CN116904523A - 利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，本发明是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术在尼罗罗非鱼中突变类固醇合成酶编码基因cyp17a2，导致雌性个体丢失挖沙筑巢的产卵行为，进而在罗非鱼中建成雌性不育群体；即在尼罗罗非鱼中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立了cyp17a2纯合敲除系，通过突变cyp17a2基因可控制基因突变雌鱼的育性，进而防止突变位点的渐渗以及保护自然环境的多样性；此种方法不仅可以丰富cyp17a2基因的功能研究，同时为水产动物的育性控制技术的开发提供新思路。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，具体涉及利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法。
背景技术
水产养殖是世界增长最快的食品生产领域之一，不仅能够为人类提供大量的优质蛋白源，成为保障世界粮食安全的重要补充，而且在降低水生生物资源的利用强度、消除贫困、促进增收、繁荣经济等方面也做出了突出贡献。我国是水产养殖大国，从2008年起养殖产量一直占世界养殖总产量的60％以上，水产养殖已成为我国农业生产的重要组成部分，但目前大多数水产品仍无法以技术手段控制苗种的繁育与供应。因此，粮农组织表示渔业和水产养殖需要进一步转型，才能应对挑战；必须推动农业粮食体系转型，保证水产食品的可持续生产，保护水生生境和生物多样性。
传统的鱼类育种方式主要包括杂交育种和人工选育。但由于种间生殖隔离的存在，远缘杂交难以形成可育品系。并且缺乏可供参考和借鉴的遗传和繁殖规律，导致人们难以预判远缘杂交后代可能会出现的后代类型。如果光凭表型优势互补来进行带有盲目性质的育种，容易导致杂交后代死亡、没有杂交优势、难以形成品系等不良结果。因此，杂交育种虽作为鱼类最常规的育种方式仍具有较多局限性。
随着基因组操作技术的飞速发展，基因编辑技术(包括TALEN、CRISPR等)已在多种水产养殖动物中广泛应用。特别是CRISPR/Cas9基因编辑技术，已经广泛运用于罗非鱼、鲤鱼、鲫鱼、半滑舌鳎、黄鳝等水产动物中，其主要针对一些关键性的经济性状(生长、体色、生殖、性别等)相关基因进行了靶向基因操作的和功能研究。研究者们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术能够精准高效的聚焦高产、抗逆等优质新品种的培育。因此将基因编辑技术与分子设计育种技术进行有机结合能够快速实现优良新品种的创制，促进水产养殖业的可持续发展以及促进农业经济增收。
2021年10月和2021年11月，商品名为“Madai”红鲷鱼和“22-seiki fugu”虎豚的两种基因编辑鱼相继在日本上市销售，这两种基因编辑上市鱼比未经基因编辑的同类长得更快更大，也可节省大量饲料，降低养殖成本。目前我国研究者们同样通过基因编辑手段获得了无(少)肌间刺的团头鲂和异育银鲫等新品种，以及在罗非鱼中突变肌肉生长抑制因子获得生长快速的罗非鱼。这些结果从一定程度上说明通过基因编辑手段可以获得具有优良性状的鱼类新品种。但是经过基因编辑的水产动物一旦释放或者逃逸到自然水体中，则有可能导致基因编辑位点渐渗至自然界的野生群体中，从而破环自然界中原有的种群遗传结构和遗传多样性，造成野生水产动物的“基因污染”，具有破环生态安全的危险。因此，建立水产养殖动物的育性控制技术，可以保护天然生态安全，阻断基因编辑位点渐渗至自然环境中破环自然群体的遗传和稳定。
罗非鱼具有生长快、繁殖周期短、抗病及适应性强等特点，作为世界性养殖鱼类，是联合国粮农组织向全球推荐的优良养殖品种，同时也是我国主要养殖的淡水品种。因此，构建优良性状的罗非鱼新种质将会推动我国水产养殖业的快速发展。
在实验室养殖群体中，野生型雌性罗非鱼在繁殖期会在池底挖一个碗状巢，以便产卵后将受精卵含在口中进行孵化。在本研究中，我们发现通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在罗非鱼中突变类固醇合成酶编码基因cyp17a2导致雌性罗非鱼不具有挖沙筑巢的产卵行为，且无法产卵，最终导致雌性不育。因此，可以通过突变cyp17a2基因可控制基因突变雌鱼的育性，进而防止突变位点的渐渗以及保护自然环境的多样性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，即基因突变位点的渐渗可能会导致自然环境生物遗传稳定性和多样性的破坏，提供利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，本发明是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术在尼罗罗非鱼中突变类固醇合成酶编码基因cyp17a2，导致雌性个体丢失挖沙筑巢的产卵行为，进而在罗非鱼中建成雌性不育群体；即在尼罗罗非鱼中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立了cyp17a2纯合敲除系，通过突变cyp17a2基因可控制基因突变雌鱼的育性，进而防止突变位点的渐渗以及保护自然环境的多样性；此种方法不仅可以丰富cyp17a2基因的功能研究，同时为水产动物的育性控制技术的开发提供新思路。
为实现以上技术效果，采用如下技术方案：
利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，包括如下步骤：
步骤S1：基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对尼罗罗非鱼cyp17a2基因进行有效打靶：
靶点设计：在CRISPRdirect上进行靶位点设计，设计原则主要为：sgRNA靶点序列一般为20nt；基因特异的sgRNA模板序列位于PAM序列前，PAM序列的特征为NGG，N可以为任意核苷酸；sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高；尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上，以保证蛋白尽可能多的功能域或结构域失效；所述的sgRNA靶点引物序列为：
5’-TAATACGACTCACTATAGGCAGTCTCCCCTGGCTTGGGTTTTAGAGCTA GAAATAGC-3’；所述的sgRNA靶点引物序列如SEQ ID NO.1所示；
gRNA和Cas9 mRNA合成：
分别以gRNA质粒和Cas9质粒为模板，纯化所述特异引物扩增的DNA片段或者线性化的Cas9质粒片段，体外合成gRNA和Cas9 mRNA；
所述gRNA合成方法为：
10X T7 Buffer，2μL；T7 RNA聚合酶，1μL；rNTP，1μL；DNA模板，800ng；RNA酶抑制剂，0.5μL；无酶水至总体积20μL。37℃，3h；
加入DNase I(RNase free)(10U/μL)；37℃温浴15min(水浴)；加入50μL100％EtOH(2.5倍体积)和2μL的pH5.3的3mol/L醋酸钠；轻轻涡旋，-20℃冷冻2小时或者过夜，4℃12000rpm离心30min；弃去乙醇并用无酶水配制70％乙醇清洗，不能涡旋；4℃12000rpm离心15min，弃去70％EtOH，室温干燥5min；加入1μL的RNase inhibitor和50μL无酶水，Nanodrop2000检测浓度及OD值，-80℃保存备用；
所述Cas9 mRNA合成方法为：
首先，提取Cas9质粒并利用Xba I对其质粒进行线性化处理，37℃酶切5h，加入终浓度为5％ SDS和80μg/μL蛋白酶K在50℃下处理30min，Qiagen PCR产物直接回收试剂盒进行纯化，注射用mRNA按照T7 mMESSAGEKit(Ambion)试剂盒步骤进行合成；体系如下：2×NTP/CAP，10μL；10×Reaction Buffer，2μL；linear template DNA，1μg；T7Enzyme Mix，2μL；RNase inhibitor，0.5μL，Nuclease-free Water，至总体积20μL；37℃孵育2h，然后加1μL TURBO DNase处理残余DNA模板10min，向反应体系中加入30μL LiCl和30μL无酶水，置于-80℃中20min，最后4℃离心30min，吸去上清，70％乙醇洗涤一次，加入30μL无酶水进行溶解，Nanodrop 2000检测RNA浓度及OD值。
之后将合成的gRNA和Cas9 mRNA按照终浓度1：1混合，最后通过显微注射仪将混合液注入一细胞期的罗非鱼胚胎中；注射完成后，将其转入恒温循环水孵化系统中进行孵化并收集受精卵检测突变效率；
步骤S2:尼罗罗非鱼cyp17a2纯合敲除系的建立：
G0代阳性鱼的筛选：在稚鱼期，取鱼鳍并提取基因组DNA，通过特异性引物扩增相应DNA片段并进行测序和筛选突变鱼；
F1代杂合突变体的获得：待G0代突变阳性鱼性成熟后，将其与野生型个体交配，从而得到不同突变类型的F1代个体，测序并进行鉴定，选取同种突变类型的雌雄鱼作为F1代亲鱼；
F2代阳性鱼的获得：待同种突变类型的F1代雌、雄亲鱼到性成熟后进行杂交繁殖获得F2代个体，同样通过测序并筛选纯合突变个体。
步骤S3：基于cyp17a2纯合突变鱼的表型鉴定：
性腺组织学观察：将性成熟后的野生型和cyp17a2纯合突变雌鱼的卵巢取出，在经过固定、包埋、切片等过程之后进行HE染色，比较野生型雌鱼和cyp17a2突变雌鱼的性腺发育情况；
纯合突变育性的检测：在性成熟以后，对野生型和cyp17a2纯合突变雌鱼进行观察，对野生型雌鱼和cyp17a2纯合突变雌鱼的产卵率进行统计；实验室养殖的条件下，对野生型雌鱼和cyp17a2纯合突变雌鱼挖沙筑巢的行为进行观察。
进一步的，所述合成gRNA和Cas9 mRNA的方法为采用T7聚合酶试剂盒体外合成。
进一步的，所述将合成的gRNA和Cas9 mRNA分别按照500ng/μL和1000ng/μL的终浓度1：1混合。
进一步的，所述恒温循环水孵化系统中进行孵化的时间为9-10天。
进一步的，所述恒温循环水孵化系统中进行孵化的温度为26-28℃。
进一步的，所述G0代阳性鱼的筛选中测序方法为Sanger测序；所述筛选突变鱼的方法为PAGE电泳检测。
进一步的，所述F1代杂合突变体的获得中测序方法为Sanger测序；所述筛选同种突变类型的雌雄鱼的方法为PAGE电泳检测。
进一步的，所述F2代阳性鱼的获得中测序方法为Sanger测序；所述筛选纯合突变个体的方法为PAGE电泳检测。
本发明的有益效果为：
基因编辑技术的快速发展，目前CRISPR/Cas9基因编辑技术已经广泛运用于养殖鱼类的遗传育种中。但是可育的基因编辑群体一旦和自然群体混合，则会和自然群体杂交从而可能造成突变位点渗入到自然群体中，进而破环自然群体的遗传物质的稳定遗传以及自然生境中的群体多样性。突变cyp17a2基因，导致雌鱼不具有挖沙筑巢的生殖行为，因此也不会和野生群体交配产生新的群体以及危害自然生境的稳定和多样性。
本发明首次在尼罗罗非鱼中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立了cyp17a2纯合敲除系，这将为水产养殖动物的育性控制技术的开发提供新的方向和思路。
附图说明
图1为实施例中尼罗罗非鱼cyp17a2基因的结构及敲除靶点的位置；
图2为实施例中Sanger测序检测F2代个体的靶位点的DNA序列图；
图3为实施例中聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选纯合突变个体图；
图4为实施例中纯合突变体氨基酸预测示意图；
图5为实施例中免疫组化检测cyp17a2纯合突变体性腺中Cyp17a2蛋白表达情况对比图；
图6为实施例中WB检测cyp17a2纯合突变体性腺中Cyp17a2蛋白表达情况对比图；
图7为实施例中野生型XX个体性腺发育的解剖图；
图8为实施例中cyp17a2纯合突变XX个体性腺发育的解剖图；
图9为实施例中野生型XX个体和cyp17a2纯合突变XX个体性腺成熟系数比较图；
图10为实施例中野生型和cyp17a2纯合突变雌鱼产卵率统计图；
图11为实施例中野生型雌鱼卵母细胞成熟状态图；
图12为实施例中cyp17a2纯合突变雌鱼卵母细胞成熟状态图；
图13为实施例中野生型雌鱼挖沙筑巢的产卵行为图；
图14为实施例中cyp17a2纯合突变雌鱼缺失挖沙筑巢行为图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
实施例1：
(一)尼罗罗非鱼cyp17a1纯合敲除系的建立
靶点设计：在CRISPRdirect上进行靶位点设计，所述的sgRNA靶点引物序列为：
5’-TAATACGACTCACTATAGGCAGTCTCCCCTGGCTTGGGTTTTAGAGCTA GAAATAGC-3’；所述的sgRNA靶点引物序列如SEQ ID NO.1所示；
分别以gRNA质粒和Cas9质粒为模板，纯化特异引物扩增的DNA片段或者线性化的Cas9质粒片段，采用T7聚合酶试剂盒体外合成gRNA和Cas9mRNA。
所述gRNA合成方法为：
10X T7 Buffer，2μL；T7 RNA聚合酶，1μL；rNTP，1μL；DNA模板，800ng；RNA酶抑制剂，0.5μL；无酶水至总体积20μL。37℃，3h；
加入DNase I(RNase free)(10U/μL)；37℃温浴15min(水浴)；加入50μL100％EtOH(2.5倍体积)和2μL的pH5.3的3mol/L醋酸钠；轻轻涡旋，-20℃冷冻2小时或者过夜，4℃12000rpm离心30min；弃去乙醇并用无酶水配制70％乙醇清洗，不能涡旋；4℃12000rpm离心15min，弃去70％EtOH，室温干燥5min；加入1μL的RNase inhibitor和50μL无酶水，Nanodrop2000检测浓度及OD值，-80℃保存备用；
所述Cas9 mRNA合成方法为：
首先，提取Cas9质粒并利用Xba I对其质粒进行线性化处理，37℃酶切5h，加入终浓度为5％ SDS和80μg/μL蛋白酶K在50℃下处理30min，Qiagen PCR产物直接回收试剂盒进行纯化，注射用mRNA按照T7 mMESSAGEKit(Ambion)试剂盒步骤进行合成；体系如下：2×NTP/CAP，10μL；10×Reaction Buffer，2μL；linear template DNA，1μg；T7Enzyme Mix，2μL；RNase inhibitor，0.5μL，Nuclease-free Water，至总体积20μL；37℃孵育2h，然后加1μL TURBO DNase处理残余DNA模板10min，向反应体系中加入30μL LiCl和30μL无酶水，置于-80℃中20min，最后4℃离心30min，吸去上清，70％乙醇洗涤一次，加入30μL无酶水进行溶解，Nanodrop 2000检测RNA浓度及OD值。
之后将合成的gRNA和Cas9 mRNA分别按照500ng/μL和1000ng/μL的终浓度1：1混合，最后通过纤维注射仪将混合液注入一细胞期的罗非鱼胚胎中。注射完成后，将其转入28℃恒温循环水孵化系统中进行孵化9天并在之后收集受精卵检测突变效率。
在稚鱼期，取鱼鳍并提取基因组DNA，通过特异性引物扩增相应DNA片段并进行Sanger测序和PAGE电泳检测筛选F0代阳性突变鱼。
如图1所示，敲除靶位点设计在第一个外显子上，含hae III酶切位点。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术以及显微注射技术，成功获得cyp17a2基因突变F0代阳性鱼。待F0代阳性鱼性成熟后，将其与野生型个体交配，从而得到不同突变类型的F1代个体，选取同种突变类型的雌雄鱼作为F1代亲鱼。
待同种突变类型的F1代雌、雄亲鱼到性成熟后进行杂交繁殖获得F2代个体，筛选纯合突变个体F2代。
经过两代的杂交建系，获得纯合突变的F2代。纯合突变个体通过Sanger测序及聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)进行鉴定。如图2所示，测序峰图比较发现纯合突变个体在PAM位点附近缺失11bp(TTGGAGGAGGC)。如图3所示，PAGE的结果显示，野生型个体和纯合突变个体只有一条带；杂合子含有四条带：位于上方的两条异源双链、位于下方的一条野生型带和一条突变带。如图4所示，氨基酸预测的结果显示，cyp17a2纯合突变提前产生终止密码子，导致产生截短型的蛋白(灰色字体表示突变体中的差异氨基酸序列；灰色阴影表示P450c17超家族序列；*表示蛋白质的终止)。如图5和图6所示，同时利用免疫组化和WB检测了性腺中Cyp17a2蛋白的表达情况，发现纯合突变个体性腺中没有检测到Cyp17a2的表达，进一步证明了成功地在罗非鱼中建立了cyp17a2的纯合突变系。
(二)cyp17a2纯合突变雌性个体性腺组织形态学观察
将性成熟后的野生型和cyp17a2纯合突变雌鱼的卵巢取出，在经过固定、包埋、切片等过程之后进行HE染色，比较野生型雌鱼和cyp17a2突变雌鱼的性腺发育情况。
组织学观察发现，孵化后360天，如图7和图8所示，在cyp17a2纯合突变的XX个体的性腺中发现大量坏死的卵母细胞，而野生型XX个体的性腺中没有坏死的卵母细胞。对野生型和纯合突变个体的性腺发育情况进行比较，如图9所示，发现cyp17a2纯合突变并没有影响性腺的发育，性成熟系数(GSI)没有显著的差异。
(三)cyp17a2纯合突变雌鱼产卵及卵母细胞成熟情况统计
在雌鱼性成熟后，野生型XX雌鱼具有14天的产卵循环周期，且每条雌鱼都能产卵。但是当突变cyp17a2基因后，XX雌性个体全都不能产卵，无法通过挤压腹部的方式获得以供受精的卵母细胞，如图10所示。如图11和图12所示，通过有机溶剂对卵母细胞进行透明发现野生型XX个体所产的卵母细胞已经达到成熟(已完成生发泡破裂过程)，而对cyp17a2纯合突变雌鱼进行解剖并取相应的卵母细胞透明发现其仍含有生发泡。
(四)野生型雌鱼挖沙筑巢的产卵行为
对于性成熟的野生型雌性尼罗罗非鱼在产卵期时具有明显的挖沙筑巢的行为，进而将成熟的卵母细胞从生殖孔产到产卵巢中，最后雌鱼将受精卵含在口中进行孵育，如图13所示。当突变cyp17a2基因后，XX雌性罗非鱼不再具有挖沙筑巢的行为，且无法将卵子排出体外，如图14所示。
综上所述，本发明公开了利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，本发明是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术在尼罗罗非鱼中突变类固醇合成酶编码基因cyp17a2，导致雌性个体丢失挖沙筑巢的产卵行为，进而在罗非鱼中建成雌性不育群体；即在尼罗罗非鱼中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立了cyp17a2纯合敲除系，通过突变cyp17a2基因可控制基因突变雌鱼的育性，进而防止突变位点的渐渗以及保护自然环境的多样性；此种方法不仅可以丰富cyp17a2基因的功能研究，同时为水产动物的育性控制技术的开发提供新思路。
至此，本领域技术人员认识到，虽然本文已详尽展示和描述了本发明的实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导符合本发明原理的许多其他变形或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变形或修改。
Claims (8)
1.利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤S1：基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对尼罗罗非鱼cyp17a2基因进行有效打靶：
靶点设计：在CRISPRdirect上进行靶位点设计，设计原则主要为：sgRNA靶点序列一般为20nt；基因特异的sgRNA模板序列位于PAM序列前，PAM序列的特征为NGG，N可以为任意核苷酸；sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高；尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上，以保证蛋白尽可能多的功能域或结构域失效；所述的sgRNA靶点引物序列为：
5’-TAATACGACTCACTATAGGCAGTCTCCCCTGGCTTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；所述的sgRNA靶点引物序列如SEQ ID NO.1所示；
gRNA和Cas9 mRNA合成：
分别以gRNA质粒和Cas9质粒为模板，纯化所述特异引物扩增的DNA片段或者线性化的Cas9质粒片段，体外合成gRNA和Cas9 mRNA；
所述gRNA合成方法为：
10X T7 Buffer，2μL；T7 RNA聚合酶，1μL；rNTP，1μL；DNA模板，800ng；RNA酶抑制剂，0.5μL；无酶水至总体积20μL。37℃，3h；
加入DNase I(RNase free)(10U/μL)；37℃温浴15min(水浴)；加入50μL100％EtOH(2.5倍体积)和2μL的pH5.3的3mol/L醋酸钠；轻轻涡旋，-20℃冷冻2小时或者过夜，4℃12000rpm离心30min；弃去乙醇并用无酶水配制70％EtOH清洗，不能涡旋；4℃12000rpm离心15min，弃去70％EtOH，室温干燥5min；加入1μL的RNase inhibitor和50μL无酶水，Nanodrop 2000检测浓度及OD值，-80℃保存备用；
所述Cas9 mRNA合成方法为：
首先，提取Cas9质粒并利用Xba I对其质粒进行线性化处理，37℃酶切5h，加入终浓度为5％SDS和80μg/μL蛋白酶K在50℃下处理30min，Qiagen PCR产物直接回收试剂盒进行纯化，注射用mRNA按照T7 mMESSAGEKit(Ambion)试剂盒步骤进行合成；体系如下：2×NTP/CAP，10μL；10×Reaction Buffer，2μL；linear template DNA，1μg；T7Enzyme Mix，2μL；RNase inhibitor，0.5μL，Nuclease-free Water，至总体积20μL；37℃孵育2h，然后加1μL TURBO DNase处理残余DNA模板10min，向反应体系中加入30μL LiCl和30μL无酶水，置于-80℃中20min，最后4℃离心30min，吸去上清，70％乙醇洗涤一次，加入30μL无酶水进行溶解，Nanodrop 2000检测RNA浓度及OD值。
之后将合成的gRNA和Cas9 mRNA按照终浓度1：1混合，最后通过显微注射仪将混合液注入一细胞期的罗非鱼胚胎中；注射完成后，将其转入恒温循环水孵化系统中进行孵化并收集受精卵检测突变效率；
步骤S2:尼罗罗非鱼cyp17a2纯合敲除系的建立：
G0代阳性鱼的筛选：在稚鱼期，取鱼鳍并提取基因组DNA，通过特异性引物扩增相应DNA片段并进行测序和筛选突变鱼；
F1代杂合突变体的获得：待G0代突变阳性鱼性成熟后，将其与野生型个体交配，从而得到不同突变类型的F1代个体，测序并进行鉴定，选取同种突变类型的雌雄鱼作为F1代亲鱼；
F2代阳性鱼的获得：待同种突变类型的F1代雌、雄亲鱼到性成熟后进行杂交繁殖获得F2代个体，同样通过测序并筛选纯合突变个体。
步骤S3：基于cyp17a2纯合突变鱼的表型鉴定：
性腺组织学观察：将性成熟后的野生型和cyp17a2纯合突变雌鱼的卵巢取出，在经过固定、包埋、切片等过程之后进行HE染色，比较野生型雌鱼和cyp17a2突变雌鱼的性腺发育情况；
纯合突变育性的检测：在性成熟以后，对野生型和cyp17a2纯合突变雌鱼进行观察，对野生型雌鱼和cyp17a2纯合突变雌鱼的产卵率进行统计；实验室养殖的条件下，对野生型雌鱼和cyp17a2纯合突变雌鱼挖沙筑巢的行为进行观察。
2.如权利要求1所述的利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，其特征在于，所述合成gRNA和Cas9 mRNA的方法为采用T7聚合酶试剂盒体外合成。
3.如权利要求1所述的利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，其特征在于，所述将合成的gRNA和Cas9 mRNA分别按照500ng/μL和1000ng/μL的终浓度1：1混合。
4.如权利要求1所述的利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，其特征在于，所述恒温循环水孵化系统中进行孵化的时间为9-10天。
5.如权利要求1所述的利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，其特征在于，所述恒温循环水孵化系统中进行孵化的温度为26-28℃。
6.如权利要求1所述的利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，其特征在于，所述G0代阳性鱼的筛选中测序方法为Sanger测序；所述筛选突变鱼的方法为PAGE电泳检测。
7.如权利要求1所述的利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，其特征在于，所述F1代杂合突变体的获得中测序方法为Sanger测序；所述筛选同种突变类型的雌雄鱼的方法为PAGE电泳检测。
8.如权利要求1所述的利用基因编辑技术构建产卵行为缺失的雌性罗非鱼的方法，其特征在于，所述F2代阳性鱼的获得中测序方法为Sanger测序；所述筛选纯合突变个体的方法为PAGE电泳检测。
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