CN115029352A - 一种基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法，涉及基因敲除技术领域。本发明公开了一种敲除斑马鱼adgrg1基因的引物组该引物组包括如SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的上游引物和如SEQIDNO：3所示的下游引物。该基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法包括：以如SEQIDNO：4所示的DNA序列为模板，利用该引物组进行PCR扩增，再经体外转录得到gRNA；将Cas9mRNA和所述gRNA显微注射入斑马鱼胚胎中，再经杂交和自交，即得该adgrg1基因缺失型斑马鱼。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，选育出了adgrg1基因缺失型斑马鱼。
Description
技术领域
本发明涉及基因敲除技术领域，特别是涉及一种基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法。
背景技术
adgrg1基因位于斑马鱼第7号染色体上，包含13个外显子和12个内含子，cDNA全长1947bp，编码648氨基酸，adgrg1包含有7个跨膜结构域和一个G蛋白偶联受体蛋白水解位点结构域。adgrg1被证明作用于神经胶质细胞发育的上游或之内，并调节少突胶质细胞祖细胞的增殖。在多种器官中均有表达，包括心脏，肠道，肝，神经系统，胸腹膜区和三叉神经基板。该基因的人类直系同源物adgrg1(粘附G蛋白偶联受体G1)与双侧额顶多小脑回和双侧外侧裂多小脑回有关。
斑马鱼与人类发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且adgrg1基因进化上较为保守，研究发现adgrg1在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。目前，还尚未有关于基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法报道。
基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的adgrg1基因上设计合适的打靶位点，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，选育出adgrg1基因缺失型斑马鱼。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种敲除斑马鱼adgrg1基因的引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物。
本发明还提供一种根据上述的引物组选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法，包括以下步骤：
(1)以如SEQ ID NO：4所示的DNA序列为模板，利用上述的引物组进行PCR扩增，得到PCR产物；
(2)所述PCR产物体外转录得到gRNA；
(3)将Cas9 mRNA和所述gRNA显微注射入斑马鱼胚胎中，再经培育和筛选得到adgrg1基因缺失型斑马鱼F0代；
(4)所述adgrg1基因缺失型斑马鱼F0代与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，再经培育和筛选得到adgrg1基因缺失型斑马鱼F1代；
(5)所述adgrg1基因缺失型斑马鱼F1代自交两代，即得所述育adgrg1基因缺失型斑马鱼。
进一步地，所述PCR的反应体系为：5×enhancer Buffer 5μL，2X Master Mix12.5μL，10μM上游引物2.5μL，10μM下游引物2.5μL，模板1μL，ddH2O 1.5μL。
进一步地，所述PCR的反应程序为：95℃3min；95℃30s，退火60℃15s，延伸72℃15s，30个循环；再72℃3min。
进一步地，在步骤(2)中，体外转录反应体系为：模板DNA 6.5μL，10×Buffer 2μL，50/100mM DTT 2μL，40U/μLRNase抑制剂0.5μL，10mM rATP 1μL，10mM rATP 1μL，10mM rUTP1μL，10mM rCTP 1μL，10mM rGTP 1μL，T7 RNA聚合酶1μL，Nuclease-Free Water 1μL。
进一步地，在步骤(2)中，显微注射体系为MgCl210 mM，Cas9 mRNA 150ng/μL，gRNA20 ng/μL，无核酸酶H2O补足至4μL。
本发明公开了以下技术效果：
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的adgrg1基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA(终浓度20ng/μL)和Cas9 mRNA(终浓度150ng/μL)，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养60h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，且干扰掉adgrg1基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示心脏、神经系统、肠道等形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上心脏疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为CRISPR/Cas9打靶系统的原理图；
图2为adgrg1基因上靶位点的结构图；
图3为斑马鱼F2代电泳结果图，其中M为DNAMarker；1，7，8为adgrg1+/+WT(野生型)斑马鱼；2，4，6为adgrg1+/-即adgrg1突变等位基因杂合子斑马鱼；3，5为adgrg1-/-即adgrg1突变等位基因纯合子斑马鱼；
图4为缺失型和WT型基因序列正向对比；
图5为靶位点附近缺失对比。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1.设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼adgrg1基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理(图1)，在网站The ZiFiT Targeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上设计adgrg1基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响adgrg1基因的整个结构域，从而来改变基因的表达。
本发明设计的adgrg1基因上靶位点的结构如图2所示。两对特异性靶位点PCR引物及模板如下：
F1(靶位点a正向引物)：
GCGTAATACGACTCACTATAGGCTGTGATCCTGCCCTGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAG(SEQ IDNO：1)；
F2(靶位点b正向引物)：
GCGTAATACGACTCACTATAGGGAAACTACATATTTGATGGTTTTAGAGCTAGAAATAG(SEQ IDNO：2)；
R(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT(SEQ ID NO：3)；
Template(共用的PCR模板)：
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTT(SEQ ID NO：4)
PCR检测引物
PCR检测引物上下游引物位于adgrg1内含子上：
检测引物F：5’-GACAGAGACTTCAAGATGTGTGG-3’(SEQ ID NO：5)
检测引物R：5’-TAAACAAATAGAAGACGACTCGC-3’(SEQ ID NO：6)
2.构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
a，以Template为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA。
正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子20pb靶序列20bp gRNA上游骨架；反向引物R：20bp gRNA下游骨架。
PCR反应体系(25μL)如下：
震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃3min，(变性95℃ 30s，退火60℃ 15s，延伸72℃ 15s)30个循环，再72℃ 3min。待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果。
d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物。
e，测定纯化的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：
体外转录反应体系(20μL)：
将反应物都加入0.2mLRNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2h；
水浴结束后，向转录体系中加入1μLDNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，以消化DNA模板，然后取1μL样品，用配制好的1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；
f，特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃。吸取纯化后的gRNA溶液1μL进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度。
3.斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中。
在进行显微注射之前，将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 mRNA的终浓度为150ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL。注射约1.8nL Cas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/LNaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/LMgSO4，0.17mmol/LKCl)中，28℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析。
显微注射体系如下：
4.Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其adgrg1基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范。
a、提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精36小时后(36hpf)，分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mL Ep管中(每管10颗胚胎)，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：
向装有胚胎的Ep管中加入200μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴锅中裂解过夜。
裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积(200μL)异丙醇(预先冷却)于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000×g离心10min，倒掉上清液；
加入75％乙醇500μL，于4℃条件下，12000×g离心5min，弃上清液，室温风干20min；
加入60μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率
b、PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段。
PCR反应体系(50μL)如下：
震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃5min，(变性95℃ 30s，退火60℃ 15s，延伸72℃ 15s)30个循环，再72℃ 3min。待反应结束后，离心PCR产物，取5μL样品点样于1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确。
c、若PCR产物正确，则用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，在紫外下切下目的条带，进行纯化回收。
d、送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息。
4.注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤。
5.目的序列的TA克隆
PCR初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序。若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测。
6.质粒的Sanger测序
将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型。
7.获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率。受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定。将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出600bp的靶位点附近区域，观察PCR扩增是否会出现小带，PCR会出现一条316bp左右的小带，如果此突变是否可以遗传到F1代，则PCR扩增是否会出现小于316bp的小带。
如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月。再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体(具体方法如前面所述)。
8.获得斑马鱼突变体的F2代纯合子
从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28℃培养，受精四天后取部分胚胎进行鉴定。将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出542bp靶位点附近区域，通过PCR扩增分析并测序，初步检验是否可以得到adgrg1突变体纯合子。如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定。
9.同上可进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到这种新的斑马鱼品系。
图3为斑马鱼F2代电泳结果图，其中包含野生型，adgrg1+/-杂合子，adgrg1-/-纯合子。将F2代的成鱼进行基因型分析，PCR扩增结果显示，2，4，6号泳道与野生型相比，除600bp的目的条带外，还有一条316bp左右的条带，为adgrg1+/-杂合子；3，5号泳道只有一条316bp左右的条带，为adgrg1-/-纯合子，将此316bp左右的条带进行切胶回收，TA克隆，并测序。如图4和图5显示，将测序结果与野生型序列(600bp)进行对比，发现adgrg1两个靶位点(粗体表示，下划线)之间有287bp的大片段缺失，且随机增加了三个碱基，并造成了移码突变，改变斑马鱼了adgrg1基因的表达。从而影响斑马鱼肠道的发育。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 一种基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgtaatacg actcactata ggctgtgatc ctgccctgaa gttttagagc tagaaatag 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgtaatacg actcactata gggaaactac atatttgatg gttttagagc tagaaatag 59
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagcaccgac tcggtgccac t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacagagact tcaagatgtg tgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taaacaaata gaagacgact cgc 23
Claims (6)
1.一种敲除斑马鱼adgrg1基因的引物组，其特征在于，所述引物组包括如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物。
2.一种根据权利要求1所述的引物组选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以如SEQ ID NO：4所示的DNA序列为模板，利用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增，得到PCR产物；
(2)所述PCR产物体外转录得到gRNA；
(3)将Cas9 mRNA和所述gRNA显微注射入斑马鱼胚胎中，再经培育和筛选得到adgrg1基因缺失型斑马鱼F0代；
(4)所述adgrg1基因缺失型斑马鱼F0代与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，再经培育和筛选得到adgrg1基因缺失型斑马鱼F1代；
(5)所述adgrg1基因缺失型斑马鱼F1代自交两代，即得所述adgrg1基因缺失型斑马鱼。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：5×enhancerBuffer 5μL，2X Master Mix 12.5μL，10μM上游引物2.5μL，10μM下游引物2.5μL，模板1μL，ddH2O 1.5μL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应程序为：95℃3min；95℃30s，退火60℃15s，延伸72℃15s，30个循环；再72℃3min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，体外转录反应体系为：模板DNA 6.5μL，10×Buffer 2μL，50/100mM DTT 2μL，40U/μL RNase抑制剂0.5μL，10mM rATP 1μL，10mM rATP 1μL，10mM rUTP 1μL，10mM rCTP 1μL，10mM rGTP 1μL，T7 RNA聚合酶1μL，Nuclease-Free Water 1μL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，显微注射体系为MgCl210 mM，Cas9 mRNA 150ng/μL，gRNA20 ng/μL，无核酸酶H2O补足至4μL。
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