CN106367428A - 一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用 - Google Patents

一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106367428A
CN106367428A CN201610847143.5A CN201610847143A CN106367428A CN 106367428 A CN106367428 A CN 106367428A CN 201610847143 A CN201610847143 A CN 201610847143A CN 106367428 A CN106367428 A CN 106367428A
Authority
CN
China
Prior art keywords
atpase
green plant
plant bug
gene
cdna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610847143.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王桂荣
刘方舟
刘杨
杨斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201610847143.5A priority Critical patent/CN106367428A/zh
Publication of CN106367428A publication Critical patent/CN106367428A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
    • C12Y306/01003—Adenosine triphosphatase (3.6.1.3)

Abstract

本发明公开了一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用，属于生物防治领域。本发明首次从绿盲蝽中克隆得到的V‑ATPase‑D基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，以该基因作为RNAi的靶标，设计与合成绿盲蝽V‑ATPase‑D dsRNA，采用注射法向绿盲蝽若虫导入dsV‑ATPase‑D后，V‑ATPase‑D基因表达分别受阻，绿盲蝽生长与代谢受抑制，死亡率提高。实验表明，本发明绿盲蝽V‑ATPase‑D基因为未来绿盲蝽RNA干扰(RNAi)介导的害虫防治策略提供了防治效果良好的候选基因。

Description

一种绿盲蝽V-ATPase-D基因cDNA及其应用
技术领域
本发明属于昆虫分子生物学与生理学领域，具体涉及绿盲蝽V型ATP酶D亚基(V-ATPase-D)cDNA的克隆，绿盲蝽V-ATPase-D基因双链RNA(dsRNA)的设计，合成与及其在生物防治绿盲蝽害虫中的应用。
背景技术
绿盲蝽(Lygus lucorum)，隶属于半翅目，盲蝽科，又称花叶虫，小臭虫。除青海西藏等少数地方，几乎遍布我国所有省份，是我国黄河流域长江流域为害棉花的多种绿盲蝽的优势种，几遍全国各棉区。绿盲蝽为杂食性害虫，寄主范围十分广泛，寄主包括棉花、十字花科蔬菜、豆类、玉米、瓜类、花卉、马铃薯、以及各种果树等，给我国农业和林业造成了巨大损失。2000年以前，绿盲蝽并非是我国棉产区农业生产的主要害虫，其种群数量低，基本不需专门防治。在防治棉花主要害虫绿盲蝽的同时即可将绿盲蝽杀死。近几年来，由于蔬菜、果树以及其他寄主作物种植面积的大幅度增加，给绿盲蝽提供了适宜的越冬场所和多样的寄主，规模化种植转基因Bt棉花有效的减少以绿盲蝽为主的鳞翅目害虫的危害，减少了农药的使用。另外，多种高毒农药的停用，致使绿盲蝽的种群数量迅速上升，并呈灾变的趋势。在很多地区已经成为了农业生产的重要害虫。目前对绿盲蝽的防治主要依靠化学防治，该方法不仅容易导致其产生抗药性，而且对环境造成污染。因此，发展一种经济有效、环境友好的方法控制绿盲蝽具有重要意义。利用转基因作物进行抗虫可以有效抵抗虫害，并且安全环保，这些优点使转基因作物成为抗虫策略的首选。基于目前以RNAi为基础发展抗虫转基因作物是当前的研究热点，且该技术在害虫防治领域已经取得一些进展，然而目前很少有关于绿盲蝽合适靶标基因的报道。因此，寻找合适的杀虫靶标是一项非常紧迫的工作。
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA引发的基因沉默现象，其作用机制是通过阻止同源基因的翻译或者转录而实现基因沉默。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生断裂而导致基因表达沉默。。
V型ATP酶(V-ATPase)是一种存在于几乎所有真核生物膜结构上的的质子泵之一。它能将ATP水解所释放的能量转化为生物膜两侧的H+质子势能。H+质子势能进一步推动细胞内各种生理反应的进行。在农业害虫防治领域，Buam等人在2007年取得了突破性进展。他们选取鞘翅目昆虫西方玉米根虫(WCR)多达290种基因作为靶标，合成dsRNA，将其涂在西方玉米根虫的食物表面。最终得到125种基因有明显致死效果。其中，对效果最为显著的V-ATPase-D，构建了可以表达其靶标基因的dsRNA玉米，转基因玉米相对于对照，在WCR取食时表现出良好的防护性，可以明显的降低WCR的侵害。这个研究表明了通过RNAi技术防治农业害虫的可行性，展现出良好的前景可见，昆虫的V-ATPase在昆虫的生长、发育、生殖等重要生命活动过程中起着非常重要的作用。
发明内容
本发明提供一种绿盲蝽(Lygus lucorum)V型ATP酶D亚基(V-ATPase-D)的cDNA及其应用，设计与合成绿盲蝽V-ATPase-D基因dsRNA，然后用显微注射法将dsRNA输入到绿盲蝽体内，绿色荧光蛋白(GFP)作为对照组，统计饲喂后7天内每日死亡率，结果实验组7天后死亡率达到60％以上，同时实时荧光定量PCR结果显示靶标基因表达水平显著降低，绿盲蝽生长与代谢受抑制，从而用于绿盲蝽的生物防治。
一种绿盲蝽V-ATPase-D基因的cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述cDNA的克隆方法，包括以下步骤：
(1)从绿盲蝽幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA；
(2)设计V-ATPase-D的特异性引物，所述特异性引物正向序列分别如SEQ ID NO.2所示，反向序列如SEG ID NO.3所示；
(3)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增，得到扩增片段；
(4)纯化PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pGME-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top 10，筛选含目的片段的阳性克隆；
(5)将阳性克隆进行序列测定，得到目标基因的cDNA。
上述cDNA在绿盲蝽RNA干扰介导的植物害虫防治中的应用。
所述绿盲蝽RNA干扰介导中以上述cDNA序列中的第249-601位作为V-ATPase-D干涉靶标合成dsRNA。
所述绿盲蝽RNA干扰介导以显微注射方法传递。
所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵。
本发明人首次从绿盲蝽中克隆得到的V-ATPase-D基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，该基因能够作为RNAi的靶标，在绿盲蝽的防治中具有很大的应用价值。
从上述的cDNA序列中选取SEQ ID NO.1中第249-601位作为V-ATPase-D干涉靶标合成dsRNA。将合成的dsRNA通过显微注射方法传递到体内，绿色荧光蛋白(GFP)作为对照组，统计饲喂后7天内每日死亡率，结果实验组7天后死亡率分别达到60％以上，同时实时荧光定量PCR结果显示靶标基因表达水平显著降低。
本发明为未来绿盲蝽RNA干扰(RNAi)介导的害虫防治策略提供了防治效果良好的候选基因。
本发明首次克隆绿盲蝽V-ATPase-D基因cDNA。V-ATPase-D是一种真核生物膜结构上的质子泵，在真核生物细胞内行使基础的、必不可少的功能，在昆虫的生长、发育、生殖等生命活动过程中发挥非常重要的作用。V-ATPase-D的沉默会破坏细胞基本的代谢与生理过程，造成昆虫生长、发育、生殖等一系列生命活动的紊乱与异常。
目前，RNAi技术已经在害虫生物防治领域展现出广阔的应用前景，以害虫靶基因dsRNA或siRNA作为有效成分研制生物农药是一个新的发展方向。本发明人首次以绿盲蝽V-ATPase-D和为干涉靶标，设计与合成V-ATPase-D dsRNA，对绿盲蝽进行显微注射，以沉默V-ATPase-D的转录表达，抑制绿盲蝽的种群数量，研究基础好，前瞻性高，害虫产生抗性的风险低，是一种防治绿盲蝽的好方法，因此本发明具有重大的应用前景。
由于绿盲蝽食性杂，寄主广泛，除为害棉花外，十字花科蔬菜、豆类、玉米、瓜类、花卉、马铃薯、以及各种果树等作物。因此，本发明所设计的V-ATPase-D dsRNA可施用于其它寄主植物，同样可用于绿盲蝽的生物防治。
附图说明
图1为V-ATPase-D dsRNA饲养7天内绿盲蝽的存活率。以GFP(绿色荧光蛋白)dsRNA为对照。图2为绿盲蝽V-ATPase-D dsRNA对其靶标基因的干扰效率。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。
实施例1：V-ATPase-D基因克隆、V-ATPase-D基因dsRNA的具备，显微注射法注射V-ATPase-D基因dsRNA。
基因的生物信息学分析
1.利用生物信息学技术及软件对绿盲蝽转录组数据进行初步的分析，筛选到绿盲蝽V-ATPase-D基因。本发明从绿盲蝽克隆到V型ATP酶D亚基(V-ATPase-D)的cDNA，其具有SEQ ID NO.1所示的序列：
2.供试昆虫及组织收集
绿盲蝽为中国农业科学院植物保护研究所使用新鲜玉米(Zea mays)及四季豆(Phaseolus vulgaris L)饲养，饲养温度为25-28℃，相对湿度为60％-70％，光照为16:8(L:D)。
3.RNA的提取
a)昆虫总RNA提取的全部过程在无RNase条件下进行。整个提取步骤如下所示：
b)取-70℃保存的昆虫组织，加入已经用液氮预冷的玻璃匀浆器中，立即向匀浆器内加入1mL Trizol试剂，将组织充分研磨磨碎；将研磨好的组织溶液用无RNA酶的枪头转移到无RNA酶的1.5mL离心管中，暂时至于冰上。
c)4℃，12000g离心15min，将上清转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中。
d)将上清在室温下放置5min后，向离心管中加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡15s，再室温静置2-3min。
e)4℃，12000g离心15min，混合物在此后分层，下层为有机相，上层为水相(RNA就在水相中)，用无RNA酶的枪头将上层水相转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中，注意尽量不要吸到中间层，以免造成蛋白质或DNA污染。
f)加入0.5mL异丙醇，混匀后，室温静置10min来沉淀RNA。
g)4℃，12000g离心10min后，观察到的沉淀即为RNA,弃上清(尽量吸净)，加入1mL75％的乙醇(用DEPC水配置，现用现配)，轻轻震荡离心管悬浮沉淀，洗涤沉淀。
h)4℃，7500g离心10min后，弃上清(尽量吸净)，超净台中干燥沉淀5-10min。
i)加入10-20μL RNase-free H2O(根据RNA量而定)，轻弹离心，使沉淀充分溶解。
j)55-60℃温育后，取1μL样品稀释至5μL，其中2.5μL进行电泳检测，2.5μL用NanoDrop仪器检测；剩余的样品用于cDNA合成或者保存于-70℃冰箱。
5.第一链cDNA的合成
整个反转录过程在无RNA酶污染的条件下进行，操作步骤按Revert Aid FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行，具体如下：
a)在无RNA酶的PCR管中依次加入：2μg RNA(根据NanoDrop定量的结果计算应该加入RNA的体积数)，DNaseⅠ1μL，1μL Ribolock RNase Inhibitor，1μL 10×Reaction Bufferwith MgCl2，用RNase-free水将体系补足到10μL；轻微震荡后离心；
b)37℃温育30min后，向体系内加入1μL 50mM EDTA，震荡后离心，然后65℃温育10min,以去除DNA酶I；
c)加入1μL Oligo-dT，用RNase-free H2O补至12μL；
d)65℃温育5min后，立即置于冰上；
e)依次加入下列试剂，使体系达到20μL：4μL的5×Reaction buffer；2μL的dNTPMix(10mM)；1μL的Revert Aid Reverse Transcriptase和1μL的Ribolock RNaseInhibitor；简单混匀离心；
f)42℃温育1h，然后再70℃温育5min；
g)合成后存于-20℃或者-70℃冰箱，使用前按情况稀释若干倍。
3、靶标基因的克隆
本发明从绿盲蝽克隆到V型ATP酶D亚基(V-ATPase-D)的cDNA，其具有SEQ ID NO.1所示的序列。
靶标基因引物的设计：
(1)利用BLAST检索数据库，搜索绿盲蝽的相近物种同一靶标基因的蛋白或者cDNA编码的氨基酸序列，用绿盲蝽成虫若虫转录组组建的本地BLAST库进行比对查询，确定所选基因的序列。
(2)根据靶标基因的片段，用Primer Premier 5.0软件设计带T7启动子的引物，引物设计原则如下：
a)引物设计的区间要在靶标基因的编码区，中间片段大小在400～500bp左右。
b)中间片段尽量选在靶标基因的特异区域。
c)引物之间不能形成引物二聚体，交叉二聚体。
d)根据以上引物设计原则设计引物后，送至华大基因进行引物合成。V-ATPase-D的T7启动
子的正引物如SEQ ID NO.2所示，T7启动子的反向序列如SEG ID NO.3所示：
SEQ ID NO.2：TAATACGACTCACTATAGGGGCAGTCAACGAAGAAGGGAG
SEQ ID NO.3：TAATACGACTCACTATAGGGCAAGGCACTGATTATGGGAG
4.目的片段的PCR扩增、测序及序列分析
以绿盲蝽cDNA为模板，用ExTaq酶扩增V型ATP酶D亚基(V-ATPase-D)的cDNA。反应体系为25μl：17μl重蒸水，2.5μl 10×反应缓冲液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl cDNA，1μl F引物(10mM)，1μl R引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测正确的PCR产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(操作步骤按试剂盒内附带的说明书进行)，回收的片段连接到pGME-T载体上(体系为8μl胶回收产物、1μl 10×T4链接反应缓冲液、0.5μlpGME-T载体和0.5μl T4连接酶，16℃条件下连接过夜)，连接体系转化Top10感受态细胞(转化步骤按感受态细胞附带的说明书进行)，培养过夜后，挑取8个阳性克隆进行PCR验证(体系和条件同上)，将检测正确的克隆用液体LB培养基(含氨苄抗生素)培养过夜检验目的片段序列。
根据测序结果，将正确的菌株加入含有氨苄抗生素的新鲜LB培养基重新摇菌，获得新鲜的菌液，进行质粒提取。
5、dsRNA模板的制备
以带有靶标基因片段的质粒为模板，用聚合酶扩增。反应体系为25μl：17μl重蒸水，2.5μl10×反应缓冲液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl载有靶标基因片段的质粒，1μl带有T7序列的正向引物(10mM)，1μl带有T7序列的正向反向引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-60℃退火45s，72℃延伸30秒，35个循环；最后72℃延伸10min。
将1μl PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。如果所得条带长度与目的片段长度一致，并且结果显示为单一明亮的条带，则将剩余的PCR产物进行酚氯仿抽提与纯化。
PCR产物的酚氯仿抽提的步骤：
a)将需要纯化的PCR产物用无RNA酶的H2O定容至200μl
b)加入等体积(200μl)的酚氯仿试剂(一定取酚氯仿试剂的下层，并且拿试剂瓶时要平稳，不能晃动)。
c)温和混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min.
d)4.取上清，加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2倍体积(400μl)的100％乙醇(-20℃贮存)，温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。
e)在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)30min.
f)白色沉淀积于离心管底部，弃上清液(为防止沉淀一起被吸出，可保留些许上清液)，加入75％乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀，洗涤沉淀
g)在4℃离心机下离心(7500rpm，4℃)5min.
h)将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥，10min左右，待乙醇全部挥发。
i)加入5μl RNase-free H2O轻弹管底，让沉淀充分均匀溶解于无RNA酶的H2O。
j)取1μl溶液溶于4μl无RNA酶的H2O中，用浓度测量仪器检测浓度和OD值。用凝胶电泳检测产物单一性，如果检测条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：
260/280:1.8-2.0
260/230:1.8-2.0
则说明PCR产物质量良好，可以作为下一步合成dsRNA的模板使用。
6、dsRNA的合成
a)将ATP，CTP，GTP，UTP(100mM)放于冰上慢慢融化，5×反转录缓冲液室温融化，T7RNA聚合酶放于-20℃贮存，随用随拿，用完立即放入-20℃环境下贮存。溶解以后轻弹管底，瞬时离心，将试剂离心到管底。
b)按以下比例将试剂混合：
按以下比例将试剂混合：
轻弹混匀，瞬时离心。放入37℃金属浴中4小时。
c)从金属浴中取出离心管，放入75℃金属浴中5min，然后放置室温冷却(切勿放在冰上)。吸出1μl，稀释5倍，凝胶电泳检测产物条带。
d)去除DNA和ssRNA.按照比例加入下列试剂：
充分混匀，轻弹管底，瞬时离心后，放入金属浴37℃30min，加入EDTA试剂1μl,65℃金属浴中放置5min终止反应。取1μl产物，稀释5倍，凝胶电泳检测产物单一性，浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：
260/280:1.8-2.0
260/230:1.8-2.0
则说明dsRNA质量良好，可以进行下一步dsRNA酚氯仿抽提。
7、dsRNA的酚氯仿抽提
a)将需要纯化的dsRNA(～60μl)用无RNA酶的H2O定容至200μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。
b)加入1/2体积(100μl)的水饱和酚试剂(一定取水饱和酚试剂的下层，并且拿试剂瓶时要平稳，不能晃动)和1/2体积的氯仿(100μl)。
c)轻轻混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min。
d)取上层水相，加入的等体积氯仿(200μl)，轻轻混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min。
e)取上层水相，加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积(500μl)的100％乙醇(-20℃贮存)，温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。
f)在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)30min。
g)白色沉淀积于离心管底部，弃上清液(为防止沉淀一起被吸出，可保留些许上清液)，加入80％乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀，洗涤沉淀。
h)在4℃离心机下离心(7500rpm，4℃)5min。
i)将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥，10min左右，待乙醇全部挥发。
j)加入5μl无RNA酶的H2O轻弹管底，让沉淀充分均匀的溶解于无RNA酶的H2O中。
k)取1μl溶解的dsRNA产物稀释于4μl DEPC H2O中，用凝胶电泳检测产物单一性，并用浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测的条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：
260/280:1.8-2.0
260/230:1.8-2.0
则证明dsRNA质量良好，可以进行绿盲蝽体内注射RNAi实验。
8、3龄(3L)绿盲蝽的准备
本发明中所选绿盲蝽为3L若虫，现以3L若虫的收集方法如下：收集1L初孵若虫(200～300头)，放入养虫盒中，盒中放入干净滤纸和一根去皮的新鲜玉米，约4天后所有1L若虫成长为3L若虫，准备铺好滤纸和7～8粒新鲜玉米粒的塑料培养皿，每个培养皿里放15只3L若虫，放若虫时，用软毛刷轻轻挑取，以免对若虫造成不必要的机械损伤。如图1所示。
同时设计绿色荧光蛋白基因(GFP)双链dsRNA作为对照，将所述dsRNA用显微注射法注入绿盲蝽若虫体内，7天内随机取样用于荧光定量PCR方法检测干扰效率，其V-ATPase-D的荧光定量PCR正引物如SEQ ID NO.4，荧光定量PCR反引物序列如SEG ID NO.5所示：
SEQ ID NO.4：TGCGACAGACGGACTACCTCA
SEQ ID NO.5：CTCCCATAATCAGTGCCTTGC
如图2，结果显示V-ATPase-D表达受抑制，正常的代谢与生理过程受破坏，绿盲蝽死亡率提高，从而用于绿盲蝽的生物防治。
上述的应用，所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等绿盲蝽寄主植物。

Claims (6)

1.一种绿盲蝽V-ATPase-D基因的cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述绿盲蝽V-ATPase-D基因的cDNA克隆方法，包括以下步骤：
(1)从绿盲蝽幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA；
(2)设计V-ATPase-D的特异性引物，所述特异性引物正向序列分别如SEQ ID NO.2所示，反向序列如SEG ID NO.3所示；
(3)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增，得到扩增片段；
(4)纯化PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pGME-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top 10，筛选含目的片段的阳性克隆；
(5)将阳性克隆进行序列测定，得到绿盲蝽V-ATPase-D基因的cDNA。
3.权利要求1所述的绿盲蝽V-ATPase-D基因的cDNA在绿盲蝽RNA干扰介导的植物害虫防治中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述绿盲蝽RNA干扰介导中以上述cDNA序列中的第249-601作为V-ATPase-D干涉靶标合成dsRNA。
5.根据权利要求3所述的应用，所述绿盲蝽RNA干扰介导以显微注射方法传递。
6.根据权利要求3所述的应用，所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵。
CN201610847143.5A 2016-09-23 2016-09-23 一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用 Pending CN106367428A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610847143.5A CN106367428A (zh) 2016-09-23 2016-09-23 一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610847143.5A CN106367428A (zh) 2016-09-23 2016-09-23 一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106367428A true CN106367428A (zh) 2017-02-01

Family

ID=57898074

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610847143.5A Pending CN106367428A (zh) 2016-09-23 2016-09-23 一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106367428A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111286515A (zh) * 2019-01-05 2020-06-16 华中农业大学 利用植物介导的RNAi创造棉花抗绿盲蝽种质的方法
CN111394371A (zh) * 2020-03-31 2020-07-10 山西大学 飞蝗V-ATPase-V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104342448A (zh) * 2013-08-08 2015-02-11 中国农业科学院植物保护研究所 一种棉铃虫V-ATPase A基因cDNA及其应用
WO2015153339A2 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104342448A (zh) * 2013-08-08 2015-02-11 中国农业科学院植物保护研究所 一种棉铃虫V-ATPase A基因cDNA及其应用
WO2015153339A2 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111286515A (zh) * 2019-01-05 2020-06-16 华中农业大学 利用植物介导的RNAi创造棉花抗绿盲蝽种质的方法
CN111394371A (zh) * 2020-03-31 2020-07-10 山西大学 飞蝗V-ATPase-V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用
CN111394371B (zh) * 2020-03-31 2022-01-28 山西大学 飞蝗V-ATPase-V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102776189B (zh) 一种细胞色素P450基因dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应用
US11117938B2 (en) RNA interference for control of insect pests
CN103993079B (zh) 对绿盲蝽进行rna干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用
CN103201385A (zh) 下调昆虫害虫中的基因表达
CN104178490B (zh) 用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用
US11608502B2 (en) RNAi nano-preparation, preparation method thereof and application thereof in TMV prevention and control
CN106399483A (zh) 对绿盲蝽进行rna干扰的饲喂方法及其在基因筛选上的应用
CN110117320A (zh) 棉花GhCAL-D07基因在促进植物开花中的应用
CN106754948A (zh) 褐飞虱NlMLP基因、编码蛋白及其应用
CN106471123A (zh) 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的sec23核酸分子
CN107916264A (zh) 翅发育相关基因vestigial的dsRNA及其在防治橘小实蝇中的应用
WO2015070765A1 (zh) 一种通过灌溉防治害虫的RNAi技术及其应用
CN106367428A (zh) 一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用
CN104561006A (zh) 舞毒蛾CYP6AN15v1基因dsRNA及其在无公害防治中的应用
CN106350529A (zh) 绿盲蝽V‑ATPaseE基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用
CN110373417A (zh) 棉花GhMADS41-A04基因在促进植物开花中的应用
CN106318956A (zh) 一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用
CN105838727B (zh) 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法
CN112695045B (zh) 一种鳞翅目昆虫Hpx12基因及应用
CN108048467A (zh) 一种氨基酸序列、核酸序列及其应用
CN108753791B (zh) 绿盲蝽decapentaplegic基因及其RNAi在害虫防控中的应用
CN104263731B (zh) 一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用
CN107760682A (zh) 一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用
CN114478735A (zh) 一种蚜虫高致死基因及其在蚜虫防治中的应用
CN104293809B (zh) 一种羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170201

RJ01 Rejection of invention patent application after publication