CN104987376A - 绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104987376A
CN104987376A CN201510484865.4A CN201510484865A CN104987376A CN 104987376 A CN104987376 A CN 104987376A CN 201510484865 A CN201510484865 A CN 201510484865A CN 104987376 A CN104987376 A CN 104987376A
Authority
CN
China
Prior art keywords
green plant
plant bug
gene
dtrc
perception
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510484865.4A
Other languages
English (en)
Inventor
王桂荣
杨婷
付婷
刘杨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201510484865.4A priority Critical patent/CN104987376A/zh
Publication of CN104987376A publication Critical patent/CN104987376A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides
    • A01N47/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides containing —N=CX2 groups, e.g. isothiourea
    • A01N47/44—Guanidine; Derivatives thereof

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及“绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用”属于昆虫生物工程领域。绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明中的基因或蛋白作为靶标为控制绿盲蝽提供了理论基础，可以作为新的有效靶标来设计高效、安全、环保的化合物或者发展新颖的物理防治措施来控制绿盲蝽的危害。无论把该基因做成转基因作物或者杀虫药剂，利用RNAi干扰原理，当绿盲蝽取食该转基因作物或药剂后，其体内该基因受到干扰，使基因功能丧失，因此蛋白表达受到影响，进而影响绿盲蝽感知环境温度，导致其生存能力下降，对棉花的抗绿盲蝽育种将起到重要的促进作用。

Description

绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及昆虫基因工程技术领域，特别是涉及一种绿盲蝽感知伤害温度的通道蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
农作物虫害严重影响农业生产，虫害严重发生时，不仅造成农作物大幅减产，而且影响农产品品质，造成巨大的经济损失。自化学杀虫剂出现后，农业害虫的防治主要以化学杀虫药剂为主。然而随着大范围高剂量化学杀虫药剂的使用，由此带来的弊端也日趋明显，例如靶标害虫产生抗药性、杀死非靶标生物、污染环境、破坏生态系统等。因此，发展现代植保技术，寻找新的靶标位点来发展高效、安全、环保的害虫防治新方法显得尤为迫切。
绿盲蝽属于半翅目盲蝽科，其重要寄主涉及棉花、绿豆、蚕豆、向日葵、苜蓿、苹果、桃子、枣、葡萄等28个科的作物，是我国农业生产中的重要害虫。近十年来，盲蝽已在我国由次要害虫上升为了主要害虫，在棉花、枣、葡萄等多种作物生产上造成了严重危害。盲蝽作为昆虫中的一种属于变温动物，生长发育、繁殖、迁移、滞育等生命活动更易受到环境温度变化的影响。研究表明，低温(18℃)抑制绿盲蝽生殖腺的发育并延缓卵的成熟，高温则抑制田间绿盲蝽的种群密度。因此，通过调控绿盲蝽温度感知对其种群或生长发育进行控制，进而有效防控绿盲蝽对农作物的危害，是一项长期而艰巨的任务。
生物总是躲避极端的温度并选择适宜的温度环境，快速、准确的感知环境温度的变化已成为生物的基本生存能力。研究发现位于细胞膜及胞内细胞器膜上的一类非选择性阳离子通道蛋白参与伤害温度感知。此类通道蛋白在某些昆虫外周神经元表达时，一方面参与调控其躲避伤害温度、伤害性机械刺激及干燥的生存环境，另一方面有助于昆虫对来自于某些植物挥发物产生厌恶反应。目前，对于此类通道蛋白，对于调控昆虫生理活动及其行为活动的重要性显而易见，但是研究却主要集中于模式生物，尚未见针对绿盲蝽中此类通道蛋白基因序列、功能等方面的研究报道。由此可见，对于该通道蛋白基因的鉴定及功能研究有助于阐明昆虫感知伤害温度的分子机制，从而很有可能使该通道蛋白及与其共同作用的相关基因成为一种新的靶标基因，同时新基因的发掘将为转基因植物的培育和基因工程杀虫剂的生产提供有效的基因来源，用来发展高效、安全、环保的害虫防治新方法控制农业害虫的危害。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白的编码基因、功能及其应用。
绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白DTRC通道蛋白，其特征在于：
(a)其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；或
(b)在(a)中的氨基酸序列经过一个或者多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有相同活性的由(a)衍生的蛋白质；或
(c)与SEQ ID NO.1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白。
本发明的目的在于提供编码上述绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白的基因。
其中，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的也在于提供含有上述基因的表达载体。
本发明的目的也在于提供含有上表达载体的宿主。
本发明的目的也在于提供含所述基因的转化植物细胞。
本发明的目的也在于提供所述绿盲蝽伤害温度通道蛋白在制备杀虫剂中的应用。
本发明的目的也在于提供绿盲蝽伤害温度通道蛋白在杀虫剂制备中作为靶标的应用。
本发明的目的还在于提供所述基因在杀虫剂制备中作为靶标的应用。
本发明中的DTRC通道蛋白或其基因可以通过从半翅目盲蝽科昆虫绿盲蝽(Apolyguslucorum)提取、基因工程或化学方法制备。
本发明中利用生物信息学技术，分析了绿盲蝽触角转录组，并获得了DTRC通道蛋白的基因片段，以此片段设计正向和反向引物，进行3’-RACE，获得了该基因的3’端序列。根据基因测序拼接获得DNA序列，在5’端和3’端非编码区重新设计一对引物DTRC-F与DTRC-R，提取绿盲蝽RNA并反转录成cDNA，以此cDNA为模板并进一步设计巢式引物来扩增DTRC基因的全长序列进行测序验证。在此基因内重新设计一对引物，提取绿盲蝽不同组织RNA并反转录成cDNA，以这些cDNA为模板进行RT-PCR反应，获得该基因在绿盲蝽不同组织中表达谱，分析证明该基因在足中高水平表达。构建表达载体，对该基因利用爪蟾卵母细胞异源表达系统进行体外表达，结合双电极电压钳技术，对该通道蛋白功能进行验证。并通过绿盲蝽行为学研究证明DTRC基因在绿盲蝽感知环境温度伤害中发挥着重要作用。
本发明中的绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白(DTRC通道蛋白)在爪蟾卵母细胞异源表达系统中表现出在感知环境温度伤害中发挥着重要作用。因此可以利用此基因和RNAi转基因植物的工作原理，用于转基因棉花育种。绿盲蝽取食此转基因棉花后，其编码的蛋白即此感知伤害温度通道蛋白功能受到影响，进而影响绿盲蝽感知环境温度，导致其生存能力下降，对棉花的抗绿盲蝽育种将起到重要的促进作用。本发明中的基因或蛋白作为靶标控制绿盲蝽提供了理论基础，可以作为新的有效靶标来设计高效、安全、环保的化合物或者发展新颖的物理防治措施来控制绿盲蝽的危害。无论把该基因做成转基因作物或者杀虫药剂，利用RNAi干扰原理，当绿盲蝽取食该转基因作物或药剂后，其体内该基因受到干扰，使基因功能丧失，因此蛋白表达受到影响。
附图说明
图1为绿盲蝽DTRC基因蛋白序列及结构示意图；
其中阴影部分序列为预测的锚蛋白重复序列(Ank1-Ank8)；下划线序列为预测的跨膜结构(TM1-TM6)。
图2为绿盲蝽DTRC基因不同龄期和组织表达谱分析；
其中(A)为绿盲蝽DTRC基因在不同龄期的表达谱分析柱状图；1-6代表1-5龄若虫及成虫；(B)为绿盲蝽DTRC基因在成虫不同组织的表达谱分析柱状图。
图3为表达DTRC基因的爪蟾卵母细胞对20-45℃温度刺激的反应检测图；
其中(A)为对照组爪蟾卵母细胞对20-45℃温度刺激的反应轨迹；(B)为表达DTRC基因的爪蟾卵母细胞对20-45℃温度刺激的反应；(C)为对照组和表达DTRC的爪蟾卵母细胞对20-45℃温度刺激反应的电流值；1为表达DTRC的爪蟾卵母细胞对20-45℃温度刺激反应的电流值图4为表达DTRC基因的爪蟾卵母细胞对一系列温度刺激的反应检测图；
其中(A)、(B)分别代表对照及表达DTRC基因的爪蟾卵母细胞对不同温度刺激的反应轨迹，(C)为对照组和表达DTRC的爪蟾卵母细胞对不同温度刺激的反应电流值，A代表表达DTRC基因的爪蟾卵母细胞对不同温度刺激的电流值；与对照相比，*表示差异显著，**表示差异极显著。
图5绿盲蝽在不同温度区域的分布比例柱状分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。
实施例1 DTRC蛋白及其编码基因的发现、获得和分离
1.DTRC基因的生物信息学分析
利用生物信息学技术及软件对绿盲蝽转录组数据进行初步的分析，筛选到绿盲蝽DTRC基因cDNA的序列片段。
2.供试昆虫及组织收集
绿盲蝽在中国农业科学院植物保护研究所使用新鲜玉米(ZeamaysL)及四季豆(Phaseolusvulgaris L.)饲养，饲养温度为25-28℃，相对湿度为60％-70％，光照为16:8(L:D)。取绿盲蝽不同龄期的全虫(蜕皮24小时内)，成虫的触角、头、喙、足、腹、翅等组织，置于-70℃冰箱等待使用。
3.RNA的提取
昆虫总RNA提取的全部过程在无RNA酶条件下进行。整个提取步骤如下所示：
1)取-70℃保存的昆虫组织，加入已经用液氮预冷的玻璃匀浆器中，立即向匀浆器内加入1mL Trizol试剂，将组织充分研磨磨碎；将研磨好的组织溶液用无RNA酶的枪头转移到无RNA酶的1.5mL离心管中，暂时至于冰上。
2)4℃，12000g离心15min，将上清转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中。
3)将上清在室温下放置5min后，向离心管中加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡15s，再室温静置2-3min。
4)4℃，12000g离心15min，混合物在此后分层，下层为有机相，上层为水相(RNA就在水相中)，用无RNA酶的枪头将上层水相转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中，注意尽量不要吸到中间层，以免其中的蛋白质或DNA对所提取RNA造成污染。
5)加入0.5mL异丙醇，混匀后，室温静置10min，沉淀RNA。
6)4℃，12000g离心10min后，观察到的沉淀即为RNA,弃上清(尽量吸净)，加入1mL75％的乙醇(用去RNA酶水配置，现用现配)，轻轻震荡离心管悬浮沉淀，洗涤沉淀。
7)4℃，7500g离心10min后，弃上清(尽量吸净)，超净台中干燥沉淀5-10min。
8)加入10-20μL去RNA酶水(根据RNA量而定)，轻弹离心，使沉淀充分溶解。
9)55-60℃温育后，取1μL样品稀释至5μL，其中2.5μL进行电泳检测，2.5μL用超微量分光光度计检测；剩余的样品用于cDNA合成或者保存于-70℃冰箱。
4.3’-RACE cDNA模板的制备
整个过程在无RNA酶污染的条件下进行，操作步骤按SMARTerTM RACE cDNAAmplification试剂盒进行，具体如下：
1)准备缓冲液体系：将2μL的5×First-Strand缓冲液；1μL的DTT(20mM)；1μL的dNTPMix(10mM)依次加入到一个无RNA酶的PCR管中,置于室温等待下步反应。
2)另备一无RNA酶的PCR管，依次加入1-3.75μL的总RNA；1μL的5’-CDS Primer A，补水至4.75μL。
3)72℃温育3min，后42℃温育2min(PCR仪控温)，冷却后，14000g简单离心10s。
4)准备母液体系：将步骤1中准备好的4μL的缓冲液混合物中依次加入0.25μL的RNA酶抑制剂(40U/μL)；1μL的SMARTScribe反转录酶(100U)。
5)将5.25μL母液体系加入到步骤3中的PCR管中，轻柔混匀，简单离心。
6)42℃温育90min，后70℃加热10min。
7)根据总RNA的量，用Tricine和EDTA配置的缓冲液稀释产物，-20℃冰箱保存。
5.第一链cDNA的合成
整个反转录过程在无RNA酶污染的条件下进行，操作步骤按Revert Aid First Strand cDNASynthesis试剂盒进行，具体如下：
1)在无RNA酶的PCR管中依次加入：2μg RNA(根据超微量分光光度计定量的结果计算应该加入RNA的体积数)，DNaseⅠ1μL，1μL Ribolock RNA酶抑制剂，混有MgCl2的10×Reaction缓冲液1μL with，用去RNA酶水将体系补足到10μL；轻微震荡后离心；
2)37℃温育30min后，向体系内加入1μL 50mM EDTA，震荡后离心，然后65℃温育10min；
3)加入1μL oligo-dT，用去RNA酶水补至12μL；
4)65℃温育5min后，立即置于冰上；
5)依次加入下列试剂，使体系达到2μL：4μL的5×Reaction缓冲液；2μL的dNTP Mix(10mM)；1μL的Revert Aid反转录酶和1μL的Ribolock RNA酶抑制剂；简单混匀离心；
6)42℃温育1h，然后再70℃温育5min；
7)合成后存于-20℃或者-70℃冰箱，使用前按情况稀释若干倍。
6.DTRC基因的扩增、测序
分析绿盲蝽转录组仅得到DTRC基因cDNA的序列片段，需要设计特异性引物通过RACE技术获得DTRC基因3’-末端的序列，从而拼接得到全长序列。首先根据已知序列片段设计了两条3’-RACE特异引物DTRC-3RACE-F1及DTRC-3RACE-F2，通过巢氏PCR得到3’-末端的序列。通过转绿组分析及3’-RACE扩增，成功得到DTRC基因的起始密码子与终止密码子。进一步设计巢式引物来扩增DTRC基因的全长序列，首先根据5’-及3-’端非编码区序列，设计外侧引物DTRC-F0与DTRC-R0进行第一轮PCR扩增，随后以第一轮PCR产物为模板，以内侧引物DTRC-F与DTRC-R来进行第二轮全长扩增。
上述试验中详细的引物序列如下：
DTRC-3RACE-F1：AAAGTGTATCCCAACAATGCCAAC
DTRC-3RACE-F2：ACGAGAGCACGAAAAATCCCATG
DTRC-F0：GTCCAACAACAACTGAACATCG
DTRC-R0：CGTCCAACGTGTTAATCAAAGT
DTRC-F：ATGGAATCCAAACGACCTGGC
DTRC-R：TTACTCCCTTAATTTAATAGAG
上述试验中RACE反应体系为：ExTaq Buffer(Mg2+Plus)2.5μL，dNTP混合物2μL，F引物(10μM)1μL，R引物(10μM)1μL，cDNA模板1μL，ExTaq 0.125μL，灭菌水补足25μL体系；反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增全长引物的PCR反应体系：10×LA PCR缓冲液II(Mg2+Plus)5μL，dNTP混合物(2.5mM)8μL，cDNA模板2μL，F引物(10μM)2μL，R引物(102μM)2μL，LATaq0.5μL，灭菌水补足50μL体系；反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸3min，35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶溶解在1×TAE的缓冲液中进行检测。在长波紫外灯下切下与目的DNA片段大小相符的凝胶，置于1.5mL的离心管中，用全式金的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(操作步骤按试剂盒内附带的说明书进行)。回收的3’RACE片段连接到pEASY-T3载体上，全长片段连接到Promega的pGEM-T载体上，用Thermo的T4连接酶连接(操作按照说明书进行)。连接体系转化至全式金Trans1-T1感受态细胞(转化步骤按感受态细胞附带的说明书进行)，培养过夜后，挑取白色单克隆进行PCR验证，阳性克隆用含有浓度为100μg/mL的氨苄的液体LB培养基震荡培养过夜，保种后送测序。测序结果使用DNAMAN软件进行拼接、比对，选择具有正确开放阅读框的克隆进行下一步的实验。
克隆得到DTRC基因的全长为2736bp，编码的911个氨基酸，详细的核酸序列和氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示。
实施例2 DTRC基因表达谱分析和氨基酸序列结构分析
1.DTRC基因的表达谱分析
根据DTRC基因的序列设计一对特异引物，以GADPH基因为内参，通过Real-time PCR分析DTRC基因在绿盲蝽不同发育阶段及成虫不同组织中的表达谱，结果见图2。绿盲蝽不同发育阶段中，DTRC基因在1龄若虫中的相对表达量最高，随着龄期的增加，相对表达量越来越低(图2A)。在绿盲蝽成虫不同组织中，足中DTRC基因的表达量最高，其次是触角和翅(图2B)。上述试验中详细的引物序列如下：
AlucGADPH-QF:CGAGTTCCTGTCCCTAATGTTTC
AlucGADPH-QR:GCCTCCTTCACCTTCTGCTT
AlucDTRC-QF:GAAGGGAATGATGGCTCTTACA
AlucDTRC-QR:GTTCGGATCAACTCCCTCATC
2.DTRC通道蛋白氨基酸序列结构分析
序列测序正确后，使用在线软件工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)对DTRC氨基酸序列进行蛋白二级结构域及功能域预测，使用在线软件TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对DTRC氨基酸序列的跨膜结构域预测，如图1所示。图中ANK代表锚蛋白重复序列，TM代表跨膜结构域，预测结果结果表明DTRC通道蛋白在N端有8个锚蛋白重复序列(ankyrin repeat)和6次跨膜结构域(transmembrane domain)。
实施例3 DTRC基因表达载体的构建
利用DNAMAN软件分析DTRC序列的酶切位点，结合PT7TS表达载体(Invitrogen)的多克隆酶切位点，设计带有酶切位点的引物，带酶切位点的F引物需要在酶切位点后加入Kozak序列(GCCACC)来增强真核基因的表达效果。PCR扩增获得DTRC的全长序列，反应体系及条件参照HS DNA Polymerase使用说明进行。PCR产物及PT7TS载体分别用Thermo的限制性内切酶处理，酶切产物用Thermo的T4连接酶连接(操作参照说明书)。连接体系转化至Trans 1-T1感受态细胞，培养过夜后，挑取白色单克隆进行PCR验证，然后送公司测序。详细的引物序列如下：
AlucDTRC-F-SpeI：GACTAGTgccaccATGGAATCCAAACGACCTGGC
AlucDTRC-R-NotI：TTGCGGCCGCCTATGCACGAAATTGCTGATTC
构建的表达载体测序正确后，提取重组质粒进行单酶切线性化，合成cRNA。实验步骤如下：利用SmaI将连到表达载体上的质粒进行单酶切，酶切体系为：45μL重组质粒、8μL的10×TBuffer、4μL的SmaⅠ、4μL的BSA，用水补足80μL体系；30℃温育3h，之后取1μL的酶切产物，电泳检测是否完全切开。
确定切开后进行酚-氯仿抽提，实验步骤如下：
1)在线性化质粒体系中加入120μL ddH2O，再加入200μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)；充分震荡后，10000rpm，常温离心10min；
2)使用无RNA酶的枪头转移上清液160μL于去RNA酶-的离心管中，加入0.5μLGenEluteLPA，20μL 3M NaAc(pH＝5.2)、400μL100％乙醇，轻轻混合后，-20℃沉淀2-3h；
3)4℃，14000rpm，离心30min；弃上清，加1mL 80％乙醇洗沉淀，离心5min，弃乙醇，风干沉淀；
4)加7μL去RNA酶水，取0.5μL电泳检测。理想的结果应该是单一的非常亮的带。
在检测正确的基础上，利用mMESSAGE mMACHINET7(Ambion)试剂盒进行cRNA的合成，实验步骤如下：
1)在另取的无RNA酶的1.5mL离心管中分别加入下列试剂，使体系达到20μL：10μL的T72×NTP/CAP，2μL的T710×Reaction缓冲液，6μL的线性化质粒模板和2μL的混合酶；充分混匀后，37℃温育2h；
2)向体系中分别加入30μL的去RNA酶水和30μL的氯化锂溶液；充分混匀后，4℃静置过夜；
3)4℃，12000rpm，离心30min；弃上清，加1mL 70％乙醇洗沉淀，12000rpm离心5min，弃乙醇，风干沉淀；
4)加8μL去RNA酶水溶解沉淀，取1μL稀释五倍，一半用来电泳检测，一半用来测定含量。
实施例4 DTRC基因感知温度刺激的功能研究
将合成好的DTRC基因cRNA稀释到2μg/μL，以50.6nL的量注射到健康且成熟的爪蟾卵母细胞中，注射好的细胞存放于18℃恒温培养箱中培养。培养2-3天后，利用双电极电压钳记录表达DTRC基因的爪蟾卵母细胞对温度刺激的反应。记录仪器为OC-725C卵母细胞电压钳，具体数据的获取和分析则是利用仪器Digidata 1440A和软件pCLAMP 10.2。
卵母细胞培养基、洗液、灌流缓冲液的制备：蒸馏水、抽滤瓶等提前灭菌，称取NaCl：56.1g、KCl：1.5g、MgCl2·6H2O：10.2g、HEPES：11.9g，灭菌水定容至1L，即10×Ringer，NaOH调节PH至7.6，抽滤备用。四环素、链霉素、庆大霉素及丙酮酸钠用灭菌水分别配成50mg/ml、100mg/ml、10mg/ml、275mg/ml的贮备液，CaCl2·2H2O配成60mm的100×CaCl2贮备液。爪蟾卵母细胞洗液由10×Ringer 100ml、1ml庆大霉素贮备液定容到1L后抽滤待用。爪蟾卵母细胞培养基由10×Ringer 100ml、100×CaCl210ml、马血清50ml、四环素贮备液1ml、链霉素贮备液1ml及丙酮酸钠贮备液2ml灭菌水定容到1L后抽滤待用。灌流缓冲液(1×Ringer)组分与洗液基本相同，但灌流液中每升加入10ml 100×CaCl2贮备液。爪蟾卵母细胞对温度刺激的反应利用GraphPadPrism 5.0进行作图分析。
对于热刺激，当温度从20℃升到所需温度时，立即停止热刺激，使用20℃的缓冲液灌流，直到细胞状态回到基线的位置再进行下一次的刺激。注射DTRC基因cRNA的爪蟾卵母细胞对温度刺激的反应如图3所示，对照爪蟾卵母细胞对20-45℃的热刺激仅产生<100nA的电流值(图3A)，而表达DTRC基因的爪蟾卵母细胞能够被20℃至45℃逐渐升高的热刺激激活(图3B)，产生的平均电流为700nA左右(图3C)。用一系列温度梯度刺激表达DTRC基因的爪蟾卵母细胞时，统计结果显示当温度>40℃时，爪蟾卵母细胞的电流值才与对照爪蟾卵母细胞存在明显差异，表明表达DTRC基因的爪蟾卵母细胞被>40℃的温度激活(图4)。
实施例5 绿盲蝽对温度刺激的行为分析
绿盲蝽对温度刺激的行为学实验在温度梯度平板上进行，一端用加热板加热，另一端用冰水循环降温，控制平板0.6-0.7℃/cm。将30头绿盲蝽成虫(♀：♂＝1：1)投放到22-25℃温度区域，30min后观察记录绿盲蝽在温度平板上的分布情况。经过多次生物学重复，统计绿盲蝽在温度平板上的分布，如图5所示。统计结果表明绿盲蝽在16-40℃的温度区域中均有分布，特别是其最适的生长温度25-28℃的区域所占比例最高，而>40℃的伤害温度范围内几乎没有绿盲蝽。因此，绿盲蝽能够躲避40℃以上的伤害性温度，且该温度与DTRC基因的激活温度接近。

Claims (10)

1.绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白，命名为DTRC通道蛋白，其特征在于：
(a)其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；或
(b)在(a)中的氨基酸序列经过一个或者多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有相同活性的由(a)衍生的蛋白质；或
(c)与SEQ ID NO.1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白。
2.编码权利要求1所述的绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白的基因。
3.根据权利要求1所述的基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表述载体，所述基因序列如SEQ ID NO2所示，其中骨架载体为原核表达载体PT7TS。
6.含有权利要求2或3所述基因的转化植物细胞。
7.根据权利要求6所述的转化植物细胞，所述基因序列如SEQ ID NO2所示，其中宿主细胞为爪蟾卵母细胞。
8.权利要求1所述的绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白在制备杀虫剂中的应用。
9.根据权利要求1所述的应用，所述绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白或者编码绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白的基因在杀虫剂中为靶标。
10.权利要求1所述的绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白或者权利要求2或3所述的基因的制备方法，通过从半翅目盲蝽科昆虫绿盲蝽(Apolyguslucorum)提取、基因工程或化学方法制备而得到。
CN201510484865.4A 2015-08-08 2015-08-08 绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用 Pending CN104987376A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510484865.4A CN104987376A (zh) 2015-08-08 2015-08-08 绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510484865.4A CN104987376A (zh) 2015-08-08 2015-08-08 绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104987376A true CN104987376A (zh) 2015-10-21

Family

ID=54299291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510484865.4A Pending CN104987376A (zh) 2015-08-08 2015-08-08 绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104987376A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399483A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 中国农业科学院植物保护研究所 对绿盲蝽进行rna干扰的饲喂方法及其在基因筛选上的应用
WO2017118260A1 (zh) * 2016-01-04 2017-07-13 北京大北农科技集团股份有限公司 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法
CN114507669A (zh) * 2021-10-09 2022-05-17 宁波大学 点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102399277A (zh) * 2010-09-16 2012-04-04 中国农业科学院植物保护研究所 一种来源于苜蓿盲蝽的OBPs蛋白及其编码基因
CN103060467B (zh) * 2013-01-28 2014-02-05 中国农业科学院植物保护研究所 一种用气味结合蛋白15基因检测昆虫自残率的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102399277A (zh) * 2010-09-16 2012-04-04 中国农业科学院植物保护研究所 一种来源于苜蓿盲蝽的OBPs蛋白及其编码基因
CN103060467B (zh) * 2013-01-28 2014-02-05 中国农业科学院植物保护研究所 一种用气味结合蛋白15基因检测昆虫自残率的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
付婷等: "绿盲蝽TRPA1基因的鉴定及功能分析", 《中国农业科学》 *
无: "XP_001950177.2", 《GENBANK》 *
魏金金等: "豌豆蚜温度受体基因Painless 的克隆及时间和组织表达", 《中国农业科学》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017118260A1 (zh) * 2016-01-04 2017-07-13 北京大北农科技集团股份有限公司 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法
US10676741B2 (en) 2016-01-04 2020-06-09 Beijing Dabeinong Biotechnology Co., Ltd. Nucleotide sequence and method for controlling insect infestation
CN106399483A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 中国农业科学院植物保护研究所 对绿盲蝽进行rna干扰的饲喂方法及其在基因筛选上的应用
CN114507669A (zh) * 2021-10-09 2022-05-17 宁波大学 点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP及其应用
CN114507669B (zh) * 2021-10-09 2023-07-11 宁波大学 点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104610440B (zh) ABC转运蛋白基因ABCH1及其特异性dsRNA在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用
CN106191114A (zh) 利用CRISPR‑Cas9系统敲除鱼类MC4R基因的育种方法
CN108893472B (zh) 一种dsRNA及其在防治德国小蠊上的应用
CN103571844B (zh) dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用
Hu et al. Identification, characterization and immunological analysis of Ras related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) from grass carp Ctenopharyngodon idella
CN103088024A (zh) 两种dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用
CN104987376A (zh) 绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用
CN104293797B (zh) 褐飞虱生长发育相关的NlAKTIP基因、编码蛋白及其应用
CN106520768A (zh) 一种基于RNAi后雄性不育对褐飞虱种群控制效果的饲养和评价方法
CN104561006A (zh) 舞毒蛾CYP6AN15v1基因dsRNA及其在无公害防治中的应用
CN104650220B (zh) 绿盲蝽温度气味受体蛋白及其编码基因和应用
Ogo et al. Molecular identification of Cordylobia anthropophaga blanchard (Diptera: calliphoridae) larvae collected from dogs (Canis familiaris) in Jos south, plateau state, Nigeria
CN103667288A (zh) 一种抑制麦蚜细胞色素C氧化酶VIIc亚基基因表达的dsRNA及其应用
CN104404042B (zh) 一种东亚飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA在害虫防治中的应用
CN106399308A (zh) zfy基因的RNA干扰片段、表达载体及其应用
CN105349547A (zh) 一种提高家蚕蛹体重量的方法
CN102586259B (zh) 甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用
CN103602681A (zh) 一种抑制麦蚜腺体蛋白MYS2基因表达的dsRNA及其应用
CN108753791B (zh) 绿盲蝽decapentaplegic基因及其RNAi在害虫防控中的应用
CN101225385B (zh) 茶尺蠖卵黄蛋白原基因vtg及其应用
CN106367428A (zh) 一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用
CN104263731B (zh) 一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用
CN106434680A (zh) 一种虾类雄性化基因及其应用
CN102613121B (zh) 一种暗色唇鱼的人工繁殖方法
Hilsdorf et al. The genetic bases of physiological processes in fish

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151021