CN1099231C - 转基因抗棉铃虫棉花杂交种的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因抗棉铃虫棉花杂交种的选育方法，目的是解决棉花的抗虫问题及棉花杂交种的选育与生产。本发明利用转基因抗虫棉基础材料，选育出抗虫性纯合的转基因抗虫棉品系南农R101，然后以南农R101作父本、苏棉12号选系为母本配制选育出抗虫杂交种南抗3号。利用本方法选育的棉花杂交种，不仅抗棉铃虫等鳞翅目昆虫，降低农药使用量，减少环境污染，同时提高了产量。
Description
技术领域
本发明转基因抗棉铃虫棉花杂交种的选育方法，属于棉花转基因育种方法，专用
于转B.t基因抗棉铃虫棉花杂交种的选育。
背景技术转B.t基因抗虫杂交棉对棉铃虫，红铃虫等棉花主要害虫具有显著的抗性，同时
又具有较常规品种个体发育潜力大，单株产量高，适于稀植的特点，在高产棉区优势十
分明显。抗虫杂交棉还特别适合进行棉花与瓜果、蔬菜的间套作。杂交种种植密度较
稀，棉花与间套作物相互影响少，从而都能取得高产；此外，转基因抗虫棉田间用农
药少，可保证蔬菜、瓜果等的安全。长江流域棉区尚无转基因抗虫杂交棉品种在生产
上大面积推广种植。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗虫杂交棉新的育种方法，培育出产量和品质优于现有
推广品种的抗虫杂交种，解决长江流域棉区尚无优良抗虫杂交棉品种供高产棉区和棉
花与瓜果蔬菜间套作地区应用的问题。
本发明转基因抗棉铃虫棉花杂交种的选育方法，包括：
以中国农科院生物技术中心培育成功的转B.t基因抗虫棉为基础材料，选择综合
性状优良的单株及株系，进行卡那霉素抗性鉴定，对抗卡那霉素的植株进行棉铃虫抗
性测定和PCR分子标记检测；经连续3-4代的系统选择，选育出产量、品质性状优
良、抗虫性纯合的品系南农R101。以南农R101为父本，苏棉12号选系为母本杂交，
培育出转基因抗虫杂交种“南抗3号”。“南抗3号”简单重复序列(SSR)指纹图谱
具有双亲谱带的共显性特征带(图1箭头指向)。
与现有技术相比，本发明所提供的转基因抗棉铃虫棉花杂交种的选育方法具有如
下优点和积极效果：
1、与中国农科院生物技术中心培育成功的转B.t基因抗虫棉原基础材料相比，
南农R101的农艺性状有较大改善，铃重4.0g左右，衣分37％左右，株高100cm左
右，对棉铃虫有显著抗性，苗期叶片对初孵棉铃虫幼虫的抗性达100％。
2、育成品种“南抗3号”的主要优点有：
产量高、品质优 在常规治虫下，籽棉产量两年平均为235.44公斤/亩，皮棉产
量为98.90公斤/亩。南抗3号纤维品质符合纺织工业要求，2.5％跨长30.08mm，整齐度47.20，比强度为19.95cN/tex，马克隆值4.78，气纱品质1782(1998-1999年两年平均)。
高抗棉铃虫“南抗3号”对棉铃虫具有极显著的抗性，苗期、初花期叶片室内喂养棉铃虫初孵幼虫5天后，幼虫死亡率达100％，盛花期以后，叶片的室内抗虫性有所下降，对初孵幼虫的抗性达40％-60％。试种表明，一、二代棉铃虫发生期可不用化学防治，三、四代棉铃虫发生期一般只须防治2-3次，较常规品种约减少用药50％-70％。
综合性状优良 “南抗3号”经多点示范试验，表明具有较好的丰产性和适应性，皮棉亩产90-150公斤/亩。1998年江苏省品种区试，亩产皮棉为100.96公斤。纤维品质符合纺织工业要求，皮棉样品经中国棉花研究所检测，长度29.5mm，整齐度45.3，比强度20cN/tex，伸长率5.7，马克隆值4.9。南抗3号株型为塔形，结铃性强，单铃重5.52g，籽指10.38g，大样衣分40％左右。
抗病性强 多年试验表明，南抗3号高抗枯萎病，耐黄萎病，1998年江苏省品种区试结果为，枯萎病指为0-1.8，黄萎病指为25-35。
附图说明
图1.南抗3号及其亲本的SSR1231指纹图谱
M：标准分子量
F1：南抗3号
P1：南农R101
P2：苏棉12选系
图2：“南抗3号”的育种方法程序图
具体实施方式
实施例
以中国农科院生物技术中心培育成功的转B.t基因抗虫棉为基础材料，该材料抗虫性存在株间分离，农艺性状较差，在南京江浦种植，株高50-60cm，铃重3.6g，衣分34％，叶片小，长势差，常常表现花粉败育等。选择综合性状优良的单株及株系，进行卡那霉素抗性鉴定，方法是将脱脂棉撕成小条沾取500ppm的卡那霉素溶液，粘附于棉花植株倒2新生叶上。5天后所有沾有卡那霉素溶液的感虫棉株的叶片均出现明显的黄色斑块，而转B.t基因抗虫棉的叶片仍为正常绿色，无任何症状。抗卡那霉素的植株再进行棉铃虫抗性测定和PCR分子标记检测。通过这一方法很快就选育出转B.t基因抗虫棉品系南农R101。与原基础材料相比，南农R101的农艺性状有较大改善，铃重4.0g左右，衣分37％左右，株高100cm左右，对棉铃虫有显著抗性，苗期叶片对初孵棉铃虫幼虫的抗性达100％。南农R101与一些陆地棉高产品种(系)杂交获F1，各F1进行系统的比较试验和多点试验，筛选出杂交组合“南抗3号”。用这一方法，结合回交也可以很快地将一种转基因植物的目的基因导入到另一个品种中。
南农R101为抗虫亲本，长势较弱、铃较小(单铃重4g左右)、衣分较低(37％)、产量也较低，但结铃性好，高抗枯萎病(病指5以下)，耐黄萎病(病指35以下)。苏棉12号选系产量高，铃大(单铃重5g左右)、长势强、衣分高(40.7％)、高抗枯萎病(病指5以下)，感黄萎病；2.5％纤维跨长28.3mm，比强度21.3cN/tex，麦克隆值4.5。而“南抗3号”综合了双亲的优点，既具有抗虫性，优质的特点，产量又高于两个亲本，杂种优势明显，并有广泛的适应性。“南抗3号”的主要特点有：
① 产量高、品质优 “南抗3号”1998-1999年参加江苏省杂交种的区试。
在常规治虫下，籽棉产量两年平均为235.44公斤/亩，比对照现有推广品
种苏棉12号增产10.07％，列第一位.霜前花籽棉产量为191.63公斤/亩，
比对照苏棉12号增产10.40％。；皮棉产量为98.90公斤/亩，比对照苏棉
12号增产7.42％，达极显著水平。“南抗3号”纤维品质符合纺织工业要
求，1998年区试结果：2.5％跨长30.40mm，整齐度49.00，比强度(cN/tex)
为20.85，马克隆值5.0，气纱品质1775。1999年区试结果：2.5％跨长
29.75mm，整齐度45.40，比强度(cN/tex)为19.05，马克隆值4.78，
气纱品质1782。两年平均：2.5％跨长30.08mm，整齐度47.20，比强度
(cN/tex)为19.95，马克隆值4.78，气纱品质1782。
② 高抗棉铃虫 用本方法育成的“南抗3号”对棉铃虫具有极显著的抗性，
苗期、初花期叶片室内喂养棉铃虫初孵幼虫5天后，幼虫死亡率达100％，
盛花期以后，叶片的室内抗虫性有所下降，对初孵幼虫的抗性达40％-
60％，对蕾的抗性下降很小。二代棉铃虫发生期，按每株300头幼虫的虫
量接虫，顶尖、蕾铃叶片无危害，植株上未发现存活幼虫，在江苏省等地
试种表明，一、二代棉铃虫发生期可不用化学防治，三、四代棉铃虫发生
期只须防治2-3次，较常规品种约减少用药50％-70％。
③ 综合性状优良 “南抗3号”经多点示范试验表明，具有较好的丰产性和
适应性，皮棉亩产90-150公斤/亩。1998年江苏省品种区试，亩产皮棉
为100.96公斤。纤维品质符合纺织工业要求，1998年区试结果，2.5％跨
度长度30.4mm，整齐度49.00，比强度20.85cN/tex，马克隆值5.0，气纱
品质1772。1998年本单位皮棉样品经中国棉花研究所检测，长度29.5mm，
整齐度45.3，比强度20cN/tex，伸长率5.7，马克隆值4.9。“南抗3号”
株型为塔形，结铃性强，单铃重5.52g，籽指10.38g，大样衣分40％左右。
④ 抗病性强 多年试验表明，南抗3号高抗枯萎病，耐黄萎病，1998年江
苏省品种区试结果为，枯萎病指0-1.8，黄萎病指为25-35。
南抗3号的指纹图谱
利用微卫星(SSR)分子标记手段，构建了“南抗3号”杂交种和其亲本的指纹图谱。这为“南抗3号”的纯度鉴定，品种的产权保护和大面积生产时保证种子质量打下了基础。具体方法为：
棉花基因组DNA的分离 参考Paterson等(Paterson AH，Brubaker CL，WendelJF.A rapid method for extraction of cotton(Gossypium spp.) genomic DNAsuitable for RFLP or PCR analysis.Plant Molecular Biology Reporter，1993，11(2)：122-127)的方法提取基因组DNA。
微卫星的PCR扩增 PCR反应体系.(67mM Tris-HCL(pH8.8)，16mM(NH4)2SO40.002％明胶，0.2mMdNTPs，2.5mMMgCL2，正向引物和反向引物(MapPairsTM产品)各0.6uM，0.25uTapDNA聚合酶(上海Sangon公司产品)，模板DNA20ng)10ul，反应程序为：95℃变性2分钟；94℃变性40秒、57℃退火45秒、72℃延伸60秒，共30个循环；72℃延伸7分钥。
扩增产物的PAGE/银染检测 扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度10％，凝胶大小为180×120×2mm，电泳缓冲液为1×TBE，恒压电泳。电泳结束后，凝胶用蒸馏水稍微冲洗。银染方法参考吴冠芸等〔5〕(吴冠芸 潘华珍 吴翚 主编，生物化学与分子生物学实验常用数据手册，P263。科学出版社，1999)介绍的方法。
杂交种的SSR指纹图谱 图1列出了“南抗3号”杂交种及其亲本的SSR指纹图谱，箭头所示的是杂交种具有双亲谱带的共显性特征带。SSR1231标记可将“南抗3号”杂交种与它们的亲本及其它栽培品种加以区分，因而可用于这些杂交种的分子鉴定和种子纯度的检测。这是南抗3号特有的分子检测特征，可作为“南抗3号”的鉴定标准。
Claims (2)
1.一种转Bt基因抗棉铃虫棉花杂交种的选育方法，包括：1) 以中国农科院生物技术中心培育成功的转B.t基因抗虫棉为基础材料，选
择综合性状优良的单株及株系，进行卡那霉素抗性鉴定，对抗卡那霉素的
植株进行棉铃虫抗性测定和PCR分子标记检测；2) 根据产量、品质、抗虫性状经连续3-4代的系统选择，选育出优良品系南
农R101；3) 以南农R101为父本，苏棉12号选系为母本杂交，培育出转基因的抗虫杂
交种“南抗3号”。
2. 根据权利要求1所述的一种转基因抗棉铃虫棉花杂交种的选育方法，其特
征在于，“南抗3号”简单重复序列(SSR)指纹图谱具有双亲谱带的共
显性特征带(箭头指向)。
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