ES2743789T3 - Líneas de algodón transgénico Cry1F y Cry1Ac y su identificación específica de evento - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar la presencia del evento de algodón cry1F 281-24-236 en una muestra que comprende ADN de algodón, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con al menos un polinucleótido que es diagnóstico para el evento de algodón cry1F 281-24-236, en donde el evento de algodón 281- 24-236 es una secuencia de polinucleótidos de inserto Cry1F que consta de los nucleótidos 2.075-12.748 de SEQ ID NO: 1 y al menos 20 nucleótidos flanqueantes contiguos en ambos lados de dicha secuencia de inserto, en donde los nucleótidos flanqueantes 5' son los restos de nucleótidos 1-2.074 de SEQ ID NO: 1 y los nucleótidos flanqueantes 3' son los restos de nucleótidos 12.749-15.490 de SEQ ID NO: 1.
Description
DESCRIPCIÓN
Líneas de algodón transgénico Cry1F y CrylAc y su identificación específica de evento
Antecedentes de la invención
El algodón es un importante cultivo para la obtención de fibras. Se ha aplicado el cruzamiento y la biotecnología al algodón para mejorar sus rasgos agronómicos y la calidad del producto. Uno de estos rasgos agronómicos es la resistencia a insectos, cuyas ventajas son claramente evidentes. Se han introducido genes que codifican proteínas insecticidas en plantas de algodón. Para mitigar la inquietud de que un tipo conceto de insecto pueda desarrollar resistencia a un único tipo de proteína insecticida, a menudo se desarrollan plantas que producen dos tipos diferentes de proteínas insecticidas. Así, la probabilidad de que un insecto sea capaz hipotéticamente de desarrollar resistencia a dos proteínas insecticidas diferentes es extremadamente baja.
En la técnica se conocen los genes y las proteínas insecticidas Cry1Ac. Véanse, por ejemplo, las patentes de EEUU núms. 6.114.138; 5.710.020; 6.251.656; y 6.229.004. En la técnica también se conocen los genes y las proteínas insecticidas Cry1F. Veánse, por ejemplo, las patentes de EEUU núms.5.188.960; 5.691.308; 6.096.708; y 6.573.240. La expresión de genes extraños en plantas se ve influida por el lugar en que se inserta el gen extraño en el cromosoma. Esto puede ser debido a la estructura de la cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o a la proximidad de elementos de regulación transcripcional (por ejemplo, potenciadores) cercanos al sitio de integración (Weising et al., Ann. Rev. Genet., 22:421-477, 1988). Por ejemplo, el mismo gen en el mismo tipo de planta transgénica (u otro organismo) puede mostrar una amplia variación en el nivel de expresión entre diferentes eventos. También pueden existir diferencias en los patrones de expresión espacial o temporal. Por ejemplo, las diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos tejidos vegetales pueden no corresponderse con los patrones esperados a partir de los elementos reguladores transcripcionales presentes en la construcción del gen introducido.
Así, es necesario crear y seleccionar un gran número de eventos para identificar un evento que exprese óptimamente un gen de interés introducido. Para fines comerciales, es habitual producir de cientos a miles de eventos diferentes y seleccionar los eventos para un único evento que tenga los patrones y niveles de expresión del transgén deseados. Un evento que tenga los patrones y niveles de expresión del transgén deseados es útil para introgresar el transgén en otros entornos genéticos mediante cruzamiento exogámico sexual empleando métodos de cruzamiento convencionales. La progenie de estos cruzamientos mantiene las características de expresión del transgén del transformante original. Esta estrategia se emplea para asegurar la expresión fiable de genes en una serie de variedades que están bien adaptadas a las condiciones de crecimiento locales.
Sería ventajoso poder detectar la presencia de un evento concreto para determinar si la progenie de un cruzamiento sexual contiene un transgén de interés. Además, un método para detectar un evento concreto sería útil para cumplir con las normas que requieren de una aprobación antes de la comercialización y el etiquetado de alimentos derivados de plantas de cultivos recombinantes, por ejemplo. Es posible detectar la presencia de un transgén mediante cualquier método de detección de ácidos nucleicos conocido, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación de ADN empleando sondas de ácidos nucleicos. Estos métodos de detección general se centran en elementos genéticos empleados con frecuencia, tales como promotores, terminadores, genes marcadores y similares. Como resultado, estos métodos pueden no ser útiles para discriminar entre diferentes eventos, en particular los producidos empleando la misma construcción de ADN, a menos que se conozca la secuencia del ADN cromosómico adyacente al ADN insertado (“ADN flanqueante”). Un ensayo de PCR específico de evento se analiza, por ejemplo, en Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent., 64/5b:459462, 1999). Esto se relaciona con la identificación del evento de soja tolerante al glifosato 40-3-2 mediante PCR empleando un conjunto de cebadores que abarca la unión entre el inserto y el ADN flanqueante, más concretamente, un cebador incluye una secuencia del inserto y un segundo cebador incluye una secuencia del ADN flanqueante.
Las solicitudes de patente de EEUU 20020120964 A1 y 20040009504 A1 se refieren al evento del algodón PV-GHGT07(1445) y a composiciones y métodos para su detección. El documento WO 02/100163 se refiere al evento del algodón MONI5985 y a composiciones y métodos para su detección. El documento WO 2004/011601 se refiere a plantas con el evento del maíz MON863 y a composiciones y métodos para su detección. El documento WO 2004/072235 se refiere al evento del algodón MON 88913 y a composiciones y métodos para su detección.
Sin embargo, hasta la fecha no se conocen específicamente procedimientos y materiales que puedan utilizarse para identificar específicamente el algodón apilado Cry1F y/o Cry1Ac, según se analiza a continuación.
Breve sumario de la invención
Esta invención proporciona ensayos para detectar la presencia de uno o más de los presentes eventos en una muestra. La presente invención proporciona ADN y ensayos relacionados para detectar la presencia de ciertos eventos de resistencia a insectos en el algodón. Los ensayos se basan en las secuencias de ADN de construcciones recombinantes insertadas en el genoma del algodón y de las secuencias genómicas que flanquean los sitios de inserción. También se proporcionan kits y condiciones útiles para realizar los ensayos.
Así, la presente invención se refiere, en parte, al análisis de las secuencias de ADN de un inserto crylF completo, y opcionalmente insertos cry1Ac completos, y sus regiones limítrofes (en líneas de algodón transgénico). Estas secuencias son exclusivas. Basándose en estas secuencias de insertos y limítrofes, se generaron cebadores específicos de evento. Un análisis de PCR demuestra que estos eventos pueden identificarse mediante el análisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores específicos de evento. Así, pueden emplearse estos y otros procedimientos relacionados para identificar con exclusividad líneas de algodón que comprenden uno o más eventos de la presente invención.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 ilustra el transgén cry1F insertado y las secuencias flanqueantes para el evento del algodón 281-24-236. Esta figura también muestra los amplicones y los cebadores descritos en la presente.
La figura 2 ilustra el transgén cry1Ac insertado y las secuencias flanqueantes para el evento del algodón 3006-210 23. Esta figura también muestra los amplicones y los cebadores descritos en la presente.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO:1 es la secuencia de ADN para el inserto del evento cry1F de 281-24-236 y sus secuencias limítrofes. SEQ ID NO:2 es la secuencia de ADN para el inserto del evento cry1Ac de 3006-210-23 y sus secuencias limítrofes. SEQ ID NO:3 es la secuencia del cebador directo “281-14” empleado con el cebador inverso “281-15” para amplificar un amplicón de 603 pb que abarca la unión 5' entre las regiones flanqueantes y del inserto del evento cry1F de 281 24-236.
SEQ ID NO:4 es la secuencia del cebador inverso “281-15” empleado con el cebador directo “281-14” para amplificar un amplicón de 603 pb que abarca la unión 5' entre las regiones flanqueantes y del inserto del evento cry1F de 281 24-236.
SEQ ID NO:5 es la secuencia de 603 pb del amplicón producido empleando los cebadores de SEQ ID NO:3 y 4. SEQ ID NO:6 es la secuencia del cebador directo “281-9” empleado con el cebador inverso “281-10” para amplificar un amplicón de 562 pb que abarca la unión 3' entre las regiones flanqueantes y del inserto del evento cry1F de 281 24-236.
SEQ ID NO:7 es la secuencia del cebador inverso “281-10” empleado con el cebador directo “281-9” para amplificar un amplicón de 562 pb que abarca la unión 3' entre las regiones flanqueantes y del inserto del evento cry1F de 281 24-236.
SEQ ID NO:8 es la secuencia de 562 pb del amplicón producido empleando los cebadores de SEQ ID NO:6 y 7.
SEQ ID NO:9 es la secuencia del cebador directo “3006-20” empleado con el cebador inverso “3006-22” para amplificar un amplicón de 614 pb que abarca la unión 5' entre las regiones flanqueantes y del inserto del evento cry1Ac de 3006-210-23.
SEQ ID NO:10 es la secuencia del cebador inverso “3006-22” empleado con el cebador directo “3006-20” para amplificar un amplicón de 614 pb que abarca la unión 5' entre las regiones flanqueantes y del inserto del evento cry1Ac de 3006-210-23.
SEQ ID NO:11 es la secuencia de 614 pb del amplicón producido empleando los cebadores de SEQ ID NO:9 y 10.
SEQ ID NO:12 es la secuencia del cebador directo “3006-9” empleado con el cebador inverso “3006-12” para amplificar un amplicón de 662 pb que abarca la unión 3' entre las regiones flanqueantes y del inserto del evento cry1Ac de 3006-210-23.
SEQ ID NO:13 es la secuencia del cebador inverso “3006-12” empleado con el cebador directo “3006-9” para amplificar un amplicón de 662 pb que abarca la unión 3' entre las regiones flanqueantes y del inserto del evento cry1Ac de 3006-210-23.
SEQ ID NO:14 es la secuencia de 662 pb del amplicón producido empleando los cebadores de SEQ ID NO:12 y 13. SEQ ID NO:15 es un segmento de ADN genómico del algodón para el evento de 281-24-236 (faltan 53 bases).
SEQ ID NO:16 es un segmento de ADN genómico del algodón para el evento de 3006-210-23 (faltan 16 bases).
Descripción detallada de la invención
Se describen aquí el cruzamiento de plantas y la protección de plantas frente a insectos. Más concretamente, nuevos eventos de transformación en plantas de algodón (por ejemplo, Gossypium hirsutum y Gossypium
barbadense), que comprenden una o más secuencias polinucleotídicas, según se describen en la presente, insertadas en un sitio o sitios específicos dentro del genoma de una célula de algodón. Dichas secuencias polinucleotídicas pueden codificar las proteínas inhibidoras de insectos lepidópteros Cry1F y Cry1Ac “apiladas”. Sin embargo, también se describen aquí plantas que presentan únicos eventos Cry1F o Cry1Ac.
La presente invención proporciona ensayos para detectar la presencia de uno o más de los presentes eventos en una muestra. Los aspectos de la presente invención incluyen métodos para diseñar y/o producir cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos de diagnóstico ejemplificadas o sugeridas en la presente, en particular las que se basan, total o parcialmente, en las presentes secuencias flanqueantes.
De modo más específico, la presente invención se refiere, en parte, a un método para detectar dos eventos del algodón transgénico (cry1F de 281-24-236 y cry1Ac de 3006-210-23), este inserto cry1F, y opcionalmente estos insertos de cry1Ac, y/o sus regiones limítrofes. Las líneas de plantas pueden detectarse empleando las secuencias descritas y sugeridas en la presente.
En realizaciones preferidas, el método se refiere a líneas de algodón resistentes a insectos y a su identificación, que produce dos proteínas insecticidas “apiladas” conocidas como Cry1F y Cry1Ac (el evento cry1F de 281-24-236 y el evento cry1Ac de 3006-210-23). Sin embargo, las plantas pueden comprender el evento Cry1F o, preferiblemente, ambos eventos analizados en la presente.
Tal como se aludió anteriormente en la sección de antecedentes, la introducción y la integración de un transgén en el genoma de una planta implica algunos eventos aleatorios (de ahí el nombre “evento” para una inserción concreta que se expresa). Es decir, con muchas técnicas de transformación, tales como la transformación con Agrobacterium, la “pistola de genes”, y WHISKERS, es imposible predecir dónde se va a insertar el transgén en el genoma. Así, la identificación del ADN genómico vegetal flanqueante en ambos lados del inserto puede ser importante para identificar una planta que presenta un evento de inserción concreto. Por ejemplo, pueden diseñarse cebadores de PCR que generen un amplicón de PCR que abarque la región de unión del inserto y el genoma del hospedante. Este amplicón de PCR puede emplearse para identificar un tipo exclusivo o diferenciado de evento de inserción.
Puesto que los “eventos” son eventos aleatorios y, en general, no pueden duplicarse, como parte de esta descripción se han depositado al menos 2500 semillas de una línea de algodón, que comprende el evento cry1F de 281-24-236 y el evento cry1Ac de 3006-210-23, y están disponibles al público sin restricciones (pero sometidas a derechos de patente), en the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. 20852. El depósito se ha denominado ATCC n.° de depósito PTA-6233. El depósito se mantendrá sin restricciones en el depósito del ATCC, que es un depósito público, durante un periodo de 30 años, o cinco años después de la petición más reciente, o durante la vida efectiva de la patente, lo que abarque más tiempo, y será reemplazado si se convierte en no viable durante ese periodo.
Evidentemente, pueden cultivarse plantas de algodón a partir de estas semillas. La presente invención también se refiere a secuencias de ADN contenidas en estas plantas de algodón que son útiles para detectar estas plantas y su progenie. Los métodos de detección y kits de la presente invención pueden estar dirigidos a identificar uno, dos o incluso los tres eventos, dependiendo del objetivo final del ensayo.
En la presente se proporcionan definiciones y ejemplos para ayudar a describir la presente invención y para guiar a los expertos en la técnica para practicar la invención. A menos que se indique lo contrario, los términos y las expresiones deben entenderse según su utilización convencional por los expertos en la técnica pertinente. Se emplea la nomenclatura para las bases de ADN indicada en 37 CFR §1.822.
Un “evento” transgénico se produce por medio de la transformación de células vegetales con ADN heterólogo, es decir, una construcción de ácido nucleico que incluye un transgén de interés, la regeneración de una población de plantas que resultan de la inserción del transgén en el genoma de la planta, y la selección de una planta concreta que se caracteriza por la inserción en una localización genómica concreta. El término “evento” se refiere al transformante original y a la progenie del transformante que incluyen el ADN heterólogo. El término “evento” también se refiere a la progenie producida por el cruzamiento exogámico sexual entre el transformante y otra variedad que incluya el ADN genómico/del transgén. Incluso después de retrocruzamientos repetidos hasta un progenitor recurrente, el ADN del transgén insertado y el ADN genómico flanqueante (ADN genómico/del transgén) del progenitor transformado sigue estando presente en la progenie del cruzamiento en la misma localización cromosómica. El termino “evento” también se refiere a ADN del transformante original y su progenie que comprende el ADN insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado que se espera que va a transferirse a una progenie que recibe el ADN insertado que incluye el transgén de interés como resultado de un cruzamiento sexual de una línea parental que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y la progenie que resulta de la autofertilización) y una línea parental que no contiene el ADN insertado.
Una “secuencia de unión” abarca el punto en que el ADN insertado en el genoma está unido al ADN del genoma nativo del algodón que flanquea el sitio de inserción, siendo suficiente la identificación o la detección de una u otra de las secuencias de unión en el material genético de una planta para diagnosticar el evento. Se incluyen las secuencias de ADN que abarcan las inserciones en los eventos del algodón descritos en la presente y longitudes
similares del ADN flanqueante. En la presente se proporcionan ejemplos específicos de estas secuencias de diagnóstico; sin embargo, otras secuencias que se solapan con las uniones de las inserciones, o las uniones de las inserciones y la secuencia genómica, también son diagnósticas y pueden utilizarse según la presente invención. La presente invención se refiere a la identificación de estas secuencias flanqueantes, de unión y del inserto. Los amplicones y cebadores PCR relacionados están incluidos en la presente invención. Según la presente invención, pueden emplearse métodos de análisis de PCR que emplean amplicones que abarcan el a Dn insertado y sus límites (de cry1F de 281-24-236 y opcionalmente cry1Ac de 3006-210-23) para detectar o identificar líneas o variedades de algodón transgénico comercializadas derivadas de las presentes líneas de algodón transgénico patentadas.
Las secuencias completas de cada uno de estos insertos, junto con las respectivas secuencias flanqueantes, se proporcionan en la presente como SEQ ID NO:1 (cry1F de 281-24-236) y SEQ ID NO:2 (cry1Ac de 3006-210-23). La tabla I proporciona las coordenadas de las secuencias del inserto y flanqueantes para estos eventos.
Tabla I
Estos eventos de inserción, y otros componentes de estos, se ilustran más a fondo en las figuras 1 y 2. Estas secuencias (en particular, las secuencias flanqueantes) son exclusivas. Basándose en estas secuencias del inserto y limítrofes, se generaron cebadores específicos de evento. Un análisis de PCR demostró que estas líneas de algodón pueden identificarse en diferentes genotipos de algodón mediante el análisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores específicos de evento. Por tanto, estos y otros procedimientos relacionados pueden utilizarse para identificar estas líneas de algodón. Las secuencias identificadas en la presente son exclusivas. Por ejemplo, las selecciones con BLAST en las bases de datos de GENBANK no revelaron ninguna homología significativa entre las secuencias limítrofes clonadas y las secuencias en la base de datos.
Las técnicas de detección de la presente invención son especialmente útiles junto con el cruzamiento de plantas, para determinar cuáles son las plantas de la progenie que comprenden un evento concreto, después de que una planta progenitora que comprende un evento de interés se cruce con otra línea de plantas para intentar impartir uno o más rasgos de interés adicionales a la progenie. Estos métodos de análisis de PCR aprovechan los programas de cruzamiento del algodón, así como el control de calidad, en especial para semillas de algodón transgénicas comercializadas. Ahora también se pueden fabricar y utilizar kits de detección de PCR para estas líneas de algodón transgénico. Esto también puede beneficiar el registro del producto y la gestión ambiental del producto.
Además, las secuencias de algodón flanqueantes pueden utilizarse para identificar específicamente la localización genómica de cada inserto. Esta información puede emplearse para fabricar sistemas de marcadores moleculares específicos para cada evento. Estos pueden utilizarse para acelerar estrategias de cruzamiento y para establecer datos de vinculaciones.
Además, la información de las secuencias flanqueantes puede emplearse para estudiar y caracterizar procesos de integración de transgenes, características del sitio de integración genómico, clasificaciones de eventos, estabilidad de los transgenes y sus secuencias flanqueantes, y expresión de genes (en especial relacionados con el silenciamiento de genes, patrones de metilación de transgenes, efectos de posición, y elementos relacionados con la expresión potenciales, tales como MARS (regiones de unión a la matriz) y similares).
Tal como se emplea en la presente, el término “algodón” significa Gossypium hirsutum, e incluye todas las variedades de plantas que pueden cruzarse con el algodón, que incluyen Gossypium barbadense.
Las moléculas de ADN de la presente invención pueden emplearse como marcadores moleculares en un método de cruzamiento asistido por marcadores (MAB). Las moléculas de ADN de la presente invención pueden utilizarse en métodos (tales como marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, SNP, y SSR) que identifican rasgos útiles desde el punto de vista agronómico que estén genéticamente conectados, tal como se conoce en la técnica. El rasgo de resistencia a insectos puede ser rastreado en la progenie de un cruzamiento con una planta de algodón de la presente invención (o su progenie y cualquier otra variedad o cultivar de algodón) empleando los métodos MAB. Las moléculas de ADN son marcadores para este rasgo, y pueden emplearse los métodos MAB, que son muy conocidos en la técnica, para rastrear el rasgo o rasgos de resistencia a insectos en plantas de algodón, para las cuales al menos una línea de algodón de la presente invención, o su progenie, ha sido un progenitor o ancestro. Los
métodos de la presente invención pueden emplearse para identificar cualquier variedad de algodón que presente el evento de resistencia a insectos de la línea de algodón 281-24-236 (crylF) y opcionalmente 3006-210-23 (cry1Ac). Una planta preferida, o una semilla, relacionada con la presente invención comprende en su genoma al menos una de las secuencias del inserto, según se identifica en la tabla I, junto con al menos 20-500 o más nucleótidos flanqueantes contiguos en ambos lados del inserto, según se identifica en la tabla I. A menos que se indique lo contrario, “el evento cry1Ac del algodón 3006-210-23” se refiere a un ADN de SEQ ID NO:1 que incluye el ADN heterólogo insertado en el transformante original (nucleótidos 2075-12.748 de SEQ ID NO:1) y todas o parte de ambas secuencias genómicas flanqueantes de SEQ ID NO:1 (restos nucleótidos 1-2074 y 12.749-15.490) inmediatamente adyacentes al ADN insertado que se espera que se transfiera a la progenie, que recibe el ADN insertado como resultado de un cruzamiento sexual de una línea parental que incluye el evento. De modo similar, a menos que se indique lo contrario, “el evento cry1Ac del algodón 3006-210-23” se refiere a un ADN de SEQ ID NO:2 que incluye el ADN heterólogo insertado en el transformante original (nucleótidos 528-8900 de SEQ ID NO:2) y todas o parte de ambas secuencias genómicas flanqueantes de SEQ ID NO:2 (restos nucleótidos 1-527 y 8901 93821) inmediatamente adyacentes al ADN insertado que se espera que se transfiera a la progenie, que recibe el ADN insertado como resultado de un cruzamiento sexual de una línea parental que incluye el evento.
Las manipulaciones (tales como mutaciones, transfecciones posteriores, y cruzamientos posteriores) de plantas o semillas, o sus partes, pueden conducir a la creación de lo que se puede denominar variedades “fundamentalmente derivadas”. The International Union for the Protection of New Varieties of Plantas (UPOV) ha proporcionado las siguientes directrices para determinar si una variedad se ha derivado fundamentalmente de una variedad protegida:
[A] Se considera que una variedad se deriva fundamentalmente de otra variedad (“la variedad inicial”) cuando: (i) se deriva predominantemente de la variedad inicial, o de una variedad que, en sí misma, se deriva predominantemente de la variedad inicial, pero mantiene la expresión de las características esenciales que surgen del genotipo o combinación de genotipos de la variedad inicial;
(ii) es claramente distinguible de la variedad inicial; y
(iii) excepto por las diferencias que resultan del acto de la derivación, se ajusta a la variedad inicial en la expresión de las características esenciales que surgen del genotipo o combinación de genotipos de la variedad inicial.
UPOV, 6a reunión con organizaciones internacionales, Ginebra, 30 de octubre, 1992, documento preparado por la Oficina de la Unión.
Tal como se emplea en la presente, una “línea” es un grupo de plantas que muestran poca o ninguna variación genética entre individuos para al menos un rasgo. Estas líneas pueden crearse mediante varias generaciones de autopolinización y selección, o mediante propagación vegetativa a partir de un único progenitor empleando técnicas de cultivos de tejidos o células.
Tal como se emplea en la presente, los términos “cultivar” y “variedad” son sinónimos y se refieren a una línea que se emplea para la producción comercial.
“Estabilidad” o “estable” significa que, con respecto a un componente dado, el componente se mantiene de generación en generación y, preferiblemente, al menos tres generaciones sustancialmente al mismo nivel, por ejemplo, preferiblemente 15%, más preferiblemente 10%, lo más preferiblemente ±5%. La estabilidad puede verse afectada por la temperatura, la localización, el estrés y el momento de la plantación. La comparación de las posteriores generaciones en condiciones de campo debería producir el componente de una manera similar.
La “utilidad comercial” se define como que la planta tiene buen vigor y alta fertilidad, de modo que el cultivo puede ser producido por agricultores empleando un equipo agrícola convencional, y el aceite puede extraerse de las semillas con los compuestos descritos empleando un equipo de prensado y extracción convencional. Para que sea comercialmente útil, el rendimiento, según se mide mediante el peso de la semilla, el contenido en aceite, y el aceite total producido por hacer, estará dentro del 15% del rendimiento medio de una variedad de canola comercial comparable sin los rasgos de valor de calidad superior, que se cultive en la misma región.
“Agronómicamente elitaria” significa que una línea tiene características agronómicas deseables, tales como rendimiento, madurez, resistencia a enfermedades, y similares, además de la resistencia a insectos debida al evento o eventos de la presente.
Tal como reconocerán los expertos en la técnica a la luz de esta descripción, los kits de detección incluyen sondas y/o cebadores dirigidos a y/o que comprenden “secuencias de unión” o “secuencias de transición” (en las que la secuencia flanqueante genómica del algodón se une con la secuencia del inserto). Por ejemplo, esto incluye una sonda, un cebador o un amplicón polinucleotídico que comprende una secuencia que incluye los restos 2074-2075 o 12.748-12.749 de SEQ ID NO:1, y opcionalmente los restos 527-528 o 8.900-8.901 de SEQ ID NO:2, según se indica en la tabla I. Para que sean diagnósticos para estos eventos concretos, los “cebadores de unión” preferidos
deben incluir al menos aproximadamente 15 restos e la secuencia flanqueante adyacente y al menos aproximadamente 15 restos de la secuencia del inserto adyacente. Con esta disposición, puede emplearse otro cebador en la región flanqueante o en la región del inserto para generar un amplicón detectable que indique la presencia de un evento de la presente invención. Sin embargo, en realizaciones preferidas, un cebador se une a la región flanqueante y otro se une en el inserto, y estos cebadores pueden emplearse para generar un amplicón que abarque (e incluya) una secuencia de unión, según se indicó anteriormente.
Los expertos en la técnica también reconocerán que pueden diseñarse cebadores y sondas para hibridarse, bajo una serie de condiciones de hibridación y/o PCR convencionales, con un segmento de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y sus complementos, en los que el cebador y la sonda no son perfectamente complementarios con la secuencia ejemplificada. Es decir, puede tolerarse algún grado de desapareamiento. Para un cebador de aproximadamente 20 nucleótidos, por ejemplo, generalmente no es necesario que uno o dos o unos cuantos nucleótidos se unan a la hebra opuesta si la base desapareada es interna o está en el extremo del cebador opuesto al amplicón. A continuación se proporcionan diversas condiciones de hibridación apropiadas. También pueden utilizarse análogos de nucleótidos sintéticos, tales como inosina, en las sondas. También pueden emplearse sondas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA), así como sondas de ADN y ARN. Lo importante es que dichas sondas y cebadores sean diagnósticas (sean capaces de identificar y distinguir de forma exclusiva) de la presencia de un evento de la presente invención.
También debe advertirse que pueden producirse errores en la amplificación con PCR que pueden producir pequeños errores de secuenciación, por ejemplo. Es decir, a menos que se indique lo contrario, las secuencias listadas en la presente se determinaron generando amplicones largos a partir de ADN genómicos de algodón, y después clonando y secuenciando los amplicones. No es raro encontrar ligeras diferencias y pequeñas discrepancias en las secuencias generadas y determinadas de esta manera, debido a las muchas rondas de amplificación que son necesarias para generar los amplicones suficientes para la secuenciación a partir de ADN genómico. Por ejemplo, se indican las siguientes diferencias entre las secuencias determinadas de los ADN flanqueantes del evento y los correspondientes ADN conocidos/de tipo salvaje/genómicos. En el flanco 50 para el presente evento cry1F, se determinó que el resto 2037 de SEQ ID NO: 1 se lista como “G”, mientras que el correspondiente resto del locus de 281-24-236 de la secuencia genómica conocida es “A” (R puede emplearse en una secuencia consenso, según las convenciones de la IUPAC-IUB convencionales). En el flanco 3' de este evento, el resto 12.781 de SEQ ID NO:1 se lista en la presente como T, mientras que en la secuencia genómica publicada se proporciona C en la correspondiente localización (Y es el código consenso). La posición 12.811 de SEQ ID NO:1 es C, mientras que se proporciona T para el genoma (Y sería el consenso). La posición 12.866 se lista como C en SEQ ID NO:1, mientras que aparece T en el genoma (Y es el consenso). La posición 12.882 se lista como G en SEQ ID NO:1, mientras que aparece A en el genoma (R es el consenso). La posición 12.918 se lista como A en SEQ ID NO:1, mientras que aparece G en el genoma (R es el consenso). El resto 13.129 se lista como G en SEQ ID NO:1, mientras que aparece A en el genoma (R es el consenso). El resto 13.222 se lista como C en SEQ ID NO:1, mientras que aparece T en la secuencia genómica (Y es el consenso). En la posición 13.441 en SEQ ID NO:1 aparece T, mientras que no existe un resto correspondiente en el listado genómico. Así, esta aparente inserción desplazaría cadena abajo la numeración de SEQ ID NO:1 en consecuencia, comparado con la secuencia genómica. Los expertos en la técnica deberían reconocer y advertir que cualquier ajuste necesario debido a este tipo de errores de secuenciación o discrepancias comunes está dentro del alcance de la presente invención.
También aparecen diferencias similares en el flanco 5' para el presente evento cry1A. En las posiciones 149, 153, 159, 165 y 244 de SEQ ID NO:2 se listan los siguientes restos, respectivamente: C, G, C, C, y C. En la secuencia genómica en el locus de 3006-210-23 aparecen los siguientes restos, respectivamente, en las correspondientes localizaciones: A, A, A, A, y A. Los códigos consenso para estas sustituciones son, respectivamente: M, R, M, M, y M. Pueden realizarse ajustes en consecuencia en las sondas y los cebadores, y las correspondientes diferencias pueden notarse en los amplicones que abarcan o incluyen cualquiera de los restos anteriores.
También debe advertirse que no es raro que una parte de la secuencia genómica se delecione cuando una secuencia se inserta durante la creación de un evento. Este es el caso para ambos eventos de la presente invención. Es decir, SEQ ID NO:1 proporciona un segmento de 53 bases de ADN genómico del algodón para el evento de 281-24-236 que se deleciona durante la inserción. Este “segmento interior” aparece entre los restos 2074 y 12.749 de SEQ ID NO:1 en el genoma del algodón no transformado. De modo similar, SEQ ID NO:2 proporciona un segmento de 16 bases del ADN genómico del algodón para el evento de 3006-210-23 que se deleciona durante la inserción. Este “segmento interior” aparece entre los restos 527 y 8.901 de SEQ ID NO:2 en el genoma del algodón no transformado.
Tal como se ilustra en las figuras 1 y 2, los componentes de cada uno de los “insertos” son los siguientes. Las moléculas de ADN del elemento genético del transgén contenidas en el presente evento Cry1F de 281-24-236 consisten en el promotor 1 de ubiquitina de maíz, conectado operablemente con fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT) de Streptomyces viridochromogenes, conectado operablemente con las secuencias de poliadenilación ORF25 (Baker et al., Plant Molecular Biology, 2:335-350, 1983); el promotor quimérico [(4OCS)8MAS] que contiene un promotor de manopinas sintasa parcialmente delecionado con 4 elementos potenciadores del promotor de octopina sintasa, conectado operablemente con el Cry1F(synpro) de Bacillus thuringiensis var. aizawai, conectado operablemente con las secuencias de poliadenilación ORF25 (Baker et al., Plant Molecular Biology, 2:335-350,
1983); y el promotor 1 de ubiquitina de maíz no conectado operablemente con una secuencia pat parcial. Las secuencias polinucleotídicas del ADN, o fragmentos de estos componentes, pueden emplearse como cebadores o sondas de ADN en los métodos de la presente invención.
Las moléculas de ADN del elemento genético del transgén contenidas en el presente evento Cry1Ac de 3006-210-23 consisten en el promotor (4OCS)8MAS conectado operablemente con PAT (según se describió anteriormente), conectado operablemente con ORF25; y el promotor 1 de ubiquitina de maíz conectado operablemente con Cry1Ac (synpro) de Bacillus thuringiensis var. kurstaki, conectado operablemente con las secuencias de poliadenilación ORF25. Las secuencias polinucleotídicas del ADN de estos componentes, o sus fragmentos, pueden emplearse como cebadores o sondas de ADN en los métodos de la presente invención.
En algunas realizaciones de la invención, se proporcionan composiciones y métodos para detectar la presencia de la región de inserción del transgén/genómica en plantas y semillas y similares, en una planta de algodón diseñada con WIDESTRIKE que comprende el evento Cry1F del algodón 281-24-236 y el evento Cry1Ac del algodón 3006-210 23. Se proporcionan secuencias de ADN que comprenden al menos un secuencia de unión de la región de inserción del transgén/genómica proporcionada en la presente en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, sus segmentos y complementos de las secuencias ejemplificadas y cualquiera de sus segmentos. La secuencia de unión de la región de inserción abarca la unión entre el ADN heterólogo insertado en el genoma y el ADN de la célula de algodón que flanquea el sitio de inserción. Esta secuencia es diagnóstica para uno o más de los eventos indicados.
Basándose en estas secuencias del inserto y limítrofes, se generaron cebadores específicos de evento. Un análisis de PCR demostró que estas líneas de algodón (Cry1F de 281-24-236 y Cry1Ac de 3006-210-23) pueden identificarse en diferentes genotipos de algodón mediante el análisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores específicos de evento. Estos y otros procedimientos relacionados pueden emplearse para identificar exclusivamente estas líneas de algodón. Por tanto, los amplicones de PCR derivados de estas parejas de cebadores son exclusivos y pueden emplearse para identificar estas líneas de algodón.
En algunas realizaciones, las secuencias de ADN que comprenden al menos una de las nuevas regiones de inserción genómica/del transgén son un aspecto de esta invención. Se incluyen secuencias de ADN que comprenden una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia del inserto del transgén y una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia genómica del algodón procedente de una o más de las tres plantas de algodón mencionadas anteriormente y/o secuencias que son útiles como secuencias de cebadores para la producción de un producto de amplicón diagnóstico para una o más de estas plantas de algodón.
Realizaciones relacionadas se refieren a secuencias de ADN que comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más nucleótidos contiguos de una porción del transgén de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, o sus complementos, y una longitud similar de una secuencia de ADN de algodón flanqueante de estas secuencias, o sus complementos. Estas secuencias son útiles como cebadores de ADN en métodos de amplificación del ADN. Los amplicones producidos empleando estos cebadores son diagnósticos para cualquiera de los eventos del algodón indicados en la presente.
A continuación aparece una tabla que resume algunas realizaciones específicas de la presente invención.
Tabla II. Lista de cebadores y sus secuencias empleados en la amplificación por PCR específica de evento
Esta invención detecta la presencia de ADN en una muestra, que se corresponde con al menos los eventos Cry1Fdel algodón indicados en la presente. Estos métodos pueden comprender: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un conjunto de cebadores que, cuando se emplea en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con un ADN procedente de al menos uno de estos eventos del algodón, produce un amplicón que es diagnóstico para dicho evento o eventos; (b) realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos,
produciendo con ello el amplicón; y (c) detectar el amplicón.
Otros métodos de detección incluyen detectar la presencia de un ADN en una muestra, que se corresponde con al menos los eventos Cry1F, en el que dicho método comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con el ADN procedente de al menos uno de dichos eventos del algodón, y que no se hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con una planta de algodón control (ADN sin el evento de interés); (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación rigurosas; y (c) detectar la hibridación de la sonda con el ADN.
También se consideran métodos para determinar la cigosidad de la progenie de un cruzamiento con uno cualquiera (o más) de dichos tres eventos. Dichos métodos pueden comprender poner en contacto una muestra, que comprende ADN de algodón, con un conjunto de cebadores de la presente invención. Dichos cebadores, cuando se emplean en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con el ADN genómico procedente de al menos uno de dichos eventos del algodón, produce un primer amplicón que es diagnóstico para al menos uno de dichos eventos del algodón. Estos métodos comprenden también realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, produciendo con ello el primer amplicón; detectar el primer amplicón; y poner en contacto la muestra que comprende ADN de algodón con dicho conjunto de cebadores (dicho conjunto de cebadores, cuando se emplea en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico procedente de plantas de algodón, produce un segundo amplicón que comprende el ADN genómico del algodón nativo homólogo con la región genómica del algodón de una inserción del transgén identificada como uno de dichos eventos del algodón); y realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, produciendo con ello el segundo amplicón. Los métodos comprenden también detectar el segundo amplicón, y comparar el primer y el segundo amplicón en una muestra, en la que la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigótica para la inserción del transgén.
Pueden desarrollarse kits de detección de ADN empleando las composiciones descritas en la presente y métodos bien conocidos en la técnica de la detección de ADN. Los kits son útiles para la identificación del ADN del presente evento del algodón en una muestra, y pueden aplicarse a métodos para el cruzamiento de plantas de algodón que contienen este ADN. Los kits contienen secuencias de ADN homólogas o complementarias con los amplicones, por ejemplo, los descritos en la presente, o con secuencias de ADN homólogas o complementarias con el ADN contenido en los elementos genéticos del transgén de los presentes eventos. Estas secuencias de ADN pueden utilizarse en reacciones de amplificación de ADN o como sondas en un método de hibridación de ADN. Los kits también pueden contener los reactivos y los materiales necesarios para realizar el método de detección.
Una “sonda” es una molécula de ácido nucleico aislada a la cual está unido un marcador detectable o una molécula indicadora convencional (tal como un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o enzima). Esta sonda es complementaria con una hebra de un ácido nucleico diana, en el caso de la presente invención con una hebra del ADN genómico procedente de uno de dichos eventos del algodón, tanto de una planta de algodón como de una muestra que incluye ADN del evento. Las sondas de acuerdo con la presente invención incluyen no solo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos, sino también poliamidas y otros materiales de sondas que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y que pueden utilizarse para detectar la presencia de esa secuencia de ADN diana.
Los “cebadores” son ácidos nucleicos aislados que se asocian a una hebra del ADN diana complementaria mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN diana, y después se extienden a lo largo de la hebra del ADN diana por medio de una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Las parejas de cebadores de la presente invención se remiten a su uso para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana, por ejemplo, mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos convencionales.
Las sondas y los cebadores generalmente tienen una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18¡, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 , 66, 67, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 82, 83, 84, 85 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154.
155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177.
178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 219, 220, 221 222, 223 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 242, 243, 244 245, 246 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264 265, 266, 267 268, 269 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287 288, 289, 290 291, 292 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310 311, 312, 313 314, 315.
316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 334, 335, 336 337, 338 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356 357, 358, 359 360, 361 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379 380, 381, 382 383, 384 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402 403, 404, 405 406, 407 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425 426, 427, 428 429, 430
431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491,492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, o 500 polinucleótidos o más. Estas sondas y cebadores se hibridan específicamente con una secuencia diana bajo condiciones de hibridación de alta rigurosidad. Preferiblemente, las sondas y los cebadores según la presente invención tienen una similitud de secuencia completa con la secuencia diana, aunque pueden diseñarse sondas que se diferencian de la secuencia diana y que conservan la capacidad para hibridarse con las secuencias diana mediante métodos convencionales.
Los métodos para preparar y emplear sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Las parejas de PCR-cebador pueden derivarse de una secuencia conocida, por ejemplo, empleando programas informáticos previstos para este fin.
Los cebadores y las sondas basadas en las secuencias del inserto y el ADN flanquente descritas en la presente pueden emplearse para confirmar (y si es necesario, para corregir) las secuencias descritas mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante reclonación y secuenciación de dichas secuencias.
Las sondas y los cebadores de ácidos nucleicos de la presente invención se hibridan bajo condiciones rigurosas con una secuencia de ADN diana. Puede emplearse cualquier método de amplificación o hibridación de ácidos nucleicos convencional para identificar las presencia de ADN de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácidos nucleicos, o sus fragmentos, son capaces de hibridarse específicamente con otras moléculas de ácidos nucleicos bajo ciertas circunstancias. Tal como se emplea en la presente, se dice que dos moléculas de ácidos nucleicos son capaces de hibridarse específicamente entre sí si las dos moléculas sn capaces de formar una estructura de ácido nucleico bicatenario antiparalela. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el “complemento” de otra molécula de ácido nucleico si muestra una complementariedad completa. Tal como se emplea en la presente, se dice que las moléculas muestran “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario con un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son “mínimamente complementarias” si pueden hibridarse entre sí con una estabilidad suficiente como para que puedan permanecer asociadas entre sí al menos bajo condiciones de “baja rigurosidad” convencionales. De modo similar, se dice que las moléculas son “complementarias” si pueden hibridarse entre sí con una estabilidad suficiente como para que puedan seguir asociadas entre sí bajo condiciones de “alta rigurosidad” convencionales. Las condiciones de rigurosidad convencionales se describen en Sambrook et al., 1989. Por tanto, son lícitas las desviaciones de la complementariedad completa, con la condición de que dichas desviaciones no impidan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura bicatenaria. Para que una molécula de ácido nucleico actúe como cebador o sonda, solo debe ser suficientemente complementaria en su secuencia para ser capaz de formar una estructura bicatenaria estable con el disolvente y las concentraciones salinas concretos empleados.
Tal como se emplea en la presente, una secuencia sustancialmente homóloga es una secuencia de un ácido nucleico que se hibridará específicamente con el complemento de la secuencia del ácido nucleico con el cual se está comparando bajo condiciones de alta rigurosidad. La expresión “condiciones rigurosas” se define desde el punto de vista funcional con respecto a la hibridación de una sonda de ácido nucleico con un ácido nucleico diana (es decir, con una secuencia de ácido nucleico concreta de interés) mediante el procedimiento de hibridación específico analizado en Sambrook et al., 1989, en 9.52-9.55. Véase también, Sambrook et al., 1989, en 9.47-9.52 y 9.56-9.58. Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden emplearse por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de fragmentos de ADN.
Dependiendo de la aplicación prevista, se pueden emplear diversas condiciones de hibridación para lograr diversos grados de selectividad de la sonda hacia la secuencia diana. Para aplicaciones que requieren una alta selectividad, se emplearán generalmente condiciones relativamente reigurosas para formar los híbridos, por ejemplo, se seleccionarán unas condiciones de concentraciones salinas relativamente bajasy/o temperatura relativamente alta, tales como las proporcionadas por NaCl de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M a unas temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C. Las condiciones rigurosas implican, por ejemplo, lavar el filtro de hibridación al menos dos veces con tampón de lavado de alta rigurosidad (0,2x SSC, SDS al 0,1%, 65 °C). Las condiciones de rigurosidad apropiadas que favorecen la hibridación del ADN, por ejemplo, 6,0x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de un lavado con 2,0x SSC a 50 °C, son conocidas por los expertos en la técnica, 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración salina en la etapa de lavado puede seleccionarse desde una baja rigurosidad de aproximadamente 2,0x SSC a 50 °C, hasta una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2x SSC a 50 °C. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentar desde unas condiciones de baja rigurosidad a la temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, hasta unas condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 °C. La temperatura y las sales pueden variar, o la temperatura o la concentración salina puede mantenerse constante mientras que se cambia la otra variable. Estas condiciones selectivas toleran poco o ningún deseapareamiento entre la sonda y el molde o hebra diana. La detección de las secuencias de ADN mediante hibridación es muy conocida por los expertos en la técnica, y las indicaciones de las patentes de EEUU núms.4.965.188 y 5.176.995 son ejemplos de los métodos de análisis de hibridación.
En una realización particularmente preferida, un ácido nucleico de la presente invención se hibridará
específicamente con uno o más de los cebadores (o amplicones u otras secuencias) ejemplificados o sugeridos en
la presente, que incluyen sus complementos y fragmentos, bajo condiciones de alta rigurosidad. En un aspecto de la
presente invención, una molécula de ácido nucleico marcadora tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en
SEQ ID NO:3-14, o sus complementos y/o fragmentos.
En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcadora comparte entre 80% y 100% o
90% y 100% de identidad de secuencia con dichas secuencias de ácidos nucleicos. En otro aspecto de la presente
invención, una molécula de ácido nucleico marcadora comparte entre 95% y 100% de identidad de secuencia con
dicha secuencia. Estas secuencias pueden utilizarse como marcadores en métodos de cruzamiento de plantas para
identificar la progenie de los cruzamientos genéticos. La hibridación de la sonda con la molécula de ADN diana
puede detectarse mediante cualquiera de una serie de métodos conocidos por los expertos en la técnica, y estos
incluyen, pero no se limitan a marcadores fluorescentes, marcadores radiactivos, marcadores basados en
anticuerpos, y marcadores quimioluminiscentes.
Con respecto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, mediante PCR) empleando
una pareja de cebadores de la amplificación concreta, las “condiciones rigurosas” son condiciones que permiten que
la pareja de cebadores se hibride solo con la secuencia del ácido nucleico diana con la que un cebador que tenga la
correspondiente secuencia de tipo salvaje (o sus complementos) se uniría, y preferiblemente se produce un producto
de la amplificación exclusivo, el amplicón.
La expresión “específico para (una secuencia diana)” indica que una sonda o un cebador se hibrida bajo condiciones
de hibridación rigurosas solo con la secuencia diana en una muestra que comprende la secuencia diana.
Tal como se emplea en la presente, “ADN amplificado” o “amplicón” se refiere al producto de la amplificación de un
ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana que es parte de un molde de ácido nucleico. Por ejemplo,
para determinar si la planta de algodón resultante de un cruzamiento sexual contiene ADN genómico del evento
transgénico procedente de la planta de algodón de la presente invención, el ADN extraído de una muestra de tejido
de una planta de algodón puede someterse a un método de amplificación de ácidos nucleicos empleando una pareja
de cebadores que incluye un cebador derivados de la secuencia flanqueante en el genoma de la planta, adyacente
al sitio de inserción del ADN heterólogo insertado, y un segundo cebador derivado del ADN heterólogo insertado,
para producir un amplicón que es diagnóstico de la presencia del ADN del evento. El amplicón tiene una longitud y
una secuencia que también son diagnósticas para el evento. El amplicón puede variar en longitud de la longitud
combinada de las parejas de cebadores más un par de bases nucleotídicas y/o la longitud combinada de las parejas
de cebadores más aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 5 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, , 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,
113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135,
136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158.
159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181
182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204
205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227
228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250
251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273
274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296
297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319.
320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342
343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365
366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388
389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411
412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434
435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457
458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480
481, 482, 483, 484 , 488 , 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, o 500, 750, 1000.
1250, 1500, 1750, 2000 o más pares de bases nucleotídicas (más o menos cualquiera de los incrementos listados
anteriormente). Como alternativa, una pareja de cebadores puede derivarse de la secuencia flanqueante en ambos
lados del ADN insertado para producir un amplicón que incluya la secuencia de nucleótidos del inserto completa. Un
miembro de una pareja de cebadores derivada de la secuencia genómica de la planta puede localizarse a una
distancia de la secuencia de ADN insertada. Esta distancia puede variar desde un par de bases nucleotídicas hasta
aproximadamente 20.000 pares de bases nucleotídicas. El uso del término “amplicón” excluye específicamente los
dímeros de cebadores que pueden formarse en la reacción de amplificación térmica del ADN.
La amplificación de ácidos nucleicos puede acompañarse de cualquiera de los diversos métodos de amplificación de
ácidos nucleicos conocidos en la técnica, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la técnica
se conoce una diversidad de métodos de amplificación y se describen, entre otros, en la patente de EEUU n.°
4.683.195 y la patente de EEUU n.° 4.683.202. Los métodos de amplificación mediante PCR se han desarrollado
para amplificar hasta 22 kb de ADN genómico. Estos métodos, así como otros métodos conocidos en la técnica de la
amplificación del ADN, pueden utilizarse en la práctica de la presente invención. La secuencia del inserto de ADN del transgén heterólogo o la secuencia genómica flanqueante de un evento del algodón de la presente pueden verificarse (y corregirse si es necesario) amplificando dichas secuencias a partir del evento empleando cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en la presente, seguido por una secuenciación de ADN convencional del amplicón de PCR o del ADN clonado.
El amplicón producido mediante estos métodos puede detectarse mediante una pluralidad de técnicas. La electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio es un método muy conocido y habitual para detectar amplicones de ADN. Otro de estos métodos en el análisis de bits genéticos, en el que se diseña un oligonucleótido de ADN que se solapa con la secuencia de ADN genómico flanqueante adyacente y con la secuencia de ADN insertada. El oligonucleótido se inmoviliza en pocillos de una placa de micropocillos. Después de una PCR de la región de interés (empleando un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia genómica flanqueante adyacente), un producto de la PCR monocatenario puede hibridarse con el oligonucleótido inmovilizado y actuar como molde para una reacción de extensión de una sola base empleando una ADN polimerasa y ddNTP marcados específicos para la siguiente base esperada. La lectura puede ser fluorescente o estar basada en ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia del inserto/flanqueante debido a una amplificación, hibridación y extensión de una sola base exitosas.
Otro método es la técnica de pirosecuenciación descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech., 00:18-24, 2000). En este método se diseña un oligonucleótido que se solapa con la unión entre el ADN genómico adyacente y el ADN insertado. El oligonucleótido se hibrida con un producto de la PCR monocatenario procedente de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina-5'-fosfosulfato y luciferina. Se añaden dNTP individualmente y la incorporación produce una señal luminosa que se mide. Una señal luminosa indica la presencia de la secuencia flanqueante/del inserto del transgén debido a una amplificación, hibridación y extensión de una sola base o de múltiples bases exitosas.
La polarización fluorescente es otro método que puede utilizarse para detectar un amplicón de la presente invención. Según este método, se diseña un oligonucleótido que se solapa con la unión del ADN insertado y flanqueante genómico. El oligonucleótido se hibrida con un producto de la PCR monocatenario procedente de la región de interés (un cebador en el ADN insertado y otro en la secuencia de ADN genómico flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP marcado de modo fluorescente. La extensión de una sola base provoca la incorporación del ddNTP. La incorporación puede medirse como un cambio en la polarización empleando un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia flanqueante/del inserto del transgén debido a una amplificación, hibridación y extensión de una sola base exitosas.
TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) es un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN. Brevemente, se diseña una sonda oligonucleotídica FRET que se solapa con la unión del ADN insertado y flanqueante genómico. La sonda FRET y los cebadores de la PCR (un cebador en la secuencia del ADN insertado y otro en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de la sonda FRET provoca la ruptura y la liberación del resto fluorescente, alejándolo del resto extintor sobre la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/del inserto del transgén debido a una amplificación y una hibridación exitosas.
Se han descrito balizas moleculares para su uso en la detección de secuencias. Brevemente, se diseña una sonda oligonucletídica FRET que se solapa con la unión del ADN insertado y flanqueante genómico. La estructura exclusiva de la sonda FRET hace que contenga una estructura secundaria que mantiene los restos fluorescentes y extintores en proximidad cercana. La sonda FRET y los cebadores de la PCR (un cebador en la secuencia del ADN insertado y otro en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Tras haber realizado con éxito una amplificación con PCR, la hibridación de la sonda FRET con la secuencia diana provoca la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los restos fluorescente y extintor. Se produce una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/del inserto del transgén debido a una amplificación y una hibridación exitosas.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar procedimientos para practicar la invención y para demostrar ciertas realizaciones preferidas de la invención. A menos que se indique lo contrario, todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de los disolventes son en volumen.
Ejemplo 1: Producción de la semilla depositada
La resistencia a insectos de marca WideStrike™ para el algodón es un rasgo transgénico desarrollado por Dow AgroSciences que proporciona una resistencia a insectos en la planta contra lepidópteros. Contiene dos genes de tolerancia a los insectos, crylAc y crylF, que se derivan de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki y Bacillus thuringiensis subespecie aizawai, respectivamente. Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria del suelo grampositiva común. En su estadio de formación de esporas produce varios cristales de proteínas insecticidas (conocidas como delta-endotoxinas) que incluyen Cry1Ac y Cry1F. Estas proteínas son tóxicas para ciertos insectos lepidópteros. En insectos susceptibles, se unen a receptores específicos presentes sobre las células epiteliales del
intestino medio, formando poros que alteran el equilibrio osmótico y finalmente provocan la lisis y muerte celular. Se ha demostrado que Cry1Ac y Cry1F no son tóxicos para seres humanos, ganado o insectos beneficiosos, que no tienen sitios de unión para la delta-endotoxina. Empleando dos delta-endotoxinas, en lugar de una, se proporciona mayor resistencia a insectos, porque las dos proteínas Cry proporcionan un mayor espectro de control que cualquiera de ellas por sí sola y presentan actividad diferenciada contra las plagas de lepidópteros contra las que son eficaces. De modo más importante, pueden ayudar a retrasar el desarrollo de insectos resistentes.
Los genes crylAc y crylF en WideStrike se introducen empleando una transformación mediada por Agrobacterium en plantas de algodón GC-510 (Gossypium hirsutum L.) en dos eventos de transformación distintos, 3006-210-23 y 281-24-236. Después del cruzamiento en una variedad de algodón elitaria, estos eventos se combinan mediante cruzamiento convencional para producir un algodón que porta el rasgo de resistencia a los insectos WideStrike. WideStrike también contiene el gen pat de Streptomyces viridochromogenes, una bacteria del suelo aerobia común. El gen pat codifica la enzima fosfinotricina acetil transferasa (PAT), que desintoxica el gufosinato amonio en un compuesto inactivo mediante acetilación. El gen pat se incluye para permitir la selección de las plantas de algodón transformadas.
Ejemplo 2: Ensayo de diagnóstico para el evento CrylF del algodón 281-24-236
El ADN del evento Cry1F de 281-24-236 y del evento Cry1Ac de 3006-210-23 y el algodón no transgénico PCS355 se extrajeron de hojas de algodón empleando el kit Plant DNeasy de QIAGEn (n.° de catálogo 69181, Qiagen, Valencia, CA, EEUU). Se siguió el protocolo sugerido por el fabricante. Brevemente, se rompieron discos de hojas en un tampón precalentado suplementado con ARNasa empleando una esfera de carburo de wolframio (diámetro de 0,125 mm) y un molino mezclador Retsch MM3000. La mezcla se centrifugó a temperatura ambiente, y después el sobrenadante se capturó haciéndolo pasar a través de una placa DNeasy 96. El ADN se eluyó en un tampón de elución y se conservó congelado hasta su utilización.
El ADN extraído del tejido de hoja de algodón se empleó en una amplificación de ADN mediante PCR de las secuencias del inserto del transgén/genómica 5' en el evento Cry1F de 281-24-236 empleando el cebador 281-14 (SEQ ID NO:3, 5'TGTCGGCTGAAGGTAGGGAGG3') y el cebador 281-15 (SEQ ID NO:4, 5'CCGGACATGAAGCCATTTAC3'), y las secuencias del inserto del transgén/genómicas 3' flanqueantes empleando el cebador 281-9 (SEQ ID NO:6, 5'TCTCTAGAGAGGGGCACGACC3') y el cebador 281-10 (SEQ ID NO:7, 5'CGAGCTGGAGa Ga CCGGTGAC3'). Se realizaron análisis de amplificación del ADN de la PCR empleando ADN genómico extraído del evento Cry1F del algodón 281-24-236 y la línea de algodón no transgénica PCS355. La reacción de amplificación para la secuencia genómica flanqueante 5' se realizó empleando el kit de PCR QIAGEN HotStarTaq (n.° de catálogo 203203 o 203205, QIAGEN, Valencia, Calif., EEUU) con una concentración final de 0,4 |iM para el cebador 281-14 y el cebador 281-15 en un volumen de reacción de 50 |il. Las reacciones se realizaron empleando un GenAmp PCR System 9600 (Applied Biosystem, Foster City, CA) bajo las siguientes condiciones de ciclación: 1 ciclo a 95 °C durante 15 minutos; 35 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 57 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 60 segundos; 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos. La PCR para la secuencia genómica flanqueante 3' se realizó empleando el kit de PCR Takara ExTaq (n.° de catálogo RR001A, Panvera, Madison, WI) en un volumen de reacción de 50 |il que contiene una concentración final de 0,4 |iM del cebador 281-9 y el cebador 281-10. Las reacciones se realizaron empleando un GenAmp PCR System 9600 (Applied Biosystem, Foster City, CA) bajo las siguientes condiciones de ciclación: 1 ciclo a 95 °C durante 5 minutos; 35 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 60 segundos; 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos. Los productos de la PCR se separaron utilizando una electroforesis en gel de agarosa al 1,0% a 100 V durante aproximadamente 1 hora y se visualizaron con tinción con bromuro de etidio.
Se determinó la secuencia de ADN producto de la PCR 5' y resultó una secuencia de 603 pares de bases nucleotídicas que representa la secuencia del inserto del transgén/genómica 5' del evento Cry1F del algodón 281 24-236, y se identificó como SEQ ID NO:5. Se determinó la secuencia de ADN producto de la PCR 3' y resultó una secuencia de 562 pares de bases nucleotídicas que representa la secuencia del inserto del transgén/genómica 3' del evento Cry1F del algodón 281-24-236, y se identificó como SEQ ID NO:8.
Las secuencias de unión del transgén/genómica, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:8, son nuevas secuencias de ADN en el evento Cry1F de 281-24-236 que son diagnósticas para el evento Cry1F de la planta de algodón 281-24-236 y su progenie.
Ejemplo 3: Ensayo de diagnóstico para el evento Cry1Ac del algodón 3006-210-23
El ADN extraído del tejido de hoja de algodón se empleó en una amplificación de ADN mediante PCR de las secuencias del inserto del transgén/genómica 5' en el evento Cry1Ac de 3006-210-23 empleando el cebador 3006 20 (SEQ ID NO:9, 5'TTCCAACCTTTAACTATTATCCTGC3') y el cebador 3006-22 (SEQ ID NO:10, 5'GCTGCGGACATCTACATTTT3'), y las secuencias del inserto del transgén/genómicas 3' flanqueantes empleando el cebador 3006-9 (SEQ ID NO:12, 5'GACATGCAATGCTCATTATCTCTA3') y el cebador 3006-12 (SEQ ID NO:13, 5'AAGTCTCTGCCTTCTACCCTGG3'). Se realizaron análisis de amplificación del ADN de la PCR empleando ADN genómico extraído del evento Cry1Ac del algodón 3006-210-23 y la línea de algodón no transgénico PCS355. La reacción de amplificación para la secuencia genómica flanqueante 5' se realizó empleando el kit de PCR QIAGEN
Claims (12)
1. - Un método para detectar la presencia del evento de algodón crylF 281-24-236 en una muestra que comprende ADN de algodón, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con al menos un polinucleótido que es diagnóstico para el evento de algodón cry1F 281-24-236, en donde el evento de algodón 281 24-236 es una secuencia de polinucleótidos de inserto Cry1F que consta de los nucleótidos 2.075-12.748 de SEQ ID NO: 1 y al menos 20 nucleótidos flanqueantes contiguos en ambos lados de dicha secuencia de inserto, en donde los nucleótidos flanqueantes 5' son los restos de nucleótidos 1-2.074 de SEQ ID NO: 1 y los nucleótidos flanqueantes 3' son los restos de nucleótidos 12.749-15.490 de SEQ ID NO: 1.
2. - El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con a. un primer cebador que se une a una secuencia flanqueante seleccionada del grupo que consiste en los restos 1 2.074 de la SEQ ID nO: 1, los restos 12.749-15.490 de la SEQ ID NO: 1 y sus complementos; y
b. un segundo cebador que se une a una secuencia de inserto seleccionada del grupo que consiste en los restos 2,075-12,748 de SEQ ID NO: 1 y sus complementos; y
someter dicha muestra a una reacción en cadena de la polimerasa; y analizar un amplicón, que se extiende por la unión entre dicha secuencia de flanqueo y dicha secuencia de inserción, generada entre dichos cebadores.
3. - El método de la reivindicación 2, en el que dicho segundo cebador se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6.
4. - El método de la reivindicación 1, en el que dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con al menos un polinucleótido, dicho polinucleótido comprende al menos 30 nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los restos 2.060 a 2.090 de la SEQ ID NO: 1, restos 12.733 a 12.765 de SEQ ID NO: 1, y sus complementos; y en el que dicho método comprende además someter dicha muestra y dicho polinucleótido a condiciones de hibridación rigurosas; y analizar en dicha muestra la hibridación de dicho polinucleótido a dicho ADN.
5. - El método de la reivindicación 1, que comprende además detectar la presencia del evento de algodón cry1Ac 3006-210-23 en dicha muestra que comprende ADN de algodón, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con al menos un polinucleótido que es diagnóstico para el evento de algodón cry1Ac 3006 210 -23, en el que el evento de algodón 3006-210-23 es una secuencia de polinucleótidos inserto Cry1Ac que consiste en los nucleótidos 528-8.900 de la SEQ ID NO: 2 y al menos 20 nucleótidos flanqueantes contiguos a ambos lados de dicha secuencia de inserción, en el que el los nucleótidos flanqueantes en 5' son los restos de nucleótidos 1-527 de SEQ ID NO: 2 y los nucleótidos flanqueantes en 3' son los restos de nucleótidos 8.901-9.382 de la SEQ ID NO: 2.
6. - El método de la reivindicación 5, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con a. un primer cebador que se une a una secuencia flanqueante seleccionada del grupo que consiste en los restos 1 527 de SEQ ID NO: 2, los restos 8.901-9.382 de SEQ ID NO: 2 y sus complementos; y
b. un segundo cebador que se une a una secuencia de inserto seleccionada del grupo que consiste en los restos 528-8.900 de la SEQ ID No : 2, y sus complementos; y
someter dicha muestra a una reacción en cadena de la polimerasa; y determinar un amplicón, que abarca la unión entre dicha secuencia flanqueante y dicha secuencia de inserción, generada entre dichos cebadores.
7. - El método de la reivindicación 6, en el que dicho segundo cebador se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12.
8. - El método de la reivindicación 5, en el que dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con al menos un polinucleótido, comprendiendo dicho polinucleótido al menos 30 nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los restos 512-543 de la SEQ ID NO: 2, restos 8,885 a 8,916 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos; y en el que dicho método comprende además someter dicha muestra y dicho polinucleótido a condiciones de hibridación rigurosas; y determinar en dicha muestra la hibridación de dicho polinucleótido con dicho ADN.
9. - Un kit de detección de ADN que comprende un primer cebador que se une a una secuencia flanqueante seleccionada del grupo que consiste en los restos 1-2.074 de la SEQ ID NO: 1, los restos 12.749-15.490 de la SEQ ID NO: 1 y sus complementos; y un segundo cebador que se une a una secuencia de inserto seleccionada del grupo que consiste en los restos 2.075-12.748 de SEQ ID NO: 1 y sus complementos.
10. - El kit de detección de ADN de la reivindicación 9, que comprende además un primer cebador que se une a una secuencia flanqueante seleccionada del grupo que consiste en los restos 1-527 de SEQ ID NO: 2, los restos 8,901 9,382 de SEQ ID NO: 2, y complementos de los mismos; y un segundo cebador que se une a una secuencia de
inserto seleccionada del grupo que consiste en los restos 528-8.900 de la SEQ ID NO: 2, y sus complementos.
11.- Un kit de detección de ADN que comprende un polinucleótido que comprende al menos 30 nucleótidos que híbrida en condiciones rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los restos 2.060 a 2.090 de la SEQ ID NO: 1, los restos 12.733 a 12.765 de la SEQ ID NO: 1, y sus complementos.
12.- El kit de detección de ADN de la reivindicación 11, que comprende además un polinucleótido que comprende al menos 30 nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los restos 512-543 de SEQ ID NO: 2, restos 8,885 a 8,916 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos.
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