CN103993079A - 对绿盲蝽进行rna干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对绿盲蝽进行RNA干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用，属于生物技术领域。一种对绿盲蝽进行RNA干扰的注射方法，其特征在于：注入dsRNA的注射位置为后胸与腹部节间膜的最外侧。首次建立了用于绿盲蝽基因功能研究的RNAi平台；创造性采用注射法对绿盲蝽进行RNAi时的最佳注射位置和特定dsRNA浓度下的最佳注射体积进行确定，检测并记录注射后绿盲蝽表现型的改变。该方法为筛选新的抗虫基因提供新的技术手段和平台，为发展抗绿盲蝽转基因作物提供新的基因资源进而依此达到发展经济有效，环境友好的新的方法来控制绿盲蝽的危害。

Description

对绿盲蝽进行RNA干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及对绿盲蝽进行RNAi的注射方法以及利用该方法在筛选绿盲蝽生长发育关键基因上的应用。 
背景技术
随着Bt棉花的大面积种植，棉铃虫的为害得到了有效地控制，然而绿盲蝽逐渐成为为害我国农业生产，尤其是棉田的重要害虫，发生面积占种植面积的90％左右，严重威胁棉花生产，导致棉花产量损失10％～20％。此外，绿盲蝽在为害棉花的同时，还影响栆、桃、樱桃、苹果和葡萄等农作物的生产。目前，对绿盲蝽的防治措施主要依靠化学防治。然而，长期大量使用农药进行害虫防治不仅会杀伤天敌、降低田间作物的自然调节能力、对自然环境造成污染、破坏生态平衡，而且长此以往，会增加绿盲蝽对化学农药产生抗性的风险。因此，开发一条经济有效、环境友好的绿色防治途径来控制绿盲蝽的危害成为当前迫在眉睫的重要任务之一。 
RNA干扰(RNAi)技术是当今研究基因功能以及健康有效防治害虫的一个重要手段和研究热点。利用注射的方法进行RNAi实验用以筛选昆虫生长发育关键基因，在此基础上发展有效的抗虫转基因作物，可以为害虫防治提供一条新的可行途径。RNAi是由双链RNA引发的基因沉默现象，其作用机制是通过诱发对同源mRNA的高效特异性降解来干扰目标基因的表达。当与内源性mRNA编码区同源的双链RNA导入细胞时，其被降解成21-23bp长度的小分子RNA即siRNA，RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)结合siRNA并将其解旋成单链，引导单链siRNA根据碱基互补配对原则特异性地结合同源mRNA(靶标)，使mRNA发生断裂而导致基因表达沉默。 
RNAi是基因功能研究的一个革命性的发现，它极大的扩展了基因研究的思路和方法。从发现至今，RNAi技术在人类医学，基因工程以及农业等各个领域得以应用，并取得了很多突破。在医学方面，此技术已被用于临床疾病治疗，如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等。在农业害虫防治领域，2007年Baum等人在鞘翅目昆虫西方玉米根虫(WCR)中利用RNAi技术沉默290个基因后，发现其中125个基因有明显致死效果。至今为止，RNAi技术主要在双翅目、膜翅目、同翅目、鞘翅目、等翅目、鳞翅目和直翅目7个目中的15种昆虫中得到成功应用。由于RNAi现象在昆虫纲中是存在的，某些基因RNAi沉默后能够导致昆虫的死亡，所以如果能够利用转基因植物表达出特异的dsRNA，让 昆虫在取食过程中摄入，对某些农业害虫的生长发育进行控制，从而能够将这种RNAi介导的转基因植物发展成一种害虫控制的新策略，为有效控制和防治农业害虫提供一条可行的途径和良好的前景。 
然而，由于利用RNAi技术培育转基因植物，周期长，成本高，不能实现从大量基因中筛选功能基因，所以在成功发展转基因植物之前能够寻找既经济又简单快捷的方法筛选鉴定大量基因从而找到候选基因显得尤为重要。 
同时，有关半翅目昆虫RNAi实验的报道中，尚未有任何关于绿盲蝽抗虫基因及绿盲蝽RNAi的实验报告。因此，从绿盲蝽的大量基因中筛选鉴定对其生长发育起关键作用并在RNAi后能够影响其生长并导致死亡的基因，可以为接下来利用RNAi发展转基因植物，用以防治当前棉花重要害虫绿盲蝽提供重要的依据和基础，从而降低杀虫药剂使用量以及绿盲蝽抗药性的产生，避免新的生态问题产生，具有重要的经济、生态和社会效益。 
虽然目前已经有关于，但是在技术方案之前，向绿盲蝽导入dsRNA能否引发RNAi效果并产生致死表型不得而知。 
发明内容
本发明提供一种对绿盲蝽进行RNAi实验的注射方法，对绿盲蝽进行RNAi实验的注射参数(包括注射位置、注射体积，注射dsRNA总量)进行确定，并挑选了绿盲蝽持家基因β-actin验证绿盲蝽导入dsRNA能否引发RNAi效果并产生致死表型，结果表明导入β-actin基因dsRNA可以导致绿盲蝽生长发育受到严重不利的影响，甚至死亡的结论。该方法为筛选新的抗虫基因提供新的技术手段和平台，为发展抗绿盲蝽转基因作物提供新的基因资源进而依此达到发展经济有效，环境友好的新的方法来控制绿盲蝽的危害。 
对绿盲蝽进行RNAi实验的注射方法，其特征在于：注射位置为后胸与腹部节间膜的最外侧。 
所述用于注射的dsRNA浓度为10μg/μl，注射体积为41.4nl。 
所述绿盲蝽为3L若虫。 
一种建立绿盲蝽生长发育关键基因的筛选方法，包括如下步骤：(1)取绿盲蝽总RNA，通过RT-PCR得到cDNA；(2)选定目标基因一段特异性片段，设计带有T7序列的特异性引物；(3)通过PCR技术扩增目的基因片段：以第一步得到的cDNA为模板，第二步设计的特异引物扩增，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(4)构建含有选定目的基因片段的载体：将目的基因片段用T4DNA连接酶插入载体PGM-T中，转入宿主大肠杆菌中，富集培养，提取含有目的基因片段的质粒；(5)以上一步所提取含有目的基因片段的质粒为模板，第二步设计的特异性引物扩增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(6) 利用T7RNA聚合酶将上一步得到的PCR产物合成为目的基因片段dsRNA；(7)将dsRNA按上述注射方法导入绿盲蝽的体内，持续饲养记录若虫经RNAi后的表现型；(8)统计死亡率，确认该目的基因与生长发育的关系。 
所述特异性片段为400-500bp。 
所述目的基因为绿盲蝽β-actin基因，其序列如SEQ ID NO1所示。 
所述绿盲蝽β-actin基因的特异性片段序列如SED ID NO4所示。 
所述步骤(7)的同时，将GFP基因的dsRNA作为对照组注射入绿盲蝽体内，所述GFP基因序列如SEQ ID NO2所示。 
所述GFP基因的特异性片段序列如SEQ ID NO3所示。 
所述持续饲养时间为5-10天。 
本发明用注射法对绿盲蝽进行RNAi实验的注射参数(包括注射位置、注射体积，注射dsRNA总量)进行确定，并挑选了绿盲蝽持家基因β-actin验证绿盲蝽导入dsRNA能否引发RNAi效果并产生致死表型，结果表明导入β-actin基因dsRNA可以导致绿盲蝽生长发育受到严重不利的影响，甚至死亡的结论。 
本发明首次建立了用于绿盲蝽基因功能研究的RNAi平台；同时利用建立的RNAi平台筛选得到了持家基因、能量代谢相关基因、细胞凋亡相关基因等多个与绿盲蝽生长发育密切相关的基因。本研究为筛选新的抗虫基因提供了新的技术手段和平台，为发展抗绿盲蝽转基因作物提供了新的基因资源。实践表明，发展转基因抗虫作物能有效地控制害虫危害，RNAi是由双链RNA引发的基因沉默现象，其作用机制是通过阻止同源基因的翻译或者转录而实现基因沉默。 
附图说明
图1 3龄绿盲蝽的注射位置 
其中：I：前胸和中胸的节间膜 
II：后胸与腹部节间膜的最外侧 
III：腹部第2和第3节间膜最外侧 
图2注射dsGFP与注射dsβ-actin绿盲蝽7天内生存率。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下面涉及到的化学试剂均为市售。 
1、绿盲蝽总RNA的提取 
绿盲蝽总RNA提取的过程在超净工作台内进行(离心除外)，以避免RNA酶(RNase)污染降解RNA。整个提取步骤如下所示： 
1.取3-5头经过72小时饥饿处理的绿盲蝽，加入经液氮冷却的玻璃匀浆器中，立即向匀浆器内加入1ml RNA提取试剂(Trizol)，将组织磨碎；将研磨好的组织溶液倒入1.5ml无RNA酶的离心管中，置于冰上； 
2.4℃，12000g离心15min，将上清液体转移到新的1.5ml无RNA酶离心管中； 
3.将上清在室温下放置5min后，向离心管中加入200μl氯仿，用手剧烈震荡15s，再室温静置2-3min； 
4.4℃，12000g离心15min，混合物在此时分层，下层为有机相，上层为水相(RNA在水相中)；将上层水相转移到新的1.5ml无RNA酶离心管中，向离心管中加入500μl异丙醇，室温静置10min； 
5.4℃，12000g离心10min后，弃掉上清(尽量吸净)，向离心管中加入1ml75％的乙醇(用无RNA酶的H2O配置，现用现配)，震荡离心管以洗涤沉淀； 
6.4℃，7500g离心10min后，弃掉上清(尽量吸净)，在超净工作台中干燥5-10min； 
7.加入20μl无RNA酶的H2O，震荡离心，使沉淀充分溶解； 
8.60℃温育10min后，取1μl样品稀释至5μl，其中2.5μl进行电泳检测，2.5μl用浓度测量仪器(NanoDrop)检测浓度；如果凝胶电泳检测结果合格且样品OD值如下： 
260/280:1.80～2.00 
260/230:1.80～2.00 
则说明RNA质量良好，存于-80℃备用。 
2、第1链cDNA的合成 
整个反转录过程尽量保证在超净工作台内进行，操作步骤按第一链cDNA合成试剂盒进行，具体操作如下： 
1.在新的1.5ml无RNA酶离心管中加入2μg RNA(根据浓度测量的结果计算需加入RNA的体积数)，再加入1μl引物(oligo-dT)，用无RNA酶的H2O补至12μl； 
2.65℃温育5min，之后马上置于冰上； 
3.在离心管中分别加入下列试剂，使体系达到20μl：4μl的5×反应缓冲液；2μl的dNTP混合物(10mM)；1μl的反转录酶和1μl的RNA酶抑制剂；简单混匀后，离心片刻； 
4.42℃温育1h，然后再70℃温育5min；合成后存于-20℃冰箱，使用前稀释10倍。 
3、靶标基因的克隆 
本发明选取了持家基因、能量代谢相关基因和细胞凋亡相关基因上的基因片段，通过注射法研究其对昆虫的影响，GFP基因上的片段作为对照。持家基因又称管家基因，是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的；而能量代谢相关 基因和细胞凋亡相关基因也在绿盲蝽生长发育和生理过程中起着非常重要的作用。本发明选取此类基因上的片段，利用注射法进行RNAi将其沉默，研究观察沉默该基因后，对绿盲蝽个体发育造成的影响。GFP即绿色荧光蛋白，在昆虫体内并不存在，故大量研究中将其作为对照基因合成dsRNA。 
1.靶标基因引物的设计： 
(1)利用BLAST检索数据库，搜索绿盲蝽的相近物种同一靶标基因的蛋白或者cDNA编码的氨基酸序列，用绿盲蝽成虫若虫转录组组建的本地BLAST库进行比对查询，确定所选基因的序列。 
(2)根据靶标基因的片段，用Primer Premier5.0软件设计带T7启动子的引物，引物设计原则如下： 
a.引物设计的区间要在靶标基因的编码区，中间片段大小在400～500bp左右。 
b.中间片段尽量选在靶标基因的特异区域。 
c.引物之间不能形成引物二聚体，交叉二聚体。 
2.根据以上引物设计原则设计引物后，送至华大基因进行引物合成。 
3.相关靶标基因的引物序列见表1-1。 
表1.实验所用引物 
4、目的片段的PCR扩增、测序及序列分析 
1.以绿盲蝽cDNA为模板，用ExTaq酶扩增表1-1中基因。反应体系为25μl：17μl重蒸水，2.5μl 10×反应缓冲液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl cDNA，1μl F引物(10mM)，1μl R引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。 
2.PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测正确的PCR产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(操作步骤按试剂盒内附带的说明书进行)，回收的片段连接到pGME-T载体上(体系为8μl胶回收产物、1μl 10×T4链接反应缓冲液、0.5μl pGME-T载体和0.5μl T4连接酶，16℃条件下连接过夜)，连接体系转化Top10感受态细胞(转化步骤按感受态细胞附带的说明书进行)，培养过夜后，挑取8个阳性克隆进行PCR验证(体系和条件同上)，将检测正确的克隆用液体LB培养基(含氨苄抗生素)培养过夜检验目的片段序列。 
3.根据测序结果，将正确的菌株加入含有氨苄抗生素的新鲜LB培养基重新摇菌，获得新鲜的菌液，将1ml菌液和百分之八十的甘油按照9:1比例混合，存于-80℃低温冰箱保存。将剩余的菌液进行质粒提取。序列结果见序列表。 
5、dsRNA模板的制备 
以带有靶标基因片段的质粒为模板，用聚合酶扩增。反应体系为25μl：17μl重蒸水，2.5μl10×反应缓冲液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl载有靶标基因片段的质粒，1μl正向(F)引物(10mM)，1μl反向(R)引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-60℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。 
将1μl PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。如果所得条带长度与目的片段长度一致，并且结果显示为单一明亮的条带，则将剩余的PCR产物进行酚氯仿抽提与纯化。 
PCR产物的酚氯仿抽提的步骤： 
1.将需要纯化的PCR产物用无RNA酶的H2O定容至200μl 
2.加入等体积(200μl)的酚氯仿试剂(一定取酚氯仿试剂的下层，并且拿试剂瓶时要平稳，不能晃动)。 
3.温和混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min. 
4.4.取上清，加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2倍体积(400μl)的100％乙醇(-20℃贮存)，温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。 
5.在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)30min. 
6.白色沉淀积于离心管底部，弃上清液(为防止沉淀一起被吸出，可保留些许上清液)，加入75％乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀，洗涤沉淀 
7.在4℃离心机下离心(7500rpm，4℃)5min. 
8.将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥，10min左右，待乙醇全部挥发。 
9.加入5μl RNase–free H2O轻弹管底，让沉淀充分均匀溶解于无RNA酶的H2O。 
10.取1μl溶液溶于4μl无RNA酶的H2O中，用浓度测量仪器检测浓度和OD值。用凝胶电泳检测产物单一性，如果检测条带是单一明亮的条带，并且其OD值为： 
260/280:1.8-2.0 
260/230:1.8-2.0 
则说明PCR产物质量良好，可以作为下一步合成dsRNA的模板使用。 
6、dsRNA的合成 
1.将ATP，CTP，GTP，UTP(100mM)放于冰上慢慢融化，5×反转录缓冲液室温融化，T7RNA聚合酶放于-20℃贮存，随用随拿，用完立即放入-20℃环境下贮存。溶解以后轻弹管底，瞬时离心，将试剂离心到管底。 
2.按以下比例将试剂混合： 
轻弹混匀，瞬时离心。放入37℃金属浴中4小时。 
3.从金属浴中取出离心管，放入75℃金属浴中5min，然后放置室温冷却(切勿放在冰上)。吸出1μl，稀释5倍，凝胶电泳检测产物条带。 
4.去除DNA和ssRNA.按照比例加入下列试剂： 
充分混匀，轻弹管底，瞬时离心后，放入金属浴37℃30min，加入EDTA试剂1μl,65℃金属浴中放置5min终止反应。取1μl产物，稀释5倍，凝胶电泳检测产物单一性，浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测条带是单一明亮的条带，并且其OD值为： 
260/280:1.8-2.0 
260/230:1.8-2.0 
则说明dsRNA质量良好，可以进行下一步dsRNA酚氯仿抽提。 
7、dsRNA的酚氯仿抽提 
1.将需要纯化的dsRNA(～60μl)用无RNA酶的H2O定容至200μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。 
2.加入1/2体积(100μl)的水饱和酚试剂(一定取水饱和酚试剂的下层，并且拿试剂瓶时要平稳，不能晃动)和1/2体积的氯仿(100μl)。 
3.轻轻混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min。 
4.取上层水相，加入的等体积氯仿(200μl)，轻轻混匀，在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)15min。 
5.取上层水相，加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积(500μl)的100％乙醇(-20℃贮存)，温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。 
6.在4℃离心机下离心(12000rpm，4℃)30min。 
7.白色沉淀积于离心管底部，弃上清液(为防止沉淀一起被吸出，可保留些许上清液)，加入80％乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀，洗涤沉淀。 
8.在4℃离心机下离心(7500rpm，4℃)5min。 
9.将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥，10min左右，待乙醇全部挥发。 
10.加入5μl无RNA酶的H2O轻弹管底，让沉淀充分均匀的溶解于无RNA酶的H2O中。 
11.取1μl溶解的dsRNA产物稀释于4μl DEPC H2O中，用凝胶电泳检测产物单一性，并用浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测的条带是单一明亮的条带，并且其OD值为： 
260/280:1.8-2.0 
260/230:1.8-2.0 
则证明dsRNA质量良好，可以进行绿盲蝽体内注射RNAi实验。 
8、3龄(3L)绿盲蝽的准备 
本发明中所选绿盲蝽为3L若虫，现以3L若虫的收集方法如下：收集1L初孵若虫(200～300头)，放入养虫盒中，盒中放入干净滤纸和一根去皮的新鲜玉米，约4天后所有1L若虫成长为3L若虫，准备铺好滤纸和7～8粒新鲜玉米粒的塑料培养皿，每个培养皿里放20只3L若虫，放若虫时，用软毛刷轻轻挑取，以免对若虫造成不必要的机械损伤。 
9、绿盲蝽RNAi注射方法的具体实施 
将以上所述的3L绿盲蝽，注射前用CO2充入装有若虫的培养皿片刻以使若虫麻醉。然后用毛刷轻轻将若虫挑入注射平板(注射平板底部为1％琼脂糖凝胶)，腹部朝上，用显微注射仪(Nanolatter2000)注射3龄若虫，注射虫量为40-100头为一组重复，至少重复三次， 统计总数至少为120头/基因。注射完成后将装有3L若虫的培养皿放在光照培养箱内饲养，L:D＝16：8，空气湿度:55-60％，每天更换玉米粒，注意保持培养皿内清洁。每隔24小时统计每个培养皿中死亡虫体数量，并做详细记录与统计。 
1.最佳注射部位的确定 
注射位置分别为绿盲蝽的前胸和中胸的节间膜(位置标记：I)，后胸与腹部节间膜的最外侧(位置标记：II)，腹部第2和第3节间膜最外侧(位置标记：III)，如图1所示。注射体积为41.4nl。我们使用同一剂量(41.4nl)RNase-free H2O分别对图1中所标记的三个位置进行注射，自注射后连续7天统计生存率，以确定最佳注射位置。具体数值见表2，结果表明，注射前胸和中胸节间膜(I)所造成的死亡率明显高于注射后胸与腹部的节间膜最外侧(II)和第2腹节与第3腹节节间膜最外侧(III)，故首先排除选取I作为注射部位。在比较注射位置II和注射位置III之时，虽然这两个注射部位的死亡率相近，但是，由于腹部(位置III)表皮之下有大量体液，注射针扎入后有大量体液流出，同时也可能造成注入的dsRNA随之流出，故不选用此位置注射。因此，我们选取II作为本发明的注射位置。 
表2.三个不同位置注射41.4nl的无RNA酶的H2O绿盲蝽7天内的存活率 
2.最佳注射体积的确定 
在确定最佳注射位置为后胸与腹部的节间膜最外侧(位置标记：II)后，未确定最佳注射体积，本发明使用四种剂量(27.6nl，41.4nl，50.6nl，101.2nl)的RNase-free H2O注射3龄绿盲蝽若虫的位置II，自注射后连续7天统计生存率，结果见表3所示，通过死亡率统计可以看出：向位置II注射101.2nl无RNA酶的H2O死亡率远远高于注射其余三个计量。在比较27.6nl，41.4nl，50.6nl三组数据发现，三组数据的差别并无显著性差异(P<0.05.LSD)，单纯从死亡率作为参考，三者都可作为注射参数。但是，笔者通过阅读文献而知：南京农业大学的刘泽文等人在注射半翅目昆虫褐飞虱(Nilaparvatalugens)时所采用的体积为50nl，注 射试剂为重蒸水后第3天的死亡率为42.8±7.6％.英国的Stéphanie JP等人在使用重蒸水注射半翅目昆虫豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)时所用的体积为46nl，两天后死亡率为38％。虽然这些实验中所采取的注射重蒸水剂量都大于46nl，但是在后续的注射dsRNA的浓度为6μg/μl。鉴于此，尽管在本发明中使用50.6nl无RNA酶的H2O注射引发的死亡率和27.6nl以及41.4nl并无明显差别。但为了减小在以后的实验中由于操作或者其他不可预知的原因造成因注射量高而导致过高死亡率的结果，我们决定使用小于46nl的剂量进行注射。并在后续的实验中将dsRNA浓度调整到10μg/μl，降低注射体积，以保证注射后3龄绿盲蝽的成活率。在27.6nl、41.4nl两组剂量的选择中，我们最终选取41.4nl作为注射量。原因如下：在其他半翅目昆虫如褐飞虱和豌豆蚜的注射法RNAi实验中，一般注射的dsRNA总量为300ng左右，如刘泽文2010年发表的《Gene knockdown by intro-thoracic injection of double-stranded RNA in the brown planthopper》中注射的剂量为300ng。同为半翅目的绿盲蝽，体型要比豌豆蚜和褐飞虱要大，所以我们决定采取注射400ng以上的dsRNA，以保证RNAi干扰的效率。根据本实验dsRNA浓度为10μg/μl，采用41.4nl为注射量符合要求，故选此注射量作为注射参数。 
表3.位置II注射4种不同体积RNase-free H20绿盲蝽7天内的存活率 
实施例1：注射筛选β-actin基因片段的dsRNA对绿盲蝽生长发育的影响 
采用上述注射法用dsGFP和dsβ-actin分别对3L绿盲蝽进行注射，注射参数如下：注射体积为41.6nl，注射dsRNA浓度为10μg/μl，注射部位为绿盲蝽的后胸与腹部节间膜的最外侧(位置标记：II)。 
按照以上参数，自注射后观察记录7天，统计死亡率，与对照注射dsGFP做比较。具体数值见表4以及图2。 
表4.注射dsGFP与注射dsβ-actin绿盲蝽7天内生存率 
由表4和图2可以看出，处理组(dsβ-actin)与对照组(dsGFP)生存率有明显的区别，并且随着天数的增加，两组数值的差距逐渐变大。自注射后的第7天，对照组绿盲蝽仍有68.46％的存活率，而处理组的存活率只有26.08％。据统计结果显示，两者具有显著性差异(P<0.05)。 
同理，采用本申请相同的方法可以将绿盲蝽体内与能量代谢相关基因、细胞凋亡相关基因进行沉默。 
由此看见，利用注射法对绿盲蝽进行RNA干扰(RNAi)能够应用于基因筛选。 

Claims (10)

1.对绿盲蝽进行RNAi实验的注射方法，其特征在于：注入dsRNA的注射位置为后胸与腹部节间膜的最外侧。
2.根据权利要求1所述的注射方法，其中用于注射的dsRNA浓度为10μg/μl，注射体积为41.4nl。
3.根据权利要求2所述的注射方法，所述绿盲蝽为3L若虫。
4.一种建立绿盲蝽生长发育关键基因的筛选方法，包括如下步骤：(1)取绿盲蝽总RNA，通过RT-PCR得到cDNA；(2)选定目标基因一段特异性片段，设计带有T7序列的特异性引物；(3)通过PCR技术扩增目的基因片段：以第一步得到的cDNA为模板，第二步设计的特异引物扩增，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(4)构建含有选定目的基因片段的载体：将目的基因片段用T4DNA连接酶插入载体PGM-T中，转入宿主大肠杆菌中，富集培养，提取含有目的基因片段的质粒；(5)以上一步所提取含有目的基因片段的质粒为模板，第二步设计的特异性引物扩增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(6)利用T7RNA聚合酶将上一步得到的PCR产物合成为目的基因片段dsRNA；(7)将dsRNA按权利要求1-3任一所述的注射方法导入绿盲蝽的体内，持续饲养记录若虫经RNAi后的表现型；(8)统计死亡率，确认该目的基因与生长发育的关系。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，所述特异性片段为400-500bp。
6.根据权利要求4所述的筛选方法，所述目的基因为绿盲蝽β-actin基因，其序列如SEQID NO1所示。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，所述绿盲蝽β-actin基因的特异性片段序列如SEDID NO4所示。
8.根据权利要求4所述的筛选方法，所述步骤(7)的同时，将GFP基因的dsRNA作为对照组注射入绿盲蝽体内，所述GFP基因序列如SEQ ID NO2所示。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，所述GFP基因的特异性片段序列如SEQ ID NO3所示。
10.根据权利要求4所述的筛选方法，持续饲养时间为5-10天。
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