

Los cebadores de PCR adecuados para la invención pueden ser los siguientes:

- oligonucleótidos que varían en longitud desde 17 nt hasta aproximadamente 100 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia flanqueante 5' (SEQ ID No 1 del nucleótido 1 al nucleótido 140 o la SEQ ID No 11 desde la posición 1 a la posición 463) en su extremo 3' (los cebadores reconocen las secuencias flanqueantes 5'); o

- oligonucleótidos que varían en longitud desde 17 nt hasta aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos consecutivos, seleccionados de la secuencia flanqueante 3' (complemento de la SEQ ID No 2 del nucleótido 113 al nucleótido 438) en su extremo 3' (cebadores que reconocen secuencias flanqueantes 3'); o

- oligonucleótidos que varían en longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos seleccionados de las secuencias de ADN insertadas (complemento de la SEQ ID No 1 del nucleótido 141 al nucleótido 192) en su extremo 3' (cebadores que reconocen ADN forastero) o

- oligonucleótidos que varían en longitud desde 17 nt hasta aproximadamente 40 nt, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos seleccionados de las secuencias de ADN insertadas (SEQ ID No 2 del nucleótido 1 al nucleótido 112).

Por supuesto, los cebadores pueden ser más largos que los 17 nucleótidos consecutivos mencionados y, por ejemplo tener 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt de largo o incluso más. Los cebadores pueden consistir enteramente en una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos mencionadas de secuencias flanqueantes y secuencias de ADN forastero. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de los cebadores en su extremo 5' (es decir, fuera de los 17 nucleótidos consecutivos ubicados en 3') es menos crítica. Por lo tanto, la secuencia 5' de los cebadores puede consistir en una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias flanqueantes o ADN forastero, según sea apropiado, pero puede contener varios (por ejemplo, 1, 2, 5, 10 no coincidencias). La secuencia 5' de los cebadores puede incluso consistir enteramente en una secuencia de nucleótidos no relacionada con las secuencias flanqueantes o ADN forastero, tal como por ejemplo una secuencia de nucleótidos que representa sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Tales secuencias no relacionadas o secuencias de ADN flanqueantes con no coincidencias no deberían tener preferentemente más de 100, más preferentemente no más de 50 o incluso 25 nucleótidos.

Además, los cebadores adecuados pueden comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos en su extremo 3' que abarca la región de unión entre las secuencias derivadas del ADN de planta y las secuencias de ADN forastero (ubicadas en los nucleótidos 140-141 en la SEQ ID No 1 y los nucleótidos 112-113 en la SEQ ID No 2) siempre que los 17 nucleótidos consecutivos situados en 3' mencionados no se deriven exclusivamente bien sea del ADN forastero o de secuencias derivadas de plantas en la SEQ ID No 1 o 2.

También resultará inmediatamente claro para el experto en la técnica que los pares de cebadores de PCR seleccionados adecuadamente tampoco deben comprender secuencias complementarias entre sí.

Para el propósito de la invención, el "complemento de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID No: X" es la secuencia de nucleótidos que puede derivarse de la secuencia de nucleótidos representada reemplazando los nucleótidos a través de su nucleótido complementario de acuerdo con las reglas de Chargaff (A O T; G O C) y leer la secuencia en la dirección 5' a 3', es decir, en la dirección opuesta a la secuencia de nucleótidos representada. Ejemplos de cebadores adecuados son las secuencias de oligonucleótidos de la SEQ ID No 7 (cebadores de reconocimiento de secuencia flanqueante 5' ), SEQ ID No 5 (cebadores de reconocimiento de ADN forastero para su uso con los cebadores de reconocimiento de secuencia flanqueante 5'), SEQ ID No 4 (cebadores de reconocimiento de ADN forastero para su uso con los cebadores de reconocimiento de la secuencia flanqueante 3' ), SEQ ID No 3, SEQ ID No 6 (cebadores de reconocimiento de la secuencia flanqueante 3').

Otros ejemplos de cebadores oligonucleotídicos adecuados comprenden en su extremo 3' las siguientes secuencias o consisten en tales secuencias:

a. cebadores de reconocimiento de la secuencia flanqueante 5':

la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 111 al nucleótido 130

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 104 al nucleótido 123

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 106 al nucleótido 125

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 112 al nucleótido 130

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 103 al nucleótido 123

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 109 al nucleótido 125

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 109 al nucleótido 130

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 113 al nucleótido 130

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 99 al nucleótido 116

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 102 al nucleótido 123

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 104 al nucleótido 125

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 108 al nucleótido 130

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 114 al nucleótido 130

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 100 al nucleótido 116

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 101 al nucleótido 123

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 103 al nucleótido 125

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 110 al nucleótido 129

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 109 al nucleótido 129

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 111 al nucleótido 129

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 108 al nucleótido 129

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 112 al nucleótido 129

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 107 al nucleótido 129

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 113 al nucleótido 129

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 287 al nucleótido 306 - la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 288 al nucleótido 306

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 289 al nucleótido 306

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido290 al nucleótido 306

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 264 al nucleótido 281

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 265 al nucleótido 281

b. cebadores de reconocimiento de secuencias de ADN forastero para su uso con cebadores de reconocimiento de secuencias flanqueantes 5':

el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 140 al nucleótido 159 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 140 al nucleótido 158 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 139 al nucleótido 158 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 140 al nucleótido 160 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 167 al nucleótido 184 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 136 al nucleótido 157 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 139 al nucleótido 157 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 140 al nucleótido 157 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 139 al nucleótido 159 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 140 al nucleótido 161 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 140 al nucleótido 156 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 139 al nucleótido 156 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 136 al nucleótido 158 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 139 al nucleótido 160 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 139 al nucleótido 155 el complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 1 del nucleótido 139 al nucleótido 161 cebadores de reconocimiento de secuencias flanqueantes 3':

complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 366 a nucleótido 385 complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 366 a nucleótido 384 complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 366 a nucleótido 386 complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 366 a nucleótido 383 complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 366 a nucleótido 387 complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 125 a nucleótido 142 complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 366 a nucleótido 382 complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 94 al nucleótido 115 d. cebadores de reconocimiento de secuencias de ADN forastero para su uso con cebadores de reconocimiento de secuencias flanqueantes 3':

la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 95 al nucleótido 114

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 96 al nucleótido 115

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No del nucleótido al nucleótido

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 96 al nucleótido 114

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 97 al nucleótido 115

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 93 al nucleótido 114

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 94 al nucleótido 115

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 98 al nucleótido 115

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 92 al nucleótido 114

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 93 al nucleótido 115

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 98 al nucleótido 114

- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No ID No 2 del nucleótido 99 al nucleótido 115

Como se usa en el presente documento, "la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. Z desde la posición X a la posición Y" indica la secuencia de nucleótidos que incluye ambos puntos finales de nucleótidos.

Preferentemente, el fragmento amplificado tiene una longitud de entre 50 y 500 nucleótidos, tal como una longitud de entre 100 y 350 nucleótidos. Los cebadores específicos pueden tener una secuencia que es entre 80 y 100 % idéntica a una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento élite y el ADN forastero del evento élite, respectivamente, siempre que las no coincidencias permitan todavía la identificación específica de el evento élite con estos cebadores bajo condiciones de PCR optimizadas. Sin embargo, el intervalo de no coincidencias permisibles puede determinarse fácilmente de manera experimental y es conocido por un experto en la técnica.

La detección de fragmentos de integración puede ocurrir de diversas formas, por ejemplo a través de la estimación del tamaño después del análisis en gel. Los fragmentos de integración también pueden secuenciarse directamente. También se conocen en la técnica otros procedimientos específicos de secuencia para la detección de fragmentos de ADN amplificados.

Como la secuencia de los cebadores y su ubicación relativa en el genoma son únicas para el evento élite, la amplificación del fragmento de integración se producirá sólo en muestras biológicas que comprenden (el ácido nucleico de) el evento élite. Preferentemente, cuando se realiza una PCR para identificar la presencia de EE-GH6 en muestras desconocidas, se incluye un control de un conjunto de cebadores con los que se puede amplificar un fragmento dentro de un "gen cuidador" de la especie vegetal del evento. Los genes cuidadores son genes que se expresan en la mayoría de los tipos de células y que se ocupan de las actividades metabólicas básicas comunes a todas las células. Preferentemente, el fragmento amplificado del gen cuidador es un fragmento que es más grande que el fragmento de integración amplificado. Dependiendo de las muestras que se van a analizar, se pueden incluir otros controles.

Los protocolos de PCR estándar se describen en la técnica, tal como en el "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2a edición, 1999) y otras referencias. Las condiciones óptimas para la PCR, incluida la secuencia de los cebadores específicos, se especifican en un "Protocolo de identificación por PCR" para cada evento élite. Sin embargo, se entiende que es posible que sea necesario ajustar un número de parámetros en el protocolo de identificación de PCR a condiciones específicas de laboratorio, y pueden modificarse ligeramente para obtener resultados similares. Por ejemplo, el uso de un procedimiento diferente para la preparación de ADN puede requerir un ajuste de, por ejemplo, la cantidad de cebadores, polimerasa y condiciones de fusión utilizadas. De manera similar, la selección de otros cebadores puede dictar otras condiciones óptimas para el protocolo de identificación por PCR. Sin embargo, estos ajustes serán evidentes para una persona experta en la técnica, y adicionalmente se detallan en los manuales de aplicación de PCR actuales como el citado más arriba.

Alternativamente, se pueden usar cebadores específicos para amplificar un fragmento de integración que se puede usar como una "sonda específica" para identificar EE-GH6 en muestras biológicas. Poner en contacto el ácido nucleico de una muestra biológica, con la sonda, bajo condiciones que permiten la hibridación de la sonda con su correspondiente fragmento en el ácido nucleico, da como resultado la formación de un híbrido ácido nucleico/sonda. Se puede detectar la formación de este híbrido (por ejemplo, marcación del ácido nucleico o sonda), por lo que la formación de este híbrido indica la presencia de EE-GH6. Tales procedimientos de identificación basados en la hibridación con una sonda específica (ya sea en un portador en fase sólida o en solución) se han descrito en la técnica. La sonda específica es preferentemente una secuencia que, bajo condiciones optimizadas, se hibrida específicamente con una región dentro de la región flanqueante 5' o 3' del evento élite y preferentemente también comprende parte del ADN forastero contiguo a la misma (en lo sucesivo denominado como "región específica"). Preferentemente, la sonda específica comprende una secuencia de entre 50 y 500 pb, preferentemente de 100 a 350 pb que es al menos 80 %, preferentemente entre 80 y 85 %, más preferentemente entre 85 y 90 %, especialmente de manera preferente entre 90 y 95 %, lo más preferentemente entre 95 % y 100 % idéntico (o complementario) a la secuencia de nucleótidos de una región específica. Preferentemente, la sonda específica comprenderá una secuencia de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 nucleótidos contiguos idénticos (o complementarios) a una región específica del evento élite.

Los oligonucleótidos adecuados como cebadores de PCR para la detección del evento élite EE-GH6 también pueden usarse para desarrollar un protocolo basado en PCR para determinar el estado de cigosidad del evento élite. Con este fin, dos cebadores que reconocen el locus de tipo silvestre se diseñan de tal manera que son dirigidos uno hacia el otro y tienen el sitio de inserción ubicado entre los cebadores. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen específicamente las secuencias flanqueantes 5' y 3' contenidas dentro de la SEQ ID NO 1 (SEQ ID No. 11) o la SEQ ID No. 2, respectivamente. Estos cebadores también pueden ser cebadores que reconocen específicamente la secuencia flanqueante 5' o 3' (tal como un cebador que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No 7 o la SEQ ID 6). Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador complementario a las secuencias de ADN transformantes (tal como un cebador que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No 5) permite la amplificación por PCR de diagnóstico simultáneo del locus específico EE-GH6, así como del locus wt. Si la planta es homocigota para el locus transgénico o el locus wt correspondiente, la PCR de diagnóstico dará lugar a un único producto de PCR típico, preferentemente de longitud típica, bien sea para el locus transgénico o wt. Si la planta es hemicigota para el locus transgénico, aparecerán dos productos de p Cr específicos del locus, lo que refleja tanto la amplificación del locus transgénico como del locus wt.

Adicionalmente, también se pueden desarrollar procedimientos de detección específicos para el evento elite EE-GH6 que difieren de los procedimientos de amplificación basados en PCR utilizando la información de secuencia específica del evento elite proporcionada en este documento. Tales procedimientos de detección alternativos incluyen procedimientos de detección de amplificación de señal lineal basados en la escisión invasiva de estructuras de ácidos nucleicos particulares, también conocida como tecnología InvaderTM (como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. 5.985.557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6.001.567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage). Con este fin, la secuencia diana puede hibridar con un primer oligonucleótido de ácido nucleico marcado que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No 1 desde el nucleótido 141 al nucleótido 148 o su complemento o dicha sonda de ácido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No 2 desde el nucleótido 95 al nucleótido 112 o su complemento y además se hibrida con un segundo oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No 1 desde el nucleótido 123 al nucleótido 140 o su complemento o dicha sonda de ácido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No 2 desde el nucleótido 113 al nucleótido 130 o su complemento, en el que el primer y segundo oligonucleótidos se superponen por al menos un nucleótido. La estructura dúplex o triplex que se produce mediante esta hibridación permite la escisión de sonda selectiva con una enzima (Cleavase®) dejando intacta la secuencia diana. La sonda marcada escindida se detecta subsecuentemente, potencialmente a través de una etapa intermedia que da como resultado una amplificación de señal adicional.

Un "kit" como se usa en este documento se refiere a un conjunto de reactivos con el propósito de realizar el procedimiento descrito en este documento, más particularmente, la identificación del evento élite EE-GH6 en muestras biológicas o la determinación del estatus de cigosidad de EE-GH6 que contiene material vegetal. Más particularmente, el kit puede comprender al menos uno o dos cebadores específicos, como se describió anteriormente para la identificación del evento élite, o tres cebadores específicos para la determinación del estatus de cigosidad. Opcionalmente, el kit puede comprender además cualquier otro reactivo descrito en este documento en el protocolo de identificación por PCR. Alternativamente, el kit puede comprender una sonda específica, como se describió anteriormente, que hibrida específicamente con el ácido nucleico de muestras biológicas para identificar la presencia de EE-GH6 en el mismo. Opcionalmente, el kit puede comprender además cualquier otro reactivo (tal como, pero sin limitarse a tampón de hibridación, marcador) para la identificación de EE-GH6 en muestras biológicas, usando la sonda específica.

El kit se puede utilizar, y sus componentes se pueden ajustar específicamente, con fines de control de calidad (por ejemplo, pureza de lotes de semillas), detección de la presencia o ausencia del evento élite en material vegetal o material que comprenda o se derive de material vegetal, tal como pero no limitado a productos de alimentos o piensos.

Como se usa en este documento, "identidad de secuencia" con respecto a las secuencias de nucleótidos (ADN o ARN), se refiere al número de posiciones con nucleótidos idénticos dividido por el número de nucleótidos en la más corta de las dos secuencias. El alineamiento de las dos secuencias de nucleótidos se realiza mediante el algoritmo de Wilbur y Lipmann (Wilbur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726) utilizando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una penalidad de brecha de 4. El análisis y la interpretación asistidos por ordenador de los datos de secuencia, incluida la alineación de secuencias como se describe anteriormente, se pueden realizar, por ejemplo, de manera conveniente utilizando el paquete de software de análisis de secuencias del Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology center). Las secuencias se indican como "esencialmente similares" cuando tales secuencias tienen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 75 %, particularmente al menos aproximadamente el 80 %, más particularmente al menos aproximadamente el 85 %, bastante particularmente aproximadamente el 90 %, especialmente aproximadamente el 95 %, más especialmente aproximadamente 100 %. Está claro que cuando se dice que las secuencias de ARN son esencialmente similares o tienen un cierto grado de identidad de secuencia con las secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN.

El término "cebador", como se usa en este documento, abarca cualquier ácido nucleico que sea capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente de plantilla, tal como PCR. Típicamente, los cebadores son oligonucleótidos de 10 a 30 nucleótidos, pero pueden emplearse secuencias más largas. Los cebadores se pueden proporcionar en forma bicatenaria, aunque se prefiere la forma monocatenaria. Las sondas se pueden usar como cebadores, pero están diseñadas para unirse al ADN o ARN diana y no necesitan usarse en un proceso de amplificación.

El término "reconocer", como se usa en este documento cuando se refiere a cebadores específicos, se refiere al hecho de que los cebadores específicos se hibridan específicamente con una secuencia de ácido nucleico en el evento élite bajo las condiciones establecidas en el procedimiento (tal como las condiciones del protocolo de identificación por PCR), por lo que la especificidad está determinada por la presencia de controles positivos y negativos.

El término "hibridación" como se usa en este documento cuando se refiere a sondas específicas, se refiere al hecho de que la sonda se une a una región específica en la secuencia de ácido nucleico del evento élite bajo condiciones de rigurosidad estándar. Las condiciones de rigurosidad estándar como se usan en este documento se refieren a las condiciones para la hibridación descritas en este documento o a las condiciones de hibridación convencionales como las descritas por Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) que por ejemplo puede comprender las siguientes etapas: 1) inmovilizar fragmentos de ADN genómico de plantas en un filtro, 2) prehibridar el filtro durante 1 a 2 horas a 42 °C en formamida al 50 %, 5 X SSPE, 2 X reactivo de Denhardt y SDS al 0,1 %, o durante 1 a 2 horas a 68 °C en 6 X SSC, 2 X reactivo de Denhardt y SDS al 0,1 %, 3) añadir la sonda de hibridación que ha sido marcada, 4) incubar durante 16 a 24 horas, 5) lavar el filtro durante 20 minutos a temperatura ambiente en 1X SSC, SDS al 0,1 %, 6) lavar el filtro tres veces durante 20 min. cada uno a 68 °C en 0,2 X SSC, SDS al 0,1 %, y 7) exponer el filtro durante 24 a 48 horas a una película de rayos X a -70 °C con una pantalla intensificadora.

Como se usa en este documento, una muestra biológica es una muestra de una planta, material vegetal o productos que comprenden material vegetal. El término "planta" pretende abarcar tejidos de plantas de algodón (Gossypium hirsitum), en cualquier etapa de madurez, así como cualquier célula, tejido u órgano extraído o derivado de tal planta, incluidas, sin limitación, cualesquier semillas, hojas, tallos, flores, raíces, células individuales, gametos, cultivos celulares, cultivos de tejidos o protoplastos. "Material vegetal", como se usa en este documento, se refiere a material que se obtiene o se deriva de una planta. Los productos que comprenden material vegetal se refieren a alimentos, piensos u otros productos que se producen utilizando material vegetal o que pueden estar contaminados por material vegetal. Se entiende que, en el contexto de la presente invención, tales muestras biológicas se prueban para determinar la presencia de ácidos nucleicos específicos para EE-GH6, lo que implica la presencia de ácidos nucleicos en las muestras. Por lo tanto, los procedimientos a los que se hace referencia en este documento para identificar el evento élite EE-GH6 en muestras biológicas, se refieren a la identificación en muestras biológicas de ácidos nucleicos que comprenden el evento élite.

Como se usa en el presente documento, "que comprende" debe interpretarse como la especificación de la presencia de las características, enteros, etapas, reactivos o componentes indicados como se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. Así, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los realmente citados, es decir, esta embebido en un ácido nucleico o proteína más grande. Un gen quimérico que comprende una secuencia de ADN que está definida funcional o estructuralmente, puede comprender secuencias de ADN adicionales, etc.

También se describe el desarrollo de un evento élite EE-GH6 en algodón para las plantas que comprenden este evento, la progenie obtenida de estas plantas y las células vegetales o material vegetal derivado de este evento. Las plantas que comprenden el evento élite EE-GH6 se obtuvieron como se describe en el ejemplo 1.

Las plantas de algodón o el material vegetal que comprenden EE-GH6 se pueden identificar de acuerdo con el protocolo de identificación 'por PCR descrito para EE-GH6 en el Ejemplo 2. En resumen, el ADN genómico de algodón presente en la muestra biológica se amplifica mediante PCR usando un cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro la secuencia flanqueante 5' o 3' de EE-GH6, tal como el cebador con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, y un cebador que reconoce una secuencia en el ADN forastero, tal como el cebador con la secuencia de la SEQ ID NO: 4. Se utilizan cebadores de ADN que amplifican parte de una secuencia de algodón endógena como control positivo para la amplificación por PCR. Si tras la amplificación por PCR, el material produce un fragmento del tamaño esperado, el material contiene material vegetal de una planta de algodón que alberga el evento élite EE-GH6.

Las plantas que albergan EE-GH6 se caracterizan por su resistencia a los insectos, así como por su tolerancia al glufosinato. Las plantas que albergan EE-GH6 también se caracterizan por tener características agronómicas que son comparables a las variedades de algodón disponibles comercialmente en los Estados Unidos, en ausencia de la presión de los insectos. Se ha observado que la presencia de un ADN forastero en la región de inserción del genoma de la planta de algodón descrita en este documento, confiere características fenotípicas y moleculares particularmente interesantes a las plantas que comprenden este evento.

Los siguientes ejemplos describen la identificación del evento élite EE-GH6 y el desarrollo de herramientas para la identificación específica del evento élite EE-GH6 en muestras biológicas.

A menos que se indique otra cosa en los Ejemplos, todas las técnicas recombinantes se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar como se describe en "Sambrook J y Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York "y en" Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA y Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Nueva York ".

Los materiales estándar y las referencias se describen en "Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" y en "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2nd Edición, Academic Press, San Diego ". Los materiales y procedimientos estándar para las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se pueden encontrar en "McPherson MJ y M0ller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" y en "PCR Applications Manual, 3rd Edition (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim o www.roche-applied-science.com "

En la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias:

SEQ ID No. 1: secuencia de nucleótidos que comprende una región flanqueante 5' de

EE-GH6

SEQ ID No. 2: secuencia de nucleótidos que comprende una región flanqueante 3' de

EE-GH6

SEQ ID No. 3: cebador GHI058

SEQ ID No. 4: cebador GHI059

SEQ ID No. 5: cebador DPA286

SEQ ID No. 6: cebador NEL115

SEQ ID No. 7: cebador NEL117

SEQ ID No. 8: cebador 1 para amplificación del fragmento de control

SEQ ID No. 9: cebador 2 para amplificación del fragmento de control

SEQ ID No. 10: Secuencia de nucleótidos de la secuencia diana genómica de la planta

antes de la inserción de EE-GH6

SEQ ID No. 11: secuencia de nucleótidos que comprende una región flanqueante 5' de

EE-GH6 (larga)

Ejemplos

1. Identificación del evento élite EE-GH6

El algodón resistente a insectos se desarrolló mediante la transformación de algodón con un vector que comprende la secuencia codificante de un gen cry2Ae modificado operativamente enlazado a un péptido de tránsito de subunidad pequeña de Rubisco bajo el control de un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.

El evento Elite EE-GH6 fue seleccionado en base a un extenso procedimiento de selección basado en la buena expresión y estabilidad del gen de resistencia a insectos y su compatibilidad con características agronómicas óptimas tales como altura de planta, altura al nudo, retención de cápsulas, soporte, vigor, longitud de fibra, se evaluaron la resistencia de la fibra y el rendimiento de pelusa.

El evento seleccionado se introdujo en diferentes antecedentes genéticos comerciales y se compararon los resultados de las pruebas de campo en diferentes lugares. Las plantas se expusieron a plagas de insectos usando diferentes tratamientos. Las plantas exhibieron un buen control de insectos.

Adicionalmente, el evento tuvo una morfología normal de hojas, flores y cápsulas, excelente fertilidad y no mostró ninguna enfermedad o susceptibilidad anormal a los insectos en múltiples antecedentes genéticos. Durante la introgresión en múltiples antecedentes genéticos, no se observaron problemas o anomalías aberrantes.

2. Identificación de las regiones flanqueantes del evento élite EE-GH6

La secuencia de las regiones que flanquean el ADN forastero en el evento élite EE-GH6 se determinó utilizando el procedimiento de PCR entrelazado asimétrico térmico (TAIL-) descrito por Liu et al. (1995, Plant J. 8 (3): 457-463) cuando sea posible. Este procedimiento utiliza tres cebadores anidados en reacciones sucesivas junto con un cebador degenerado arbitrario más corto de tal manera que las eficiencias relativas de amplificación de productos específicos y no específicos puedan controlarse térmicamente. Los cebadores específicos se seleccionaron para fusionar con el borde del ADN forastero y en base a sus condiciones de fusión. Se analizó una pequeña cantidad (5 |jl) de productos de PCR no purificados, secundarios y terciarios en un gel de agarosa al 1 %. El producto de PCR terciario se purificó y secuenció.

2.1. Región flanqueante derecha (5')

El fragmento identificado de forma que comprende la región flanqueante 5' se secuenció (SEQ ID No. 1). La secuencia entre el nucleótido 1 y 140 corresponde al ADN vegetal, mientras que la secuencia entre el nucleótido 141 y 192 corresponde al ADN forastero. También se secuenció un fragmento más largo que comprende la región flanqueante 5' (SEQ ID No 11). La secuencia entre el nucleótido 1 y el nucleótido 463 corresponde al ADN vegetal, mientras que la secuencia entre los nucleótidos 464 y 555 corresponde al ADN forastero.

2.2. Región flanqueante izquierda (3')

El fragmento identificado de forma que comprende la región flanqueante 3' obtenido por el procedimiento TAIL-PCR se secuenció (SEQ ID No. 2). La secuencia entre los nucleótidos 1 y 112 corresponde al ADN forastero, mientras que la secuencia entre los nucleótidos 113 y 438 corresponde al ADN vegetal.

2.3. Identificación del ADN vegetal de preinserción

El ADN de la planta de preinserción se amplificó mediante amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos NEL115 (SEQ ID No. 6) y NEL117 (SEQ ID No. 7). Se identificó la secuencia de nucleótidos del fragmento amplificado (SEQ ID No. 10). La región entre las posiciones de nucleótidos 141 y 148 se identificó como reordenada (eliminación del sitio diana) cuando se comparó con las secuencias de nucleótidos derivadas de plantas en las regiones flanqueantes 5' y 3' del evento élite EE-GH6.

.DesarroNo de protocolos de identificación de la reacción en cadena de la polimerasa para EE-GH6

3.1. Cebadores

Se desarrollaron cebadores específicos que reconocen secuencias dentro del evento élite.

Se desarrolló un cebador que reconoce una secuencia dentro de la región flanqueante 3' de EE-GH6. A continuación, se seleccionó un segundo cebador dentro de la secuencia del ADN forastero de tal manera que los cebadores abarcan una secuencia de aproximadamente 189 nucleótidos. Se encontró que los siguientes cebadores dan resultados particularmente claros y reproducibles en una reacción por PCR en el ADN de EE-GH6:

GHI058: 5'- gAA.ATT.gCg.TgA.CTC.AAA.TTC.C -3' (diana: ADN vegetal) (SEQ ID No.: 3)

GHI059: 5'- ggT.TTC.gCT.CAT.gTg.TTg.AgC-3' (diana: ADN inserto) (SEQ ID No.: 4)

Los cebadores que se dirigen a una secuencia endógena se incluyen preferentemente en el cóctel de PCR. Estos cebadores sirven como control interno en muestras desconocidas y en el control positivo de ADN. Un resultado positivo con el par de cebadores endógenos (presencia de un fragmento amplificado por PCR de 445 pb) demuestra que hay suficiente ADN de calidad adecuada en la preparación de ADN genómico para generar un producto de PCR. Los cebadores endógenos se seleccionaron para reconocer un gen cuidador en el algodón:

GHI001: 5'-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC-3' (SEQ ID No.: 8)

GHI002: 5'-CAA.CTC.CTC.CAg.TCA.TCT.CCg-3' (SEQ ID No.: 9)

3.2. Fragmentos amplificados

Los fragmentos amplificados esperados en la reacción de PCR son:

Para cebador par GHI001-GHI002: 445bp (control endógeno)

Para cebador par GHI058-GHI059: 189bp (EE-GH6 evento élite)

3.3. ADN de Plantilla

El ADN de plantilla se preparó a partir de una sección de hoja de acuerdo con Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Cuando se usa ADN preparado con otros procedimientos, se debe realizar una prueba con diferentes cantidades de plantilla. Usualmente, 50 ng de ADN molde genómico producen los mejores resultados.

3.4. Controles positivos y negativos asignados

Para evitar falsos positivos o negativos, se determinó que los siguientes controles positivos y negativos deben incluirse en una serie de PCR:

- Mezcla maestra de control (control negativo de ADN). Esta es una PCR en la que no se agrega ADN a la reacción. Cuando se observa el resultado esperado, sin productos de PCR, esto indica que el cóctel de PCR no estaba contaminado con ADN diana.

- Un control de ADN positivo (muestra de ADN genómico que se sabe que contiene las secuencias transgénicas). La amplificación satisfactoria de este control positivo demuestra que la PCR se realizó bajo condiciones que permiten la amplificación de las secuencias diana.

- Un control de ADN de tipo silvestre. Esta es una PCR en la que el ADN de plantilla proporcionado es ADN genómico preparado a partir de una planta no transgénica. Cuando se observa el resultado esperado, sin amplificación de un producto de PCR transgénico, sino amplificación del producto de PCR endógeno, esto indica que no hay amplificación de fondo transgénica detectable en una muestra de ADN genómico.

3.5. Condiciones de PCR

Se obtuvieron resultados óptimos bajo las siguientes condiciones:

- la mezcla de PCR para reacciones de 25 pl contiene:

2.5 pl de ADN de plantilla

2.5 pl de tampón de amplificación 10x (suministrado por el fabricante con la Taq polimerasa)

0,5 pl de dNTP 10 mM

0,4 pl GHI001 (10 pmoles/pl)

0,4 pl GHI002 (10 pmoles/pl)

0,7 pl GHI058 (10 pmoles/pl)

0,7 pl GHI059 (10 pmoles/pl)

0,1 pl de ADN Taq polimerasa (5 unidades/pl)

agua hasta 25 pl

- El perfil de termociclado que se debe seguir para obtener resultados óptimos es el siguiente:

4 min. a 95 °C

3.6. Análisis de gel de agarosa

Para visualizar de manera óptima los resultados de la PCR, se determinó que se deben aplicar entre 10 y 20 pl de las muestras de PCR en un gel de agarosa al 1,5 % (tampón Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo, separador PHARMACIA de 100 pb).

3.7. Validación de los resultados

Se determinó que los datos de muestras de ADN de plantas transgénicas dentro de una sola serie de PCR y un solo cóctel de PCR no deberían ser aceptables a menos que 1) el control de ADN positivo muestre los productos de PCR esperados (fragmentos transgénicos y endógenos), 2) el control de ADN negativo sea negativo para la amplificación por PCR (sin fragmentos) y 3) el control de ADN de tipo silvestre muestra el resultado esperado (amplificación del fragmento endógeno).

Cuando se sigue el Protocolo de identificación por PCR para EE-GH6 como se describe anteriormente, los carriles que muestran cantidades visibles de los productos de PCR transgénicos y endógenos de los tamaños esperados indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el ADN de plantilla genómica, ha heredado el evento élite EE-GH6. Los carriles que no muestran cantidades visibles de ninguno de los productos de PCR transgénicos y que muestran cantidades visibles del producto de PCR endógeno, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el ADN de plantilla genómico, no comprende el evento élite. Los carriles que no muestran cantidades visibles de los productos de PCR endógenos y transgénicos indican que la calidad y/o cantidad del ADN genómico no permitió generar un producto de PCR. Estas plantas no se pueden clasificar. Se debe repetir la preparación del ADN genómico y se debe realizar una nueva serie de PCR, con los controles apropiados.

3.8. Uso de un protocolo de PCR discriminatorio para identificar EE-GH6

Antes de intentar detectar las incógnitas, se debe realizar una prueba de funcionamiento con todos los controles apropiados. El protocolo desarrollado puede requerir optimización para componentes que pueden diferir entre laboratorios (preparación de ADN de plantilla, Taq ADN polimerasa, calidad de los cebadores, dNTP, termociclador, etc.).

La amplificación de la secuencia endógena juega un papel clave en el protocolo. Uno tiene que alcanzar condiciones de PCR y termociclado que amplifiquen cantidades equimolares tanto de la secuencia endógena como transgénica en una plantilla de ADN genómico transgénico conocido. Siempre que el fragmento endógeno diana no se amplifique o cuando las secuencias diana no se amplifiquen con las mismas intensidades de tinción con bromuro de etidio, según se juzgue por electroforesis en gel de agarosa, puede ser necesaria la optimización de las condiciones de PCR.

Se ensayó material de hojas de un número de plantas de algodón, algunas de las cuales comprendían EE-GH6 de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Se tomaron muestras del evento élite EE-GH6 y del algodón de tipo silvestre como controles positivos y negativos, respectivamente.

La Figura 2 ilustra el resultado obtenido con el protocolo de identificación de PCR de eventos de élite 1 para EE-GH6 en un número de muestras de plantas de algodón. Se encontró que las muestras en los carriles 2 a 5 contenían el evento élite cuando se detecta la banda de 189 pb, mientras que las muestras en los carriles 6 y 7 no comprenden EE-GH6. Los carriles 6 y 7 comprenden otros eventos de élite del algodón (que incluyen plantas que comprenden diferentes genes quiméricos de tolerancia a insectos); el carril 8 representa la muestra de control negativo (agua), y los carriles 1 y 9 representan el marcador de peso molecular (separador de 100 pb).

4. Uso de un fragmento de integración específico como sonda para la detección de material que comprende EE-GH6

Se obtiene un fragmento de integración específico de EE-GH6 mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores específicos GHI058 (SEQ ID No. 3) y GHI059 (SEQ ID No. 4) o mediante síntesis química y se marca. Este fragmento de integración se utiliza como sonda específica para la detección de EE-GH6 en muestras biológicas. El ácido nucleico se extrae de las muestras de acuerdo con procedimientos estándar. A continuación, este ácido nucleico se pone en contacto con la sonda específica bajo condiciones de hibridación que se optimizan para permitir la formación de un híbrido. A continuación, se detecta la formación del híbrido para indicar la presencia de ácido nucleico EE-GH6 en la muestra. Opcionalmente, el ácido nucleico de las muestras se amplifica utilizando los cebadores específicos antes de entrar en contacto con la sonda específica. Alternativamente, el ácido nucleico se marca antes de entrar en contacto con la sonda específica en lugar del fragmento de integración. Opcionalmente, la sonda específica se une a un portador sólido (tal como, pero no limitado a un filtro, una tira o perlas), antes de entrar en contacto con las muestras.

5. Protocolo para la determinación basada en PCR del estado de cigosidad del material vegetal de algodón EE-GH6

5.1. Cebadores

Se diseñaron dos cebadores que reconocen las secuencias de nucleótidos del locus de tipo silvestre antes de la inserción del evento élite, de tal manera que se dirigen entre sí y tienen el sitio de inserción en el medio. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador complementario a las secuencias de ADN forastero y dirigido hacia el ADN flanqueante, permite la amplificación por PCR simultánea del locus EE-GH6 así como del locus wt.

Se encontró que los siguientes cebadores dan resultados particularmente claros y reproducibles en una reacción de PCR de puntuación de cigosidad en el ADN de EE-GH6:

NEL115 5 '-ACT.gAT.ggC.TCA.ACg.gTT.AC-3' (SEQ ID No.: 6) (diana: ADN vegetal corriente arriba de la secuencia flanqueante 5')

DPA286 5'- gAT.CgC.CAT.ggA.gCC.ATT-3' (diana: ADN inserto) (SEQ ID No.: 5) NEL117 5' - AAA.TCA.CAg.gCA.gAg.ggA.Ag-3' (SEQ ID No.: 7)

(diana: ADN vegetal de la secuencia flanqueante 3')

5.2. Fragmentos amplificados

Los fragmentos amplificados esperados en la reacción de PCR son:

Para cepador par GHI065 - GHI066: 451 bp (locus tipo silvestre)

Para cepador par GHI057 - GHI065: 197 bp (locus EE-GH6)

5.3. ADN de plantilla

El ADN de plantilla se preparó a partir de una sección de hoja de acuerdo con Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Cuando se usa ADN preparado con otros procedimientos, se debe realizar una prueba con diferentes cantidades de plantilla. Usualmente 50 ng de ADN de plantilla genómico producen los mejores resultados.

5.4. Controles positivos y negativos asignados

Para evitar falsos positivos o negativos, es aconsejable que se incluyan los siguientes controles positivos y negativos en una serie de PCR:

- Mezcla de control maestro (control negativo de ADN). Esta es una PCR en la que no se agrega ADN a la reacción. Cuando se observa el resultado esperado, sin productos de PCR, esto indica que el cóctel de PCR no estaba contaminado con ADN diana.

- Un control de ADN positivo (muestra de ADN genómico que se sabe que contiene las secuencias transgénicas). La amplificación satisfactoria de este control positivo demuestra que la PCR se realizó bajo condiciones que permiten la amplificación de las secuencias diana.

- Un control de ADN de tipo silvestre. Esta es una PCR en la que el ADN de plantilla proporcionado es ADN genómico preparado a partir de una planta no transgénica. Cuando se observa el resultado esperado, sin amplificación de un producto de PCR transgénico, sino amplificación del producto de PCR endógeno, esto indica que no hay amplificación de fondo transgénica detectable en una muestra de ADN genómico.

5.5. Condiciones de PCR

Se obtuvieron resultados óptimos en las siguientes condiciones:

- la mezcla de PCR para reacciones de 25 pl contiene:

x pl de ADN de plantilla (150 ng)

2,5 pl de tampón de amplificación 10x (suministrado por el fabricante con la Taq polimerasa)

0,5 pl de dNTP 10 mM

0,5 pl NEL115(10pmoles/pl)

0,5 pl NEL117(10pmoles/pl)

0,2 pl DPA286 (10pmoles/pl)

0,1 pl de ADN Taq polimerasa (5 unidades/pl)

agua hasta 25 pl

- el perfil de termociclado que se debe seguir para obtener resultados óptimos es el siguiente:

4 min. a 95 °C

5.6. Análisis de gel de agarosa

Para visualizar de manera óptima los resultados de la PCR, se determinó que se deben aplicar entre 10 y 20 |jl de las muestras de PCR en un gel de agarosa al 1,5 % (tampón Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo, searador PHARMACIA de 100 pb).

5.7. Validación de los resultados

Los datos de muestras de ADN de plantas transgénicas dentro de una única serie de PCR y una única mezcla maestra de PCR no serán aceptables a menos que:

el control positivo muestra los productos de PCR esperados (amplificación de la diana transgénica)

el control de ADN positivo de tipo silvestre muestra el resultado esperado (amplificación de la diana de tipo silvestre)

el control negativo es negativo para la amplificación por PCR (sin fragmentos)

Los carriles que muestran cantidades visibles del producto de PCR transgénico del tamaño esperado y que no muestran cantidades visibles del producto de PCR de tipo silvestre, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó la plantilla de ADN genómico es homocigótica para el casete del gen transgénico.

Los carriles que muestran cantidades visibles de los productos de PCR transgénicos y de tipo silvestre de los tamaños esperados, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el ADN de plantilla genómico, es hemicigóta para el casete del gen transgénico. Los carriles que no muestran cantidades visibles del producto de PCR transgénico y que muestran cantidades visibles del producto de PCR de tipo silvestre, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el ADN de plantillo genómico no ha heredado la secuencia transgénica ensayada y, por lo tanto, es homocigota para el locus de tipo silvestre.

Los carriles que no muestran cantidades visibles de productos de PCR transgénicos y de tipo silvestre, indican que la calidad y/o cantidad del ADN genómico no permitió que se generara un producto de PCR. Estas plantas no se pueden calificar. Se debe repetir la preparación del ADN genómico y se debe realizar una nueva serie de PCR, con los controles apropiados.

5.8. Uso del protocolo de puntuación de cigosidad para la identificación del estado de cigosidad en plantas que contienen EE-GH6.

La Figura 3 ilustra el resultado obtenido con la PCR de puntuación de cigosidad para EE-GH6 en un número de plantas de algodón. Se encontró que las muestras en los carriles 2-3 contenían el fragmento de PCR (197 pb) característico para el evento élite EE-GH6, mientras que las muestras en los carriles 4 a 7 contenían el fragmento característico de la presencia del locus wt. Los carriles 4-6 contenían ambos fragmentos. Por lo tanto, los carriles 2 y 3 contenían EE-GH6 en forma homocigota, los carriles 4 a 6 contenían EE-GH6 en forma hemicigota y el carril 7 contenía el locus wt en forma homocigota (azigoto para EE-GH6). El carril 8 representa la muestra de control negativo (agua) y los carriles 1 y 9 representan el marcador de peso molecular (separador de 100 pb).

6. Introgresión de EE-GH6 en cultivares preferidos

El evento élite EE-GH6 se introduce mediante el retrocruzamiento repetido en cultivares comerciales de algodón tales como, pero no limitados a, FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 y FM958, FM989, FM958, FM832, FM991, FM819, FM800, FM960, FM966, FM981, FM5035, FM5044, FM5045, FM5013, FM5015, FM5017 o FM5024.

Se observa que la introgresión del evento élite en estos cultivares no influye significativamente en ninguna de las características fenotípicas o agronómicas deseables de estos cultivares (sin arrastre de enlazamiento) mientras que

Claims (2)

REIVINDICACIONES

1. Una planta, o célula, parte o semilla de algodón transgénica que controla insectos, comprendiendo cada una en su genoma un evento élite EE-GH6, comprendiendo dicho evento élite EE-GH6 un ADN forastero que comprende una secuencia codificante de un gen cry2Ae modificado operativamente enlazado a un péptido de tránsito de subunidades pequeñas de Rubisco bajo el control de un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y secuencias de nucleótidos que abarcan las regiones de unión entre secuencias de ADN derivadas de plantas y secuencias de ADN forastero que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 1 o SEQ ID 11 y SEQ ID 2; en la que dicho evento élite EE-GH6 está comprendido en la semilla de referencia depositada en la ATCC bajo el número de depósito PTA-8398, en la que la presencia de dicho evento élite EE-GH6 se caracteriza por la resistencia a insectos así como por la tolerancia al glufosinato.

2. ADN genómico de algodón que comprende el evento élite EE-GH6 como se describe en la reivindicación 1.