CN113142105B - 一种黄颡鱼杂交方法及杂交黄颡鱼突变体的培育方法 - Google Patents

一种黄颡鱼杂交方法及杂交黄颡鱼突变体的培育方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种黄颡鱼杂交方法及杂交黄颡鱼突变体的培育方法。其中，黄颡鱼杂交方法包括：S11、亲鱼选择；S12、亲鱼培育；S13、亲鱼管理；S14、人工催产；S15、人工授精；S16、孵化管理。本申请提供的黄颡鱼杂交方法，能够大大提升黄颡鱼杂交的成功率，提高杂交黄颡鱼的质量，为杂交黄颡鱼的继续繁衍、突变研究等打下坚实的基础。本申请提供的杂交黄颡鱼突变体的培育方法能够显著的抑制杂交黄颡鱼体内mstn的功能，改善杂交黄颡鱼的肌肉质量，进一步促进杂交黄颡鱼的生长。

Description

一种黄颡鱼杂交方法及杂交黄颡鱼突变体的培育方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别涉及一种黄颡鱼杂交方法及杂交黄颡鱼突变体的培育方法。
背景技术
黄颡鱼是鲿科、黄颡鱼属一种常见的淡水鱼。黄颡鱼属小型鱼类，生长较慢，黄颡鱼0+-2+龄为性成熟前的旺盛生长阶段，平均增长率较高。特别是1+龄阶段生长最快，一般至1+龄大部分性成熟，2+龄全部性成熟，3+龄以后体长相对增长率递减明显，但由于性腺的发育，体重相对增长率递减缓缓慢。
杂交黄颡鱼相对于普通黄颡鱼长速较快、体型修长、抗逆性强、耐运输、易存养，越来越受到人们的青睐，但是目前的杂交方法成功率低，成本高，不适于大规模的推广应用。并且，得到的杂交黄颡鱼肉质较差，亟待改良。
肌肉生长抑制素(mstn)是转化生长因子β超家族成员之一，是哺乳动物骨骼肌生长发育的负调控因子。经实验证明，mstn基因敲除的小鼠，其骨骼肌重量明显增加，是正常普通小鼠的2-3倍左右。mstn包含N端的前肽和C端的成熟肽，在动物体内前肽可以和成熟肽发生二聚体结合，从而抑制mstn的功能，促进动物的生长。
对于黄颡鱼，特别是杂交黄颡鱼而言，针对其mstn基因突变的研究十分稀少，目前，现有技术是通过直接敲除杂交黄颡鱼的mstn基因组DNA片段来达到抑制mstn功能、促进杂交黄颡鱼生长的目的，但实验研究证明，mstn基因组DNA片段中部分片段可能会对于杂交黄颡鱼的生长具有积极作用，发明人针对于此展开了系列研究。
发明内容
有鉴于此，本申请实施例提供了一种黄颡鱼杂交方法及杂交黄颡鱼突变体的培育方法，以解决现有技术中存在的技术缺陷。
本申请的一个发明点为提供一种黄颡鱼杂交方法，该方法包括：
S11、亲鱼选择：选择体质健壮、无病无伤的雌鱼和雄鱼，雌鱼尾重100-150g，雄鱼尾重400g-450g；
S12、亲鱼培育：将雌鱼和雄鱼分养在溶解氧的培育池中，投喂亲鱼饲料；
S13、亲鱼管理：产卵前一个月，每隔5-6天冲水一次，且每半个月检测水质常规指标，确保氨氮低于0.05mg/L，亚硝酸盐保持低于0.015mg/L；
S14、人工催产：配制催产注射液，并在亲鱼的鳍基部注射两次；
S15、人工授精：按雌雄比例1000:1-1.5配组，取出雄鱼精巢，吸干精巢上的血液和水分后，放入研钵中用剪刀剪碎后研碎，加入20倍体积的精子保存液保存备用；然后挤出雌鱼鱼卵流入瓷盆内，随即加入精液，搅拌，再加入0.3％-0.5％的氯化钠溶液，迅速不停地搅拌激活受精；最后用黄泥浆水脱粘，并将受精卵放入孵化桶内流水孵化，密度为30-50万粒/m3；
S16、孵化管理：调节水流以适应受精卵的发育，出膜平游后下鱼苗至暂养池，待鱼苗体色全黑并开始分散时，计数后使用高聚乙烯氧气袋打包后下塘培育，获得杂交黄颡鱼。
进一步地，所述雌鱼为雌黄颡鱼/江黄颡鱼，所述雄鱼为雄瓦氏黄颡鱼。
进一步地，所述S12，包括：
将雌鱼和雄鱼分养在溶解氧5mg/L以上、水深2米的培育池中，投喂亲鱼饲料，所述亲鱼饲料为人工配合膨化饲料，其日投喂量为亲鱼体重的1％-5％；
并且春季强化培育期间，每周投喂1-2次鲜活饵料，所述鲜活饵料包括小鱼、虾、螺、蚌中的一种或几种。
进一步地，在S14中，所述催产注射液由促黄体释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素、地欧酮和0.5％-0.7％的氯化钠溶液配置而成；
具体注射方法为：
第一针雌鱼注射的剂量为促黄体释放激素类似物15μg/kg-20μg/kg，雄鱼不注射；
第二针雌鱼注射的剂量为促黄体释放激素类似物15μg/kg-20ug/kg，绒毛膜促性腺激素1800-2000L.U./kg，地欧酮6-8mg/kg，雄鱼注射剂量减半；
注射液用量为雌鱼每尾0.2-0.4mL，胸腔注射深度为0.5cm-1cm；在水温为25-28℃的情况下，两针的注射间隔为12h。
进一步地，在S15中，所述精子保存液包括：葡萄糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠和氯化钠；
其中，葡萄糖的浓度为20-30g/L，柠檬酸钠的浓度为5-15g/L，碳酸氢钠的浓度为1-5g/L，氯化钠的浓度为0.1-0.5g/L。
本申请的另一个发明点为提供一种杂交黄颡鱼突变体的培育方法，该方法包括：
S21、通过上述的杂交方法得到杂交黄颡鱼，获取杂交黄颡鱼目标基因组DNA片段，采用DNA限制内切酶对所述杂交黄颡鱼目标基因组片段进行消化处理，获得酶切片段；
S22、采用DNA连接酶对所述酶切片段进行连接处理，获得重排DNA片段；
S23、将所述重排DNA片段克隆至目标载体上，采用PCR扩增引物对所述目标载体上的重排DNA片段进行PCR扩增处理，获得扩增产物；
S24、将所述扩增产物注入杂交黄颡鱼胚胎中，经繁殖培育后获得杂交黄颡鱼目标基因突变体。
进一步地，所述杂交黄颡鱼目标基因组DNA片段为杂交黄颡鱼mstn基因组DNA片段。
进一步地，所述杂交黄颡鱼通过雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼杂交得到。
进一步地，所述DNA限制内切酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或与SEQ IDNO：1所示核苷酸序列具有90％-99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；
所述DNA连接酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有90％-99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。
进一步地，所述PCR扩增引物选自以下三组中的任意一组：
(1)正向引物5'-GATCGGTTAACTCGACCGTT-3'，
反向引物5'-CTTGCCACGTTAGCTGCTTG-3'；
(2)正向引物5'-GATCAATTAGATCGACCGTT-3'，
反向引物5'-CTTGGCTCGTTAGGTGCTTG-3'；
(3)正向引物5'-GATCAATGCTATCGACCCAT-3'，
反向引物5'-CTTGGCTCTTACGGTGCAGG-3'。
进一步地，在所述S23之前，还包括：
采用所述DNA限制内切酶对所述重排DNA片段以及所述目标载体进行线性化处理；
所述S23，包括：
以经过线性化处理的所述目标载体为模板，采用PCR扩增引物对所述重排DNA片段进行PCR扩增处理，获得扩增产物。
进一步地，PCR扩增处理的步骤包括：
85℃-90℃预变性3min，30个循环，70℃-75℃延长5min，其中，每个循环包括85℃-90℃变性10-60s，40℃-50℃退火10-60s，70℃-75℃延伸1-5min。
进一步地，所述S24，包括：
将所述扩增产物通过显微注射注入至杂交黄颡鱼胚胎中，将所注射后的所述杂交黄颡鱼胚胎培至性成熟，并与普通同品种杂交黄颡鱼交配产卵；
荧光显微镜下筛选阳性的F0代，并继续自交传至F1、F2代，得到稳定遗传的杂交黄颡鱼目标基因突变体。
本申请的技术效果为：
本申请提供的黄颡鱼杂交方法，通过亲鱼选择、亲鱼培育、亲鱼管理、人工催产、人工授精、孵化管理六个步骤完成黄颡鱼的杂交，能够大大提升黄颡鱼杂交的成功率，提高杂交黄颡鱼的质量，为杂交黄颡鱼的继续繁衍、突变研究等打下坚实的基础。
本申请提供的杂交黄颡鱼培育方法，通过独特的DNA限制内切酶对目标基因组DNA片段中的特定部分产生消化作用，获得酶切片段，再通过独特的DNA连接酶对上述酶切片段进行重排连接，形成特定的重排DNA片段，该重排DNA片段相对于杂交黄颡鱼目标基因组DNA片段能够增强该基因组对杂交黄颡鱼产生的积极作用，在获得其重排DNA片段后，其重排DNA片段的前肽和成熟肽更加易于发生二聚体结合，进而能够更为显著的抑制mstn的功能，改善杂交黄颡鱼的肌肉质量，进一步促进杂交黄颡鱼的健康生长。
附图说明
图1为本申请一实施例的黄颡鱼杂交方法的步骤流程图；
图2为本申请一实施例的杂交黄颡鱼的培育方法的步骤流程图；
图3为本申请一实施例的试验组与对照组平均肌肉面积比例对照图；
图4为本申请一实施例的试验组与对照组平均肌纤维总数对照图；
图5为本申请一实施例的试验组与对照组平均肌纤维细胞数量对照图；
图6为本申请一实施例的试验组与对照组平均肌纤维的纤维面积对照图。
具体实施方式
在本申请中，下列术语具有下述的含义：
"亲鱼"，指发育到性成熟阶段，有繁殖能力的雄鱼或雌鱼，也叫种鱼。
"突变"，包括碱基序列的插入、替换和缺失。
"核酸"、"核酸序列"或"碱基序列"是指核苷酸，寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分。本申请的核酸能够以RNA(例如mRNA)的形态、或DNA的形态(例如cDNA或基因组DNA)存在。DNA可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA可以是编码链(有义链)、或非编码链(反义链)中任一种。另外，本申请的多核苷酸也可以在其5'侧或3'侧融合编码标签标记(标签序列或标记物序列)的多核苷酸。它们可以是合成的或是从天然来源获得的(例如分离和/或纯化)，其可以包含天然的、非天然的或者修饰过的核苷酸。
"表达载体"、"重组表达载体"是指遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，该构建体包括编码mRNA、肽、多肽、或蛋白的核苷酸序列，以及病毒、质粒以及其他运载体；该构建体在足以使所述mRNA、肽、多肽或蛋白在宿主细胞内表达的条件下与所述细胞接触，可允许宿主细胞表达所述mRNA、蛋白、多肽、或肽。本发明中，重组表达载体可以包含任意类型的核苷酸序列，包括但不限于，DNA和RNA，其可以是单链的或双链的，合成的或部分获自天然来源，并且其可以包括天然的、非天然的或改变的核苷酸。
"基因"指包括编码蛋白质的翻译序列("外显子")、不翻译的间隔序列("内含子")、以及5'和3'端不翻译的区域和任何与前述序列结合的调控元件。
"胚胎"是指处于从受精卵形成到幼体从卵壳膜中孵化前或从母体中分娩前的发育过程中的幼体。
下面结合附图对本申请的具体实施方式进行描述。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。
实施例1
本实施例提供一种黄颡鱼杂交方法，如图1所示，该方法包括步骤S11-S16。
S11、亲鱼选择：选择2-5龄体质健壮、无病无伤的雌鱼和雄鱼，雌鱼尾重100-150g，雄鱼尾重400g-450g。
其中，雌鱼优选为雌黄颡鱼/江黄颡鱼，雄鱼优选为雄瓦氏黄颡鱼。
在本实施例中，雌黄颡鱼/江黄颡鱼、雄瓦氏黄颡鱼并不是随意选择的，而是基于二者基因序列的相似性确定的。通过对比多个种类的黄颡鱼基因序列，最终发现雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼的基因序列最为适配，杂交结果也最为优异。
此外，雌鱼尾重可以为100g、110g、120g、130g、140g、150g等，雄鱼尾重可以为400g、410g、420g、430g、440g、450g等，在以上的尾重范围内，能够保证雌鱼与雄鱼的品质均等，提高其杂交的成功率。
S12、亲鱼培育：将雌鱼和雄鱼分养在溶解氧的培育池中，投喂亲鱼饲料。
具体地，可以将雌鱼和雄鱼分养在溶解氧5mg/L以上、水深2米的培育池中，投喂亲鱼饲料，所述亲鱼饲料为人工配合膨化饲料，其日投喂量为亲鱼体重的1％-5％；并且春季强化培育期间，每周投喂1-2次鲜活饵料，所述鲜活饵料包括小鱼、虾、螺、蚌中的一种或几种。
其中，亲鱼饲料的原料经膨化处理后，香味增加，适口性提高，能刺激黄颡鱼的食欲。同时，使蛋白质、脂肪等有机物的长链结构变为短链结构的程度增加，故变得更易消化。此外，膨化饲料还能够提高蛋白质的效价和利用率，减少原料中的细菌、霉菌和真菌含量，提高了饲料的卫生品质，从而减少黄颡鱼的患病风险。
此外，本实施例还可以将阿拉伯木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶等酶类制剂加入至亲鱼饲料中，以破坏亲鱼饲料的原料玉米、小麦、豆粕等植物的细胞壁，进而促进黄颡鱼对饲料中营养物质的吸收，提高黄颡鱼的免疫力。
S13、亲鱼管理：产卵前一个月，每隔5-6天冲水一次，且每半个月检测水质常规指标，确保氨氮低于0.05mg/L，亚硝酸盐保持低于0.015mg/L。
水的质量对鱼的生长影响极大，对水质的检测和管理可以有效避免环境对黄颡鱼产生的负面影响，提高黄颡鱼的培养质量。
S14、人工催产：配制催产注射液，并在亲鱼的鳍基部注射两次。
具体地，所述催产注射液由促黄体释放激素类似物(LRH-A)、绒毛膜促性腺激素(HCG)、地欧酮(DOM)和0.5％-0.7％的氯化钠溶液配置而成。
具体注射方法优选为：
第一针雌鱼注射的剂量为促黄体释放激素类似物15μg/kg-20μg/kg，雄鱼不注射；
第二针雌鱼注射的剂量为促黄体释放激素类似物15μg/kg-20ug/kg，绒毛膜促性腺激素1800-2000L.U./kg，地欧酮6-8mg/kg，雄鱼注射剂量减半；
注射液用量为雌鱼每尾0.2-0.4mL，胸腔注射深度为0.5cm-1cm；在水温为25-28℃的情况下，两针的注射间隔为12h。
需要说明的是，此处催产注射液的组成成分、注射方法、间隔时间均不是随意设置的，而是经过大量的试验最终确定的，使用上述的催产注射液和注射方法能够在保证黄颡鱼雌鱼活性的情况下，提高其排卵、排精效率和质量，进而辅助提高授精成功率。
S15、人工授精：按雌雄比例1000:1-1.5配组，取出雄鱼精巢，吸干精巢上的血液和水分后，放入研钵中用剪刀剪碎后研碎，加入20倍体积的精子保存液保存备用；然后挤出雌鱼鱼卵流入瓷盆内，随即加入精液，搅拌，再加入0.3％-0.5％的氯化钠溶液，迅速不停地搅拌激活受精；最后用黄泥浆水脱粘，并将受精卵放入孵化桶内流水孵化，密度为30-50万粒/m3。
具体地，所述精子保存液包括：葡萄糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠和氯化钠；其中，葡萄糖的浓度为20-30g/L，可以为22g/L、25g/L、28g/L等，优选为29g/L；柠檬酸钠的浓度为5-15g/L，可以为6g/L、8g/L、10g/L、12g/L等，优选为10g/L；碳酸氢钠的浓度为1-5g/L，可以为1g/L、3g/L、5g/L等，优选为2g/L；氯化钠的浓度为0.1-0.5g/L，可以为0.2g/L、0.4g/L等，优选为0.3g/L。
葡萄糖的质量份数可以为40-60份，具体为40份、45份、50份、55份、60份等；柠檬酸钠的质量份数可以为10-30份，具体为10份、15份、20份、25份、30份等；碳酸氢钠的质量份数可以为1-15份，具体为5份、8份、10份、12份、15份等；氯化钠的质量份数可以为0.1-3份，具体为0.2份、0.3份、0.5份、0.8份、1份、2份、3份等。
精子保存液中葡萄糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠、氯化钠的相互配合可以为精子的存活提供足够的营养物质与适宜其存活的外部环境，从而保证精子的活性，以提高授精的成功率。
S16、孵化管理：调节水流以适应受精卵的发育，出膜平游后下鱼苗至暂养池，待鱼苗体色全黑并开始分散时，计数后使用高聚乙烯氧气袋打包后下塘培育，获得杂交黄颡鱼。
在实际应用中，可以根据孵化桶内受精卵发育情况调节水流的大小，做到破膜前流速较大，破膜后流速适当降低；出膜平游后下鱼苗暂养池，然后投枝角类开口，待鱼苗体色全黑，并开始分散时，计数后使用高聚乙烯氧气袋打包后下塘培育，获得杂交黄颡鱼。
为探究本实施例提供的杂交方法的杂交成功率与稳定性，当黄颡鱼鱼卵发育到原肠中期时，随机捞取一定数量的卵子，对好卵和坏卵分别计数，可得受精率，其中，呈白色浑浊样的卵子为坏卵，发育成受精卵的记为好卵，受精率(％)＝受精卵数/卵粒总数×100％。
观察并记录鱼苗出膜时间，待完全出膜后，对孵出的鱼苗进行估算，得出孵化率。孵化率(％)＝孵出鱼苗数/受精卵数。
鱼苗平游出口摄食，计算平游开口摄食鱼苗数，得出出苗率。出苗率(％)＝平游鱼苗数/受精卵数×100％。结果如表1所示。
表1黄颡鱼杂交结果展示表
Figure 105725DEST_PATH_IMAGE001
从表1的结果可以看出，本申请提供的黄颡鱼杂交方法能够使黄颡鱼的受精率、孵化率、出苗率稳定保持在百分之九十以上，大大提高了杂交的成功率。
进一步地，我们设置对照组1-2和试验组1-2。其中，对照组1选择50只江黄颡鱼，对照组2选择50只雄瓦氏黄颡鱼，试验组1-2均选择50只杂交黄颡鱼，各组黄颡鱼在相同的环境条件下饲养60天。
其中，试验组1的杂交黄颡鱼通过实施例1所述的杂交方法得到。
试验组2的杂交黄颡鱼通过以下方法杂交得到：亲鱼选择→亲鱼培育→亲鱼管理→人工催产→自然受精→孵化管理，除“自然受精”步骤外，其余步骤均同实施例1。
为探究杂交与否、杂交方法是否会对黄颡鱼的生长产生影响，我们分别在饲养开始时、饲养结束时对各组黄颡鱼进行了初重(g)、末重(g)的称量以及增重率(％)、特定生长率(％)的计算，其中增重率(％)＝(末重-初重)/初重×100％，特定生长率(％)＝(末重-初重)/养殖天数×100％，结果如表2所示。
表2杂交对黄颡鱼生长的影响结果表
Figure 288444DEST_PATH_IMAGE002
由表2结果可知，杂交黄颡鱼相对于普通黄颡鱼而言，其生长情况更优，而采用本申请提供的杂交方法获得的杂交黄颡鱼相对于普通杂交黄颡鱼而言，生长更为良好。所以，本申请提供的黄颡鱼杂交方法，其不仅不会影响黄颡鱼的生长，反而能够促进黄颡鱼生长速度、质量的提高，效果优异。
总之，本申请提供的黄颡鱼杂交方法，通过亲鱼选择、亲鱼培育、亲鱼管理、人工催产、人工授精、孵化管理六个步骤完成黄颡鱼的杂交，能够大大提升黄颡鱼杂交的成功率，提高杂交黄颡鱼的质量，为杂交黄颡鱼的继续繁衍、突变研究等打下坚实的基础。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例提供一种杂交黄颡鱼培育方法，如图2所示，包括步骤S21至步骤S24。
S21、通过实施例1所的杂交方法得到杂交黄颡鱼，获取杂交黄颡鱼目标基因组DNA片段，采用DNA限制内切酶对所述杂交黄颡鱼目标基因组片段进行消化处理，获得酶切片段。
具体地，该杂交黄颡鱼目标基因组DNA片段优选为杂交黄颡鱼mstn基因组DNA片段。
DNA限制内切酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。并且该DNA限制内切酶还可以为与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90％-99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。
本实施例提供的DNA限制内切酶，能够特异性的对杂交黄颡鱼mstn基因组DNA片段进行消化处理，使该DNA片段在特定之处断开，获得一个或多个酶切片段。
S22、采用DNA连接酶对所述酶切片段进行连接处理，获得重排DNA片段。
所述DNA连接酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，并且该DNA连接酶还可以为与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有90％-99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。
本实施例提供的DNA连接酶，能够特异性的将杂交黄颡鱼的酶切片段连接起来，以获得所需重排DNA片段。
S23、将所述重排DNA片段克隆至目标载体上，采用PCR扩增引物对所述目标载体上的重排DNA片段进行PCR扩增处理，获得扩增产物。
作为本实施例的另一种实施方式，在实际应用中还可以采用所述DNA限制内切酶对所述重排DNA片段以及所述目标载体进行线性化处理，再将线性化处理后的重排DNA片段和目标载体进行PCR扩增处理，获得扩增产物。目标载体优选为p42250载体。
其中，PCR扩增引物选自以下三组中的任意一组：
(1)正向引物5'-GATCGGTTAACTCGACCGTT-3'，
反向引物5'-CTTGCCACGTTAGCTGCTTG-3'；
(2)正向引物5'-GATCAATTAGATCGACCGTT-3'，
反向引物5'-CTTGGCTCGTTAGGTGCTTG-3'；
(3)正向引物5'-GATCAATGCTATCGACCCAT-3'，
反向引物5'-CTTGGCTCTTACGGTGCAGG-3'。
PCR扩增处理的步骤包括：85℃-90℃预变性3min，30个循环，70℃-75℃延长5min，其中，每个循环包括85℃-90℃变性10-60s，40℃-50℃退火10-60s，70℃-75℃延伸1-6min。
其中，预变性温度和变性温度可以为85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃等，延长温度和延伸温度可以为70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃等，退火温度可以为40℃、42℃、44℃、45℃、46℃、48℃、50℃等，变性时间和退火时间可以为10s、20s、30s、40s、50s、60s等，延伸时间可以为1min、2min、3min、4min、5min、6min等，本申请对此不做限制。
S24、将所述扩增产物注入杂交黄颡鱼胚胎中，经繁殖培育后获得杂交黄颡鱼目标基因突变体。
具体地，可以将所述扩增产物通过显微注射注入至杂交黄颡鱼胚胎中，将所注射后的所述杂交黄颡鱼胚胎培至性成熟，并与普通同品种杂交黄颡鱼交配产卵；荧光显微镜下筛选阳性的F1代，并继续自交传至F2代，得到稳定遗传的杂交黄颡鱼目标基因突变体。
更为具体地，可以使用LHRH-A2和多潘立酮注射液促进亲本杂交黄颡鱼性成熟，收集磁雌性杂交黄颡鱼鱼卵，采集雄性杂交黄颡鱼睾丸匀浆液，并将鱼卵与睾丸匀浆液在0.69％的氯化钠溶液中混合，将受精卵置于加入曝气水的鱼缸中，注入扩增产物并于28℃孵化，获得F0代杂交黄颡鱼突变体。
将F0代突变体分别与普通杂交黄颡鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10-20个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增，再进行酶切分析并测序，确定此突变是否可以遗传到F1代。
若从F1代胚胎中检测到存在突变，则将杂交黄颡鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代杂交黄颡鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体。
从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28℃培养，受精四天后取部分胚胎进行鉴定。将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增、酶切分析并测序，初步检验是否可以得到mstn突变体纯合子。如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定。依次重复上述步骤，最终得到mstn基因突变杂交黄颡鱼纯合品系。
需要说明的是，上述DNA限制内切酶、DNA连接酶、PCR扩增引物等均不是随意选择的，而是基于杂交黄颡鱼的特性、培育方法的特性并经过大量的理论研究及试验结果确定的。本申请提供的DNA限制内切酶、DNA连接酶、PCR扩增引物配合使用，能够准确使杂交黄颡鱼的mstn基因片段产生特定突变，获得稳定的杂交黄颡鱼突变体，突变稳定性高。
本实施例提供的杂交黄颡鱼培育方法，通过DNA限制内切酶的消化作用与DNA连接酶的连接作用可以使杂交黄颡鱼目标基因组DNA产生特异性突变，获得重排DNA片段，该重排DNA片段相对于杂交黄颡鱼目标基因组DAN片段减少了对于杂交黄颡鱼生长产生负面作用的部分，在获得其重排DNA片段后，其重排DNA片段的前肽和成熟肽更加易于发生二聚体结合，进而能够更为显著的抑制mstn的功能，进一步促进杂交黄颡鱼的生长。
实施例3
本实施例提供一种杂交黄颡鱼突变体，所述杂交黄颡鱼突变体通过如实施例1所述的杂交黄颡鱼突变体的培育方法获得。
该杂交黄颡鱼突变体优选为杂交型杂交黄颡鱼突变体。
杂交黄颡鱼突变体的突变mstn基因序列如SEQ ID NO：3所示，普通杂交黄颡鱼的mstn基因序列如SEQ ID NO：4所示，与普通杂交黄颡鱼的mstn基因序列相比，本实施例提供的杂交黄颡鱼突变体的突变mstn基因序列的第380-400位发生突变。
分别将普通杂交黄颡鱼和本实施例提供的杂交黄颡鱼突变体在相同条件下分别饲养在两个鱼缸中，每月观察普通杂交黄颡鱼与杂交黄颡鱼突变体的形态学差异，任选五只野生杂交黄颡鱼和五只杂交黄颡鱼突变体，测量其全长(鱼的长度测量从鼻子的顶端到尾鳍)、体高(鱼顶部的垂直距离)、体宽(从左到右鱼体的最大距离)和体重(鱼没有水的重量)，结果如表1所示。
表1普通杂交黄颡鱼与黄桑性突变体对比表
Figure 537023DEST_PATH_IMAGE003
测量结果表明，普通杂交黄颡鱼的平均全长为12.286±0.316cm，杂交黄颡鱼突变体的平均全长为12.824±0.484cm，杂交黄颡鱼突变体的平均全长比普通杂交黄颡鱼长4.20％。
普通杂交黄颡鱼的平均体高为36.168±0.932mm，杂交黄颡鱼突变体的平均体高为39.564±0.804mm，杂交黄颡鱼突变体的平均体高比普通杂交黄颡鱼高8.58％。
普通杂交黄颡鱼的平均体宽为23.50±1.21mm，杂交黄颡鱼突变体的平均体宽为33.352±0.858mm，杂交黄颡鱼突变体的平均体宽比普通杂交黄颡鱼宽29.54％。
普通杂交黄颡鱼的平均体重为22.29±1.69g，杂交黄颡鱼突变体的平均体重为31.664±1.206g，杂交黄颡鱼突变体的平均体重比普通杂交黄颡鱼重29.60％。
由此可见，本实施例提供的杂交黄颡鱼突变体相对于普通杂交黄颡鱼，其全长、体高、体宽、体重均得到显著提升，生长状态良好，适于大规模推广与应用。
实施例3
本实施例设置试验组和对照组，试验组与对照组分别为在相同条件下饲养的10只杂交黄颡鱼突变体和10只普通杂交黄颡鱼。
从试验组杂交黄颡鱼突变体和对照组普通杂交黄颡鱼的头部、躯干和尾部选取横切面，在躯干和尾部的横切面上选择背部、中部和腹部三个肌纤维区域，在头部的横切面选择背部和腹部两个肌纤维区域，观察其纤维形态大小(面积)和纤维数量。其中，细胞数量是以每个横切面肌肉面积中的纤维数量计算得到，肌肉面积区域采用Photoshop软件从捕获的数字图像中测量得到，肌纤维的数量和面积大小由ImageJ程序计算得到，结果如图1-4所示。
图1为试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的尾部、头部、躯干横切面平均肌肉面积比例对照图，从图1中可以看出，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的尾部横切面平均肌肉面积比例分别为91.41％和78.65％，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的头部横切面平均肌肉面积比例分别为43.96％和32.39％，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的躯干横切面平均肌肉面积比例分别为86.52％和76.36％，差异明显。可见，试验组杂交黄颡鱼突变体头部、尾部、躯干肌肉面积显著大于对照组普通杂交黄颡鱼。
图2为试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的尾部、头部、躯干横切面平均肌纤维总数对照图，从图2中可以看出，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的尾部横切面平均肌纤维总数分别为7502.2和4187.5，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的头部横切面平均纤维总数分别为4996.3和2954.8，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的躯干横切面平均肌纤维总数分别为5015.1和3488.0，可见不论是尾部、头部还是躯干部分，试验组杂交黄颡鱼突变体的纤维总数均显著高于对照组普通杂交黄颡鱼的纤维总数。
图3为试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的尾部、头部、躯干横切面平均肌纤维细胞数量对照图，从图3中可以看出，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的头部横切面平均肌纤维细胞数量分别为14.12和11.28，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的躯干横切面平均肌纤维细胞数量分别为10.85和9.06，差异不大，而试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的尾部横切面平均肌纤维细胞数量分别为13.10和6.02，差异明显。可见，试验组杂交黄颡鱼突变体尾部肌纤维细胞数量显著大于对照组普通杂交黄颡鱼。
图4为试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的尾部、头部、躯干横切面平均肌纤维的纤维面积(FA)对照图，从图4中可以看出，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的头部横切面平均肌纤维的纤维面积分别为603.19μm2和534.98μm2，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的躯干横切面平均肌纤维的纤维面积分别为630.24μm2和540.30μm2，试验组杂交黄颡鱼突变体与对照组普通杂交黄颡鱼的尾部横切面平均肌纤维的纤维面积分别为676.03μm2和587.98μm2，差异明显。可见，试验组杂交黄颡鱼突变体尾部、头部、躯干肌纤维的纤维面积均显著大于对照组普通杂交黄颡鱼。
综上，试验组杂交黄颡鱼突变体的平均肌肉面积比例、肌纤维总数、肌纤维细胞数量、肌纤维面积均高于对照组普通杂交黄颡鱼，这说明本申请提供的突变方法能够以突变的形式改善杂交黄颡鱼的基因，促进杂交黄颡鱼的生长，提高杂交黄颡鱼的肌肉质量，效果显著，适于大规模推广和应用。
在本文中，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等仅用于表示相关部分之间的相对位置关系，而非限定这些相关部分的绝对位置。
在本文中，“第一”、“第二”等仅用于彼此的区分，而非表示重要程度及顺序、以及互为存在的前提等。
在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。
除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。
上面结合附图对本申请优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本申请并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请构思的前提下做出各种变化。
SEQUENCE LISTING
<110> 眉山市人和渔业专业合作社
<120> 一种黄颡鱼杂交方法及杂交黄颡鱼突变体的培育方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctcgagaaaa gacaatccca agtttggcaa cagtgtggtg gtactggttt ctctggttcc 60
actacttgtg tttccggttc ctactgttcc gagatcaacg actactactc ccagtgtgtt 120
ccaggtactg atccaaacgc aggttctcaa tattctgctt cttccgctcc accatctcaa 180
cctactggta cttctcctcc tgctgcttct ggtccattga agttctacgg tgttaacgat 240
gccggtttcg acttcggttg taacactgat ggtaactgtc aggcttctgc tgcttagcca 300
cctttgttga agtattacgg tcacgacggt gaggctcaaa tggacacctt tgttaaggac 360
gacagtttca attgcctgat ggttggtagt tcttgatcaa cgatgttctt tcagcgacgc 420
caacttgcta gaatacgatg acttggtcca ggcctgtatt atccacaact gaacgatgag 480
aactctggtg ctgctgcttg taccaacgaa ggtaacaact acgctagatg agcacaggtt 540
acgcttgggc atcattggtc aaggtggtcc ttactgctat ctacttgggg tgctatcgct 600
gctaagtacg ctaacaactc caagatcctg ttcggtgtca aaggttacta tactaagacc 660
ccagatatta tgactctgtt caggctgctg tagaaacgct ctctgaacac tgaacgaacc 720
ttgtgtgagc agatcgcttt ccaagagcag aactccgatg ttttcctggg ttactttggt 780
tgggctgctg gtaacttcga cccatcttac gttttgggtg aagtcccaac tcaatccggt 840
tctacttgga ctgacacttc cttggtttcc gcttgtttgg ctcctaacaa gcaccatcac 900
catcaccatc actaatctag a 921
<210> 2
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgacggcac tgcagagaat aaccaaggag atgcaggacc tggccgacga cccgctgggc 60
cagttctcgg tgggccccgt gggaaccgac ctcttccact gccaggcgac cgtcatgggg 120
ccccgtggcg cgccttacga attcggcctc ttcgaactca gcgtcgataa ccccaaatca 180
tagcctttcc agccggcgca gattgggttt aaaactgcaa tctaccacat gaacgtcggc 240
ccatacggag atatctgcct gataaaaact ggtcccaagc aatctctatc atgaggaaag 300
cagtggacac gccagcatgc tatgtgattc cttccttcta tgctcacggg aaacatcatt 360
gggatgctca tatgtaaacc attatatact cacactcata tgaggaaagg tgcttaagtt 420
gttaatttgt atatgttggc atttgttatg aaagggaagc aagggtcgtt gaattgttga 480
tcttctgttt ttcttttctt caattgaatt aaaatacaaa cgttaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaa 543
<210> 3
<211> 1710
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatgacacct ctctgtacct gtccggtgcg catggcacaa ggtgttcctg ttcctgctgc 60
cacacgcaca acccaacagt ccaacagctc ctctgtgata tcagaccccg gtgatcatgc 120
atttagcgca ggttgtgatt tctctgggct tcgtggtggc tttcgcccct attgcgcgca 180
ctgacaccgg cgcaccggag caccagcagc agcagcagca ccaacaacaa cccactgccg 240
tgacggagga gcgtgaagcg cagtgttcag cggccagcgc gtgcgctttc cgccagcaca 300
gcaagcagct ccgtcttcaa gccatcaagt cccagatcct gagtaaactg cgcctcaaac 360
acgctcccaa agcagctgct ccctaaagcg ccgccggtgc agcagctgct cgacctgtac 420
gacgtagtcg gtgacgacgg taaaccggga gccgcgctcc cggacgagga ggaggacgac 480
gaggagcacg ccactaccga gaccgtcatg agcatggccg cagagcccaa cccagacgtt 540
caagtagacc aaaaaccaaa gtgctgtttt ttctccttca gcccaaagat ccaagcgagc 600
cgcattgtaa gggcacagct ctgggtgcac ttacggccag cagacgaggc aacaacggtg 660
ttcttgcaga tatcgcgact catgcccatc aaagatggga gaaggcatgt aagaattcgt 720
tcactgaaga tcgacgtgga tgcgggtgtc aagtcatggc agagcatcga tgtaaagcag 780
gtgcttgtgg tgtggctgag gcagccggaa acaaactggg gtattgagat caaagcattc 840
gactccaaaa gcaatgatct tgctattacc tctgcagagc ctggagaaga gggactgctc 900
ccattcttgg aggtcaaaat ttccgatgtt cccaagcgca ccaagagaga atcaggacta 960
gactgtgatg agaattcttc tgagtcacgc tgctgccgct acccccttac ggtggacttt 1020
gaagactttg gctgggactg gattattgcc ccgaaacgct acaaggccaa ctactgctcg 1080
ggcgagtgtg actatgtgca cttgcagaag tacccacaca cacacttggt caacaaggcc 1140
aatccgcgcg gcactgctgg cccttgctgc acgcccacca agatgtcccc catcaatatg 1200
ctttacttca acggaaaaga gcagatcatc tacggcaaga tcccctccat ggtggtggat 1260
cgctgtggct gctcgtgatt gatgcgtcca tgcaaggact cgatttattc tgtttccaaa 1320
tgtttctctt tggacttctc tgcaacacct ttcaaccatt atccatgcta acactgtgca 1380
atatgcaata gaaccagaat agcagcaagc aaggagccat ccacagagca ccgcttactc 1440
tcactgactt cttattcgtt tacgctaaat ctgcatcttg gggtcagaga tcacatggac 1500
gtactgaagg aatgtaatgc cggttcgaca cggagaaatg gacaacaaat gtcttttaca 1560
caatgctcat agtacaaaaa acacacacac gtattaaaca aacacgctcg acaatatccg 1620
tttagttctg ttctcactcc aaacagctgc ctaaaaatcg attgtttttt aagttaacta 1680
tccaagagca acagagaggg actcaagaac 1710
<210> 4
<211> 1730
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatgacacct ctctgtacct gtccggtgcg catggcacaa ggtgttcctg ttcctgctgc 60
cacacgcaca acccaacagt ccaacagctc ctctgtgata tcagaccccg gtgatcatgc 120
atttagcgca ggttgtgatt tctctgggct tcgtggtggc tttcgcccct attgcgcgca 180
ctgacaccgg cgcaccggag caccagcagc agcagcagca ccaacaacaa cccactgccg 240
tgacggagga gcgtgaagcg cagtgttcag cggccagcgc gtgcgctttc cgccagcaca 300
gcaagcagct ccgtcttcaa gccatcaagt cccagatcct gagtaaactg cgcctcaaac 360
acgctcccaa cgtgagccgc gatgtggtca agcagctgct ccctaaagcg ccgccggtgc 420
agcagctgct cgacctgtac gacgtagtcg gtgacgacgg taaaccggga gccgcgctcc 480
cggacgagga ggaggacgac gaggagcacg ccactaccga gaccgtcatg agcatggccg 540
cagagcccaa cccagacgtt caagtagacc aaaaaccaaa gtgctgtttt ttctccttca 600
gcccaaagat ccaagcgagc cgcattgtaa gggcacagct ctgggtgcac ttacggccag 660
cagacgaggc aacaacggtg ttcttgcaga tatcgcgact catgcccatc aaagatggga 720
gaaggcatgt aagaattcgt tcactgaaga tcgacgtgga tgcgggtgtc aagtcatggc 780
agagcatcga tgtaaagcag gtgcttgtgg tgtggctgag gcagccggaa acaaactggg 840
gtattgagat caaagcattc gactccaaaa gcaatgatct tgctattacc tctgcagagc 900
ctggagaaga gggactgctc ccattcttgg aggtcaaaat ttccgatgtt cccaagcgca 960
ccaagagaga atcaggacta gactgtgatg agaattcttc tgagtcacgc tgctgccgct 1020
acccccttac ggtggacttt gaagactttg gctgggactg gattattgcc ccgaaacgct 1080
acaaggccaa ctactgctcg ggcgagtgtg actatgtgca cttgcagaag tacccacaca 1140
cacacttggt caacaaggcc aatccgcgcg gcactgctgg cccttgctgc acgcccacca 1200
agatgtcccc catcaatatg ctttacttca acggaaaaga gcagatcatc tacggcaaga 1260
tcccctccat ggtggtggat cgctgtggct gctcgtgatt gatgcgtcca tgcaaggact 1320
cgatttattc tgtttccaaa tgtttctctt tggacttctc tgcaacacct ttcaaccatt 1380
atccatgcta acactgtgca atatgcaata gaaccagaat agcagcaagc aaggagccat 1440
ccacagagca ccgcttactc tcactgactt cttattcgtt tacgctaaat ctgcatcttg 1500
gggtcagaga tcacatggac gtactgaagg aatgtaatgc cggttcgaca cggagaaatg 1560
gacaacaaat gtcttttaca caatgctcat agtacaaaaa acacacacac gtattaaaca 1620
aacacgctcg acaatatccg tttagttctg ttctcactcc aaacagctgc ctaaaaatcg 1680
attgtttttt aagttaacta tccaagagca acagagaggg actcaagaac 1730

Claims (9)

1.一种杂交黄颡鱼突变体的培育方法，其特征在于，该方法包括：
S21、通过黄颡鱼杂交方法得到杂交黄颡鱼，获取杂交黄颡鱼目标基因组DNA片段，采用DNA限制内切酶对所述杂交黄颡鱼目标基因组片段进行消化处理，获得酶切片段；
所述DNA限制内切酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90%-99%同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；
S22、采用DNA连接酶对所述酶切片段进行连接处理，获得重排DNA片段；
所述DNA连接酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有90%-99%同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；
S23、将所述重排DNA片段克隆至目标载体上，采用PCR扩增引物对所述目标载体上的重排DNA片段进行PCR扩增处理，获得扩增产物；
所述PCR扩增引物选自以下三组中的任意一组：
(1) 正向引物5 '-GATCGGTTAACTCGACCGTT-3 '，
反向引物5 '-CTTGCCACGTTAGCTGCTTG-3 '；
(2) 正向引物5 '-GATCAATTAGATCGACCGTT-3 '，
反向引物5 '-CTTGGCTCGTTAGGTGCTTG-3 '；
(3) 正向引物5 '-GATCAATGCTATCGACCCAT-3 '，
反向引物5 '-CTTGGCTCTTACGGTGCAGG-3 '；
S24、将所述扩增产物注入杂交黄颡鱼胚胎中，经繁殖培育后获得杂交黄颡鱼目标基因突变体；
所述黄颡鱼的杂交方法，包括：
S11、亲鱼选择：选择2-5龄体质健壮、无病无伤的雌鱼和雄鱼，雌鱼尾重100-150g，雄鱼尾重400g-450g；
S12、亲鱼培育：将雌鱼和雄鱼分养在溶解氧的培育池中，投喂亲鱼饲料；
S13、亲鱼管理：产卵前一个月，每隔5-6天冲水一次，且每半个月检测水质常规指标，确保氨氮低于0 .05mg/L，亚硝酸盐保持低于0.015mg/L；
S14、人工催产：配制催产注射液，并在亲鱼的鳍基部注射两次；
S15、人工授精：按雌雄比例1000：1-1.5配组，取出雄鱼精巢，吸干精巢上的血液和水分后，放入研钵中用剪刀剪碎后研碎，加入20倍体积的精子保存液保存备用；然后挤出雌鱼鱼卵流入瓷盆内，随即加入精液，搅拌，再加入0.3%-0.5%的氯化钠溶液，迅速不停地搅拌激活受精；最后用黄泥浆水脱粘，并将受精卵放入孵化桶内流水孵化，密度为30-50万粒/m3；
S16、孵化管理：调节水流以适应受精卵的发育，出膜平游后下鱼苗至暂养池，待鱼苗体色全黑并开始分散时，计数后使用高聚乙烯氧气袋打包后下塘培育，获得杂交黄颡鱼。
2.根据权利要求1所述的杂交黄颡鱼突变体的培育方法，其特征在于，所述雌鱼为雌黄颡鱼/江黄颡鱼，所述雄鱼为雄瓦氏黄颡鱼。
3.根据权利要求1所述的杂交黄颡鱼突变体的培育方法，其特征在于，所述S12，包括：
将雌鱼和雄鱼分养在溶解氧5mg/L以上、水深2米的培育池中，投喂亲鱼饲料，所述亲鱼饲料为人工配合膨化饲料，其日投喂量为亲鱼体重的1%-5%；
并且春季强化培育期间，每周投喂1-2次鲜活饵料，所述鲜活饵料包括小鱼、虾、螺、蚌中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的杂交黄颡鱼突变体的培育方法，其特征在于，在S14中，所述催产注射液由促黄体释放激素类似物、绒毛膜促性腺激素、地欧酮和0.5%-0.7%的氯化钠溶液配置而成；
具体注射方法为：
第一针雌鱼注射的剂量为促黄体释放激素类似物15μg/kg-20μg/kg，雄鱼不注射；
第二针雌鱼注射的剂量为促黄体释放激素类似物15μg/kg-20μg/kg，绒毛膜促性腺激素1800-2000L.U./kg，地欧酮6-8mg/kg，雄鱼注射剂量减半；
注射液用量为雌鱼每尾0.2-0.4mL，胸腔注射深度为0.5cm-1cm；在水温为25-28℃的情况下，两针的注射间隔为12h。
5.根据权利要求1所述的杂交黄颡鱼突变体的培育方法，其特征在于，在S15中，所述精子保存液包括：葡萄糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠和氯化钠；
其中，葡萄糖的浓度为20-30g/L，柠檬酸钠的浓度为5-15g/L，碳酸氢钠的浓度为1-5g/L，氯化钠的浓度为0.1-0.5g/L。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的杂交黄颡鱼突变体的培育方法，其特征在于，所述杂交黄颡鱼目标基因组DNA片段为杂交黄颡鱼mstn基因组DNA片段。
7.根据权利要求6所述的杂交黄颡鱼突变体的培育方法，其特征在于，在所述S23之前，还包括：
采用所述DNA限制内切酶对所述重排DNA片段以及所述目标载体进行线性化处理；
所述S23，包括：
以经过线性化处理的所述目标载体为模板，采用PCR扩增引物对所述重排DNA片段进行PCR扩增处理，获得扩增产物。
8.根据权利要求6所述的杂交黄颡鱼突变体的培育方法，其特征在于，PCR扩增处理的步骤包括：
85℃-90℃预变性3min，30个循环，70℃-75℃延长5min，其中，每个循环包括85℃-90℃变性10-60s，40℃-50℃退火10-60s，70℃-75℃延伸1-5min。
9.根据权利要求6所述的杂交黄颡鱼突变体的培育方法，其特征在于，所述S24，包括：
将所述扩增产物通过显微注射注入至杂交黄颡鱼胚胎中，将所注射后的所述杂交黄颡鱼胚胎培至性成熟，并与普通同品种杂交黄颡鱼交配产卵；
荧光显微镜下筛选阳性的F0代，并继续自交传至F1、F2代，得到稳定遗传的杂交黄颡鱼目标基因突变体。
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