CN102352357B

CN102352357B - 抑制FLPs神经肽基因的dsRNA及其应用

Info

Publication number: CN102352357B
Application number: CN 201110322065
Authority: CN
Inventors: 左元梅; 董林林; 李晓林
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2011-10-20
Filing date: 2011-10-20
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2031-10-20
Also published as: CN102352357A

Abstract

本发明公开了一种抑制FLPs神经肽基因的dsRNA及其应用。本发明提供了dsRNA，由序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸组成的双链RNA。本发明的实验证明，本发明提供了一种dsRNA(dsRNA)，浸泡南方根结线虫的二龄幼虫，通过RNAi后，有效的趋避南方根际线虫向寄主植物的趋向性迁移，降低对寄主植物的侵染，而且还抑制了线虫的繁殖，从生物学安全的角度上考虑，dsRNA不会产生功能蛋白，具有专一性的特点，减少对非目标生物的影响。

Description

抑制FLPs神经肽基因的dsRNA及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抑制FLPs神经肽基因的dsRNA及其应用。

背景技术

根结线虫是世界范围内的重要病原生物之一，它给世界农业生产带来了严重损失，每年全世界因此而造成的农业经济损失高达1570亿。目前世界上已经报道的根结线虫有90余种，而南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)，花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)占整个根结线虫的95％。南方根结线虫造成设施生产的一系列问题并使其大量经济作物减产。而在我国北方，以南方根结线虫为主，根结线虫的寄主植物范围广泛，超过3000种植物，包括单子叶植物，双子叶植物，草本植物，木本植物，特别是蔬菜中的茄科、葫芦科等经济价值高的作物，尤其是番茄和黄瓜，受害后，一般可造成减产30％～40％，甚至绝收。当前，根结线虫的防治主要以化学药品防治为主，但是，由于其对环境、人畜安全的危害，逐渐被立法部门取消。所以，安全有效的生物学防治方法迫在眉睫。

根结线虫主要包括六个生育期，而在线虫的二龄期，利用发达的受神经支配的头感器，通过头部的嗅觉神经元(AWA，AWC)来感知根系散发出的信号物质，向寄主植物进行趋向性迁移，侵染植物，从而完成其生命周期。因此，在根结线虫的二龄期，可以通过干扰根结线虫的趋向性迁移，起到线虫防治的目的。随着模式动物Caenorhabditis elegans基因组测序工作的完成，已经分离和鉴定了19,800个能够编码6627个蛋白家族的基因，并对有关基因的功能进行了详细而深入的研究。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种dsRNA。

本发明提供的dsRNA，由序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸组成的双链RNA。

上述dsRNA的编码基因也是本发明保护的范围。

含有上述dsRNA或其编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列3。

本发明的另一个目的是提供一种防治线虫的产品。

本发明提供的产品，其活性成分为所述dsRNA或所述编码基因或所述重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒或所述DNA分子。

上述dsRNA或其编码基因或上述重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒或上述的DNA分子在抑制Mi-flp-18基因表达中的应用也是本发明保护的范围，所述Mi-flp-18基因的核苷酸序列为序列表中的序列4。

上述dsRNA或上述编码基因或上述重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒或上述的DNA分子在制备防治线虫产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述dsRNA或上述编码基因或上述重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒或上述的DNA分子在防治线虫中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用是通过降低线虫对寄主植物的趋向性迁移和/或降低线虫侵染和繁殖能力体现。

在上述应用中，所述降低线虫对寄主植物的趋向性迁移通过降低吸引指数体现；

在上述应用中，所述降低线虫侵染和繁殖能力通过减少根结数量体现；

在上述应用中，所述线虫为南方根结线虫；

在本发明的实施例中，上述寄主植物为番茄。

本发明的实验证明，本发明提供了一种dsRNA，浸泡南方根结线虫的二龄幼虫，通过RNAi后，有效的趋避南方根际线虫向寄主植物的趋向性迁移，降低对寄主植物的侵染，而且还抑制了线虫的繁殖，从生物学安全的角度上考虑，dsRNA不会产生功能蛋白，具有专一性的特点，减少对非目标生物的影响。

附图说明

图1为RNAi处理对线虫表型、吸收及在转录水平的效应

图2为RNAi处理对线虫趋向性的影响

图3为RNAi处理对线虫侵染的影响

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

番茄(Lycopersicon esculentum cv.)佳粉19，种子购自北京蔬菜花卉研究所。

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)(武扬，郑经武，商晗武.根结线虫分类和鉴定途径及进展.浙江农业学报.2005，17：106-110，公众可从中国农业大学获得)从山东寿光温室大棚土壤中分离获得。

大肠杆菌DH5a感受态细胞购自TIANGEN公司。

pMD20-T购自TAKARA公司。

质粒DNA小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自天根生物技术公司；Trizol试剂、RNase-free DNAse I，Taq等DNA聚合酶，Real-time PCR的试剂、SYBE GREEN用东洋纺的产品；反转录酶采用Promega公司产品；MEGAscript RNAi Kit试剂盒购自Ambion公司；亚精胺、FITC购自sigma公司；其他主要化学试剂为国产AR级试剂。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生物工程公司合成，DNA测序由上海生物工程公司完成。

表1实施例中所用的基因及引物

实施例1、dsRNA(Mi-flp-18 dsRNA)的获得

1、南方根结线虫的培养及收集

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)从山东寿光温室大棚中分离获得，将孵化出得二龄幼虫接种到种植在灭菌土中生长30天的番茄幼苗(Lycopersiconesculentum cv.)。2个月后，收集番茄根系，冲洗干净，在培养皿中放置大小合适的100目筛网，筛网放置一张滤纸，将挑取的虫卵放置滤纸上，加去离子水没过卵块，室温(25℃)下放置72h，收集网下的水，在5000rpm离心2min，收集到的沉淀即为南方根结线虫的二龄幼虫。

2、双链的合成

1)、利用RNase Kit(Tiangen)提取线虫的总RNA，采用M-MLV(Promega)进行反转录，获得cDNA第一条链，具体步骤如下：

(1)取RNase-free的0.2ml的离心管，冰上加入如下试剂：

(2)75℃孵化5min，立即冰上冷却。

(3)将上述冷却后的溶液在冰上放置，并加入以下成分：

(4)混匀后，42℃孵化1h，得到cDNA。

2)、含T7启动DNA片段的合成

(1)以上述步骤1)得到的cDNA为模板，以特异性引物(flp-18-F，flp-18-R，)进行PCR扩增，得到483bp的基因片段。

上述PCR扩增体系如下表：

PCR的反应程序为：94℃5min；30cycles：94℃30sec，55℃30sec，70℃50sec；72℃10min。

(2)PCR产物经胶回收，纯化，方法按照QIAquick Gel Extraction Kit(Tiangen)试剂盒说明书进行。

(3)以胶回收后的DNA片段进行TA克隆。在灭菌的0.2ml的离心管中加入以下试剂：

(4)加入5ul Solution I。混匀后，16℃反应30min。

(5)将连接后的反应液转移至100ul的DH5a的感受态细胞，按其说明书进行重组质粒的转化，将LB平板上的白色单菌落接种于3ml LB液体培养基中(氨苄青霉素100ug ml^-1)中，37℃培养12-16h。

(6)将获得的菌种送至上海生物工程技术服务公司测序，结果表明上述获得的PCR产物的基因具有序列表中序列3所示的核苷酸，经过比对，即为Mi-flp-18编码基因(序列4)的一部分，其编码的蛋白为Mi-flp-18，含有该PCR产物的菌为测序正确菌株。

(7)将测序正确的菌株的菌液，按照质粒小提试剂盒(Tiangen)的说明，提取质粒。

(8)以步骤(7)得到的质粒为模板，含T7启动子的特异性引物(T7-flp-18-F，T7-flp-18-R)，进行PCR扩增，反应体系同上，而反应程序为：94℃5min；30cycles：94℃30sec，69℃30sec，70℃50sec；72℃10min。胶回收及纯化的方法同上述，将该PCR产物命名为T7-Mi-flp-18(含有序列3)。

3)、dsRNA合成

采用Ambion MEGAscript RNAi Kit试剂盒(Ambion，1626)，方法如下：

(1)、将T7Enzyme Mix直接放于冰上，4种核苷酸溶解后置于冰上，10×T7Reaction Buffer溶解后置于室温。

(2)、将以上溶液轻微离心后，按顺序将以下成分在室温(25℃)下加入离心管中构成20μl反应体系。

(3)、将以上溶液混匀，并轻微离心使溶液聚于管底。

(4)、37℃反应10小时。

(5)、变性处理：75℃加热5min，然后缓慢冷却至室温(25℃，不可放在冰上冷却)，得到dsRNA溶液。

(6)、向dsRNA溶液中加入以下成分，以消化掉溶液中的单链RNA和DNA模板。

(7)、37℃反应1小时。

(8)、向以上dsRNA溶液中加入如下成分：

(9)、将以上溶液转移到放在收集管中的吸附柱上，离心机最大速度离心2min。弃去离心出的液体。

(10)、向吸附柱中加入500μl漂洗液(wash solution)。离心机最大速度离心2min。弃去离心出的液体。

(11)、重复第9步。

(12)、离心机最大速再次离心2min，除去残余的漂洗液。

(13)、将吸附柱转移到新的收集管中。向吸附柱中加入100μl预热到95℃以上的洗脱液(Elution solution)。离心机最大速离心2min。

(14)、重复步骤12。洗脱得到的溶液(最后的洗脱液为DEPC水)即为dsRNA水溶液，置于-20℃保存。

将得到的dsRNA水溶液送去测序，结果为该dsRNA由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列1(正义链对应的编码区的核苷酸序列为序列3)，其反义链为序列表中的序列2，该dsRNA为Mi-flp-18dsRNA。

也可以人工合成Mi-flp-18dsRNA。

实施例2、dsRNA(Mi-flp-18dsRNA)对南方根结线虫的二龄幼虫的影响

一、南方根结线虫的二龄幼虫对dsRNA的吸收

1、试剂

Fluorescein isothiocyanate(FITC)在试验中作为吸收效率的标记；

利用soaking buffer，促进南方根结线虫对dsRNA的吸收。

Soaking buffer(将FITC、间苯二酚、亚精胺溶入DEPC水中，使间苯二酚浓度为2.5％，亚精胺浓度为150mM)。

含Mi-flp-18dsRNA的soaking buffer：将由实施例1得到的dsRNA水溶液(Mi-flp-18dsRNA)与Soaking buffer混合，Mi-flp-18dsRNA在混合溶液中的终浓度为1mg/ml，而Soaking buffer浓度为稀释为原来的0.5倍。

2、处理实验

分别将收集到刚孵化出的南方根结线虫的二龄幼虫进行如下三组处理：

DEPC水处理组(对照1)：将20,000条二龄幼虫在DEPC水中浸泡6h；

soaking buffer处理组(对照2)：将20,000条二龄幼虫在soaking buffer中浸泡6h；

含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer组(RNAi处理)：处理将20,000条二龄幼虫在含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer中浸泡6h。

上述浸泡的条件如下：黑暗条件下，温度为25℃。

二、检测

1、RNAi处理对线虫表型的影响

分别将上述三组处理后的二龄幼虫，通过荧光显微镜(Olympus BX51)检测，结果如图1A-1F所示，A，D：DEPC处理线虫；B，E：soaking buffer处理线虫；C，F：含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer处理，从图1E、1F中看出，只要有Soaking buffer，则浸泡线虫后，幼虫食道中可以清楚的观察到FITC(绿色荧光)，但清水浸泡的线虫食道中没有观察到FITC(图1D)，说明在soaking buffer中浸泡线虫，幼虫可以吸收dsRNA。

三组处理均未对线虫的运动性及死亡的缺陷(图1A-C，线虫的弯曲摆动没有区别，而且没有伸直的虫子，说明运动性、死亡没有影响)。

2、RNAi处理对线虫在转录水平的效率

1)Mi-flp-18转录水平

分别将上述三组处理后的二龄幼虫，各10,000条，提取RNA，并利用RNase-freeDNase I(Takara)，进行纯化，反转录后得到cDNA。

分别以cDNA链为模板(2ug)，进行Real-time PCR，荧光染料采用2×SYBR Greenmix(Toyobo)，10uM上游引物与下游引物(re-Mi-flp-18-F；re-Mi-flp-18-R)各1ul，用高纯水补足25ul。内参为Actin，其引物为Re-actin-F和Re-actin-R。

PCR反应条件为二步法：

第一步：50℃2min，95℃1min；

第二步：95℃15sec，52℃15sec，72℃45sec，40个循环，并在72℃采集荧光。

实验结果每组取平均值，结果如图1G所示，为RNAi对Mi-flp-18表达的影响：

DEPC水处理组的Mi-flp-18的相对表达量为0.23；

soaking buffer处理组的Mi-flp-18的相对表达量为0.22；

含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer处理组(RNAi处理)的Mi-flp-18的相对表达量为0.03；

可以看出，与soaking buffer处理组相比，Mi-flp-18的转录水平的相对表达量显著下降86％。

2)FLPs家族其他基因的转录水平

检测FLPs家族其他基因，具体基因与引物见表1，PCR条件与上述1)相同。

结果如图1H所示，为RNAi对Mi-flp-1、7、12、14、16表达的影响，

soaking buffer处理组中的Mi-flp-1、Mi-flp-7、Mi-flp-12、Mi-flp-14、Mi-flp-16的相对表达量分别为0.378、0.296、0.411、0.775、0.263；

含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer处理中的Mi-flp-1、Mi-flp-7、Mi-flp-12、Mi-flp-14、Mi-flp-16的相对表达量分别为0.310、0.349、0.528、0.902、0.270；

可以看出，与soaking buffer处理组相比，Mi-flp-1的相对表达量下降17.9％，而Mi-flp-7、Mi-flp-12、Mi-flp-14、Mi-flp-16的相对表达上调，上调的范围为：2.8％-28.5％。结果表明，RNAi处理后，线虫表型主要是有Mi-flp-18的沉默造成。

3、RNAi对线虫趋向性的影响

通过模拟试验验证RNAi处理后对线虫趋向性的影响：将番茄种子(购自农科院蔬菜花卉研究所)，10％H₂O₂消毒10min，灭菌水清洗三遍，浸泡4h，培养皿中催芽，当种子露白时，将其播在直径9cm的MS培养基中，五天(幼苗培养光照时间为14h，温度为26度，湿度为60％；黑暗时间为10h，温度为22度，湿度为70％)之后，分别在距根系1cm处加入不同处理组的50条新孵化出南方根结线虫的二龄幼虫(一个根系周围放一组虫子)，在25℃下，黑暗中孵化4h，观察并记录线虫的趋向性运动，利用吸引指数统计不同处理后的线虫对寄主植物根系趋向性运动，其中吸引指数(Attractive Index)为：靠近根系0.5cm范围内线虫数量与加入线虫数量的比值。

结果如图2所示，

DEPC水处理组(对照1)的吸引指数为0.110；

soaking buffer处理组(对照2)的吸引指数为0.105；

含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer处理组(RNAi处理)的吸引指数为0.025；

可以看出，含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer处理组线虫的趋向性运动显著下降；与对照2相比，RNAi处理(含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer处理组)后线虫向寄主植物迁移下降76.0％，而且DEPC处理与Soaking buffer处理的线虫趋向性差异小于5％，soaking buffer没有对线虫的运动性造成缺陷，结果表明，Mi-flp-18dsRNA处理后，线虫的趋向性迁移能力下降，Mi-flp-18是南方根结线虫趋向性迁移的关键基因。

4、RNAi对线虫侵染及繁殖的影响

将生长30d的番茄幼苗，分别转移到12cm的塑料盆中，每盆三株。盆中有1kg经γ射线照射过的土壤，移苗2周后，分别回接(每盆接一组)上述三组处理后的线虫，每盆接种2000条，分别于接种后14d及35d取样，统计番茄的根结个数及线虫的卵块数(3D结果为接种14天后，番茄根结的个数，3E为接种35天后，番茄根结的个数，反映线虫侵染的指标)。

回接试验结果图3所示，其中，A：DEPC处理线虫；B：soaking buffer处理线虫；C：含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer处理线虫；D：RNAi处理14d；E：RNAi处理35d；从图3A-3C(第35天结果)可以看出，DEPC水处理和Soaking buffer处理后，番茄根结上有大量的卵块(肉眼可以看到，就是红色的胶状物)而RNAi处理后，番茄根结上没有卵块，说明，RNAi处理抑制了线虫的繁殖能力。

而在处理14天观察，各组均没有卵块出现。

图3D为RNAi处理14d的根结数结果：

DEPC水处理组接种14d的番茄的根结个数28.76g^-1干重；

soaking buffer处理组接种14d的番茄的根结个数30.17g^-1干重；

含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer处理组接种14d的番茄的根结个数0.95g^-1干重；

DEPC水处理组接种35d的番茄的根结个数为61.70g^-1干重；

soaking buffer处理组接种35d的番茄的根结个数为57.07g^-1干重；

含Mi-flp-18dsRNA soaking buffer处理组接种35d的番茄的根结个数为2.00g^-1干重；

可以看出，与两个对照(DEPC水处理组和soaking buffer处理组)相比，接种14d及35d后的，根结数量下降，根结变小，并且接种35d后，番茄根系上没有发现卵块，表明，Mi-flp-18dsRNA处理后的线虫侵染能力下降，无繁殖能力。除此之外，DEPC处理及soaking buffer处理之间的变异小于5％。结果表明，Mi-flp-18是南方根结线虫侵染、繁殖过程中的关键基因。

以上实验的数据使用SPSS 11.0进行分析，在0.05水平上，进行方差分析。

综上所述，Mi-flp-18是南方根结线虫趋向性迁移、侵染、繁殖过程中的关键基因，可作为南方根结线虫防治的靶基因。除此之外，长度为483bp的dsRNA双链，RNAi效应显著，可作为线虫防治有效的核酸制剂。

Claims

1.一种dsRNA，由序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸组成的双链RNA。

2.权利要求1所述dsRNA的编码基因。

3.含有权利要求2所述的编码基因的重组表达载体。

4.含有权利要求2所述的编码基因的转基因细胞系。

5.含有权利要求2所述的编码基因的重组菌。

6.含有权利要求2所述的编码基因的表达盒。

7.一种DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列3。

8.一种防治线虫的产品，其活性成分为权利要求1所述dsRNA、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述重组表达载体、权利要求4所述转基因细胞系、权利要求5所述重组菌、权利要求6所述表达盒或权利要求7所述的DNA分子；

所述线虫为南方根结线虫。

9.权利要求1所述dsRNA、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述重组表达载体、权利要求4所述转基因细胞系、权利要求5所述重组菌、权利要求6所述表达盒或权利要求7所述的DNA分子在抑制Mi-flp-18基因表达中的应用；所述Mi-flp-18基因的核苷酸序列为序列表中的序列4。

10.权利要求1所述dsRNA、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述重组表达载体、权利要求4所述转基因细胞系、权利要求5所述重组菌、权利要求6所述表达盒或权利要求7所述的DNA分子在制备防治线虫产品中的应用；

所述线虫为南方根结线虫。

11.权利要求1所述dsRNA、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述重组表达载体、权利要求4所述转基因细胞系、权利要求5所述重组菌、权利要求6所述表达盒或权利要求7所述的DNA分子在防治线虫中的应用；

所述线虫为南方根结线虫。

12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于：所述应用通过降低线虫对寄主植物的趋向性和/或降低线虫侵染和繁殖能力体现。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述寄主植物为番茄。