CN112674240B - 一种禾花鲤肌间刺弱化调节剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种禾花鲤肌间刺弱化调节剂，调节剂包括食用剂和浸泡剂，其中食用剂由油酸、棕榈酸、亚油酸和花生四烯酸组成；浸泡剂采用经标记和化学修饰的化学合成双链小RNA配置成浓度大于2.5mg/L的溶液，双链小RNA包括正向序列和反向序列。反向序列进行化学修饰：3′端胆固醇修饰，5′端两个硫代修饰，3′端4个硫代修饰，反向序列全碱基甲基化修饰。在使用本发明的产品后，通过改变肌间刺生长内环境，改善肌间刺周围组织营养，弱化禾花鲤肌间刺的分化形成，使肌间刺生长减缓，长度变短，硬度降低，使禾花鲤肉质口感更好，更利于鱼产品的产业化加工。

Description

一种禾花鲤肌间刺弱化调节剂及其应用

技术领域

本发明属于农产品和分子生物学技术领域，涉及一种禾花鲤肌间刺弱化调节剂及其应用。

背景技术

禾花鲤，食禾花后鱼肉具有禾花香味而得名,它体型粗短、鳞细皮薄、肉质细嫩、味道鲜美。是一种稻鱼共养品种。稻田养殖鲤鱼这种稻鱼共生的农业生产模式在我国具有悠久的历史和文化传承，稻渔产业化水产养殖是具有稳粮、促渔、增收、提质、环境友好、可持续发展的一种种养模式。稻田养鱼模式在保护环境和保证水稻增产的同时，增加了水产养殖的产量，进一步发展农村经济的一条重要途径。

养殖的禾花鲤除以鲜活形式进入市场外，还有很大一部分为深加工产品，如制成鱼丸，鱼片等。禾花鲤的肌间刺数目较多，是鱼产品深加工的关键限制性因素之一，同时也对其在鲜鱼市场上的受欢迎程度有着重要影响。

肌间刺是鱼类的肌间骨骼，是位于脊椎骨两侧肌间隔中的硬骨小刺，是由肌膈间的结缔组织直接骨化而形成的。肌间骨在低等真骨鱼类中普遍存在，随着鱼类的演化，其形态逐渐复杂化。众多细小的肌间刺一直以来影响多种鱼类的食用品质，因此，鱼类肌间刺的形态和发育机制一直是水产研究的热点。其中，关于真骨鱼类肌间骨的骨化模式研究主要集中在黄鳝、鲢鱼、鲫鱼、鲤鱼和团头鲂，这些研究主要集中在肌间骨的形态、数量和分布等规律，而关于肌间骨发育分子调控的研究仅仅在罗非鱼(Tilapia)、鲤鱼(Commoncarp)和团头鲂有报道。

有研究表明补充外源性脂质，可以弱化肌间刺。其主要机制是通过外源脂质的添加抑制细胞对代谢应激反应的调节剂FOXOs基因的激活，影响其核定位，进而降低SOX9基因的表达，激活脂肪酸氧化，改善肌间刺周围组织营养，从而抑制骨质生成、弱化肌间刺的发生。小分子RNA(microRNA,miRNA)是一类进化保守的、内源性的、非编码的小RNA。miRNA通过与靶基因的3′非翻译区(Untranslated regions,UTR)结合从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种禾花鲤肌间刺弱化调节剂及其应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种禾花鲤肌间刺弱化调节剂，调节剂包括食用剂和浸泡剂，其中食用剂由油酸、棕榈酸、亚油酸和花生四烯酸组成；浸泡剂为双链小RNA溶液。

进一步，按质量百分比计，食用剂由油酸10-25％；棕榈酸5-30％；亚油酸20-35％；花生四烯酸10-35％组成。

进一步，食用剂添加至禾花鲤的基础混合饲料中，按重量百分比计，食用剂添加比例为1％。

进一步，浸泡剂为经过标记和化学修饰的化学合成双链小RNA溶液。

进一步，双链小RNA的正向序列为：5′-UGUGCAAACCCAUGCAAAACUGA-3′；双链小RNA的反向序列为：5′-UsCsAGUUUUGCAUGGGUUUGCsAsCsAs-Chol3′。该双链小RNA特异性抑制FOXO1基因，进而影响SOX9基因的功能行使，改变肌间刺生长内环境，结合食用剂达到改善肌间刺周围组织营养，协同弱化肌间刺分化生长的目的。

进一步，反向序列进行化学修饰：3′端胆固醇修饰，5′端两个硫代修饰，3′端4个硫代修饰，反向序列全碱基甲基化修饰。

进一步，双链小RNA溶液为浓度2.5mg-5mg/L的溶液。

进一步，浸泡剂使用前，先将鱼禁食6-10h。

2.以上任一项所述的禾花鲤肌间刺弱化调节剂在制备鱼饲料、鱼饲料添加剂中的应用。

进一步，所述鱼饲料为禾花鲤鱼饲料。

目前，有关于禾花鲤肌间刺的研究主要集中于数目、形态及分子机制等研究，但关于通过营养学影响肌间刺分化发育的研究很少，有研究表明，脂质是骨膜细胞代谢的限制性因素，而成骨细胞的高耗氧状态主要是由脂肪酸高氧化率(FAO)维持。因此脂肪酸成为在营养水平上调控鱼肌间刺分化的一个选项。

油酸：是一种单不饱和脂肪酸，存在于动植物体内，是动物食物中不可缺少的营养素。可补充升高FAO，抑制骨化作用。

亚油酸：是生物体必需脂肪酸，它具有预防胆固醇过高和动脉硬化的作用。富含亚油酸的食物：红花油、棉籽油、玉米油、胡桃、葵花籽油、大豆油、芝麻油、花生油。

α-亚麻酸：也是生物体必需脂肪酸，能够降低空腹及餐后的甘油酯，降解血栓。使血流顺畅。富含α-亚麻酸的食物：紫苏油、大麻籽油、亚麻籽油、黑加仑籽油、大豆油。

花生四烯酸：是一种半必需脂肪酸，可调节免疫系统、改善预防全身的多种病症、保护肝细胞、促进消化功能。

本发明的有益效果在于：本发明通过综合运用分子生物学、组织学和化学合成原理，在对禾花鲤肌间刺形成深入研究基础上，研究开发高效、稳定的禾花鲤肌间刺弱化的调节剂。通过化学合成一对特异抑制禾花鲤FOXO1基因表达的核苷酸短链，从降低肌肉FOXO1含量方面来改变肌间刺生长内环境，并结合食用剂改善肌间刺周围组织营养，协同影响弱化禾花鲤肌间刺的分化形成，使肌间刺生长减缓，长度变短，硬度降低，使得禾花鲤肉质口感更好，有利于鱼产品的产业化发展。本发明禾花鲤肌间刺弱化的调节剂包括食用部分和浸泡部分，采用多角度弱化机制，具有原材料便宜、效果突出、产品质量稳定、价格合理、核心技术先进和易操作性，是目前比较新型的禾花鲤肌间刺弱化的调节剂，具有广阔的市场前景。更甚的是本发明最突出优点是结合外源脂质和人工合成的禾花鲤肌间刺弱化的新型小RNA化合物，制作的调节剂能够明显抑制禾花鲤肌间刺的形成，同时在使用调节剂后对禾花鲤生长增重不产生影响，开拓了禾花鲤的深加工范围。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为禾花鲤肌间刺弱化调节剂对禾花鲤肌肉FOXO1基因表达量的影响。

图2为禾花鲤肌间刺的形态学观察。

具体实施方式

下面将结合附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：禾花鲤肌间刺弱化调节剂对禾花鲤生长指标的影响

禾花鲤肌间刺弱化调节剂包括食用剂和浸泡剂，其中食用剂按质量百分比计由以下原料混合而成：

油酸10-25％；

棕榈酸5-30％；

亚油酸20-35％；

花生四烯酸10-35％。

浸泡剂采用经过标记和化学修饰的化学合成双链小RNA配置成浓度2.5mg-5mg/L的溶液，将禾花鲤定期浸泡其中。

双链小RNA的正向序列为：5′-UGUGCAAACCCAUGCAAAACUGA-3′；

双链小RNA的反向序列为：5′-UsCsAGUUUUGCAUGGGUUUGCsAsCsAs-Chol3′。

反向序列进行化学修饰：3′端胆固醇修饰，5′端两个硫代修饰，3′端4个硫代修饰，反向序列全碱基甲基化修饰。

本实施例共设2组，第一组为普通日粮饲喂对照组；第二组为试验组，在禾花鲤普通日粮中按照1％的比例添加调节剂的食用剂，并在养殖时长7个月的第2-5个月采用肌间刺弱化调节剂浸泡剂每月浸泡禾花鲤1次，每次浸泡时间5个小时，在进行弱化浸泡之前，先禁食6-10h。生长指标具体结果如表1，禾花鲤肌间刺弱化调节剂试验组和对照组相比，禾花鲤的体重增加及增重率没有显著性差异。

表1肌间刺弱化调节剂对禾花鲤生长性能的影响(平均值±标准差)n＝5

实施例2

肌间刺统计具体结果如图1，共设4组，第一组为普通日粮饲喂对照组；第二组在禾花鲤普通日粮中按照1％的比例添加调节剂的食用剂部分；第三组禾花鲤定期每月采用肌间刺弱化浸泡剂部分浸泡；第四组为饲料添加食用剂和浸泡剂浸泡结合组。各组禾花鲤肌肉FOXO1基因表达量统计如图1。

由图1可知，相比较普通日粮饲喂对照组，第二组和第三组FOXO1的相对表达量显著降低，第四组为饲料添加食用剂和浸泡剂浸泡结合组，禾花鲤肌肉中FOXO1表达量最低。

实施例3：禾花鲤肌间刺弱化调节剂对禾花鲤肌间刺的影响

肌间刺统计具体结果如表2，共设4组，第一组为普通日粮饲喂对照组；第二组在禾花鲤普通日粮中按照1％的比例添加食用调节剂部分；第三组禾花鲤仅定期每月采用肌间刺弱化浸泡液部分浸泡；第四组为饲料添加和浸泡结合组。

养殖时长7个月，每组取8条鱼，敲晕并测量外部形态特征→煮至九成熟→分离肌间刺并做好记录→整理分析数据，用纱布将鱼全部包裹两三层，然后用白线打好结，最后再放入开水中煮，煮到九成熟即可。然后将鱼捞出，去掉纱布，用镊子轻轻的将鱼皮全部拨开，一定要保证鱼的完整性。将鱼敲晕，是为了避免鱼在开水中活蹦乱跳。将鱼包裹上纱布再煮是为了避免鱼黏在锅底，从而损坏了鱼的完整性。煮到九成熟是便于肌间刺的分离，不太熟，鱼肉跟肌间刺还没有分离，太熟了鱼肉跟肌间刺又会直接分离，从而不能保证禾花鲤的完整性。为了有序的分离肌间刺，我们先把鱼进行划分。上下和腹背以脊椎为界，前后以腹腔后缘为界，这样我们把一条禾花鲤分为八个部分，分别为左躯轴上、左尾轴上、左躯轴下、左尾轴下、右躯轴上、右尾轴上、右躯轴下、右尾轴下。分离肌间刺时就以这样的一个顺序来进行分离，按照顺序将肌间刺取出，洗净，摆放整齐，记录。肌间刺需要将禾花鲤进行彻底的解剖才能分离出来进行观察。图2是本实验中将肌间骨进行彻底分离后得出的禾花鲤肌间刺形态图。肌间刺有三种类型，髓弓小刺、脉弓小刺、椎体小刺。如图所示，肌间刺有7种形态，分别为“I”型、“Y”型、“卜”型、“一端多叉”型、“两端两叉”型、“两端多叉”型、“树枝”型。

表2肌间刺弱化调节剂对禾花鲤肌间刺性状的影响

试验期内，动物死亡率(0.4％)不受日粮处理的影响。但不同调节剂处理对禾花鲤肌间刺影响显著，从表观统计结果看，处理4组的左侧肌间刺最长刺和最短刺平均长度均为最低，且最长刺平均硬度也为最低。同时，处理4组禾花鲤肌肉FOXO1基因表达量也最少，从理论上也提供了支撑。这表明处理4组在弱化禾花鲤肌间刺的分化形成方面效果最佳。综上所述，采用本发明的禾花鲤肌间刺弱化调节剂后，改变了肌间刺生长内环境，改善了肌间刺周围组织营养，弱化禾花鲤肌间刺的分化形成，使肌间刺生长减缓，长度变短，硬度降低，使禾花鲤口感更好，有利于鱼产品的产业化发展和加工。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种禾花鲤肌间刺弱化调节剂，其特征在于，调节剂包括食用剂和浸泡剂，按质量百分比计，食用剂由油酸10-25％；棕榈酸5-30％；亚油酸20-35％；花生四烯酸10-35％组成；浸泡剂为经过标记和化学修饰的化学合成双链小RNA溶液，双链小RNA的正向序列为：5′-UGUGCAAACCCAUGCAAAACUGA-3′；双链小RNA的反向序列为：5′-UsCsAGUUUUGCAUGGGUUUGCsAsCsAs-Chol3′；反向序列进行化学修饰：3′端胆固醇修饰，5′端两个硫代修饰，3′端4个硫代修饰，反向序列全碱基甲基化修饰。

2.根据权利要求1所述的禾花鲤肌间刺弱化调节剂，其特征在于，食用剂添加至禾花鲤的基础混合饲料中，按重量百分比计，食用剂添加比例为1％。

3.根据权利要求1所述的禾花鲤肌间刺弱化调节剂，其特征在于，双链小RNA溶液为浓度2.5mg-5mg/L的溶液。

4.根据权利要求1所述的禾花鲤肌间刺弱化调节剂，其特征在于，浸泡剂使用前，先将鱼禁食6-10h。

5.权利要求1-4任一项所述的禾花鲤肌间刺弱化调节剂在制备鱼饲料、鱼饲料添加剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述鱼饲料为禾花鲤鱼饲料。

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