CN108018316A - 一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法 - Google Patents

一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，属于基因敲除领域。该方法通过CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计，构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成，斑马鱼胚胎进行显微注射，检测靶位点的有效性，注射两个月之后，进行剪尾鉴定，对目的序列进行TA克隆，质粒进行Sanger测序获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代，从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交获得斑马鱼突变体的F2，从中挑选出F2代纯合子，进行F3代纯系遗传得到rmnd5b基因缺失型斑马鱼品系。本发明方法脱靶率较低，且研究rmnd5b基因的缺失与其他器官的发育的相关性，具有很好的医学研究价值。

Description

一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法
技术领域
本发明属于基因敲除领域，更具体地说，涉及一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法。
背景技术
RMND5B(required for meiotic nuclear division 5homolog B)基因位于人类5q35.3，编码391个氨基酸。一般认为该基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达，在心脏、肝和肾中的表达水平较强。通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现RMND5B基因与心脏早期发育密切相关。
斑马鱼与人类在心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且RMND5B基因进化上较为保守，人类RMND5B基因对应于斑马鱼rmnd5b基因，研究发现rmnd5b在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼个体小、幼鱼通体透明，利于心脏发育的观察。
基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要的方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。
发明内容
针对现有基因打靶技术中存在的脱靶率相对较高问题，本发明提供了一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，脱靶率较低，且研究rmnd5b基因的缺失与其他器官的发育的相关性，具有很好的医学研究价值。
解决上述技术问题的技术方案如下：
A.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼rmnd5b基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站TheZiFiT Targeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9)上设计一对rmnd5b基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择必须确保靶点位置碱基的插入或者缺失可以影响rmnd5b基因的整个结构域，从而改变基因的表达。
两对特异性PCR引物如下：
F1(靶位点a正向引物)：
tgTAATACGACTCACTATAgagtagttgctgagaatgtgtGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
F2(靶位点b正向引物)：
tgTAATACGACTCACTATAgtgttgcagaagacctctgccGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT
B.构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
(1)首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：
离心混匀后于37℃水浴，酶切2h以上。
(3)以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA。
>PCR引物
PCR引物上下游引物分别位于1号和3号内含子上：
F(5’-GCCAGTGCTGCTGACATGACTAATA-3’)
R(5’-GAACACAGACCCACAAGACACAAGT-3’)
正向引物F：T7启动子_20bp靶序列_20bp gRNA上游骨架
反向引物R：20bp gRNA下游骨架
PCR反应体系(25μL)如下：
震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃8min，(变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃20s)30个循环，再72℃8min。待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果
(4)检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物。
(5)测定纯化之后的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下。
体外转录反应体系(20μL)：
将反应物都加入1.5mL RNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2h；
水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；
向转录体系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率。
(6)特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃。吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度。
C.斑马鱼胚胎的显微注射
尽量在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中。
在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL。注射约1.8nL Cas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.19mmol/LKCl，)中，28℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析。
显微注射体系如下：
D、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其rmnd5b基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范。
提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精50小时后(50hpf)，分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mL Ep管中(每管10只胚胎)，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：
向装有胚胎的Ep管中加入400μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴锅中裂解2小时以上(期间每隔半小时，轻轻颠倒混匀，以保证胚胎被充分裂解完全)；
裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积(400μL)异丙醇(预先冷却)于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000×g离心10min，倒掉上清液；
加入75％乙醇500μL，于4℃条件下，12000×g离心5min，弃上清液，室温风干20min；
加入60-100μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率
PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段。
PCR反应体系(50μL)如下：
震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性94℃5min，(变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃21s)30个循环，再72℃8min。待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确。
若PCR产物正确，则用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，在紫外下切下目的条带，进行纯化回收。
T7核酸内切酶I(T7E1)法
用T7E1分析检测是否存在突变。首先，取纯化回收之后的DNA15μL装于150μL的Ep管中，置于95℃热水中进行变性，然后自然冷却至室温(至少30min)。再取变性之后的DNA进行T7E1酶切，体系如下：
混匀体系后，于37℃水浴锅中酶切反应30min，再用2％的凝胶进行电泳，以检测目的DNA片段是否被切开。如若目的DNA片段下面有被切开的条带，则使用ImageJ软件，通过酶切后条带的亮度来估计非同源末端连接的频率。
另外，送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息。
E.注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤。
F.目的序列的TA克隆
T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序。若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测。
G.质粒的Sanger测序
H.获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率。受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出309bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到F1代。如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体(具体方法如前面所述)。
I.获得斑马鱼突变体的F2代纯合子
从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28℃培养，受精三天后取部分胚胎进行鉴定。将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出309bp靶位点附近区域，通过转化、挑单克隆并测序，初步检验是否可以得到rmnd5b突变体纯合子。如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定。
同上可进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到这种新的斑马鱼品系。
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)通过CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计，构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成，斑马鱼胚胎进行显微注射，T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性；
(2)本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，脱靶率较低，且研究rmnd5b基因的缺失与其他器官的发育的相关性，具有很好的医学研究价值。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9打靶系统的原理图；
图2为rmnd5b基因上靶位点的结构图；
图3为缺失型和WT型F0代成鱼PCR电泳图；
图4为缺失型和WT型基因序列反向对比图；
图5为靶位点附近缺失对比。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。
实施例1
基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，主要通过如下步骤完成：
A.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼rmnd5b基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站TheZiFiT Targeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9)上设计一对rmnd5b基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择必须确保靶点位置碱基的插入或者缺失可以影响rmnd5b基因的整个结构域，从而改变基因的表达。
两对特异性PCR引物如下：
F1(靶位点a正向引物)：
tgTAATACGACTCACTATAgagtagttgctgagaatgtgtGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
F2(靶位点b正向引物)：
tgTAATACGACTCACTATAgtgttgcagaagacctctgccGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT
B.构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
(1)首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：
离心混匀后于37℃水浴，酶切2h以上。
(3)以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA。
>PCR引物
PCR引物上下游引物分别位于1号和3号内含子上：
F(5’-GCCAGTGCTGCTGACATGACTAATA-3’)
R(5’-GAACACAGACCCACAAGACACAAGT-3’)
正向引物F：T7启动子_20bp靶序列_20bp gRNA上游骨架
反向引物R：20bp gRNA下游骨架
PCR反应体系(25μL)如下：
震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃8min，(变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃20s)30个循环，再72℃8min。待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果
(4)检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物。
(5)测定纯化之后的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下。
体外转录反应体系(20μL)：
将反应物都加入1.5mL RNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2h；
水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；
向转录体系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率。
(6)特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃。吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度。
C.斑马鱼胚胎的显微注射
尽量在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中。
在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL。注射约1.8nL Cas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.19mmol/LKCl，)中，28℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析。
显微注射体系如下：
D、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其rmnd5b基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范。
提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精50小时后(50hpf)，分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mL Ep管中(每管10只胚胎)，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：
向装有胚胎的Ep管中加入400μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴锅中裂解2小时以上(期间每隔半小时，轻轻颠倒混匀，以保证胚胎被充分裂解完全)；
裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积(400μL)异丙醇(预先冷却)于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000×g离心10min，倒掉上清液；
加入75％乙醇500μL，于4℃条件下，12000×g离心5min，弃上清液，室温风干20min；
加入60-100μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率
PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段。
PCR反应体系(50μL)如下：
震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性94℃5min，(变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃21s)30个循环，再72℃8min。待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确。
若PCR产物正确，则用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，在紫外下切下目的条带，进行纯化回收。
T7核酸内切酶I(T7E1)法
用T7E1分析检测是否存在突变。首先，取纯化回收之后的DNA15μL装于150μL的Ep管中，置于95℃热水中进行变性，然后自然冷却至室温(至少30min)。再取变性之后的DNA进行T7E1酶切，体系如下：
混匀体系后，于37℃水浴锅中酶切反应30min，再用2％的凝胶进行电泳，以检测目的DNA片段是否被切开。如若目的DNA片段下面有被切开的条带，则使用ImageJ软件，通过酶切后条带的亮度来估计非同源末端连接的频率。
另外，送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息。
E.注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤。
F.目的序列的TA克隆
T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序。若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测。
G.质粒的Sanger测序
H.获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率。受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出309bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到F1代。如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体(具体方法如前面所述)。
I.获得斑马鱼突变体的F2代纯合子
从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28℃培养，受精三天后取部分胚胎进行鉴定。将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出309bp靶位点附近区域，通过转化、挑单克隆并测序，初步检验是否可以得到rmnd5b突变体纯合子。如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定。
J.同上可进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到这种新的斑马鱼品系。
图1为CRISPR/Cas9打靶系统的原理图；图2为rmnd5b基因上靶位点的结构图；图3为缺失型和WT型F0代成鱼PCR电泳图，将测序结果与野生型序列(309bp)进行对比，发现rmnd5b两个靶位点处(粗体表示，下划线)都有碱基缺失，并且从靶位点a处开始到靶位点b处，共有连续的92个碱基的缺失；图4为缺失型和WT型基因序列反向对比图；图5为靶位点附近缺失对比，由于筛选到的突变体F1代的rmnd5b基因部分碱基缺失造成整个基因的移码突变，严重影响了斑马鱼rmnd5b基因的表达，出现幼虫期纯合致死、心脏环化异常、心包水肿等不同程度的畸形。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼rmnd5b基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiTTargeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9)上设计一对rmnd5b基因的靶位点；
两对特异性PCR引物如下：
F1(靶位点a正向引物)：
tgTAATACGACTCACTATAgagtagttgctgagaatgtgtGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
F2(靶位点b正向引物)：
tgTAATACGACTCACTATAgtgttgcagaagacctctgccGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT
B.构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
(1)首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)特异性gRNA体外合成；
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒，体系如下：
离心混匀后于37℃水浴，酶切2h以上；
(3)以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；
>PCR引物
PCR引物上下游引物分别位于1号和3号内含子上：
F(5’-GCCAGTGCTGCTGACATGACTAATA-3’)
R(5’-GAACACAGACCCACAAGACACAAGT-3’)
正向引物F：T7启动子_20bp靶序列_20bp gRNA上游骨架
反向引物R：20bp gRNA下游骨架
PCR反应体系(25μL)如下：
震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；
(4)检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；
(5)测定纯化之后的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA，转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：
体外转录反应体系(20μL)：
将反应物都加入1.5mL RNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2h，水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功，向转录体系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率；
(6)特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃，吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度；
C.斑马鱼胚胎的显微注射
尽量在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL，注射约1.8nL Cas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内，注射过的受精卵放置于E3水中，28℃孵化，在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；
显微注射体系如下：
D.T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其rmnd5b基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；斑马鱼胚胎受精50小时后(50hpf)，分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mL Ep管中(每管10只胚胎)，提取基因组DNA；
PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；
PCR反应体系(50μL)如下：
震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确，若PCR产物正确，则用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，在紫外下切下目的条带，进行纯化回收；
T7核酸内切酶I(T7E1)法
首先，取纯化回收之后的DNA 15μL装于150μL的Ep管中，置于95℃热水中进行变性，然后自然冷却至室温(至少30min)。再取变性之后的DNA进行T7E1酶切，体系如下：
混匀体系后，于37℃水浴锅中酶切反应30min，再用2％的凝胶进行电泳，以检测目的DNA片段是否被切开，如若目的DNA片段下面有被切开的条带，则使用ImageJ软件，通过酶切后条带的亮度来估计非同源末端连接的频率，同时送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息；
E.注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤
F.目的序列的TA克隆
T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序，若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；
G.质粒的Sanger测序
H.获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率，受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定，将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出309bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到F1代，如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体；
I.获得斑马鱼突变体的F2代纯合子
从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28℃培养，受精三天后取部分胚胎进行鉴定，将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出309bp靶位点附近区域，通过转化、挑单克隆并测序，初步检验是否可以得到rmnd5b突变体纯合子，如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定；
J.同上可进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到这种新的斑马鱼品系。
2.根据权利要求1所述的一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤A中靶点的选择须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’，其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但须保证靶位点的3’端是NGG，靶点的选择必须确保靶点位置碱基的插入或者缺失可以影响rmnd5b基因的整个结构域，从而改变基因的表达。
3.根据权利要求1所述的一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤B的(3)步骤中所述于PCR仪上进行扩增反应，其条件为预变性95℃8min，(变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃20s)30个循环，再72℃8min。
4.根据权利要求1所述的一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤C中E3水为5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.19mmol/LKCl。
5.根据权利要求1所述的一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤D中提取基因组DNA的具体步骤为：向装有胚胎的Ep管中加入400μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴锅中裂解2小时以上(期间每隔半小时，轻轻颠倒混匀，以保证胚胎被充分裂解完全)；裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积(400μL)异丙醇(预先冷却)于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000×g离心10min，倒掉上清液；加入75％乙醇500μL，于4℃条件下，12000×g离心5min，弃上清液，室温风干20min；加入60-100μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率。
6.根据权利要求1所述的一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤D中PCR仪上扩增反应的反应条件为：预变性94℃5min，(变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃21s)30个循环，再72℃8min。
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