CN115807037A - 一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法及三倍体鱼的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法及三倍体鱼的制备方法：利用基因敲除技术对目标鱼cntd1基因进行敲除，通过基因型鉴定和选育获得cntd1纯合敲除个体；利用cntd1纯合敲除二倍体雌鱼能够产生部分不减数卵子的特性，可获得三倍体鱼，进而筛选获得cntd1纯合敲除三倍体(3N_cntd^‑/‑/‑)鱼；利用3N_cntd^‑/‑/‑雌鱼能够产生部分不减数卵子的特性，可获得四倍体鱼，进而筛选获得杂合突变四倍体(4N_cntd^{‑/‑/‑/+})鱼；利用4N_cntd^{‑/‑/‑/+}能够产生大量二倍体配子的特性，进而制备大量的三倍体鱼。与其他多倍体育种方法相比，本发明的方法，具有普适性和遗传可控性。

Description

一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法及三倍体鱼的制备方法

技术领域

本发明属于鱼类遗传育种领域，尤其涉及一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法及三倍体鱼的制备方法。

背景技术

三倍体鱼不仅具备生长快、抗逆性强的经济性状，也满足两性不育的生态要求，具有巨大的应用潜力。目前三倍体鱼的制备主要有人工诱导和远缘杂交两种方法。

人工诱导三倍体是指通过冷热休克、静水压、化学药品处理，抑制受精卵排出第二极体获得三倍体鱼，或是抑制第一或第二次卵裂获得四倍体鱼，进而制备出三倍体鱼。通过人工诱导的方法虽然可以直接获得三倍体鱼，但由于孵化率和成活率低，且存活下来的胚胎仅部分为三倍体，难以实现规模化生产。通过人工诱导制备四倍体进而培育三倍体的方法在近十种鱼类中进行了研究，虽然能够获得四倍化的胚胎，但难以获得成年四倍体鱼。有研究发现即使三倍体诱导非常成功的条件下，静水压诱导也会导致大西洋鲑鱼的染色体发生畸变，从而影响三倍体的生长和四倍体的育性。

鱼类进行倍性调控的另一重要方法是远缘杂交，通过远缘杂交制备三倍体的方法，关键在于获得可育的四倍体鱼。利用四倍体鲫鲤分别与二倍体红鲫和鲤鱼交配，获得了三倍体湘云鲫和湘云鲤，以湘云鲫为代表的异源三倍体鱼具有生长快、抗逆性强且不育的特点，在实际生产中得到了大规模的应用。但并非所有的杂交组合都能产生四倍体鱼，目前仅在鲫鲤、鲫鲂和鲤鲂三种杂交组合中报道有四倍体鱼的产生。

大规模制备三倍体鱼的关键在于获得可育的四倍体品系，建立一套通用的、遗传可控的四倍体鱼选育方法对于鱼类育种具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种通用的、遗传可控的四倍体鱼的选育方法，并提供一种遗传可控的三倍体鱼的制备方法。

由于Cntd1在减数分裂过程中促进交叉的形成至关重要，通过敲除该基因以抑制减数分裂过程中交叉的形成，以干扰染色体的精准分裂，产生不减数配子，以选育出四倍体品系，进而规模化制备三倍体鱼。基于上述总的构思，本申请提供一种遗传可控的四倍体选育及三倍体鱼制备方法：利用基因敲除技术对目标鱼cntd1基因进行敲除，通过基因型鉴定和选育获得cntd1纯合敲除个体；利用cntd1纯合敲除二倍体(2N_cntd^-/-)雌鱼能够产生部分不减数卵子的特性，可获得三倍体鱼，进而筛选获得cntd1纯合敲除三倍体(3N_cntd^-/-/-)鱼；利用3N_cntd^-/-/-雌鱼能够产生部分不减数卵子的特性，可获得四倍体鱼，进而筛选获得杂合突变四倍体(4N_cntd^-/-/-/+)鱼；利用4N_cntd^-/-/-/+能够产生大量二倍体配子的特性，进而制备大量的三倍体鱼。与其他多倍体育种方法相比，本发明提出的基于cntd1敲除选育四倍体鱼品系的方法，具有普适性和遗传可控性。

基于上述总的构思，本发明提出的具体技术方案为：

一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法，包括如下步骤：

(1)利用基因敲除技术对二倍体目标鱼的cntd1基因进行敲除，通过基因型鉴定和选育获得cntd1纯合敲除二倍体鱼2N_cntd^-/-；

(2)将雌性2N_cntd^-/-与其他基因型的雄性交配，获得的子代生长至可以剪尾时，通过基因型鉴定和流式检测，筛选获得cntd1纯合敲除三倍体鱼3N_cntd^-/-/-；

(3)将雌性3N_cntd^-/-/-与其他基因型的雄性交配，获得的子代生长至可以剪尾时，通过基因型鉴定和流式检测，筛选获得cntd1杂合敲除四倍体鱼4N_cntd^-/-/-/+，即为遗传可控的四倍体鱼。

上述的选育方法，优选的，在步骤(1)中，所述利用基因敲除技术对二倍体目标鱼的cntd1基因进行敲除的具体操作包括以下步骤：在NCBI数据库中搜索或者通过PCR扩增测序获得目标鱼cntd1基因的序列，根据序列设计敲除靶点，构建敲除质粒或合成敲除相关RNA，经显微注射后获得敲除F0胚胎。

优选的，在步骤(1)中，所述通过基因型鉴定和选育获得cntd1纯合敲除二倍体鱼2N_cntd^-/-的具体操作包括以下步骤：在敲除靶点上、下游设计检测引物，通过PCR扩增涵盖靶点的DNA片段，再检测cntd1靶点序列的变化情况，对显微注射后获得的敲除F0胚胎进行敲除效率检测，并将经检测敲除有效的F0胚胎培育至成年得到阳性F0个体；再将阳性F0个体与野生型交配得到的F1胚胎，对F1胚胎进行敲除效率检测，并将经检测敲除有效的F1胚胎培育至成年得到阳性F1个体；再将具有相同突变的阳性F1个体进行自交得到F2胚胎，对F2进行基因型鉴定，筛选获得cntd1纯合敲除个体2N_cntd^-/-。

上述的选育方法，优选的，所述二倍体目标鱼为二倍体斑马鱼。

优选的，利用基因敲除技术对二倍体斑马鱼的cntd1基因进行敲除时，根据序列设计敲除靶点、构建敲除质粒、经显微注射后获得敲除F0胚胎的具体操作包括如下步骤：

在NCBI数据中搜索获得斑马鱼cntd1的基因序列，根据Crispr/cas9靶点设计规则，在斑马鱼cntd1基因靠前的几个外显子上设计敲除靶点，选取外显子中以G/GG开头、NGG结尾的18-22bp片段作为靶点，序列为GGCCTGATATGCGACCACA(如SEQ ID NO.1所示)；

将T7启动子序列、靶点序列和gRNA骨架前20个碱基合并设计为正向引物F1，序列为taatacgactcactatagGGCCTGATATGCGACCACA-gttttagagctagaaatagc(如SEQ ID NO.2所示)；将gRNA骨架末端20个碱基设计为反向引物R1，序列为AGCACCGACTCGGTGCCACT(如SEQID NO.3所示)；

以含有gRNA骨架的质粒为模板，利用所述正向引物F1、反向引物R1进行PCR扩增，得到gDNA；以gDNA为模板，进行体外转录，得到gRNA，保存于-80℃冰箱中；用XbaI内切酶线性化pT3.Cas9-UTRglobin质粒，再以线性化的质粒为模板，经体外转录合成Cas9mRNA，保存于-80℃冰箱中；显微注射前，将gRNA和cas9 mRNA混合，使其终浓度分别为100ng/μl和200ng/μl，将注射液滴调成鱼卵1/10体积大小，进行显微注射，获得敲除F0斑马鱼胚胎。

优选的，通过基因型鉴定和选育获得cntd1纯合敲除二倍体斑马鱼时，在敲除靶点上、下游设计的检测引物为cntdF/cntdR，引物序列下：

正向引物cntdF:GTCTACTCATTGCAGTTATG(如SEQ ID NO.4所示)，

反向引物cntdR：GTCAGATGAATAATTGCGGC(SEQ ID NO.5所示)。

优选的，对显微注射后获得的敲除斑马鱼F0胚胎进行敲除效率检测时，敲除效率检测的具体包括如下步骤：将经显微注射的F0胚胎培育至出膜，以5个胚胎为一组，收集至1.5ml离心管中，共取6组胚胎，每组胚胎加入80μl氢氧化钠溶液(50mM)，95℃高温下消化10分钟后，震荡3秒，胚胎溶解，再加热5分钟，放置常温冷却后加入8μl Tris-HCl，混合均匀后作为PCR扩增模板；利用检测引物(cntdF/cntdR)对F0胚胎的cntd1基因进行PCR扩增，进行测序检测cntd1靶点序列的变化情况，对敲除效率进行检测；当检测出的cntd1基因峰图将在靶点附近出现套峰，并且套峰现象延续至序列末端时，即为敲除有效的F0胚胎；

对斑马鱼F1胚胎进行敲除效率检测时，敲除效率检测的具体包括如下步骤：将F1胚胎培育至出膜，选取20个胚胎，单个胚胎放入1个1.5ml离心管中，加入20μl氢氧化钠溶液，95℃高温下消化10分钟后，震荡3秒，胚胎溶解，再加热5分钟，放置常温冷却后加入2μlTris-HCl，混合均匀后作为PCR扩增模板；利用检测引物(cntdF/cntdR)对F1胚胎的cntd1基因进行PCR扩增，进行测序检测cntd1靶点序列的变化情况，对敲除效率进行检测；当检测出的cntd1基因峰图在靶点附近出现双峰，对照野生型斑马鱼cntd1基因序列在双峰位点排除野生型，得到非三倍数的插入/缺失改变的F1胚胎，即为敲除有效的F1胚胎。

还可以经过进一步筛选获得有效F1个体及F2群体，具体操作包括以下步骤：：当F1群体达到性成熟，将F1斑马鱼剪取尾鳍后，编号进行单独养殖，尾鳍放入1.5ml离心管中，加入100μl氢氧化钠溶液，95℃高温下消化15分钟后，震荡3秒，尾鳍溶解，再加热5分钟，后置于室温冷却，加入10μl Tris-HCl，混合均匀后作为PCR模板；利用检测引物(cntdF/cntdR)进行PCR扩增，获得F1群体的cntd1基因序列，同样，突变个体的测序峰图从靶点附近开始出现双峰，根据野生型斑马鱼cntd1基因序列，通过排除双峰位点野生型对应的碱基，可以获得F1个体突变的cntd1序列，筛选具有非三倍数插入或缺失的个体，将其保留下来；此时筛选出的F1个体等位基因中只有1个拷贝发生了移码突变，另一个拷贝与野生型斑马鱼cntd1序列相同，这样的突变斑马鱼也称之为杂合子。将具有相同移码突变的F1雌雄个体进行交配，获得F2胚胎，相同移码突变的F1个体间可以多次交配，获得足够数量的F2群体。

优选的，对F2进行基因型鉴定的具体操作包括以下步骤：当F2群体达到2月龄后，剪取尾鳍进行基因型鉴定，即将尾鳍放入1.5ml离心管中，用氢氧化钠法提取DNA，利用筛选引物cntdF/cntdR2进行PCR扩增，引物序列如下所示：

正向引物cntdF:GTCTACTCATTGCAGTTATG(如SEQ ID NO.4所示)，

反向引物cntdR2:ATTACCTCTCCAGTATTTCGATGGCCTGAT-ATGGGATC(如SEQ ID NO.6所示)；

得到的PCR产物经BamHI酶切检测，获得F2群体的cntd1基因型(F2群体中包含野生型(cntd^+/+)、杂合子(cntd^+/-)、纯合子(cntd^-/-)三种基因型的子代，其中测序结果显示双峰的个体为杂合子，野生型和纯合子均为单一峰，通过跟数据库中的野生型cntd1序列进行比对，野生型序列与数据序列一样，纯合子cntd1序列则插入或缺失了碱基)；选择其中测序结果显示单一峰的个体为野生型或纯合子，通过跟数据库中的野生型cntd1序列进行比对排除野生型，筛选得到的纯合子即为2N_cntd^-/-斑马鱼。

上述的选育方法，优选的，所述筛选获得cntd1纯合敲除三倍体鱼3N_cntd^-/-/-的具体操作包括以下步骤：将性成熟的雌性2N_cntd^-/-斑马鱼与杂合子或纯合子交配，获得F3胚胎，F3胚胎包含大量非整倍体、少量二倍体及三倍体胚胎，非整倍体发育致死，二倍体和三倍体可以正常发育至性成熟。通过剪尾鳍进行基因型和流式检测，筛选出3N_cntd^-/-/-斑马鱼成体。即对F3个体剪取尾鳍后进行单独养殖，将尾鳍放入1.5ml离心管中，通过碱裂解法提取基因组，采用酶切检测引物(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6)进行扩增，产物经酶切跑胶后可鉴定基因型，筛选出纯合子代群体。进而将纯合子代剪取尾鳍后加入50μlACD溶液，置于冰上，用剪刀剪碎尾鳍组织，加入200μl PBS溶液混匀，瞬时离心后取上清，加入300μlDAPI染液，避光染色10分钟后，经流式仪检测倍性，可以筛选出2N_cntd^-/-和3N_cntd^-/-/-斑马鱼。

Cntd1功能缺失对雌性和雄性的影响并不相同，雌性2N_cntd^-/-能产生大量非整倍体及部分单倍体和二倍体卵子，而雄性2N_cntd^-/-则表现为精子生成量显著减少，但其产生的少量精子仍然为单倍体精子。因此，利用2N_cntd^-/-斑马鱼可进一步获得纯合突变的三倍体斑马鱼(3N_cntd^-/-/-)，使得其雌性依然保持产生不减数卵子的能力，进而可以制备四倍体斑马鱼。

上述的选育方法，优选的，所述筛选获得cntd1杂合敲除四倍体鱼4N_cntd^-/-/-/+的具体操作包括以下步骤：将达到性成熟的雌性3N_cntd^-/-/-斑马鱼与野生型雄性(2N_cntd^+/+)进行交配，获得F4胚胎，F4胚胎包含大量非整倍体和少量整倍体胚胎，其中非整倍体发育致死，整倍体胚胎可以发育至性成熟。同样，以尾鳍组织为样本，通过流式细胞仪检测其中血细胞的DNA含量，筛选出四倍体(4N_cntd^-/-/-/+)斑马鱼。

四倍体鱼是制备三倍体的亲本，需要恢复其Cntd1的功能，才能保持雌性和雄性都具备正常的繁殖能力。因此，采用3N_cntd^-/-/-雌性与野生型二倍体交配获得cntd1杂合突变四倍体(4N_cntd^-/-/-/+)，该四倍体具有一份正常拷贝的cntd1，能够正常完成减数分裂，达到两性可育的目的。

上述的选育方法，优选的，在步骤(2)中，所述其他基因型的雄性为杂合子或纯合子雄鱼；在步骤(3)中，所述其他基因型的雄性为野生型或杂合子雄鱼。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种遗传可控的三倍体鱼的制备方法，利用上述选育方法选育得到的cntd1杂合敲除四倍体鱼4N_cntd^-/-/-/+与异性野生型二倍体进行交配，得到三倍体鱼。

优选的，利用4N_cntd^-/-/-/+雄鱼与野生型二倍体雌鱼进行交配。主要考虑雄性的配子比雌鱼多得多，因此可以制备更多的三倍体子代，实现规模化生产。在目前实验的鱼类品种中(如斑马鱼、湘云鲫)，也是采用四倍体雄鱼与二倍体雌鱼交配。

经流式鉴定，利用4N_cntd^-/-/-/+雄鱼与野生型二倍体雌鱼进行交配得到的F5子代均为三倍体。所述流式鉴定具体操作包括以下步骤：待F5胚胎孵化出膜，单个胚胎为一组，取20组胚胎，每组加50μlACD溶液，将胚胎剪碎，加入200μl PBS溶液，瞬时离心取上清，加入300μl DAPI染色液，避光染色10分钟后进行流式检测，确定检测的20个胚胎均为三倍体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明提出的基于cntd1敲除选育四倍体鱼品系的方法，具有通用性和遗传可控性；可以通过该基因的敲除实现其他经济鱼类的四倍体选育和三倍体制备，且可以通过控制cntd1的基因型调控其是否可育。

2、本发明提出的四倍体选育方法培育的是同源四倍体，该同源四倍体即可以作为制备同源三倍体的亲本，实现经济鱼尤其是基因编辑鱼类的育性控制，也可以作为制备杂交鱼的亲本，培育异源三倍体，维持杂交鱼的不育特性和生长优势，为杂交育种提供新的思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中四倍体斑马鱼选育和三倍体斑马鱼制备方法的流程图；

图2为本发明实施例中建立cntd1纯合敲除品系结果图；

图3为本发明实施例中cntd1纯合敲除雌鱼子代发育及存活率图；

图4为本发明实施例中cntd1纯合敲除雌鱼子代倍性及染色体图；

图5为本发明实施例中cntd1纯合敲除雌鱼存活子代外观、流式及雄性受精率统计图；

图6为本发明实施例中cntd1纯合敲除三倍体雌鱼子代发育、存活率、倍性及染色体结果；

图7为本发明实施例中cntd1纯合敲除三倍体雌鱼存活子代外观、流式及精巢流式图；

图8为本发明实施例中cntd1纯合敲除三倍体雌鱼存活子代与野生型交配子代胚胎发育、流式及染色体图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

需要说明的是，为方便描述和美观，本发明在表示基因型时用cntd代替cntd1，如cntd^-/-代表cntd1^-/-，cntd^-/-/-代表cntd1^-/-/-等。

实施例：

一种本发明的四倍体斑马鱼选育和三倍体斑马鱼制备方法，如图1所示，包括如下步骤：

1、基于Crispr/cas9敲除技术构建cntd1敲除斑马鱼：

靶点设计：从NCBI数据库获取斑马鱼cntd1基因序列，针对cntd1基因第二个外显子区域设计靶点(图2)，靶点序列为：GGCCTGATATGCGACCACA(如SEQ ID NO.1所示)。

gDNA制备：将T7启动子序列、靶点序列和gRNA骨架前20个碱基合并设计为正向引物F1；将gRNA骨架末端20个碱基设计为反向引物R1；以gRNA骨架质粒为模板，利用上述正反向引物进行PCR扩增，扩增出gDNA；

F1：taatacgactcactatagGGCCTGATATGCGACCACA-gttttagagctagaaatagc(如SEQID NO.2所示)，

SEQ ID NO.3：AGCACCGACTCGGTGCCACT(如SEQ ID NO.3所示)。

gDNA纯化：PCR扩增完成后可获得gDNA模板片段，通过电泳分离目的条带，进一步通过胶回收试剂盒进行纯化回收，得到纯化gDNA。

以gDNA为模板，通过体外转录体系合成gRNA。

Cas9 mRNA合成：通过XbaI内切酶线性化pT3.Cas9-UTRglobin质粒，以纯化的线性化质粒为模板，通过加帽体外转录系统合成Cas9 mRNA。

显微注射获得F0胚胎：将cntd1_gRNA和Cas9 mRNA混合，使其终浓度分别为50ng/μl和100ng/μl。利用显微注射仪将RNA混合物注射到1-2细胞期的斑马鱼胚胎中，获得F0胚胎。

F0敲除效率检测：待F0胚胎孵化出膜后，通过NaOH法提取基因组作为PCR模板。利用检测引物序列具体如下：

正向引物cntdF1：GTCTACTCATTGCAGTTATG(如SEQ ID NO.4所示)，

反向引物cntdR1：GTCAGATGAATAATTGCGGC(S如EQ ID NO.5所示)。

测序峰图显示敲除F0胚胎检测片段从靶点附近开始出现多个套峰的现象，则表示敲除有效。

2、建立cntd1纯合敲除品系：

F1培育：经3个月左右的培育，F0斑马鱼可与野生型斑马鱼进行交配，获得F1胚胎。

F1筛选：培育至成年，剪尾鳍进行基因型鉴定，筛选突变的F1个体，检测引物序列具体如下：

正向引物cntd1 F1:GTCTACTCATTGCAGTTATG(SEQ ID NO.4)，

反向引物cntd1 R1:GTCAGATGAATAATTGCGGC(SEQ ID NO.5)；

测序峰图显示阳性F1个体从靶点附近开始出现双峰，通过排除野生型对应位点的碱基，可以获得F1阳性个体的具体序列，最终获得了插入1个碱基的有效突变体。

F2培育及纯合子筛选：将具有相同的有效突变F1斑马鱼进行自交，获得F2斑马鱼，成年后剪尾鳍提基因组并进行PCR扩增，引物如下所示：

正向引物cntd1 F1:GTCTACTCATTGCAGTTATG(SEQ ID NO.4)，

反向引物cntd1 R2:ATTACCTCTCCAGTATTTCGATGGCCTGA-TATGGGATC(SEQ IDNO.6)；

PCR产物经BamHI酶切检测，可获得cntd1纯合突变品系，此时的纯合子为2N_cntd^-/-(图2)。

3、Cntd1纯合敲除三倍体斑马鱼的培育与筛选：

2N_cntd^-/-雌鱼与不同基因型雄鱼交配获得子代F4，其中大量子代发育致死，少量子代能够正常发育并存活(图3)。

流式检测2N_cntd^-/-雌鱼与野生型型雄鱼交配获得的子代倍性在二倍体和三倍体之间连续波动。染色体检测显示，其子代染色体在25到62之间波动(图4)。

说明2N_cntd^-/-雌鱼的卵子在减数分裂过程中，染色体随机分配，产生大量非整倍性配子和少量整倍性卵子。非整倍性卵子生成非整倍体，发育致死，整体性卵子生成整倍体，发育正常。

由雌性2N_cntd^-/-获得的存活子代，包含二倍体和三倍体。其中，由2N_cntd^-/-与野生型交配获得的杂合敲除三倍体均为雄鱼，由2N_cntd^-/-自交获得的纯合敲除三倍体具有雌雄两性个体。所有的三倍体雄性虽然能够与野生型卵子受精产生子代，但子代均不能存活(图5)。

4、杂合四倍体斑马鱼的培育与筛选：

3N_cntd^-/-/-雌鱼与不同基因型雄鱼交配获得子代F5，其中大量子代发育致死，少量子代能够正常发育并存活。流式检测3N_cntd^-/-/-雌鱼与野生型型雄鱼交配获得的子代倍性在二倍体和四倍体之间连续波动。染色体检测显示，其子代染色体在43到88之间波动(图6)。

3N_cntd^-/-/-雌鱼与野生型雄鱼交配获得的存活子代，包含二倍体和四倍体。流式检测四倍体DNA含量(FL1500＝200)为二倍体DNA含量(FL1500＝100)的两倍。四倍体雄鱼精子的DNA含量(FL1500＝100)与野生型体细胞的DNA含量相同(图7)。

5、三倍体斑马鱼的大量培育：

将雄性四倍体斑马鱼与野生型雌鱼进行交配，获得大量F6子代，F6子代发育正常并能够正常存活。经流式检测，该F6子代均为三倍体，染色体制片显示其染色体数为75(图8)。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)利用基因敲除技术对二倍体目标鱼的cntd1基因进行敲除，通过基因型鉴定和选育获得cntd1纯合敲除二倍体鱼2N_cntd^-/-；

(2)将雌性2N_cntd^-/-与其他基因型的雄性交配，获得的子代生长至可以剪尾时，通过基因型鉴定和流式检测，筛选获得cntd1纯合敲除三倍体鱼3N_cntd^-/-/-；

(3)将雌性3N_cntd^-/-/-与其他基因型的雄性交配，获得的子代生长至可以剪尾时，通过基因型鉴定和流式检测，筛选获得cntd1杂合敲除四倍体鱼4N_cntd^-/-/-/+，即为遗传可控的四倍体鱼。

2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述利用基因敲除技术对二倍体目标鱼的cntd1基因进行敲除的具体操作包括以下步骤：在NCBI数据库中搜索或者通过PCR扩增测序获得目标鱼cntd1基因的序列，根据序列设计敲除靶点，构建敲除质粒或合成敲除相关RNA，经显微注射后获得敲除F0胚胎。

3.根据权利要求2所述的选育方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述通过基因型鉴定和选育获得cntd1纯合敲除二倍体鱼2N_cntd^-/-的具体操作包括以下步骤：在敲除靶点上、下游设计检测引物，通过PCR扩增涵盖靶点的DNA片段，再检测cntd1靶点序列的变化情况，对显微注射后获得的敲除F0胚胎进行敲除效率检测，并将经检测敲除有效的F0胚胎培育至成年得到阳性F0个体；再将阳性F0个体与野生型交配得到的F1胚胎，对F1胚胎进行敲除效率检测，并将经检测敲除有效的F1胚胎培育至成年得到阳性F1个体；再将具有相同突变的阳性F1个体进行自交得到F2胚胎，对F2进行基因型鉴定，筛选获得cntd1纯合敲除个体2N_cntd^-/-。

4.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，所述二倍体目标鱼为二倍体斑马鱼。

5.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，利用基因敲除技术对二倍体斑马鱼的cntd1基因进行敲除时，根据序列设计敲除靶点、构建敲除质粒、经显微注射后获得敲除F0胚胎的具体操作包括如下步骤：

在NCBI数据中搜索获得斑马鱼cntd1的基因序列，根据Crispr/cas9靶点设计规则，在斑马鱼cntd1基因上设计敲除靶点，选取外显子中以G/GG开头、NGG结尾的18-22bp片段作为靶点，序列如SEQ ID NO.1所示；

将T7启动子序列、靶点序列和gRNA骨架前20个碱基合并设计为正向引物F1，序列如SEQID NO.2所示；将gRNA骨架末端20个碱基设计为反向引物R1，序列如SEQ ID NO.3所示；

以含有gRNA骨架的质粒为模板，利用所述正向引物F1、反向引物R1进行PCR扩增，得到gDNA；以gDNA为模板，进行体外转录，得到gRNA；用XbaI内切酶线性化pT3.Cas9-UTRglobin质粒，再以线性化的质粒为模板，经体外转录合成Cas9 mRNA；进行显微注射，获得敲除F0斑马鱼胚胎。

6.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，通过基因型鉴定和选育获得cntd1纯合敲除二倍体斑马鱼时，在敲除靶点上、下游设计的检测引物为cntdF/cntdR，所述cntdF的引物序列如SEQ ID NO.4所示，所述cntdR的引物序列如SEQ ID NO.5所示。

7.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，对显微注射后获得的敲除斑马鱼F0胚胎进行敲除效率检测时，敲除效率检测的具体包括如下步骤：利用检测引物对F0胚胎的cntd1基因进行PCR扩增，进行测序检测cntd1靶点序列的变化情况，对敲除效率进行检测；当检测出的cntd1基因峰图将在靶点附近出现套峰，并且套峰现象延续至序列末端时，即为敲除有效的F0胚胎；

对斑马鱼F1胚胎进行敲除效率检测时，敲除效率检测的具体包括如下步骤：利用检测引物对F1胚胎的cntd1基因进行PCR扩增，进行测序检测cntd1靶点序列的变化情况，对敲除效率进行检测；当检测出的cntd1基因峰图在靶点附近出现双峰，对照野生型斑马鱼cntd1基因序列在双峰位点排除野生型，得到非三倍数的插入/缺失改变的F1胚胎，即为敲除有效的F1胚胎。

8.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，对F2进行基因型鉴定的具体操作包括以下步骤：当F2群体达到2月龄后，剪取尾鳍进行基因型鉴定，利用筛选引物cntdF/cntdR2进行PCR扩增，所述cntdF的引物序列如SEQ ID NO.4所示，所述cntdR2的引物序列如SEQ IDNO.6所示；得到的PCR产物经BamHI酶切检测，获得F2群体的cntd1基因型，其中测序结果显示单一峰的个体为野生型或纯合子，通过跟数据库中的野生型cntd1序列进行比对排除野生型，筛选得到的纯合子即为2N_cntd^-/-斑马鱼。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的选育方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述其他基因型的雄性为杂合子或纯合子雄鱼；在步骤(3)中，所述其他基因型的雄性为野生型或杂合子雄鱼。

10.一种遗传可控的三倍体鱼的制备方法，其特征在于，利用权利要求1-9中任一项所述选育方法选育得到的cntd1杂合敲除四倍体鱼4N_cntd^-/-/-/+与异性野生型二倍体进行交配，得到的三倍体鱼。

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