CN103884848B - 一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法 - Google Patents

一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103884848B
CN103884848B CN201410130084.0A CN201410130084A CN103884848B CN 103884848 B CN103884848 B CN 103884848B CN 201410130084 A CN201410130084 A CN 201410130084A CN 103884848 B CN103884848 B CN 103884848B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
cotton
toxalbumin
embryo
resistance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201410130084.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103884848A (zh
Inventor
陈旭升
狄佳春
赵亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Academy of Agricultural Sciences filed Critical Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201410130084.0A priority Critical patent/CN103884848B/zh
Publication of CN103884848A publication Critical patent/CN103884848A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103884848B publication Critical patent/CN103884848B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法，属于生物技术领域。包括：棉籽浸种、取种胚，利用Cry1Ab/Ac的ELISA试剂盒进行Bt毒蛋白的提取，毒蛋白含量测定，采用测定的毒蛋白含量划分其抗性等级。本发明提供了一种抗虫棉抗性强度的早期预测方法，即通过检测棉种胚的毒蛋白含量水平来早期预测抗虫棉株未来整体抗虫性的强弱。该方法只需少量棉种，通过利用其种胚在室内检测其毒蛋白含量，即可对棉种的抗虫性进行快速评判，为提升转Bt基因抗虫棉的育种效率提供技术支持。

Description

一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法
一、技术领域
本发明涉及利用棉种胚预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法，属于生物技术领域。
二、背景技术
转基因抗虫棉表达的抗虫性强度是维持品种对棉铃虫持久抗性的重要保障。因此，检测抗虫棉的抗虫性强度也就成了转基因抗虫棉安全性评价的一项重要指标。一个可以在生产上推广应用的抗虫棉品种，其综合抗虫性强度一般要达抗级水平。国内现有检测转Bt基因抗虫棉抗虫性主要有以下2种方法：
1、叶片毒蛋白表达量检测：在蕾期，取抗株棉花顶端叶片，按ELISA方法测定Bt毒蛋白定量含量，确定Bt表达量水平（全国农业技术推广中心. 中国棉花新品种动态. 中国农业科学技术出版社，2013年版，P139）。其中：不表达，Bt蛋白≤5ng/g鲜重; 低表达，5ng/g＜Bt蛋白≤150ng/g鲜重；中表达，150ng/g＜Bt蛋白≤300ng/g鲜重；中高表达，300ng/g＜Bt蛋白≤450ng/g鲜重；高表达，Bt蛋白＞450ng/g鲜重。
2、综合生物学抗虫性检测：包括（1）苗期抗虫性鉴定，采取室内棉苗叶片接虫法；(2）蕾铃期抗虫性鉴定，采用田间罩笼接蛾法。而后根据室内、室外抗性鉴定进行量化，按单次高抗的赋值4，抗的赋值3，低抗的赋值2，不抗的赋值1，累计各项次鉴定结果的抗性值，得到该品种综合抗性值（K）、平均抗性值(PK)。抗性等级的综合评判根据PK值的大小进行量化。其抗级评判标准为：PK值小于等于1.5为不抗，PK值大于1.5小于等于2.5为低抗，PK值大于2.5小于等于3.5为抗，PK值大于等于3.5为高抗（柏立新，束春娥，张龙娃，等. 棉花新品种（系）抗棉铃虫鉴定与综合量化评估. 中国棉花，2004，31（1）：19-22）。
上述两种方法用于已经定型的少量品系检测有其独特的应用价值；但对于大量早期育种材料——比如单株、株行等的鉴定，以上两种方法具有明显的局限性：（1）时效性较差：必须在蕾期以后才能取组织样品来检测品种的抗虫性；（2）耗财费力：需将检测材料进行播种出苗，而后移栽到大田，待棉株长到现蕾期才能取样检测，需大量人力、物力的投入。
对于棉花育种者来说，寻找一种早期快速检测抗虫棉抗性的技术至关重要。这样可以大大节省育种人力、物力的投入，提高抗虫棉育种的目的性与选择效率。
一般说来，抗虫棉的整体抗性强度与Bt毒蛋白的整体组成型表达量密切相关。由于在棉株在发育过程中，Bt毒蛋白的表达具有一定的时空动态变化（陈松，吴敬音，何小兰，等. 转基因抗虫棉组织中Bt毒蛋白表达量的       ELISA测定，江苏农业学报，1997，13（3）：154-156），能否通过棉种早期器官的毒蛋白含量测定来比较准确地预测后来棉株整体的抗性水平，乃是本发明重点要解决的问题所在。
不同棉种的籽指大小存在一定差异，对应其种仁大小也存在一定差异。已知棉种的种仁 = 子叶+种胚（胚芽+胚轴+胚根）（中国农业科学院棉花研究所主编. 中国棉花栽培学.上海科学技术出版社，P115-116）。其中子叶约占整个种仁的95%的比重，种胚约占5%左右。与子叶相比，单个种胚在不同品种间，其重量差异相对较小，具有相互比较的物质基础。当棉花长出5-6片真叶后，子叶完成其生命周期自行脱落。去除子叶后，构建后来棉株整体的其实就是种胚（即：胚芽+胚轴+胚根）。棉种胚尽管占的比重很少，但却是形成棉花未来成体的“微型植株”，是棉株未来整体在早期的缩影，是后来棉株整体的“微缩版”。它们的生化物质构成特点基本可以反映出未来成株组成型生化物质的基本构成特点。基于以上认知，本发明拟采用棉种胚的毒蛋白表达量来预测后来棉株整体的毒蛋白表达水平，即通过对种胚毒蛋白含量的定量检测来早期预测抗虫棉株未来整体的抗性水平。
三、发明内容
技术问题
本发明目的是拟提供一种可在早期进行快速检测的技术，一种抗虫棉抗性强度的早期预测方法，即通过检测棉种胚的毒蛋白含量水平来早期预测抗虫棉株未来整体抗虫性的强弱。该方法只需少量棉种，通过利用其种胚在室内检测其毒蛋白含量，即可对棉种的抗虫性进行快速评判，为提升转Bt基因抗虫棉的育种效率提供技术支持。
技术方案
利用棉种胚预测转Bt基因棉花抗虫性的方法，包括：
    1、棉种在25℃的温室浸种20-28小时，取浸种后的种子20粒，用手按棉种，在珠孔端挤出完整种胚或剥出种胚；
2、每个材料称取0.10-0.15g种胚或数15个种胚，加0.25-0.5ml Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒样品提取液，用组织研磨器匀浆3min，转入1.5ml离心管，6000转/min，离心10 min，取上清液待检，残渣弃去；
3、加标样及待测样：将Bt标样（由Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒提供）用样品稀释液配成 45、15、5、1.7 ng/ml。将系列标准样加入96孔的Cry1Ab/Ac的酶标板的前两列，每个浓度加2孔，每孔50μl。其余孔加待测样，每个样本依次2倍稀释2个浓度。（按预试验结果，若某样品测得的OD值超阈值，则补做更高浓度稀释，直到该样品的OD在标准曲线范围内）。每孔均加50μl。
4、加抗体：用样品稀释液1:1000稀释Bt毒蛋白抗体，混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始反应， 37℃条件下 90 min；
5、洗板：将反应液甩干并在纸上拍净用洗板机洗涤四次；
6、显色：在每孔中加100μl TMB，37℃ 15 min，每孔加入100μl盐酸终止反应；
7、比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品450nm处的OD值；
8、结果计算
根据标准样品2次测定数据的平均值，绘制标准曲线。其中横坐标X为各浓度显色OD450值表示，纵坐标Y为蛋白标样各浓度值（ng/ml），拟合标准曲线方程。
待测样品毒蛋白含量计算：根据以上标准品曲线方程，从显色OD450值，计算出被测样品的蛋白浓度（ng/ml）；而后乘稀释倍数，计算待测样品的平均毒蛋白含量（ng/ml）。最后依据公式：样品平均毒蛋白浓度（ng/ml）×样品原体积／样品胚重量，即得样品每克种胚鲜重的毒蛋白含量（ng/g）。
9、按毒蛋白划分抗性等级
采用测定的毒蛋白含量划分其抗性等级，具体标准如下：
不抗——Bt蛋白≤5ng/g鲜重;
低抗——5ng/g＜Bt蛋白≤150ng/g鲜重；
中抗——150ng/g＜Bt蛋白≤300ng/g鲜重；
中高抗——300ng/g＜Bt蛋白≤450ng/g鲜重；
高抗——Bt蛋白＞450ng/g鲜重。
有益效果
本发明提供了一种抗虫棉抗性强度的早期预测方法，即通过检测棉种胚的毒蛋白含量水平来早期预测抗虫棉株未来整体抗虫性的强弱。该方法只需少量棉种，通过利用其种胚在室内检测其毒蛋白含量，即可对棉种的抗虫性进行快速评判，为提升转Bt基因抗虫棉的育种效率提供技术支持。试验证明，根据胚组织与叶组织的抗性级别量化值，两者进行相关分析，结果显示：两者抗性级别的相关系数R=0.783**，达极显著相关水平，表明可以利用种胚的毒蛋白表达量来早期预测转Bt基因抗虫棉的抗虫性强度。利用种胚毒蛋白预测抗性与生物学综合抗虫鉴定结果列于表3。在测定的9个品系中，两者抗性级别的吻合度高达88.9%。该研究结果显示：测定种胚毒蛋白表达量也可以在早期快速预测转Bt基因抗虫棉的生物学抗虫性级别。
具体实施方式
一、利用棉种胚预测转Bt基因棉花抗虫性的方法，包括：
   （一）棉籽浸种
棉种（非脱绒毛子、脱绒光子皆可），在25℃的温室浸种24小时左右。通过浸种有利于种胚的快速挤出。
（二）取种胚
取浸种后的种子20粒，用手按棉种，在珠孔端挤出完整种胚（或剥出种胚）。每个材料称种胚0.1克，约合15个种胚。
（三）Bt毒蛋白ELISA检测
1．实验器材
组织碾磨机，冷冻离心机，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板，可调微量液体加样器（10μl、40μl、200μl、1000μl）。
2．试剂
(1) Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒（由上海佑隆生物技术有限公司提供）
(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4·12H2O，用蒸馏水定容至1 000 ml（pH 7.5）。
(3) 洗涤液：PBS，0.05% Tween 20
(4) 样品提取液：专用Bt毒蛋白提取液（由Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒提供）
(5) 稀释液：PBST-1% BSA
(6) TMB显色液：试剂盒提供
(7) 终止液：1M HCL
3．Bt毒蛋白的提取
（1） 称取0.1g种胚，加0.5ml样品提取液，用组织研磨器匀浆3min，转入1.5ml离心管，6000转/min，离心10 min，
（2） 取上清液待检，残渣弃去。
4．毒蛋白含量测定
（1）加标样及待测样：将Bt标样（由Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒提供）用样品稀释液配成 45、15、5、1.7 ng/ml。将系列标准样加入96孔的Cry1Ab/Ac的酶标板的前两列，每个浓度加2孔，每孔50μl。其余孔加待测样：按预试验结果，依次做2个浓度稀释，保证各样品的OD值均在标准曲线范围内，每孔加样50μl。
（2）加抗体：用样品稀释液1:1000稀释抗体（由Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒提供），混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始反应， 37℃条件下 90 min。
（3）洗板：将反应液甩干并在纸上拍净用洗板机洗涤四次。
（4）显色：在每孔中加100μl TMB，37℃ 15 min，每孔加入100μl盐酸终止反应。
（5）比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品450nm处的OD值。
（四）结果计算
1、根据标准样品，绘制标准曲线。其中横坐标X为各浓度显色OD450值表示，纵坐标Y为蛋白标样各浓度值（ng/ml），拟合标准曲线方程：Y = 0.6339X  2 + 19.275X - 1.3305（R2=0.9998）。
2、待测样品毒蛋白含量计算：根据以上标准品曲线方程，从显色OD450值，计算出被测样品的蛋白浓度（ng/ml）；而后乘稀释倍数，计算待测样品的平均毒蛋白含量（ng/ml）。最后依据公式：样品平均毒蛋白浓度（ng/ml）×样品原体积（0.5ml）／样品胚重量（0.1g），得样品每克种胚鲜重的毒蛋白含量（ng/g）。
（五）按毒蛋白划分抗性等级
采用测定的毒蛋白含量划分其抗性等级。具体标准如下：
不抗——Bt蛋白≤5ng/g鲜重;
低抗——5ng/g＜Bt蛋白≤150ng/g鲜重；
中抗——150ng/g＜Bt蛋白≤300ng/g鲜重；
中高抗——300ng/g＜Bt蛋白≤450ng/g鲜重；
高抗——Bt蛋白＞450ng/g鲜重。
二、种胚预测抗性级别与叶片检测抗性级别之间的相关性
试验材料：（1）2013年5月8号将9个材料的棉种在25℃条件下做浸种24小时，5月9号挤出种胚，取样测定。（2）2013年7月8号在大田取9个材料的倒1-2嫩叶，测定叶片毒蛋白。
利用Bt毒蛋白试纸盒（即Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒）测定各材料的毒蛋白表达量结果，并按标准确定各材料的抗性级别（见表1）。由表可见：按种胚毒蛋白测定结果确定的抗性级别与测定叶片毒蛋白确定的抗性抗性级别——9个材料中有6个材料确定的抗性级别完全一致。
同时对胚组织与叶组织的检测结果，按毒蛋白含量进行抗性等级量化赋值，其标准如下：
0——不抗（Bt蛋白≤5ng/g鲜重）;
1——低抗（5ng/g＜Bt蛋白≤150ng/g鲜重）；
2——中抗（150ng/g＜Bt蛋白≤300ng/g鲜重）；
3——中高抗（300ng/g＜Bt蛋白≤450ng/g鲜重）；
4——高抗（Bt蛋白＞450ng/g鲜重）。
根据胚组织与叶组织的抗性级别量化值，两者进行相关分析，结果显示：两者抗性级别的相关系数R=0.783**，达极显著相关水平。该研究表明：可以利用种胚的毒蛋白表达量来早期预测转Bt基因抗虫棉的抗虫性强度。
表1、转基因棉花的种胚与顶叶的毒蛋白含量及抗性级别
抗虫材料编号 ng蛋白/g胚样品 抗性级别量化赋值 ng蛋白/ g叶样品 抗性级别量化赋值
32B 536 高抗（4） 1664.6 高抗（4）
99B 592 高抗（4） 2464.6 高抗（4）
33B 1528 高抗（4） 1123.9 高抗（4）
鲁棉研28 3480 高抗（4） 1671.1 高抗（4）
苏杂6号 900.6 高抗（4） 1404.2 高抗（4）
星杂棉168 474.2 高抗（4） 369 中高抗（3）
冀棉958 499.3 高抗（4） 128.5 中抗（2）
苏杂118 200 中抗（2） 60.4 低抗（1）
苏杂3号 474.7 高抗（4） 1413.1 高抗（4）
（注：R0.05(7)=0.553；R0.01(7)=0.684）
三、种胚预测抗虫性与叶片测定生物学抗虫性的相关性
1、生物学抗虫性鉴定
（1）供试棉花材料
    参试的9个棉花新品种（系），选用非抗虫品种“苏棉9号”作对照品种。试验设在南京江苏省农科院试验地。所有试验材料均于4月26日播种，地膜覆盖。随机区组排列，二次重复。区组内每个棉花试验材料（处理）种植1行，每行30～35株左右。试验田各处理统一按高产栽培措施进行肥水管理等，害虫防治也根据棉田发生实况与试验要求统一进行。
（2）鉴定虫源准备
    从棉田采集棉铃虫，在恒温养虫室内用人工饲料饲养形成标准虫种。养虫室内温光条件控制为：光照16h，温度为26℃。
（3）抗虫性鉴定
采取室内棉叶接虫测定法。于6月9日（4～5片真叶期）及7月3日（蕾铃期）接虫测定，各区组每品种采回10张嫩叶（每株最多采1张），每培养皿放2张嫩叶，用脱脂棉保湿，接龄期整齐的棉铃虫低龄幼虫6头。3、5天后观察其死虫数、活虫数、活虫龄期及叶片被害程度等。
（4）生物抗性检测结果
根据室内、室外抗性鉴定进行量化，按单次高抗的赋值4，抗的赋值3，低抗的赋值2，不抗的赋值1，累计各项次鉴定结果的抗性值，得到该品种综合抗性值（K）、平均抗性值(PK)。抗性等级的综合评判根据PK值的大小来量化。其抗级评判标准为：PK值小于等于1.5为不抗，PK值大于1.5小于等于2.5为低抗，PK值大于2.5小于3.5为抗，PK值大于等于3.5为高抗（柏立新，束春娥，张龙娃，等. 棉花新品种（系）抗棉铃虫鉴定与综合量化评估. 中国棉花，2004，31（1）：19-22）。
本试验通过上述室内接虫鉴定方法所得到的不同指标的动态抗性信息与综合抗性信息汇总于表2。
表2 供试棉花品种对棉铃虫抗性值的时空动态及其综合评价
注：综合抗性级别一栏中：HR代表高抗， R代表抗，LR代表低抗，S代表感或不抗
2、相关性分析
利用种胚毒蛋白预测抗性与生物学综合抗虫鉴定结果列于表3。由表可见：在测定的9个品系中，两者抗性级别的吻合度高达88.9%。该研究结果显示：测定种胚毒蛋白表达量也可以在早期快速预测转Bt基因抗虫棉的生物学抗虫性级别。
表3、胚毒蛋白测定抗性与生物学综合抗虫级别的关系
抗虫材料编号 ng蛋白/g胚样品 按Bt表达量确定抗性级别 生物学平均抗性值PK 综合抗性级别
32B 536 高抗 3.33 R
99B 592 高抗 3.00 R
33B 1528 高抗 3.42 R
鲁棉研28 3480 高抗 3.42 R
苏杂6号 900.6 高抗 3.33 R
星杂棉168 474.2 高抗 2.75 R
冀棉958 499.3 高抗 2.75 R
苏杂118 200 中抗 2.67 R
苏杂3号 474.7 高抗 3.67 HR
以上材料均为公知公用，见参考文献来源：
[1]周尤付,邓守炳. 保铃棉32B的品种特性及栽培技术. 安徽农业，2001（4）：16；
[2]苏涛. 抗虫棉99B高产栽培技术探讨. 新疆农垦科技, 2007(5) : 11-12；
[3]仲维珍,刘素娟. 转Bt基因抗虫棉33B种子繁育推广技术.中国棉花，1999,26（1）:45；
[4]王留明,王家宝,白林红,杨静,陈莹,王秀丽. 抗虫棉鲁棉研28号的选育及栽培技术要点. 山东农业科学, 2008(2): 110-111；
[5]陈旭升,狄佳春,许乃银,刘剑光,肖松华. 转基因抗虫杂交棉新品种——苏杂6号. 江苏农业科学, 2008,(6):100；
[6]安徽省农作物品种审定委员会四届十一次会议审定通过品种“星杂棉168”， 安徽省农业委员会公告（第23号）第42页, 2014年1月17日；
[7]孟建朝 葛朝红 尹晓琳. 冀棉958品种特性及其高产栽培. 种子科技, 2008,26(2): 61-62
[8]陈旭升,狄佳春,许乃银,肖松华,刘剑光. 杂交棉新品种——苏杂118. 中国棉花, 2006,33(8): 26-27；
[9]陈旭升,郭三堆,许乃银,狄佳春,肖松华,刘剑光. 转基因双价抗虫杂交棉新品种——苏杂3号. 江苏农业学报, 2005, 21(3):190。

Claims (1)

1.利用棉种胚预测转Bt基因棉花抗虫性的方法，包括：
   1）棉种在25℃条件下浸种20-28小时，取浸种后的种子20粒，用手按棉种，在珠孔端挤出完整种胚或剥出种胚；
2）称取0.10-0.15g种胚或数15个种胚，加0.25-0.5ml Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒样品提取液，用组织研磨器匀浆3min，转入1.5ml离心管，6000转/min，离心10 min，取上清液待检，残渣弃去；
3）加标准样品及待测样品：将Bt标准样品用样品稀释液配成 45、15、5、1.7 ng/ml；将系列标准样品加入96孔的Cry1Ab/Ac的酶标板的前两列，每个浓度加2孔，每孔50μl；其余孔加待测样：按预试验结果，依次2倍做2个浓度稀释，保证各样品的OD值均在标准曲线范围内，每孔加样50μl；
4）加抗体：用样品稀释液1:1000稀释Bt毒蛋白抗体，混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始反应， 37℃条件下 90 min；
5）洗板：将反应液甩干并在纸上拍净用洗板机洗涤四次；
6）显色：在每孔中加100μl TMB，37℃ 15 min，每孔加入100μl盐酸终止反应；
7）比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品450nm处的OD值；
8）结果计算
根据标准样品2次测定数据的平均值，绘制标准曲线，其中横坐标X为各浓度显色OD450值表示，纵坐标Y为蛋白标准样品各浓度值ng/ml，拟合曲线得出标准方程；
待测样品毒蛋白含量计算：根据标准曲线方程，从显色OD450值，计算出待测样品的蛋白浓度ng/ml；而后乘稀释倍数，计算待测样品的平均毒蛋白含量ng/ml，最后依据公式：样品平均毒蛋白浓度ng/ml×样品原体积／样品胚重量，得样品每克种胚鲜重的毒蛋白含量ng/g；
9）按毒蛋白划分抗性等级
采用测定的毒蛋白含量划分其抗性等级，具体标准如下：
不抗——Bt蛋白≤5ng/g鲜重;
低抗——5ng/g＜Bt蛋白≤150ng/g鲜重；
中抗——150ng/g＜Bt蛋白≤300ng/g鲜重；
中高抗——300ng/g＜Bt蛋白≤450ng/g鲜重；
高抗——Bt蛋白＞450ng/g鲜重。
CN201410130084.0A 2014-04-02 2014-04-02 一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法 Expired - Fee Related CN103884848B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410130084.0A CN103884848B (zh) 2014-04-02 2014-04-02 一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410130084.0A CN103884848B (zh) 2014-04-02 2014-04-02 一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103884848A CN103884848A (zh) 2014-06-25
CN103884848B true CN103884848B (zh) 2015-08-05

Family

ID=50953856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410130084.0A Expired - Fee Related CN103884848B (zh) 2014-04-02 2014-04-02 一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103884848B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109752274A (zh) * 2018-12-26 2019-05-14 中国农业科学院棉花研究所 转非Bt基因棉花对棉铃虫控制效果的评价方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1334874A (zh) * 1998-08-19 2002-02-06 法马西亚公司 Cry3B杀虫蛋白在植物中的提高表达
CN101027396A (zh) * 2004-03-26 2007-08-29 美国陶氏益农公司 Cry1F和Cry1Ac转基因棉花株系及其事件特异性鉴定
CN101818157A (zh) * 2009-12-02 2010-09-01 安徽省农业科学院水稻研究所 一种人工设计的Bt抗虫基因及其应用
CN102499060A (zh) * 2011-11-01 2012-06-20 江苏省农业科学院 一种转基因抗棉铃虫和种仁无酚棉花的育种方法
CN103155857A (zh) * 2011-12-15 2013-06-19 中国农业科学院棉花研究所 一种抗烟粉虱棉花品种或品系的筛选方法
US8552274B2 (en) * 2011-10-07 2013-10-08 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Cotton cultivar UA103

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1183558A (zh) * 1997-10-16 1998-06-03 山东农业大学 转基因棉花抗虫检测法
CN1229140A (zh) * 1999-03-30 1999-09-22 中国科学院遗传研究所 一种转基因植株的生产方法
CN1099231C (zh) * 2000-11-03 2003-01-22 南京农业大学 转基因抗棉铃虫棉花杂交种的选育方法
CN102181540B (zh) * 2011-03-31 2013-01-23 合肥丰乐种业股份有限公司 一种棉花种子纯度检验的方法
CN103145815B (zh) * 2013-03-06 2014-12-31 中国农业大学 一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1334874A (zh) * 1998-08-19 2002-02-06 法马西亚公司 Cry3B杀虫蛋白在植物中的提高表达
CN101027396A (zh) * 2004-03-26 2007-08-29 美国陶氏益农公司 Cry1F和Cry1Ac转基因棉花株系及其事件特异性鉴定
CN101818157A (zh) * 2009-12-02 2010-09-01 安徽省农业科学院水稻研究所 一种人工设计的Bt抗虫基因及其应用
US8552274B2 (en) * 2011-10-07 2013-10-08 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Cotton cultivar UA103
CN102499060A (zh) * 2011-11-01 2012-06-20 江苏省农业科学院 一种转基因抗棉铃虫和种仁无酚棉花的育种方法
CN103155857A (zh) * 2011-12-15 2013-06-19 中国农业科学院棉花研究所 一种抗烟粉虱棉花品种或品系的筛选方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103884848A (zh) 2014-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xia et al. Epichloë endophyte affects the ability of powdery mildew (Blumeria graminis) to colonise drunken horse grass (Achnatherum inebrians)
Mbodj et al. Arbuscular mycorrhizal symbiosis in rice: establishment, environmental control and impact on plant growth and resistance to abiotic stresses
Drapela et al. Spider assemblages in winter oilseed rape affected by landscape and site factors
BR112015006119B1 (pt) Método iterativo de triagem de traço fenotípico ou genotípico de planta para selecionar um ou mais microorganismos capazes de transmitir pelo menos um traço fenotípico ou genotípico benéfico à uma planta, método para a produção de uma composição, métodos para a seleção de composições e métodos para a seleção de um ou mais micro-organismos.
Nasab et al. Effects of humic acid and plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) on induced resistance of canola to Brevicoryne brassicae L
CN110121978B (zh) 一种不同小麦品种发芽期耐盐性的鉴定方法
Bao et al. Does endophyte symbiosis resist allelopathic effects of an invasive plant in degraded grassland?
Yamamoto et al. The relationship between salt gland density and sodium accumulation/secretion in a wide selection from three Zoysia species
Su et al. The ecology of nematode-trapping hyphomycetes in cattle dung from three plateau pastures
CN103884848B (zh) 一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法
Candole et al. Evaluation of phytophthora root rot-resistant Capsicum annuum accessions for resistance to phytophthora foliar blight and phytophthora stem blight
López-Zapata et al. Tomato (Solanum lycopersicum L.) and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici interaction. A review
Wang et al. Exogenous application of abscisic acid (ABA) enhances chilling tolerance in seedlings of napier grass (Pennisetum purpureum Schum.)
RU2625027C2 (ru) Способ определения относительной устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков
Badieritakis et al. A qualitative and quantitative study of mites in similar alfalfa fields in Greece
Arslan Evaluation of genetic similarity and agronomic traits of castor bean populations naturally grown in the eastern Mediterranean region of Turkey
Stephenson et al. Identification and characterization of pitted morningglory (Ipomoea lacunose) ecotypes
CN108056104B (zh) 一种抑制美国白蛾生长的杨树化合物及其应用
Konzen et al. Genetic variation of landraces of common bean varying for seed coat glossiness and disease resistance: valuable resources for conservation and breeding
Jiang et al. Analysis of genetic diversity of salt-tolerant alfalfa germplasms
Koçak et al. The Incidence Rate of White Rot (Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary) Disease in Sunflower Cultivation Areas in Konya and Aksaray Provinces and its Pathogenic Potential
Norazliza et al. Comparison and relationship between water parameters and abundance of insects in field and irrigation system of paddy area of Sungai Burong, Tanjung Karang, Selangor, Malaysia
Zală et al. Research regarding the response of rapeseed hybrids to pathogens
Kouadria et al. Salinity stress resistance of durum wheat (Triticum durum) enhanced by fungi
Terletskaya et al. Osmotic Stress Effect on Different Cytological Characters of Roots and Growth Parameters in Different Wheat Species

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150805