CN106399483A - 对绿盲蝽进行rna干扰的饲喂方法及其在基因筛选上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对绿盲蝽进行RNA干扰的饲喂方法及其在基因筛选上的应用，属于生物技术领域。对绿盲蝽进行RNA干扰的饲喂方法，其特征在于：把dsRNA混合到人工饲料中，用封口膜包裹饲料，模拟昆虫自然进食状态。首次建立了用于绿盲蝽基因功能研究的饲喂RNAi传递方法的可行性和方法；该方法为筛选新的抗虫基因提供新的技术手段和平台，为发展抗绿盲蝽转基因作物提供新的基因资源进而依此达到发展经济有效，环境友好的新的方法来控制绿盲蝽的危害。

Description

对绿盲蝽进行RNA干扰的饲喂方法及其在基因筛选上的应用

技术领域

本发明涉及生物应用技术领域，特别是涉及对绿盲蝽进行RNAi的饲喂方法以及利用该方法在筛选绿盲蝽生长发育关键基因上的应用。

背景技术

1997年开始的Bt棉花种植规模的扩大导致以前处于次要害虫的绿盲蝽代替棉铃虫成为对我国农业生产严重为害的主要害虫，特别是成为长江和黄河流域棉田的重要害虫，在此地区绿盲蝽发生面积甚至达到了90％左右，不但造成棉铃掉落而且叶子枯萎从而严重影响棉花产量，所产生的经济损失产量损失约10-20％，严重发生地区超过30％。此外，绿盲蝽不但危害棉花，而且还影响苹果、葡萄、樱桃、栆等其他水果和农作物的产量和质量。当下防治此害虫的方法很多，比如生物防治，昆虫综合防治，化学防治和物理防治等。遗憾的是至今绿盲蝽还没有一种专一性天敌，而且防治成本很高，在Bt蛋白方面还没有找到效果很好的一种防治蛋白，所以绿盲蝽的防治被迫靠化学方法来进行。虽然化学农药的使用有严格的执行规律，但反复使用农药，不但严重污染环境，而且绿盲蝽对一些农药也开始产生抗药性，而且许多杀虫剂严重的缺点是也可以杀死非靶标的有益昆虫。鉴于将来发展趋势，开发一条田间可行，经济效益高、环境友好型地绿色防治途径是摆在研究人员面前的重要任务。

双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默通常被称为RNA干扰(RNAi)，当外源双链dsRNA(长双链RNA)或siRNA(小干扰RNA)被转入到细胞或组织时在体内产生内源互补靶标mRNA序列的特异性降解并阻断转录，抑制翻译的现象。在这个过程中首先dsRNA被Dicer酶切割成21-23bp长度的小分子RNA即siRNA，然后RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex,RISC)的作用下siRNA被解旋成单链，反义链特异性地与同源mRNA(靶标)结合并引导RISC使mRNA发生断裂而导致基因表达沉默。RNAi的发现在生物领域彻底改变了研究方法和思考模式。通过将近20年的研究RNAi已变成了非常成熟的反向遗传学研究基因功能的巧妙工具。至今RNAi在医学，作物改良，农业，畜牧业，园艺，农业等方面取得了很大的进展。理论上讲我们通过RNAi可也沉默任何一个我们感兴趣的靶标基因。至今研究人员在这些方面做了大量研究筛选出大量的靶标基因，并实际应用取得了令人兴奋地突破。比如Baum(Baum,J.A.et al.(2007)Control of coleopteran insect pests throughRNAinterference.Nat.Biotechnol.25,1322–1326)等通过饲喂方法在西方玉米根虫(WCR)中一共筛选将近300中基因并最后证明14种基因的RNAi效果是很好的。

自从1998年首次在昆虫里被发现以来，在几乎所有昆虫种类都发现RNAi现象并初步进入应用阶段。最近通过细菌、寄主植物和寄主植物病毒成功的用于干扰昆虫靶标基因的表达。这些研究使用了转基因介导的RNAi并在害虫防治方面取得了显著地进步。在细菌里靶标昆虫的dsRNA通过把部分cDNA在T7启动子中反向定位来构建载体在杆菌球菌Escherichia coli Migula菌株中表达而产生的，这样dsRNA在细菌细胞里像体外合成那样产生。吸收这样表达dsRNA的细菌显示在草地夜蛾Spodoptera frugiperda、橘小实蝇Bactrocera dorsalis Hendel和马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata Say不但在表达量而且表型上产生强大的RNAi反应。这些dsRNA表达细菌相当于新的生物农药。然而为提高效率和田间使用需要新的传递方法，因此发展能够诱导RNAi的转基因植物最近几年引起了很大关注。在这个系统里寄主植物被带有靶标昆虫基因反向重复序达载体的土壤农杆菌侵染并形成能够表达dsRNA的转基因植物。至今这种方法分别在玉米根萤叶甲virgiferaLeConte，棉铃虫Helicoverpa armigera Hübner(Mao et al.,2007)，烟草天蛾天蛾M.sexta和一些吸韧皮部汁液昆虫如褐飞虱Nilaparvata lugens 桃蚜Myzuspersicae Sulzer等中产生明显的死亡率和昆虫蜕皮异常等表型。这些研究成果使RNAi在田间应用方面迈出了突破性的一步。至今昆虫里dsRNA的传递方法主要有显微注射法，饲喂即口服传递法，转基因植物法等三种。由于利用RNAi技术培育转基因植物，周期长，成本高，不能实现从大量基因中筛选高效率基因，所以在发展转基因植物之前能够寻找既经济又简单快捷的方法筛选鉴定大量基因从而找到候选基因显得尤为重要。显微注射方法最致命的缺点是在实验昆虫里产生机械性死亡而影响死亡结果，此外考虑到将来田间应用dsRNA，必须通过昆虫消化道并在这样特别不友好的环境里持续存在一段时间，所以在实验室初步筛选阶段，最有说服力的dsRNA传递方法无疑是饲喂即口服方法。饲喂法相对于注射法，有实验成本低，便于大规模实验，不易造成昆虫人为原因而死亡等显著优势。虽然前一段时间关于绿盲蝽RNAi的研究报较多，然而1)主要集中在嗅觉系统相关基因上，RNAi介导的杀虫剂方面的研究处于空白状态，2)上述研究都使用显微注射dsRNA传递方法。所以发展以饲喂RNAi介导的dsRNA传递方法是大大促进基因筛选和将来田间应用的脚步。

Actin即肌动蛋白是广泛存在于细胞的一种重要骨架蛋白，Actin在细胞吞噬、分泌、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。其中β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分，具有收缩功能，分布广泛。因为其在细胞里非常保守及表达量相对恒定，所以β-Actin一般作为内参基因来检测。所以我们首先用β-Actin来验证了绿盲蝽饲喂RNAi存在与否。

V-ATPase是广泛存在于原核生物和真核细胞的胞质膜和管泡膜膜系统中的持家基因，其由8个亚基(A、B、C、D、E、F、G、H)构成的V1催化结构域和6个亚基(a、c、c′、c″、d、e)构成的膜融合V0结构域组成。V-ATPaseE是主要亚基之一。

发明内容

本发明提供一种对绿盲蝽进行RNAi实验的饲喂方法，首先在证明绿盲蝽饲喂RNAi存在的基础上对绿盲蝽进行RNAi实验的饲喂参数(包括喂食浓度、喂食体积，喂食dsRNA总量)进行确定，并挑选了绿盲蝽细胞膜及管泡细胞器膜上广泛分布一种与H+主动转运有关的蛋白E亚基即V-ATPaseE作为靶标基因验证了绿盲蝽口服传递的dsRNA的RNAi效果，结果表明导入V-ATPaseE基因dsRNA可以在绿盲蝽体内诱导RNAi反应并引起靶标害虫快速死亡。该方法为筛选可靠，高效率，可持续的抗虫基因提供新的技术手段和平台，为将来发展抗绿盲蝽转基因棉花的培育打下了踏实的基础。

绿盲蝽饲喂RNAi实验的方法，是把靶标基因dsRNA混合到绿盲蝽人工饲料中，并通过绿盲蝽吸入体内来进行RNA干扰。

人工饲料中混合dsRNA最终浓度为0.3-0.8μg/μl，每天喂食体积为10-15μl/头，所述持续饲养时间为5-7天。

优选人工饲料中混合dsRNA最终浓度为0.5μg/μl，每天喂食体积200μl/15头。

所述人工饲料包裹在封口膜内。

所述绿盲蝽为3L若虫。

上述方法在绿盲蝽生长发育关键基因的筛选中的应用。

所述应用包括如下步骤：

(1)测序绿盲蝽转录组并建立本地BLAST数据库，通过NCBI已公布的其他物种靶标基因序与转录组测序所获得的比对筛选靶标基因并确定基因片段，(2)取绿盲蝽总RNA，通过RT-PCR得到cDNA；(3)设计带有T7序列的特异性引物；(4)通过PCR技术扩增目的基因片段：以cDNA为模板，以设计的特异性引物扩增，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(5)构建含有选定目的基因片段的载体并转入宿主大肠杆菌中，培养，提取含有目的基因片段的质粒；(6)以该质粒为模板，以设计的带有T7序列的特异性引物扩增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(7)利用T7RNA聚合酶将上一步得到的PCR产物合成为目的基因片段dsRNA；(8)将dsRNA混合到人工饲料中并饲喂绿盲蝽3龄幼虫24小时后用正常饲料继续饲养；(9)统计死亡率，观察表型。

所述特异性片段为300-500bp。

所述目的基因为绿盲蝽β-Actin，其序列如SEQ ID NO1所示。

所述目的基因β-Actin中合成dsRNA选定的特异性片段序列如SED ID NO2所示。

所述目的基因为绿盲蝽V-ATPaseE，其序列如SEQ ID NO3所示。

所述目的基因片段V-ATPaseE中合成dsRNA的选定特异性片段序列如SED ID NO4所示。

所述步骤(8)种，同时将GFP基因的dsRNA作为对照组混合到绿盲蝽人工饲料中，所述GFP基因序列如SEQ ID NO5所示。

所述GFP基因中选定合成dsRNA的靶标片段序列如SEQ ID NO6所示。

所述持续饲养时间为5-7天。

本发明用饲喂法对绿盲蝽进行RNAi实验的饲喂参数(包括饲喂体积，饲喂dsRNA总量)进行确定，并挑选了绿盲蝽持家基因V-ATPaseE验证绿盲蝽饲喂方法导入dsRNA能否引发RNAi效果并产生致死表型，结果表明导入V-ATPaseE基因dsRNA可以导致绿盲蝽生长发育受到严重影响，并进入体内后导致靶标害虫快速死亡。

本发明首次建立了利用饲喂方法用于绿盲蝽基因功能研究的RNAi方案；同时利用建立的RNAi平台筛选得到了持家基因、能量代谢相关基因、细胞凋亡相关基因等多个与绿盲蝽生长发育密切相关的基因。本研究为筛选新的抗虫基因提供了新的技术手段和平台，为发展抗绿盲蝽转基因作物提供了新的基因资源。实践表明，发展转基因抗虫作物能有效地控制害虫危害，RNAi是由双链RNA引发的基因沉默现象，其作用机制是通过阻止同源基因的翻译或者转录而实现基因沉默。

附图说明

图1实验所用dsRNA凝胶电泳结果图，

其中A、B、C分别表示为dsRNAβ-Actin、dsRNAGFP、dsRNAVA-E凝胶电泳结果。

图2绿盲蝽饲喂方法现场图片。

图3β-Actin饲喂RNAi存活率。

图4β-Actin饲喂RNAi后异常表型。

图5饲喂dsV-ATPaseE浓度梯度对绿盲蝽存活率的影响。

图6饲喂传递dsV-ATPaseEF1对绿盲蝽存活率的影响。

图7饲喂传递dsV-ATPaseE F1对靶标基因表达量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下面涉及到的化学试剂均为市售。

绿盲蝽的转绿组测序和ApoV-ATPaseE基因的生物信息学分析。

本实验室事前对绿盲蝽进行转绿组测序，成功得到绿盲蝽63029条基因序列，并注释了其中25760条基因序列。利用生物信息学技术及相关在线软件对绿盲蝽转录组数据进行初步的分析，通过在线程序NCBI Blast等程序的帮助下确定了绿盲蝽ApoV-ATPaseE基因。

测序结果见SEQ ID NO：3所示。

1、绿盲蝽总RNA的提取

绿盲蝽总RNA提取的过程在超净工作台内进行(离心除外)，以避免RNA酶(RNase)污染降解RNA。整个提取步骤如下所示：

1.取5头经过72小时饥饿处理的绿盲蝽，加入经液氮冷却的玻璃匀浆器中，立即向匀浆器内加入1ml RNA提取试剂(Trizol)，将组织磨碎；将研磨好的组织溶液倒入1.5ml无RNA酶的离心管中，置于冰上；

2. 4℃，12000g离心15min，将上清液体转移到新的1.5ml无RNA酶离心管中；

3.将上清在室温下放置5min后，向离心管中加入200μl氯仿，用手剧烈震荡15s，再室温静置2-3min；

4. 4℃，12000g离心15min，混合物在此时分层，下层为有机相，上层为水相(RNA在水相中)；将上层水相转移到新的1.5ml无RNA酶离心管中，向离心管中加入500μl异丙醇，室温静置10min；

5. 4℃，12000g离心10min后，弃掉上清(尽量吸净)，向离心管中加入1ml 75％的乙醇(用无RNA酶的H₂O配置，现用现配)，震荡离心管以洗涤沉淀；

6. 4℃，7500g离心10min后，弃掉上清(尽量吸净)，在超净工作台中干燥5-10min；

7.加入20μl无RNA酶的H₂O，震荡离心，使沉淀充分溶解；

8. 60℃温育10min后，取1μl样品稀释至5μl，其中2.5μl进行电泳检测，2.5μl用浓度测量仪器(NanoDrop)检测浓度；如果凝胶电泳检测结果合格且样品OD值如下：

260/280:1.80～2.00

260/230:1.80～2.00

则说明RNA质量良好，存于-80℃备用。

2、第1链cDNA的合成

整个反转录过程尽量保证在超净工作台内进行，操作步骤按第一链cDNA合成试剂盒进行，具体操作如下：

1.在新的1.5ml无RNA酶离心管中加入2μg RNA(根据浓度测量的结果计算需加入RNA的体积数)，再加入1μl引物(oligo-dT)，用无RNA酶的H₂O补至12μl；65℃温育5min，之后马上置于冰上；

2.在离心管中分别加入下列试剂，使体系达到20μl：4μl的5×反应缓冲液；2μl的dNTP混合物(10mM)；1μl的反转录酶和1μl的RNA酶抑制剂；简单混匀后，离心片刻；

3. 42℃温育1h，然后再70℃温育5min；合成后存于-20℃冰箱，使用前稀释10倍。

3、靶标基因的克隆

本发明选取了持家基因、能量代谢相关基因和细胞凋亡相关基因上的基因片段，GFP基因上的片段作为对照。持家基因又称管家基因，是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的；而能量代谢相关基因和细胞凋亡相关基因也在绿盲蝽生长发育和生理过程中起着非常重要的作用。本发明选取此类基因上的片段，利用饲喂法进行RNAi将其沉默，研究观察沉默该基因后，对绿盲蝽个体发育造成的影响。GFP即绿色荧光蛋白，在昆虫体内并不存在，故大量研究中将其作为对照基因合成dsRNA。

1.靶标基因引物的设计：

(1)利用BLAST检索数据库，搜索绿盲蝽的相近物种同一靶标基因的蛋白或者cDNA编码的氨基酸序列，用绿盲蝽成虫若虫转录组组建的本地BLAST库进行比对查询，确定所选基因的序列。

(2)根据靶标基因的片段，用Primer Premier 5.0软件设计带T7启动子的引物，引物设计原则如下：

a.引物设计的区间要在靶标基因的编码区，中间片段大小在400～500bp左右。

b.中间片段尽量选在靶标基因的特异区域。

c.引物之间不能形成引物二聚体，交叉二聚体。

2.根据以上引物设计原则设计引物后，送至华大基因进行引物合成。

3.相关靶标基因的引物序列见表1-1。

表1.实验所用dsRNA引物

4、目的片段的PCR扩增、测序及序列分析

1.以绿盲蝽cDNA为模板，用ExTaq酶扩增表1-1中基因。反应体系为25μl：17μl重蒸水，2.5μl 10×反应缓冲液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl cDNA，1μl F引物(10mM)，1μl R引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

2.PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测正确的PCR产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(操作步骤按试剂盒内附带的说明书进行)，回收的片段连接到pGME-T载体上(体系为8μl胶回收产物、1μl 10×T4链接反应缓冲液、0.5μlpGME-T载体和0.5μl T4连接酶，16℃条件下连接过夜)，连接体系转化Top10感受态细胞(转化步骤按感受态细胞附带的说明书进行)，培养过夜后，挑取8个阳性克隆进行PCR验证(体系和条件同上)，将检测正确的克隆用液体LB培养基(含氨苄抗生素)培养过夜检验目的片段序列。

3.根据测序结果，将正确的菌株加入含有氨苄抗生素的新鲜LB培养基重新摇菌，获得新鲜的菌液，将1ml菌液和百分之八十的甘油按照9:1比例混合，存于-80℃低温冰箱保存。将剩余的菌液进行质粒提取。序列结果见序列表。

5、dsRNA模板的制备

以带有靶标基因片段的质粒为模板，用聚合酶扩增。反应体系为25μl：17μl重蒸水，2.5μl10×反应缓冲液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl载有靶标基因片段的质粒，1μl正向(F)引物(10mM)，1μl反向(R)引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-60℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。

将1μl PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。如果所得条带长度与目的片段长度一致，并且结果显示为单一明亮的条带，则将剩余的PCR产物进行酚氯仿抽提与纯化。

PCR产物的酚氯仿抽提的步骤：

1.将需要纯化的PCR产物用无RNA酶的H₂O定容至200μl，

2.加入等体积(200μl)的酚氯仿试剂(一定取酚氯仿试剂的下层，并且拿试剂瓶时要平稳，不能晃动)。

3.温和混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min.

4.取上清，加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2倍体积(400μl)的100％乙醇(-20℃贮存)，温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。

5.在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)30min.

6.白色沉淀积于离心管底部，弃上清液(为防止沉淀一起被吸出，可保留些许上清液)，加入75％乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀，洗涤沉淀

7.在4℃离心机下离心(7500rpm，4℃)5min.

8.将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥，10min左右，待乙醇全部挥发。

9.加入5μl RNase–free H₂O轻弹管底，让沉淀充分均匀溶解于无RNA酶的H₂O。

10.取1μl溶液溶于4μl无RNA酶的H₂O中，用浓度测量仪器检测浓度和OD值。用凝胶电泳检测产物单一性，如果检测条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

则说明PCR产物质量良好，可以作为下一步合成dsRNA的模板使用。

6、dsRNA的合成

1.将ATP，CTP，GTP，UTP(100mM)放于冰上慢慢融化，5×反转录缓冲液室温融化，T7RNA聚合酶放于-20℃贮存，随用随拿，用完立即放入-20℃环境下贮存。溶解以后轻弹管底，瞬时离心，将试剂离心到管底。

2.按以下比例将试剂混合：

轻弹混匀，瞬时离心。放入37℃金属浴中4小时。

3.从金属浴中取出离心管，放入75℃金属浴中5min，然后放置室温冷却(切勿放在冰上)。吸出1μl，稀释5倍，凝胶电泳检测产物条带。

4.去除DNA和dsRNA.按照比例加入下列试剂：

充分混匀，轻弹管底，瞬时离心后，放入金属浴37℃30min，加入EDTA试剂1μl,65℃金属浴中放置5min终止反应。取1μl产物，稀释5倍，凝胶电泳检测产物单一性，浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

则说明dsRNA质量良好，可以进行下一步dsRNA酚氯仿抽提。

7、dsRNA的酚氯仿抽提

1.将需要纯化的dsRNA(～60μl)用无RNA酶的H₂O定容至200μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。

2.加入1/2体积(100μl)的水饱和酚试剂(一定取水饱和酚试剂的下层，并且拿试剂瓶时要平稳，不能晃动)和1/2体积的氯仿(100μl)。

3.轻轻混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min。

4.取上层水相，加入的等体积氯仿(200μl)，轻轻混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min。

5.取上层水相，加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积(500μl)的100％乙醇(-20℃贮存)，温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。

6.在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)30min。

7.白色沉淀积于离心管底部，弃上清液(为防止沉淀一起被吸出，可保留些许上清液)，加入80％乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀，洗涤沉淀。

8.在4℃离心机下离心(7500rpm，4℃)5min。

9.将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥，10min左右，待乙醇全部挥发。

10.加入5μl无RNA酶的H₂O轻弹管底，让沉淀充分均匀的溶解于无RNA酶的H₂O中。

11.取1μl溶解的dsRNA产物稀释于4μl DEPC H₂O中，用凝胶电泳检测产物单一性，并用浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测的条带是单一明亮的条带，并且其OD值为：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

则证明dsRNA质量良好，可以进行绿盲蝽体内注射RNAi实验。

8、事实荧光定量PCR与分析

实验采用的是2-ΔΔCT法进行相对定量，即通过内参基因校准不同样品的模板加入总量的差异。ΔΔCT＝(CT目的基因-CT内参基因)实验组-(CT目的基因-CT内参基因)对照组，2-ΔΔCT的意义即为：实验组的目的基因相对于对照组的目的基因的倍数，由此即可得到相对表达量。本实验所用的引物如表2所示

表2实时荧光PCR实验所用引物

本实验中，以α-tubulin,GADPH为内参基因，按照TakaRa公司的SYBR PRemix ExTaqTM试剂盒说明书对绿盲蝽对照组和实验组进行Real Time PCR反应，以实验的三组基因的第1d、2d、3d、4d、5d样品的cDNA模板。反应体系以及反应条件如下：

反应体系为20μL

反应条件：

第1阶段 预变性

95℃ 2min

第2阶段 PCR扩增

95℃ 10s

55℃ 10s

第3阶段：溶解曲线分析

温度以0.5℃/s的速度从55℃增加到95℃，连续测定样品的荧光强度以获得溶解曲线。

9、3龄(3L)绿盲蝽的准备

本发明中所选绿盲蝽为3L若虫，现以3L若虫的收集方法如下：收集1L初孵若虫(200～300头)，放入养虫盒中，盒中放入干净滤纸和一根去皮的新鲜玉米，约4天后所有1L若虫成长为3L若虫，准备铺好滤纸和7～8粒新鲜玉米粒的塑料培养皿，每个培养皿里放15只3L若虫，放若虫时，用软毛刷轻轻挑取，以免对若虫造成不必要的机械损伤。饥饿处理两个小时

人工饲料的配制

人工饲料是按照中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫研究组所提供的配方来配制的(棉虫组已经在人工饲料的配制和实际应用方面通过了实验验证)。

利用β-Actin基因dsRNA绿盲蝽饲喂RNAi的存在验证

人工饲料问题解决以后我们用管家基因dsRNA来验证了绿盲蝽饲喂RNAi的存在与否，我们研究表明dsβ-Actin不但通过饲喂方法诱导RNAi而且有明显的异常表型。结果如图4所示。

10、绿盲蝽RNAi饲喂方法的具体实施

(1)实验前准备；将以上所述的3L绿盲蝽，饲喂前每15个分一个培养皿，两个小时饥饿处理。饥饿处理过程中把配好的人工饲料分到几个离心管提前准备。把200ul的枪头头端用剪刀剪切1/3的部分，以便容易吸取粘稠的人工饲料。(2)将含有dsRNA的人工饲料用封口膜包起来(总体积200ul)轻混匀后喂给绿盲蝽。

饲喂虫量为30-60头为一组重复，至少重复三次，统计总数至少为120头/基因。包装完含有dsRNA的人工饲料后将装有3L若虫的培养皿放在光照培养箱内饲养，L:D＝16：8，空气湿度:55-60％，每天更换人工饲料，注意保持培养皿内清洁。每隔24小时统计每个培养皿中死亡虫体数量，并做详细记录与统计。

1.最佳饲料传递方法和每次饲料体积的确定

在人工饲料的传递方法方面以前在刺吸式口器昆虫和其他类昆虫都有相关尝试并取得了实际应用。本专利中我们为了降低dsRNA降解速度和实验简易，应用性等方面考虑，我们就应用了封口膜包饲料法(图1)，此方法方便简易，操作简单，所需时间不多等特点。

在本发明中另一个实验前解决问题是确定每次饲喂量和饲喂数量(个体数量)，考虑到重复试验dsRNA的使用量和虫子数量的最佳配合及高效和俭约性，我们首先使用了100ul，150ul和200ul饲料体积进行试验，结果表明100ul和150ul虽然节约dsRNA量但试验虫子数量受限制。所以200ul饲料(培养皿)体积确定为下一步试验饲料体积。

饲料体积确定以后下一步确定每培养皿/个体数量的确定。我们分别10头，15头和20头三组做实验。考虑到10头/培养皿增加试验量，20头/培养皿却因饲料量24h不够而导致绿盲蝽饥饿死亡现象，所以我们把15头/培养皿确定为下一步试验个体数。

2.最佳dsRNA饲喂浓度的确定

在确定饲喂体积和个体数以后，本发明使用6种剂量的dsRNA V-ATPaseE：表1(0.01ul，0.03ul，0.1ul，0.3ul，0.5ul，0.8ul)的人工饲料和dsRNA的混合饲喂给3龄绿盲蝽若虫饲喂后连续7天统计生存率，结果见表3所示，通过死亡率统计可以看出：随着dsRNA浓度的提高绿盲蝽存活率明显下降。0.3ul，0.5ul和0.8ul的浓度显著提高了靶标害虫的死亡率(P<0.05.LSD)。见图5.

表3不同饲喂dsRNA浓度对绿盲蝽存活率的影响

考虑到今后饲喂实验结果与dsRNA浓度的关系我们最后确定0.5ug/ul定位今后实验的筛选浓度。

实施例1：饲喂筛选V-ATPaseE基因片段的dsRNA对绿盲蝽生长发育的影响

采用上述饲喂法用dsGFP和ds V-ATPaseE分别对3L绿盲蝽进行饲喂实验，饲喂参数如下：饲喂体积为200ul，饲喂dsRNA最终浓度为0.5μg/μl。结果见图6,7。

由图6和图7可以看出，处理组(dsV-ATPaseE)与对照组(dsGFP)存活率有明显的区别，并且随着天数的增加，两组数值的差距逐渐变大。饲喂实验后的第7天，对照组绿盲蝽仍有很高的存活率。据统计结果显示，两者具有显著性差异(P<0.05)。

同理，采用本申请相同的方法可以将绿盲蝽体内与能量代谢相关基因、细胞凋亡相关基因进行沉默。由此看见，利用饲喂法对绿盲蝽进行RNA干扰(RNAi)能够应用于基因筛选。

Claims (10)

1.绿盲蝽饲喂RNAi实验的方法，是把靶标基因的dsRNA混合到绿盲蝽人工饲料中，并通过绿盲蝽吸入体内来进行RNA干扰。

2.根据权利要求1所述方法，所述人工饲料中混合dsRNA最终浓度为0.3-0.8μg/μl，每天喂食体积为10-15μl/头，所述持续饲养时间为5-7天。

3.根据权利要求2所述方法，所述人工饲料中混合dsRNA最终浓度为0.5μg/μl，每天喂食体积200μl/15头。

4.根据权利要求1所述方法，根据权利要求1所述方法，所述人工饲料包裹在封口膜内。

5.根据权利要求1所述方法，所述绿盲蝽为3L若虫。

6.权利要求1-5任一所述方法在绿盲蝽生长发育关键基因的筛选中的应用。

7.权利要求6所述的应用，包括如下步骤：(1)取绿盲蝽总RNA，通过RT-PCR得到cDNA；(2)选定目标基因一段特异性片段，设计带有T7序列的特异性引物；(3)通过PCR技术扩增目的基因片段：以第一步得到的cDNA为模板，第二步设计的特异引物扩增，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(4)构建含有选定目的基因片段的载体：将目的基因片段用T4DNA连接酶插入载体PGM-T中，转入宿主大肠杆菌中，富集培养，提取含有目的基因片段的质粒；(5)以上一步所提取含有目的基因片段的质粒为模板，第(2)步设计的特异性引物扩增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(6)利用T7RNA聚合酶将上一步得到的PCR产物合成为目的基因片段dsRNA；(7)将dsRNA按权利要求1-5任一所述的饲喂方法导入绿盲蝽的体内，24小时后用正常人工饲料持续饲养记录若虫经RNAi后的表现型；(8)统计死亡率，确认该目的基因与生长发育的关系。

8.根据权利要求7所述的筛选方法，所述特异性片段为400-500bp。

9.根据权利要求7所述的筛选方法，所述目的基因为绿盲蝽V-ATPaseE基因，其序列如SEQ ID NO1所示，所述合成dsRNA的特异性片段的序列如SED ID NO2所示。

10.根据权利要求7所述的筛选方法，所述步骤(7)的同时，将GFP基因的dsRNA作为对照组口服入绿盲蝽体内，所述GFP基因序列如SEQ ID NO3所示，所述合成dsRNA的特异性片段的序列如SEQ ID NO4所示。