CN110684777B - 一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用 - Google Patents

一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，利用本领域的常规方法，以SEQ ID NO.1为靶基因进行基因突变操作，筛选出发生突变的F0，对F0与野生型杂交产生的F1进行基因分型，筛选出突变体F1并自交，即可获得肌间刺数目显著减少70%以上且稳定遗传的斑马鱼少肌间刺品系。本发明利用一段分离的核苷酸序列首次获得了肌间刺减少的鱼类品系，且具有性状改良效果显著、育种时间短、遗传稳定、成本低等优点，具有科学研究的基础价值和应用价值，不仅能用于鱼类肌间刺发育机制研究，而且为获得多种鱼类少肌间刺的稳定遗传品系提供了方法。

Description

一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用，通过对该核苷酸序列进行突变，可减少斑马鱼肌间刺，同时获得可稳定遗传的减少了肌间刺的斑马鱼突变体。
背景技术
肌间刺(Intermuscular bone)是仅存在于低等真骨鱼类肌肉中的针状骨骼，是由肌膈结缔组织连续同源骨化而来的膜骨(Patterson and Johnson,1995；Danos and Ward,2012)。全世界主要养殖鱼类中，几乎一半属于鲤形目(Cypriniformes)，这些鱼类都具有一定数量的肌间刺，如鲫鱼(Carassiuscarassius)、草鱼(Ctenopharyngodonidella)、鲢(Hypophthalmicht hys molitrix)等。有肌间刺的鲤科鱼类贡献了约70％的鱼类水产养殖总产量以及56％的总产值(Nie et al.,2019)，但肌间刺的存在对其经济与食用价值都造成了不利的影响(Knight&Lesser 1989；Lin et al.,2014)。自然缺失全部肌间刺的大盖巨脂鲤个体与同种含肌间刺个体无其它性状差别(Perazza et al.,2017)，表明了肌间刺数量性状选育的可行性。已有研究也对肌间刺发生发育及数目相关的分子遗传信息进行了发掘(Wan et al.,2016；Nie et al.,2017；Wan et al.,2017；Nie et al.,2018；Wan etal.,2019)，提供了肌间刺研究的遗传数据基础，但之前未筛选出与肌间刺数目直接相关的基因信息。
斑马鱼(Danio rerio)体型小巧、易于饲养、发育周期短且繁殖能力强，是重要的脊椎动物实验模型。目前，基因编辑、转基因、分子诱导等实验技术已成功在斑马鱼模型中获得应用，研究人员通过这些实验手段发现并且证明了数以千计的基因功能(彭伟等，2019)。随着骨骼研究方法和技术日益完善，斑马鱼也已经成为鱼类和脊椎动物骨骼研究的理想模型，具有广阔的科研和商业前景。已有研究对斑马鱼肌间刺的类型，分布及发育进行了观察，结果表明斑马鱼肌间刺的形态学与发育学特征与鲤科含刺鱼类基本一致(聂春红等，2018)。鉴于斑马鱼全基因组数据完善(http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)，产卵量大且易收集，胚胎成活率高(黄桂才等，2017)，DNA显微注射技术成熟(陶大昌等，2012)等特点，可以选择模式斑马鱼进行肌间刺数目性状相关基因的筛选与功能验证。
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas9)是2013年初出现的新一代基因编辑技术。它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统人工改造而成，具有制作简单、使用方便、成本低、作用效率高等特点(Mussolino&Cathomen,2013)。CRISPR/Cas9技术自发现至今，已被证实能在不同物种广泛使用，包括哺乳动物、微生物和植物，如人(Homo sapiens)(Liang et al.,2015)、小鼠(Musmusculus)(Coppola et al.,2015)、果蝇(Drosophila melanogaster)(Port&Bullock,2016)、斑马鱼(Xie et al.,2016)等。CRISPR/Cas9基因编辑技术为筛选鱼类肌间刺发生发育关键调控基因以及培育少或无肌间刺的鱼类新品系提供了高效的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。以该序列为靶序列，进行基因突变，可减少斑马鱼肌间刺，方法易行，操作简单。
本发明的另一个目的在于提供了一种肌间刺减少的斑马鱼品系包含的突变基因序列，所述的基因序列为SEQ ID NO.2所示。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
以上所述的应用中，是将SEQ ID NO.1所示序列进行突变，获得的突变序列编码的蛋白质与SEQ ID NO.1序列编码的蛋白质不同，即可。
以上所述的应用中，是将SEQ ID NO.1所示序列突变后，筛选出有突变的F0突变体，将该突变体与野生斑马鱼杂交产生F1代，培养至成鱼，筛选出F1代有突变体的杂合子，自交产生F2代，F2代中的纯合子即为肌间刺减少的斑马鱼。
以上所述的应用中，优选的，是采取CRISPR/Cas9的方式，以SEQ ID NO.1所示序列为靶位点进行基因编辑。
以上所述的应用中，优选的，在肌间刺减少的斑马鱼品系中，包含SEQ ID NO.2所示的基因序列。
以上所述的应用中，优选的，在进行CRISPR/Cas9编辑时，包括下述步骤：sgRNA上游引物(Guide Oligo：5’TGTAATACGACTCACTATAGGACAAACCTCTGACCTGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)与保守的下游引物(scaffold：5’GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC)进行Overlap PCR扩增，纯化回收sgRNA；线性化pT3TS-nCas9n质粒，纯化回收后体外转录zCas9mRNA；sgRNA和zCas9mRNA注射到1细胞期的斑马鱼胚胎，筛选突变的F0，对F0与野生型杂交产生的F1进行基因分型，筛选出突变基因型相同的F1并自交，对产生的F2基因分型后获得的纯合子即为肌间刺减少的斑马鱼品系。
本发明的保护内容还包括：通过在其它有肌间刺鱼类中，筛选与本发明SEQ IDNO.1同源的片段，通过突变该同源片段，也能获得对应的肌间刺减少的的鱼类。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次提供了可用于肌间刺减少的鱼类品系构建的基因序列以及突变基因序列。本发明中的方法可用于快速建立肌间刺减少的斑马鱼品系。该方法易行，操作简单，成本低，育种时间短(F2即可获得纯系)，可以通过表型观测与基因分型，快速且高效的获得斑马鱼肌间刺减少的品系。利用基因突变的方法获得的肌间刺减少的斑马鱼比野生型斑马鱼的肌间刺数目减少了70％以上，性状改良效果显著，具有科学研究的基础价值和商业应用价值。该方法可以成为一种快速获得肌间刺减少的斑马鱼品系的新技术，并可用于动物骨骼发生发育机制研究，还为其它鱼类获得稳定的肌间刺减少的品系提供了同源基因序列及基因突变方法。
附图说明
图1为斑马鱼的突变设计和靶位点的序列分析示意图；
确定靶位点获得了序列的突变而导致了肌间刺减少。
图2为野生型，杂合子以及纯合子斑马鱼靶位点序列测序峰图。
图3为野生型斑马鱼整体，背部与尾部的肌间刺分布示意图。
图4为杂合子斑马鱼整体，背部与尾部的肌间刺分布示意图。
图5为纯合子斑马鱼整体，背部与尾部的肌间刺分布示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方式；所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例以CRISPR/Cas9的方法对靶序列进行突变来制备无肌间刺斑马鱼品系，本领域的其他基因编辑方式，只要是针对SEQ ID NO.1做的突变，本发明所述的突变包括错义突变、移码突变等，只要突变后的序列编辑的氨基酸序列与SEQ ID NO.1编辑的氨基酸序列不同，都能成功制备肌间刺减少的斑马鱼品系。
实施例1：
一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用：
1.1实验材料
野生型斑马鱼(eGFP:sp7)(Liang et al.,2019)饲养于华中农业大学水产学院循环养殖系统，水温28℃，昼夜时长比为14:10。斑马鱼显微注射所用的胚胎由雌雄斑马鱼自然产卵获得。
1.2实验方法
1.2.1确定sgRNA靶位点
确定sgRNA靶位点为：5‘GGGTGGCGGACGGCTGAT’3。
1.2.2体外合成sgRNA
利用带有T7启动子，特异性靶点序列以及互补末端的上游引物(Guide Oligo：5’TGTAATACGACTCACTATAGGACAAACCTCTGACCTGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)与保守的下游引物(scaffold：5’GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC)进行Overlap PCR扩增。PCR体系为：2*MasterMix(YEASEN，上海)12.5μL，上下游引物(Guide Oligo/scaffold)各5μL，H2O 2.5μL。PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s，45个循环；72℃再延伸5min。取2μL PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，条带大小验证正确后使用Gel Extraction Kit(Omega，美国)试剂盒纯化回收PCR产物，并用Nanodrop 2000测浓度(Thermo Scientific，美国)。使用TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo Scientific，美国)试剂盒体外转录sgRNA，然后使用氯化锂沉淀法纯化回收sgRNA，具体操作如下：在转录后的样品中加入30μL氯化锂和30μL RNasefree H2O，充分混匀后置于-20℃过夜。4℃，20000g离心15min后移去上清，加入1mL 70％乙醇(RNase free water配制)，重复一次。移去上清，小心吸取微量残夜，待干燥后加入约20μLRNase free water溶解，即可获得sgRNA。取出1μL测RNA浓度，并通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量后分装置于-80℃保存待用。
1.2.3体外转录zCas9mRNA
使用Xba I(NEB，美国)限制性内切酶线性化pT3TS-nCas9n质粒，经过1％琼脂糖凝胶电泳确认质粒线性化完全后，用Gel Extraction Kit(Omega，美国)试剂盒纯化回收酶切产物。根据mMESSAGEmMACHIN T3 Transcription Kit(Ambion，美国)说明书体外转录zCas9mRNA，使用氯化锂沉淀法纯化回收zCas9mRNA，加入RNase free water溶解RNA后，使用Nanodrop 2000(Thermo Scientific，美国)检测浓度并通过1％琼脂糖凝胶电泳确认转录的mRNA质量后，分装置于-80℃保存待用。
1.2.4显微注射
注射前一天晚上将雌雄斑马鱼按1:1比例配对并用隔板隔开，次日注射前30min抽出隔板使其自然产卵，20min后收集胚胎并清洗待用。使用sgRNA和zCas9mRNA配制注射液，其中sgRNA的终浓度为80ng/μL，zCas9mRNA的终浓度为400ng/μL，同时加入终浓度为0.2％的酚红做指示剂。利用PicoliterMicroinjector注射仪(Warner，美国)将实验样品注射到1-2细胞期的斑马鱼胚胎中(勿超过2细胞期)。注射完成后用亚甲基蓝培养液培养斑马鱼胚胎，并置于28℃恒温培养箱中孵化。
1.2.5检测靶点突变率
选取16颗注射后24h的F0胚胎，快速提取斑马鱼胚胎基因组DNA。将待裂解的胚胎置于0.2mL EP管中吸干多余的水分，加入50μL溶液I(10mM Tris,PH＝8.4；50mM KCl；1.5mMMgCl2；0.3％Tween-20；0.3％NP-40)，94℃PCR仪器孵化/水浴20min，降温至55℃后再加入5ul 10mg/ml的蛋白酶K溶液，55℃孵化1h，94℃孵化20min，孵化结束后置于4℃待用。用靶位点扩增引物(seq F:5’-GAGCCTTGTGGAGAGCGTTA-3’；seq R:5’-AGATCTGTTTGGGCTGCGAG-3’)扩增出靶点附近576bp序列。PCR反应体系为：2*MasterMix(YEASEN，上海)10μL，上下游引物各0.5μL，基因组DNA模板1μL，无菌水8μL。PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。取2μL PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，条带大小验证正确后送到公司测序(擎科生物技术有限公司，武汉)。根据PCR产物测序的峰形图PAM序列附近的套峰，初步判断靶点能有效产生突变。16颗胚胎的突变率是30％。
1.2.6杂合F1的获得
在检测出上述16个F0胚胎全部或部分已发生突变后，将同批次注射的其余胚胎培养至成年，筛选出F0中发生突变的个体，方法同上所述：剪取少量尾鳍快速提取基因组DNA作为模板，使用靶位点扩增引物进行PCR扩增，将产物送至公司测序后，根据测序峰图筛选出发生突变的F0个体。将F0突变个体与野生型斑马鱼进行雌雄1:1配对繁殖，即可获得体细胞遗传信息完全相同的杂合F1个体。对F1个体进行基因分型测序检测，筛选出靶位点序列突变类型相同且导致移码突变的F1个体。
1.2.7纯合F2的获得
将以上获得的F1杂合子斑马鱼进行自交，即可获得1/4的纯合子突变个体。基因分型确定突变纯合子序列信息后，即可获得可稳定遗传的斑马鱼肌间刺减少的品系。
1.2.8斑马鱼肌间刺减少的品系基因型与表型分析
野生型斑马鱼与肌间刺减少的突变体斑马鱼的靶位点基因序列比较结果如图1所示。Wild为野生型斑马鱼靶位点序列，Mutant为肌间刺减少的斑马鱼靶位点基因组序列。野生型，杂合子，纯合子靶位点序列测序峰图如图2所示。
通过茜素红骨骼染色法(成鱼在4％多聚甲醛中固定48h后，在ddH2O水中过夜漂洗；随后在3％H2O2与1％KOH混合溶液中漂白4h；在ddH2O中漂洗30min；在30％饱和硼砂溶液中处理12h；ddH2O漂洗30min；在1％茜素红S(Sigma)与1％KOH混合溶液中染色24h；20％甘油和1％KOH溶液中漂洗24h；在1％胰蛋白酶(Solarbio)和2％饱和硼砂混合溶液中漂洗24h，去除杂质；在50％，100％甘油中梯度透明，储存)对斑马鱼肌间刺表型进行观察。
野生型斑马鱼整体肌间刺表型如图3所示，其背部与尾部分布有数目显著的肌间刺，单侧肌间刺总数目约为35-40根；纯合子突变体斑马鱼整体肌间刺表型如图5所示，其背部肌间刺已全部消失，单侧尾部仅存在10-15根肌间刺。但杂合子成鱼的肌间刺表型与正常野生型斑马鱼无区别(图4)。我们通过进一步的侧交实验，用纯合子的肌间刺减少的品系和野生型斑马鱼杂交，得到的杂合子成鱼肌间刺表型和野生型个体表型一致，说明该基因为隐性遗传，肌间刺减少的表型需要等位基因都突变。纯合子肌间刺减少的品系自交得到的子代都是肌间刺减少的品系，证明其等位基因都已突变，且能产生稳定遗传的表型。测序分析表明该稳定遗传的肌间刺减少的品系来自于一种突变体，与野生型(SEQ ID NO.1)相比，靶序列附近的序列突变为SEQ ID NO.2所示序列，导致移码突变。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttaaagttg gaagaaagag gaaatccagt gtagggggtg gcggacggct gattggtgta 60
acaccaacca ttcccacc 78
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttaaagttg gaagaaagag gaaatccagt gtagggggtg gcggacggtg taacaccaac 60
cattcccacc 70
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtggcgga cggctgat 18
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtaatacga ctcactatag gacaaacctc tgacctgtgg ttttagagct agaaatagc 59
<210> 5
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatccgcacc gactcggtgc cactttttca agttgataac ggactagcct tattttaact 60
tgctatttct agctctaaaa c 81
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagccttgtg gagagcgtta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatctgttt gggctgcgag 20

Claims (6)

1.一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的应用的过程包括将SEQ ID NO.1所示序列进行突变，突变后的序列为SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的应用的过程是将SEQ ID NO.1所示序列突变后，筛选出有突变的F0突变体，将该突变体与野生斑马鱼杂交产生F1代，培养至成鱼，筛选出F1代有突变体的杂合子，自交产生F2代，F2代中的纯合子即为肌间刺减少的斑马鱼。
4.根据权利要求3所述的应用，所述突变是采取CRISPR/Cas9的方式。
5.根据权利要求1所述的应用，在制备的肌间刺减少的斑马鱼品系中，包含SEQ IDNO.2所示的基因序列。
6.根据权利要求4所述的应用，在进行CRISPR/Cas9编辑时，包括下述步骤：sgRNA上游引物Guide Oligo：5’TGTAATACGACTCACTATAGGACAAACCTCTGACCTGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC与保守的下游引物scaffold：5’GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC进行Overlap PCR扩增，纯化回收sgRNA；线性化pT3TS-nCas9n质粒，纯化回收后体外转录zCas9m RNA；sgRNA和zCas9mRNA注射到1细胞期的斑马鱼胚胎，筛选突变的F0，对F0与野生型杂交产生的F1进行基因分型，筛选出突变基因型相同的F1并自交，对产生的F2基因分型后获得的纯合子即为肌间刺减少的斑马鱼品系。
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