CN112795660A - 绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合及其应用。具体组合方案如下：不同发育阶段稳定表达的内参基因组合为RPL27和RPL32，不同组织的内参基因组合为RPL27和RPL32，dsRNA处理条件下的内参基因组合为RPL27和EF1γ。还提出了该稳定表达内参基因用于荧光定量分析时所使用的不同引物序列。本发明首次确定了绿盲蝽在三种因子条件下最稳定的内参基因组合，为研究绿盲蝽在不同发育阶段、不同组织、以及dsRNA介导的RNA干扰条件下基因表达水平的分析提供了合适内参基因的选择，为研究绿盲蝽的基因功能以及RNAi介导的转基因作物的研发及其安全评价建立了夯实的基础。

Description

绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因及其应用

技术领域

本发明属于昆虫分子生物学中实时荧光定量PCR内参基因表达稳定性的技术领域，更具体地，涉及绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合及其应用；包括绿盲蝽在不同发育阶段、不同组织以及dsRNA介导的RNA干扰条件下稳定表达的内参基因及应用。

背景技术

绿盲蝽(Apolygus lucorum)属于半翅目，盲蝽科，是我国棉花种植区域的主要害虫之一，其寄主范围十分广泛，主要包括棉花、玉米、大豆、苜蓿、十字花科蔬菜、茶树、花卉、以及各种果树等，给我国的农业和林业造成了巨大的经济损失。目前对其的防治主要以化学防治为主，但是化学药剂的长期使用容易导致抗药性的产生以及环境污染等问题。鉴于该害虫在农业经济上日益增涨的重要性，过去几十年来，昆虫学家们从生态学，生理学和分子生物学等角度对其进行了广泛的研究。随着高通量测序技术的发展，大量可能参与发育，免疫，能量代谢，繁殖，化学感受等生理过程的基因信息被报道。研究这些基因的功能，理解绿盲蝽各种生物学或生理学过程中的分子机制，对于开发新的盲蝽防治技术具有重要意义。

研究绿盲蝽体内特定基因的功能，最基本的技术方法之一就是对功能基因进行简单、快速、准确的表达定量分析。与传统的半定量RT-PCR，印记杂交等定量分析方法比较，实时荧光定量PCR具有操作简单、特异性强、灵敏度高、重复性好、成本低等优点，是一种最为广泛使用的基因表达分析技术。然而，一些实验因素，例如RNA提取中的批次间差异， cDNA合成和PCR反应的效率等等，这些非生物的变异均会影响实时荧光定量PCR的准确性。为了减少这些因素的影响，需要对数据进行标准化过程以消除非生物变异，其中最常用的策略是使用稳定表达参考基因作为数据标准化的内部参照，通常称为内参基因。因此，实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上取决于内参基因的选择。然而目前大量的研究表明，没有任何一个内参基因mRNA表达水平在所有的实验条件下都是恒定的。使用不稳定的内参基因作为数据标准化的内部参照会导致对定量数据的错误解释，最终导致错误的生物学结论。因此，选择一个在处理因素作用下表达相对稳定的基因作内参基因是实时荧光定量 PCR成功与否的关键所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有绿盲蝽分子生物学研究过程中内参基因方案的缺乏，提供绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因及其应用；包括绿盲蝽在不同发育阶段、不同组织中以及dsRNA介导的RNA干扰条件下稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用。

本发明的目的是提供一种绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组。

本发明另一目的是提供一种绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合的筛选方法

本发明再一目的是提供所述绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现

①用生物克隆技术获得候选内参基因序列：本发明首先提取绿盲蝽全虫的总RNA，构建转录组数据库，通过Illumina测序获得绿盲蝽全虫转录组序列信息。随后以上述序列信息为基础，通过相似度比对筛选出8个看家基因(EF1γ、RPL32、RPL27、SDH、TBP、ACT2、GAPDH和βTUB)作为候选内参基因，同时通过NCBI搜索获得已报道的看家基因ACT的序列信息。最后以上述获得的9个候选内参基因序列信息为基础，设计9对特异性RT-PCR 引物，通过RT-PCR技术进行序列验证,以确定所得的核苷酸序列为绿盲蝽内参基因序列， RT-PCR引物序列如表1所示。

表1 9个内参基因序列RT-PCR引物

②绿盲蝽在不同因子条件下稳定表达的内参基因的筛选：首先，以上述克隆获得9个候选内参基因的序列为基础，设计9对的特异性实时荧光定量PCR引物，并通过标准曲线和溶解曲线检测引物的性能，筛选扩增效率E(％)在90％-110％之间、回归系数R²>0.99、溶解曲线显示单峰的引物对进行后续实验，9对实时荧光定量PCR引物序列如表2所示。

表2 9个内参基因的荧光定量PCR引物

然后，提取不同因子条件下的绿盲蝽的RNA，并反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别利用表2中所述实时荧光定量PCR对9个内参基因进行实时荧光定量PCR分析。导出各候选内参基因在各处理样本中的循环阈值(Ct值)后，分别利用ΔCt法、Bestkeeper、 NormFinder、geNorm四种分析软件计算各候选内参基因在不同实验条件下的稳定值，并进行稳定性的排名，最后利用RefFinder对四种软件的分析结果进行综合评价，给出综合的稳定性排名，同时，还利用geNorm对各实验条件下的候选内参基因进行了配对变异性分析，以确定用于实时荧光定量PCR靶基因数据标准化的最佳内参基因数量。最终确立不同因子条件下最稳定表达的内参基因的组合。具体操作步骤详见具体实施方式。

③确定绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合，经比较确定如下：

绿盲蝽虫在不同发育阶段中稳定表达的内参基因组合为RPL27和RPL32；

绿盲蝽虫在不同组织中稳定表达的内参基因组合为RPL27和RPL32；

绿盲蝽虫在dsRNA处理条件下稳定表达的内参基因组合为RPL27和EF1γ。

其中RPL27的核苷酸序列表如SEQ ID NO:3所示，RPL32的核苷酸序列表如SEQ IDNO:2所示，EF1γ的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的内参基因均来自绿盲蝽的RNA。

本发明提供的上述内参基因组合为研究绿盲蝽不同发育阶段、不同组织以及dsRNA介导的RNA干扰条件下的基因表达水平提供了稳定内参基因的选择依据。

本发明所述的RPL27作为稳定内参基因用于实时荧光定量PCR分析时所使用的引物序列为：正：CGATTTTGAACACAGCAGTT，反：AGTCGACAAGCACAAATACT；

本发明所述的RPL32作为稳定内参基因用于荧光定量分析时所使用的引物序列为：正： CGATTTTGAACACAGCAGTT，反：AGTCGACAAGCACAAATACT；

本发明所述的EF1γ作为稳定内参基因用于荧光定量分析时所使用的引物序列为：正： CGATTTTGAACACAGCAGTT，反：AGTCGACAAGCACAAATACT。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明首次克隆得到绿盲蝽的8个内参基因(EF1γ、RPL32、RPL27、SDH、TBP、ACT2、GAPDH和βTUB)全长序列。

(2)本发明首次验证和比较了9个内参基因(EF1γ、RPL32、RPL27、SDH、TBP、ACT、ACT2、GAPDH和βTUB)在绿盲蝽在不同发育阶段、不同组织中以及dsRNA介导的RNA干扰条件下的表达稳定性。

(3)本发明首次筛选确定了绿盲蝽在不同发育阶段、不同组织中以及dsRNA介导的RNA 干扰条件下最稳定的内参基因组合，为研究绿盲蝽在不同发育阶段、不同组织中以及dsRNA 介导的RNA干扰条件下基因的表达水平提供了内参基因的选择依据。

(4)本发明设计的实时荧光定量PCR引物具有扩增特异性，并具有90％以上的扩增效率，能够为准确定量提供坚实基础

附图说明

图1为绿盲蝽9个候选内参基因的溶解曲线。

图2为ReFinder对9个候选内参基因在不因子下的稳定性分析结果。附图标记说明：图2中的A图：不同发育阶段中9个候选内参基因的稳定性分析结果；图2中的B图：不同组织中9个候选内参基因的稳定性分析结果；图2中的C图：dsRNA处理条件下9个候选内参基因的稳定性分析结果。其中横坐标为内参基因名称，从左至右稳定性排序，越靠近坐标轴左侧稳定性越高。纵坐标表示ReFinder计算出的内参基因的稳定值。

图3为geNorm分析各因子下的候选内参基因的配对变异值以确最佳内参基因数量。配对变异值V小于0.05即认为无需增加额外的内参基因来进行数据的标准化。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，本领域技术人员可通过公关途径或商业途径获得。其中内参基因稳定性分析软件的使用按其使用说明进行。

实施例1：绿盲蝽候选内参基因序列的获得

绿盲蝽候选内参基因序列的获得方法，包括如下步骤：

(1)绿盲蝽的饲养：绿盲蝽的种群来自于中国农业科学院植物保护研究所的室内种群，以新鲜玉米(Zea mays)及四季豆(Phaseolus vulgaris)饲养，饲养温度为25-28℃，相对湿度为60％-70％，光照为16:8(L:D)。

(2)获得候选内参基因序列：首先提取绿盲蝽全虫的总RNA，构建转录组数据库，通过Illumina测序获得绿盲蝽全虫转录组序列信息。随后以上述序列信息为基础，通过相似度比对筛选出8个看家基因EF1γ(SEQ ID NO:1)、RPL32(SEQ ID NO:2),RPL27(SEQ ID NO:3)、SDH(SEQ ID NO:4)、TBP(SEQ ID NO:5)、ACT2(SEQ ID NO:6)、GAPDH(SEQ ID NO:7)和βTUB(SEQ ID NO:8)作为候选内参基因，同时通过NCBI搜索获得已报道的看家基因ACT的序列信息。上述9个候选内参基因序列均通过RT-PCR技术进行序列验证，具体方法为：基于上述候选内参基因的核苷酸序列，利用一个在线引物设计工具 (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计合成了RT-PCR引物(表1)，利用Trizol试剂盒提取绿盲蝽成虫全身总RNA(详细步骤参照试剂盒说明书)，并按照

RTReagent Kit with gDNA Eraser试剂盒的方法合成cDNA模板(详细步骤参照宝生物工程大连有限公司提供的说明书)，随后以所得cDNA为模板，利用表一中引物进行PCR扩增，琼脂凝胶回收纯化目的片段PCR产物，再将纯化产物利用TransGen公司的 pEASY-T1SimpleCloning Kit连接到pEASY-T1载体(详细步骤参照北京全式金生物技术有限公司提供的说明书)，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆子后送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序所得的序列与NCBI数据库进行Blast比较分析，以确定所得的核苷酸序列为绿盲蝽内参基因序列。

实施例2：不同条件下绿盲蝽稳定表达内参基因的筛选

(1)不同因子下的绿盲蝽的处理与收集

①不同发育阶段绿盲蝽的收集：分别收集50头一龄若虫、30头二龄若虫、15头三龄若虫、6头四龄若虫、6头五龄若虫、5头性未成熟(1日龄)雌成虫、5头性未成熟(1日龄) 雄成虫、5头性成熟(12日龄)雌成虫、5头性成熟(12日龄)雄成虫，置于液氮中速冻后， -80℃保存备用。每个处理有3个生物学重复。

②绿盲蝽不同组织的收集：收集绿盲蝽5龄若虫，于预冷的PBS中解剖收集头、胸、中肠和残体，每个样本至少解剖25只试虫，解剖后的组织立刻置于液氮中速冻后，-80℃保存备用。每个处理有3个生物学重。

③dsRNA处理条件下绿盲蝽的收集：首先利用promega的T7 RiboMAXTM ExpressRNAi System试剂盒合成并纯化靶向绿盲蝽LIM基因的dsRNA(命名为dsLIM)，具体合成方法参照Promega生物科技有限公司提供的产品说明书。合成dsLIM所使用的特异性引物序列为：正：GCGTAATACGACTCACTATAGGCTGGAATCGTGCCGTGTCT，反： GCGTAATACGACTCACTATAGGCGCTGGCTGTCTCAGTATGG。按照同样的方法合成靶向 GFP基因的dsRNA(命名为dsGFP)，以作为对照处理使用。合成dsGFP所使用的特异性引物序列为：正：GCGTAATACGACTCACTATAGGTGGTCCCAATTCTCGTGGAAC，反： GCGTAATACGACTCACTATAGGCGCTGGCTGTCTCAGTATGG。随后利用显微注射系统将 50nL浓度为10μg/μL的dsLIM注射至绿盲蝽3龄若虫体内，按照同样的方法注射相同剂量的dsGFP和无菌水作为对照。注射后的试虫分别置于养虫盒内，按照实施例1(1)的饲养方法和条件饲养2天后，分别收集三种不同注射处理的试虫各7只，置于液氮中速冻后， -80℃保存备用。每个处理有3个生物学重复。

(2)RNA提取和cDNA合成

利用Trizol试剂盒对上述收集的绿盲蝽不同处理的样本分别进行总RNA提取，详细步骤参照试剂盒说明书，随后使用Nanodrop 2000C测定所提取RNA的浓度，并保证所有样品的OD260/280比值皆在1.9～2.1之间，同时还通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，最后使用宝生物工程大连有限公司的

RT Reagent Kit with gDNA Eraser将1μg的 RNA反转录成cDNA模板，详细步骤参照产品使用说明。

(3)实时荧光定量PCR检测9个候选内参基因分别在这三种试验条件下的稳定性

①候选内参基因实时荧光定量PCR引物的设计及性能检测

实时荧光定量PCR引物的设计：以实施例1中获得的9个候选内参基因(EF1γ、RPL32、 RPL27、SDH、TBP、ACT、ACT2、GAPDH和βTUB)的序列信息为基础，按照实施例1(2) 中描述的方法设计9个候选内参基因的特异性荧光定量PCR引物，如表2所示。

实时荧光定量PCR引物标准曲线和溶解曲线检测：将上述反转录合成的cDNA按5倍等比稀释成5个不同浓度梯度的cDNA模板，利用表2所示特异性引物进行实时荧光定量PCR，以扩增候选内参基因。实时荧光定量PCR的反应体系包含2μL的cDNA模板，5μL 2X

Premix ExTaq^TM II(Takara,宝生物工程大连有限公司)，10mM正/反向引物各0.4μL，无菌水2.2μL。PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃10s，60℃30s，共40个循环；58℃到95℃，每个循环上升0.5℃。反应结束后利用实时荧光定量PCR仪自带软件 (Bio-Rad CFXConnectTM Real-time PCR Detection System)分析每对引物的标准曲线和溶解曲线。以扩增效率E(％)在90％-110％之间、回归系数R²>0.99、溶解曲线显示单峰为标准筛选获得合格的荧光定量PCR引物(表2，图1)。

②候选内参基因分别在这三种实验条件下的稳定性分析

将上述不同发育阶段、不同组织和dsRNA介导的RNA干扰条件下的绿盲蝽实验样本cDNA，稀释20倍作为模板，按照实施例2(3)①中描述的方法进行实时荧光PCR扩增。随后，导出各候选内参基因在各处理样本中的循环阈值(Ct值)。

表3四种分析方法对候选内参基因稳定性的排名

分别利用ΔCt法、Bestkeeper、NormFinder、geNorm四种分析软件计算各候选内参基因在不同实验条件下的稳定值(具体操作方法详见软件说明书)，并进行稳定性的排名，具体结果如表3所示。随后利用RefFinder对四种软件的分析结果进行综合评价，给出综合的稳定性排名，具体结果如下：

不同发育阶段的内参基因稳定性从高到底排序为：RPL27>RPL32>GAPDH>EF1γ>ACT2>TBP>SDH>ACT>βTUB(见图2中的A图)。

不同组织的内参基因稳定性从高到底排序为：RPL32＝RPL27>EF1γ>ACT2> GAPDH>TBP>SDH>ACT>βTUB(见图2中的B图)。

dsRNA处理条件下的内参基因稳定性从高到底排序为：RPL27>EF1γ>ACT2>SDH>RPL32>GAPDH>ACT>TBP>βTUB(见图2中的C图)。

同时，还利用geNorm对各实验条件下的候选内参基因进行了配对变异性分析，结果显示所有的实验处理组的初始V值小于0.15均出现在V_2/3，表明在这三个实验条件下，用于实时荧光定量PCR靶基因数据标准化的最佳内参基因数量为二(图3)。因此我们推荐绿盲蝽虫在不同发育阶段中稳定表达的内参基因组合为RPL27和RPL32，在不同组织中稳定表达的内参基因组合为RPL27和RPL32，在dsRNA处理条件下稳定表达的内参基因组合为 RPL27和EF1γ。

综上所述，本发明按照荧光定量PCR要求对不同发育阶段、不同组织、以及dsRNA介导的RNA干扰那条件下绿盲蝽的9个内参基因进行了定量PCR验证，最终分别筛选出了绿盲蝽在不同发育阶段、不同组织、以及dsRNA介导的RNA干扰那条件下稳定表达的内参基因组合，上述内参基因组合为研究绿盲蝽不同发育阶段、不同组织以及dsRNA介导的RNA 干扰条件下的基因表达水平提供了稳定内参基因的选择依据，为今后绿盲蝽基因功能的研究建立了坚实的基础。

序列表

<110>湖北大学

<120> 绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因及其应用

<141> 2019-08-04

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1272

<212> DNA

<213> 绿盲蝽（Apolygus lucorum）

<220>

<221> EF1γ

<222> (1)···（1272）

<400> 1

atggcgtccg gtaccctgta cacgtaccct gacaatttcc gagcttacaa agcgctgatt 60

gcggcacagt atggaggcgg aaacgttcag gtagcacctg gttttgtctt cggcgaaaca 120

aataaaacca cggaatttct caaaaaattc ccccttggaa aggtgccagc ttttgaagcc 180

aaggatggtc aatgcattac cgaaagtaat gcgattgcgt ggtacgttgc gagcaacgag 240

cttaggggaa agactgacat cgaaaaggct caagtactgc aatggctgaa ctattcagac 300

tccgatcttc ttcaagctgt ctgcacttgg gtcttccctt atcttggaat cctcgacttt 360

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aacttcctcc ttagccgcac ttacctcgtc aacgagcagg ttacactcgc tgatatcgtt 480

gtcgcatgca cacttcttcc agcgtatcaa accgttctag accctgaatt cagaaaggcg 540

ttcaaaaacg tcaacagatg gttcacaacc attgtcaacc agcccaaagt aaagaacgtg 600

ctgggtgccg taaaactttg cgataaagaa ccccaagtcg cccccaaggc ggaacaacaa 660

ggaggaggca aaaaagataa gaagaaggga ggagataaac caccacaaca acctaagaaa 720

cccaaagctg agaaggagga accggaggag atggacctgg ctgacgaggc cctcttagaa 780

gaacccaaat ccaaggatcc cttcgatgaa ctccctaagg gtacttgggt gatggatgac 840

ttcaagagat tttattccaa cgaggataca gataaatcca tcccctactt ttgggaaaag 900

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aaagtgttca tgagctgtaa cctgatcaca ggcatgttcc agaggttgga taagatgagg 1020

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tacgaatcct acaagtggac caagttggat cccaacagcg ctgataccaa gaagatggtt 1200

gacgaatact tggcgtggtc agggaaggat aaggatggtc gtgcttttaa tcagggaaag 1260

attttcaagt aa 1272

<210> 2

<211> 405

<212> DNA

<213> 绿盲蝽（Apolygus lucorum）

<220>

<221> RPL32

<222> (1)···（405）

<400> 2

atggccatcc gacctgtgta caggccgact atcgtcaaaa agaggacgaa gaaattcatt 60

cgccaccaaa gcgatcgtta tgtcaagctc acgaggaatt ggcgtaagcc gaaaggtatt 120

gataacagag tgaggaggag gttcaagggc cagtacctta tgccctctat cggttatgga 180

agcaacaaaa agaccaagca catgctccct accggcttca ggaaagtcct cgttcacaac 240

gttaaggagc tggagatgct gatgatgcaa aacagaaagt tctgcgcgga aatcgctcac 300

gccgtctcct ccaaaaagcg caagtccatc gtcgagcgcg cccaacagct ttccatcaga 360

gtcaccaacg ccaacgcccg gctcaggaca gaggagaacg aataa 405

<210> 3

<211> 447

<212> DNA

<213> 绿盲蝽（Apolygus lucorum）

<220>

<221> RPL27

<222> (1)···（447）

<400> 3

atgtcgacac ataagaagaa gaccagaaag ttgaggggtc acgtgagtca tggtcacgga 60

cgtatcggta agcacaggaa gcatcctggt ggtcgtggta acgccggtgg catgcaccac 120

cacagaatca acttcgacaa gtaccatcct ggttacttcg gaaagctcgg tatgagaaac 180

taccatttga gacgaaacca gaagttctgc ccttccatca acttggaccg cctctggacc 240

ctcgtcaccg aacagaccag actgaagtac aaagataacg ccgacaaaaa ggctccagtt 300

atcgactgcg tccgagcggg ttactacaaa gttaccggca aaggcaggat ccccaagcag 360

cctgtcatcg tcagagcgaa atacttctcc aaaacagctg aagagaagat caaggccgtt 420

ggaggttgct gcgttcttac ggcgtaa 447

<210> 4

<211> 1986

<212> DNA

<213> 绿盲蝽（Apolygus lucorum）

<220>

<221> SDH

<222> (1)···（1986）

<400> 4

atgaccagca ttctcaaagt gtcgtcactc cttgcaaaaa atgcatccaa cacagctttg 60

agaactctgt gtccttccgc gaccatcaac tcgaggaaaa tccacattac cccgaacgct 120

ggaactacta ctgctaacca gatctcaaag gaatacccgg tcgttgatca cacctacgat 180

gctgtggtgg ttggagcagg aggagctggt ctgcgggcag ctttcggtct cgtagctgag 240

ggcttcaaga cagctgtcat taccaaattg tttcccacga ggtctcacac tgtcgccgct 300

cagggtggta tcaacgccgc tctcgggaac atggaagaag atgactggca ctggcacatg 360

tatgataccg tcaagggttc cgattggcta ggagatcaag atgctattca ctacatgacc 420

cgagaggcac cgaaagctgt aatcgaactc gaaaattatg gtatgccgtt ttctcgaact 480

cccgatggca agatttacca aagagctttt ggagggcaga gtttgaagta cggaaagggc 540

ggccaggctc atagatgctg tgctgttgct gaccgaactg gacattctct tcttcatact 600

ctatacggac agtccctaag ctacaactgc aattacttca tcgaatactt cgctttggat 660

ctgctgatgg aaggcgacac ttgcgttggt gtcatcgccc tttgccttga ggatggcact 720

ttgcacagat tcagagccaa gaacactgtt ttggctactg gagggtatgg cagagcttac 780

ttttcatgca catcggctca cacttgcacg ggagatggtc aagcaatggt ttcccgagct 840

gggcttccca acgaagatct tgagttcgtc cagttccatc ccactggcgt ttacggtgct 900

ggttgcctga ttactgaggg atgtcgtggt gaaggtggct acctcgtcaa ttctgaaggt 960

gagaggttca tggagagata cgccccagtt gccaaggact tggcctctcg agatgttgtc 1020

tctagatcta tgactatcga aattcgcgaa ggaagaggag tcggacctga gaaggaccac 1080

gtcttcctcc agctccacca tctcccccca gagcaactgg ctatgaggtt gcctggcatc 1140

tccgagactg ccatgatctt cgcaggcgtc gacgtcacga gggagcccat ccccgttatc 1200

ccgaccgttc actacaacat gggcggcatt ccgaccaact acaagggaca ggtgttactg 1260

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ggacgcgcgt gcgcacttac agtcgctgaa gaaaacaaac ctggagagag cattcctgag 1440

ctgactcaga gccacgggga agaatctgtt gccaatctgg atcatgtcag acgcgccgac 1500

ggagatctaa caactgctca gatcagattg acgatgcaga aaactatgca aaaagacgca 1560

gccgtattta gaacgggaga aaccttgaaa cagggagtag agaacatgaa agaagtctac 1620

aaatctatgg aacgcatcaa agtcagtgac aggagtttgg tgtggaattc tgacctcgtg 1680

gagacactgg agctgcaaaa tcttatgatt tgcgccaacc aaaccatcgt ctcagctgaa 1740

aacagaaagg aatctcgcgg tgcccacgct agagaggact tcaagacgag gattgacgag 1800

tacgactatt ccaaacctat tgatggccaa cagaagaaac cttacgagca gcactggcgc 1860

aaacacactc ttacttggat caacccgaaa actggagagg ttacaattga ctacagaccc 1920

gtaattgacg aaactctgga cgccaacgag tgcaagacgg ttcctcctgc gatccgctcg 1980

tattaa 1986

<210> 5

<211> 891

<212> DNA

<213> 绿盲蝽（Apolygus lucorum）

<220>

<221> TBP

<222> (1)···（891）

<400> 5

atggatagca tgcttccgag tcctgggttc agcattccca gtattgggac gcctctgcat 60

cagccagaag aagatcaaca gattttgccg attgctcaac agcaacagca actccaaatg 120

ccgcctttgc tacccttaca gtcctcaggt atgacgcctc acaagacaat gaacgcctac 180

gccccttcta tgggatttca aacacctcaa aacatgatgc aacctcaaac accacacaat 240

ttggtgagca tgtcgcccat ggtgaacaga atggaccaaa gtcaaactcc aaatatccag 300

ccaacaactc ccagtcctat gacgccaatg actccttctg gcgaaccagg ttctatccct 360

caactgcaga atattgtgtc cacagtcaac ctcgggtgta agctagactt gaaacgtatc 420

gccctccacg ccagaaacgc tgagtacaat ccgaaacggt ttgctgcggt catcatgaga 480

attcgtgaac caagaacaac tgctctcatt ttcagttcag gaaaaatggt gtgcactggt 540

gctaaaagcg aagatgactc ccgactcgct gcgaggaaat atgctcgtat aattcaaaaa 600

cttgggttcc aagctaggtt tcatgatttc aaagttcaaa acatggttgg aagttgcgac 660

gtgaaatttc ccataagact ggaaggcttg gtcctcactc acgggcagtt cagcagctac 720

gaaccagagc ttttcccagg actcatctac cgaatggtca aaccgaggat cgttctgttg 780

attttcgtat ctggaaaggt cgtcctgact ggagccaaag tgcgccaaga gatatacgac 840

gccttcgaca acatttaccc tattttaaaa agttttaaga agcaatccta a 891

<210> 6

<211> 1185

<212> DNA

<213> 绿盲蝽（Apolygus lucorum）

<220>

<221> ACT2

<222> (1)···（1185）

<400> 6

atggataacg acggcaagaa agtcatcgtg tgtgacaatg gaactgggtt tgtgaaatgt 60

ggctacgccg gatccaactt cccggagcac atcttccctt cgatggtcgg acggcccatc 120

atacgagctg tcaacaagat cggggacata gaagtcaagg acttaatggt tggggatgaa 180

gccagcaaat tgcggtctat gttggaagtt aattatccaa tggaaaatgg catcgttcgg 240

aactgggagg acatgtgcca cgtctgggat tatacgtttg gtccggaaaa gatgaacatc 300

aaccccaaag actgtaaaat attgctgacc gagcctccga tgaaccctac cagaaacaga 360

gaaaaaatga ttgaggtgat gtttgagaaa tacgggttca gcggtgcgta catcgcgatc 420

caagctgtgc tgactctcta cgcgcaggga ctgctgagtg gagtggtcgt ggactccgga 480

gatggtgtca cccacatctg ccctgtttac gaggaatttg cgcttcctca cctcacacga 540

cggcttgaca tcgctggccg agatatcacc aagtacctca tcaagttatt actcctgcgt 600

ggttacgctt ttaatcattc agccgacttc gagacggtgc gaattatgaa agaaaagctc 660

tgctacatcg ggtacaacat tgaaactgaa cagaaattag cgctggaaac tactgtcctt 720

gttgagccgt acacactacc tgatggaaga gttatcaaag tgagtggtga gaggttcgaa 780

gcgccagaag ctctgtttca acctcacctc atcaacgtcg aaggtcaagg tattgctgaa 840

atggtgttca atacgataca agctgcagac atcgatatga gaacggagct gtacaaacac 900

attgtcctat ctggaggttc aaccatgtac ccaggactgc ctagtagact tgaaagggaa 960

ataaagcaac tttacctgga gcgagttctt aaaaacgaca tcgacaaact atcgaaattc 1020

aaaatccgaa tcgaagatcc cccccacaga aaagacatgg tcttcatcgg cggagccgtt 1080

ctcgcagaag tgatgaaaaa ccgtgaaaac ttctggatga cgaaccagga gtatcaagaa 1140

atgggcgtca acgtcctcaa aaaacttgga gccaggtcca actaa 1185

<210> 7

<211> 1002

<212> DNA

<213> 绿盲蝽（Apolygus lucorum）

<220>

<221> GAPDH

<222> (1)···（1002）

<400> 7

atgtccaaaa tcgggatcaa tggtttcggc cgtatcgggc gcctcgtgtt gagggcatcc 60

gttgagaaag gagccgaggt agttgccatt aatgacccct tcctgggagt tgactacatg 120

gcttacctcc tgaagtacga ctccacccac ggacgcttca agggcaaagt cgacatcgat 180

ggagacagcc tcgttgtcaa tggtaagaaa atcgccgtct tcatggagcg tgatcccaaa 240

gctatccctt ggggtaaggc tggagctgaa tacgtcgttg aatctaccgg tgtcttcacc 300

actattgaga aagcaaaggc ccacatcgac ggaggagcca agaaagtcat catttccgcc 360

ccttccgccg atgcccccat gttcgtcgtc ggagtcaact tggaagccta cgatccctcg 420

atgaccgtcg tatccaacgc ctcttgcacc accaactgcc tcgctcccct cgctaaggtc 480

atcgatgaca actttggaat tgaggaaggt ctcatgacca ctgtccatgc cgttaccgct 540

acacaaaaga ccgtggatgg tccttctggc aagctgtgga gagatggccg tggtgctggc 600

cagaacatca ttcccgctgc tactggagcc gccaaggctg tcggcaaggt cattcccaag 660

ctgaatggca agctcaccgg aatggctttc cgagttcctg tccctaatgt ttcagtcgtg 720

gacctcactg tcaggctgac caaagaagcc acttatgatg aaatcaagca gaaggtgaag 780

gaggcttccg aaggacctct caagggaatc ttggggtaca ctgatgacca ggtcgtcagc 840

gctgatttca ttggtgatac caatagctcc atcttcgacg cccaggctgg catccccctc 900

aacaacaaat tcgtcaagct tgtgtcttgg tacgataacg agtttggtta ctccaaccgt 960

gttgttgatc tcatcaaata catgcagacc aaggacaagt aa 1002

<210> 8

<211> 1341

<212> DNA

<213> 绿盲蝽（Apolygus lucorum）

<220>

<221>βTUB

<222> (1)···（1341）

<400> 8

atgcgagaaa tttgccacat acaagcgggc caatgtggta atcaagttgg agcgaagttt 60

tgggaggtga tttcagacga acatggcatt gatccgactg gcacatatca cggagacagt 120

gatcttcagc ttgagagaat aaacgtgtac tacaatgaag ctactggagg gaagtacgtt 180

ccaagagcga tcttggtcga tttggaacca ggaacgatgg actcaacacg ctcgggacct 240

tttggacaga tttttaggcc ggacaacttc gttttcgggc agtcgggcgc cgggaacaac 300

tgggctaagg ggcactacac agaaggtgct gaacttgtcg attcagtgct ggatgttgtg 360

aggaaagagg cggaaagttg cgactgtttg caaggattcc agctgaccca ctcgcttggt 420

ggtggaaccg gatcgggtat gggaacgctt attatttcca agataagaga agagtaccca 480

gataggatca tgaatacttt cagcatcgtt ccttcaccca aggtgtccga taccgtcgtg 540

gagccttaca atgcgacttt gtccgtccat cagttggtgg aaaacacgga tgaaacattt 600

tgcattgaca atgaagcact gtatgacata tgcttcagga cgctcaagct caccacgccg 660

acttatggag acctgaacca tttagtttcg gccacgatgt caggagtcac cacttgcctt 720

cgtttccccg gtcaactgaa ctctgacctc aggaagctcg ctgtcaacat ggtgccattc 780

cctcggcttc acttcttcat gcccggattt gctcctttga cgtcccgtgg ttcacagcaa 840

taccgcgctc tgactgtgcc agaattggtt caacaaatgt ttgacgccaa gaacatgatg 900

gctgcctgcg atcctcgtca tgggcgatac cttacggttg cagctatatt cagaggaaga 960

atgtcaatga aggaagtcga cgagcaaatg ctgaacgtcc agaacaagaa ttcttcgtac 1020

ttcgtcgaat ggattcccaa caactgcaag acagcagtgt gcgacatccc tcccagaggc 1080

ttgaagatgg catcaacctt catcggaaat accactgcaa ttcaagaact cttcaagcga 1140

gtttctgaac agttcacttc gatgttcagg aggaaagctt tcttacattg gtacacagga 1200

gagggcatgg acgaaatgga gttcacagaa gccgagtcaa acatgaatga tctgatttct 1260

gagtaccagc agtaccaaga cgcaacggct gaagaagctg gcgagttcga agaagacgaa 1320

gataacattg aagaaaacta a 1341

<210> 9

<211> 1131

<212> DNA

<213> 绿盲蝽（Apolygus lucorum）

<220>

<221> ACT

<222> (1)···（1131）

<400> 9

atgtgtgacg acgatgttgc ggcgctcgta gtcgacaatg gctcaggcat gtgcaaggcc 60

ggcttcgccg gagatgacgc ccccagggcc gtcttccctt ccatcgtcgg tcgcccaagg 120

catcagggtg tcatggtcgg tatgggtcaa aaggactcct acgtcggaga tgaagcccag 180

agcaagagag gtatcctcac cctgaaatac cccatcgagc acggcatcat caccaactgg 240

gacgacatgg agaaaatctg gcaccacacc ttctacaacg agctccgcgt cgcccccgag 300

gagcacccca tcctcctcac cgaggctccc ctcaacccca aggccaacag ggagaagatg 360

actcagatca tgtttgagac cttcaacacc cccgccatgt acgtcgccat ccaggctgtc 420

ctctccctgt acgcctccgg tcgtaccacc ggtatcgtcc tcgactccgg agatggtgtt 480

tcccacaccg tccccatcta tgaaggttat gcccttcccc acgccatcct ccgtctggac 540

ttggctggcc gtgacttgac tgactacctg atgaagatcc tcaccgagag gggttactct 600

ttcaccacca ccgctgaaag ggaaatcgtc cgcgacatca aggagaagct ctgctacgtc 660

gctctggact tcgagcagga aatggccacc gccgccgcct ccacctccct cgagaagtcc 720

tatgaacttc ccgacggaca ggtcatcacc atcggtaacg agaggttccg ttgccctgaa 780

gccctcttcc agccttcctt cctgggtatg gaatcttgcg gtatccacga aaccgtctac 840

aactccatca tgaagtgcga cgtcgacatc aggaaagacc tgtacgccaa caccgtcctc 900

tccggaggta ccaccatgta ccccggtatc gccgacagga tgcagaagga aatcaccgcc 960

ctcgctccct ccaccatcaa gatcaagatc atcgctcccc cagaaaggaa gtactccgta 1020

tggatcggtg gctccatcct cgcctctctc tccaccttcc aacagatgtg gatctccaag 1080

caggaatacg acgaatccgg ccctggcatc gtccaccgca agtgcttcta a 1131

7

Claims (2)

1.一种绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合，其特征在于，

绿盲蝽虫在不同发育阶段中稳定表达的内参基因组合为RPL27和RPL32；

绿盲蝽虫在不同组织中稳定表达的内参基因组合为RPL27和RPL32；

绿盲蝽虫在dsRNA处理条件下稳定表达的内参基因组合为RPL27和EF1γ；

其中RPL27的核苷酸序列表如SEQ ID NO:2所示，RPL32的核苷酸序列表如SEQ ID NO:3所示，EF1γ的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示；

所述的RPL27作为稳定内参基因用于实时荧光定量PCR分析时所使用的引物序列为：正：CGATTTTGAACACAGCAGTT，反：AGTCGACAAGCACAAATACT；

所述的RPL32作为稳定内参基因用于荧光定量分析时所使用的引物序列为：正：CGATTTTGAACACAGCAGTT，反：AGTCGACAAGCACAAATACT；

所述的EF1γ作为稳定内参基因用于荧光定量分析时所使用的引物序列为：正：CGATTTTGAACACAGCAGTT，反：AGTCGACAAGCACAAATACT。所述基因组合均所述的内参基因均来自绿盲蝽虫的RNA。

2.一种绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合的筛选方法，其特征在于步骤为：

1)、用生物克隆技术从绿盲蝽全虫的总RNA中提取EF1γ、RPL32、RPL27、SDH、TBP、ACT2、GAPDH、βTUB、ACT 9个候选内参基因，并通过RT-PCR技术进行序列验证；

2)对9个内参基因在不同因子条件下稳定表达进行实时荧光定量PCR分析筛选；

3)确定绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合为：

绿盲蝽虫在不同发育阶段中稳定表达的内参基因组合为RPL27和RPL32；

绿盲蝽虫在不同组织中稳定表达的内参基因组合为RPL27和RPL32；

绿盲蝽虫在dsRNA处理条件下稳定表达的内参基因组合为RPL27和EF1γ。

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