CN111454992B - 一种促进鱼类生长性状改良的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进鱼类生长性状改良的方法。本发明具体涉及了用基因编辑的方式敲除鱼类下丘脑‑垂体‑肾上腺轴通路的相关信号分子的基因，以此抑制下丘脑‑垂体‑肾上腺轴信号通路，进而促进鱼类的生长。本发明通过鱼类下丘脑‑垂体‑肾上腺轴信号分子的基因多态性与鱼类生长性状的关联分析，得到了下丘脑‑垂体‑肾上腺轴通路中促进鱼类生长的信号分子的基因型，以此作为鱼类遗传育种改良的辅助分子标记，促进鱼类生长性状的遗传改良。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及鱼类下丘脑-垂体-肾上腺轴信号通路信号分子的基因编辑，抑制鱼类下丘脑-垂体-肾上腺轴信号通路，用以促进鱼类个体生长；还涉及遗传育种领域，具体涉及鱼类促生长性状遗传育种改良的分子标记技术。
背景技术
鱼类个体的生长是水产养殖的重要经济性状。通过遗传辅助育种技术可以加快鱼类的生长速度并提高饲料转化率。这种定向培育技术可以直接提高渔业产量，并且可以降低饲料消耗、达到生态养殖的经济目的。动物个体的生长过程是一个能量、物质代谢的调控过程。个体生物量的增长实际是在动物个体摄取营养物质并消耗部分能量后物质沉积的结果。动物个体消耗能量以满足日常的生理活动，主要包括基本的摄食活动、运动、繁殖，以及应激反应等，因此在动物饲养过程中通过降低其运动和应激反应来降低能量消耗并促进生长是一种可行的方式。
目前研究较多的定向培育鱼类促生长品种的技术，主要是鱼类基因组多倍体化技术，调控鱼类性别决定机制技术，和基因编辑技术。多倍体鱼类已被广泛揭示具有生长快、适应性广和抗病性强的优良特性。养殖鱼类普遍存在雌雄个体间生长速度和体型大小的显著差异，所以可以通过调控鱼类性别决定机制，来促进鱼类快速生长。基因编辑技术能够高效地并在相对较短的时间内特异地对鱼类基因进行精确编辑,因而它非常有利于对现有的鱼类优良品系进行改良(叶鼎，2014)。因此基因编辑技术可以为鱼类遗传辅助育种提供理论指导。分子标记辅助育种(molecular marker-assisted breeding,MAS) 是借助与性状紧密相关的分子标记对具有性状优势的等位基因或基因型的个体进行直接选择育种。因此，获得与鱼类生长性状连锁的标记是开展鱼类促生长分子标记辅助育种的基础。目前水产鱼类分子标记辅助育种主要集中在抗病、生长和品质等性状。水产鱼类分子标记辅助抗病育种目前已应用到产业,并取得了较好的选育效果(Mochizuki M et al.,2007)；生长性状相关基因的标记例如体重相关分子标记等，也在逐渐应用到品种选育中(孙效文，2009)。但是，目前国内水产养殖鱼类的优良品种还相对较少，鱼类遗传育种基础理论研究和育种实践还存在一定的距离。分子育种、基因组选择、基因编辑、性别控制等精准育种及高效扩繁核心技术相对不足。
下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamus-Pituitary-Adrenal axis，HPA axis) 是神经内分泌的重要组成部分，在调控运动和应激反应的过程中具有重要功能(Charmandariet al.,2005)。当机体感受到外界压力时，下丘脑合成和分泌促肾上腺素皮质激素释放素(corticotropin-releasing hormone,CRH)，CRH通过垂体门静脉与垂体前叶细胞膜上的CRH受体(CRH receptor,CRHR)结合，调控垂体中阿片-促黑皮素原(proopiomelanocortin,POMC)的表达、合成、加工和分泌，POMC最后将其效应信号传递至肾上腺、食欲调控和痛感调控神经系统，构成了一条动物体内重要的环境应激的行为调节和能量代谢的神经内分泌调控通路。
POMC是形成黑色素相关肽类激素活性分子的前体蛋白分子，这些活性分子包括促肾上腺皮质激素合成激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、α、β-黑皮质素(α、β-melanocortin,α、β-MSH)和β-内啡肽(β-endorphin)等，这些活性多肽激素分子多由组织特异性合成后加工的方式形成。这些分子家族自进化角度考量，主要功能与动物对环境因子应激反应调控，如血液循环调节(心率、血压等)、食欲、体色及逃避行为、痛感等方面的调控，使身体产生对环境因素或应激状态产生反应与应答。而通过这些方面的调控，POMC 影响着生物个体的整体代谢与生长活动。
既往的动物实验表明，HPI轴信号通路主要调控着机体对环境因素的应激反应。动物个体在胁迫环境中，主要由HPI轴信号通路导致身体产生相应的神经系统、循环系统、体色、食欲、行为等生理活动的反应，其主要形式包括提高相应感受神经元的灵敏度、血压升高、心率加快、基础代谢率提高、肤色改变来适应周边环境、食欲抑制、逃逸活动增强，而这些都将直接或间接地影响到个体的能量代谢和生长性状。通过对一系列哺乳动物POMC基因的突变与敲除所导致的突变品系的分析，表明POMC的突变或功能缺陷会导致小鼠的脂肪积累、体重与食欲增加(Yaswen et al.,1999)；在人类突变家系的观察研究中表明POMC的突变会导致幼儿早夭，在幼年期出现食欲增强和肥胖等(Krude et al.,1998)。2016年，Raffan等人发现在一种狗的品系发现POMC 基因的缺失14个碱基，导致该品系的狗表现出较大的体重和食欲，其身体中的脂肪含量也显著增加(Raffan et al.,2016)。已经有研究发现，在一些生长较慢的大西洋鲑鱼中，其皮质醇的含量往往较高(Vindas et al.,2016)，而在动物的育种实践中，已有报道研究了一种牛的POMC基因与其个体生长的关联。鱼类在进化中经过一次基因组加倍，导致其存在两个pomc基因，分别是pomca 和pomcb，有研究报道pomcb不在垂体组织表达，而且属于假基因(Mahendra Wagle et al.,2011)。目前已有POMC基因在鱼类中的进化与系统发育的相关研究(AkiyoshiTakahashi et al.,2005；P.B.Danielson et al.，1999；Jasem Alrubaian et al.,2003)；也有相关研究报道，POMC通过控制α-促黑素细胞激素(α-MSH) 的分泌来调节鱼类的食欲，因此POMC是鱼类抑制摄食的调控因子 (VOLKOFF H et al.,2005)。
在鱼类中下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamus-Pituitary-Interrenal axis，HPI axis)轴信号通路也被证实可以调控外界环境因素导致的应激反应 (Pankhurst,2011；Specker,1982)。这些因素包括环境因素如水温、光照条件、流速的变动，以及在养殖过程中所发生的拥挤、惊扰与出水转移过程等 (Pavlidis et al.,2015)。
尽管HPI轴与外界因素的胁迫处理直接相关，但有关鱼类HPI轴信号通路中的相关信号分子的具体生理功能，以及信号分子的遗传变异与鱼类个体生长性状的关联研究却不多见，尤其是其用于养殖鱼类遗传育种方面的应用尚未有研究报道。
鲫鱼是我国重要的经济养殖鱼类，主要以雌核发育为生殖方式，同时还具有有性生殖的方式，因此被人工选育出许多不同的品系(Gui and Zhou, 2010)。洞庭鲫(DT)生长速度慢，是未经选育的野生型鲫鱼。中科三号异育银鲫(CAS III)是经过人工选育的，相较于洞庭鲫具有生长速度快，饲料转化率高等特性(Xu et al.,2019)。但是导致中科三号异育银鲫这种优良生长性状的遗传机制及其与HPI轴的关系还不清楚。
发明内容
本发明的目的是根据HPI轴信号通路参与调控鱼类的应激反应能力，通过基因编辑技术抑制HPI轴信号通路的信号可以调控鱼类的基础代谢水平和应激反应的敏感程度，从而达到促进鱼类个体生长的目的；还通过HPI轴信号分子基因多态性与鱼类生长性状的关联分析，得到了HPI轴通路中促进鱼类生长的信号分子的基因型，用以筛选具有高饲料转化率特征的鱼类品系，具有显著的水产育种价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明用基因编辑的方法敲除鱼类HPI轴信号分子基因，抑制鱼类HPI 轴信号通路，用以促进鱼类个体生长的方法；本发明还通过2b-RAD测序技术和饲料转化率(FCE)性状的关联分析，发现HPI轴中相关基因的多态性可以促进鱼类的FCE。所分析的HPI轴信号分子基因包括但不限于pomc，crh， crhr，mcr和pcs，均可通过下述方法，筛选得到促进鱼类生长的突变基因型，作为鱼类育种改良的分子标记。进而将此技术应用于一种鱼类促生长育种分子标记的试剂盒，以HPI通路上的分子为检测对象，检测出HPI通路信号分子缺失的促生长鱼类品种。本发明优选的HPI轴信号分子基因为pomc和crhr2 基因。本发明所述的鱼类为鲤科鱼类；更优选的，为斑马鱼和鲫鱼。
本发明的第一方面是用基因编辑的方法敲除鱼类pomc基因，通过构建鲤科模式鱼类-斑马鱼中缺失HPI轴中POMC蛋白的突变体，将其HPI轴信号分子敲除或抑制。本发明应用TALENs技术敲除斑马鱼pomc基因。然后对斑马鱼HPI轴信号分子基因多态性与斑马鱼生长性状进行关联分析，结果表明， pomc基因突变可以导致斑马鱼应对外部刺激的应激能力和基础代谢率下降，能够快速提高鱼类的生长速度，说明pomc突变是斑马鱼育种培育上的一个优良性状，具有显著的水产育种价值。
本发明的第二方面是利用2b-RAD测序技术和鲫鱼饲料转化率(FCE)性状的关联分析，发现HPI轴中的crhr2基因的多态性可以降低POMC蛋白水平和血浆中皮质醇的含量，从而抑制HPI轴信号通路，降低了鲫鱼的日常活动量，进而促进了饲料转化率(FCE)。这进一步说明HPI轴信号的降低是鱼类育种中的一个优良性状，以此作为鱼类遗传育种改良的辅助分子标记，促进鱼类生长性状的遗传改良，具有显著的水产应用价值。
本发明的第三方面是一种鱼类育种分子标记的试剂盒，以HPI通路上的分子为检测对象，检测出HPI通路信号分子缺失的促生长鱼类品种。分子标记试剂盒主要是对HPI轴中相关基因的SNP检测或者HPI轴中相关基因的 mRNA和蛋白质水平检测。
有益效果
1.用基因编辑的方法敲除鱼类HPI轴信号分子基因，抑制鱼类下丘脑- 垂体-肾上腺HPI轴信号通路，发现突变体鱼类应对外部刺激的应激能力和基础代谢率下降、个体生长加快，因此具有显著的水产育种价值。
2.与哺乳动物突变品系的报道不同是，HPI轴信号分子缺失并不伴随着突变鱼的不正常死亡以及肥胖现象的出现，克服了现有技术的偏见。
3.通过2b-RAD测序技术和鱼类饲料转化率的关联分析，发现HPI轴中相关基因的多态性可以促进鱼类的饲料转化率，进而促进鱼类个体生长。
4.通过关联分析，筛选得到促进鱼类生长的突变基因型，可以作为鱼类育种改良的分子标记。进而通过遗传改良的方式可以选育出促进鱼类生长的优良品种。
5.将上述技术应用于一种鱼类育种分子标记的试剂盒，以HPI通路上的分子为检测对象，检测出HPI通路信号分子缺失的促生长鱼类品种。
附图说明
图1为通过TALENs技术构建pomca突变斑马鱼图示。
图2为野生型、突变体M1和M2的POMC蛋白质比对示意图。
图3为4dpf时期斑马鱼的光-暗刺激实验。
图4为野生型和pomca突变鱼日常活动量。
图5为野生型和pomca突变鱼的基础耗氧量。
图6为野生型和pomca突变鱼体重的生长曲线。
图7为野生型和pomca突变鱼体长的生长曲线。
图8为野生型和pomca突变鱼的体成分。
图9为野生型和pomca突变鱼正常喂养和饱食喂养下脂肪含量。
图10为野生型和pomca突变鱼正常喂养和饱食喂养下体长。
图11为野生型和pomca突变鱼正常喂养和饱食喂养下体重。
图12为野生型和pomca突变鱼脂肪在脑、肌肉和内脏中的分布。
图13为119条杂交鱼饲料转化率。
图14为crhr2基因的多态性。
图15为洞庭鲫和中科三号鲫鱼的脑和肌肉组织中crhr2基因mRNA相对表达量。
图16为洞庭鲫和中科三号鲫鱼垂体组织中POMC蛋白相对含量。
图17为洞庭鲫和中科三号鲫鱼血浆中皮质醇含量。
图18为洞庭鲫和中科三号鲫鱼日常活动量。
图19为鱼类生长性状改良的方法流程示意图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
实施例一：
用基因编辑的方法，构建pomc缺失的斑马鱼突变体
1.应用TALENs技术敲除斑马鱼pomc基因
(1)TALENs靶位点的设计及组装
根据TALENs(transcription activator-like effector nucleases，转录激活因子样效应物核酸酶)设计的基本原则(Cermak et al.,2011)以及NCBI基因库中的斑马鱼pomca(Gene ID:353221)的基因序列信息，在pomca基因靶位点两侧设计靶向臂。为了获得缺失所有POMC来源的多肽激素的突变体M1，在翻译起始位点ATG之后以及编码α-MSH的序列之前设计靶位点，使其发生移码突变。TALENs臂的组装严格按照Addgene公司的GoldenGate TALENs Kit试剂盒提供的说明书操作。选择的靶位点具体序列为：左臂： 5’-GTTGGGAAAATGCCCGCT-3’；右臂：5’-CACCAAGATGTTCTCCTCT-3’。具体信息如图1所示。
图1下划线表示TALENs双臂识别pomca基因上的序列，红色字体表示限制性内切酶Eco31I识别的DNA序列。
(2)体外合成TALENs mRNA及显微注射
将组装完成的TALENs质粒用限制性内切酶SacⅠ线性化，酶切体系总体积为50μL，其中TALENs质粒15μL,SacⅠ1.5μL,10×Buffer 5μL,ddH2O 28.5μL。
混匀后至于37℃恒温水浴锅中孵育8-12h。酶切完成后将线性化产物用酚氯仿抽提纯化，具体步骤如下：
(1)向50μL酶切体系中加入50μL ddH2O，和100μL的酚氯仿(体积比为1:1)；
(2)涡旋混匀后，在室温条件下静止5分钟，然后11000×g离心10分钟；
(3)小心吸取分层后的上清液体到1.5mL RNase-free的EP管中；
(4)加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积3M的醋酸钠(PH＝5.6)，至于-20℃条件下沉淀2小时以上；
(5)在4℃条件下，13200×g离心10分钟；
(6)小心吸取上清，加入1mL 70％的乙醇，上下颠倒8-10次后在4℃条件下，13200×g离心10分钟；
(7)小心吸取上清，在室温下晾5分钟，加入20μL DEPC处理后的 ddH2O。
(8)用超微量分光光度计测线性化后的模板DNA浓度。
线性化的TALENs质粒模板用Thermo Fisher公司的mMessage mMachine SP6Kit体外合成mRNA，具体合成体系总体积为20μL，其中Linear template DNA 0.1-1μg,2×NTP/CAP 10μL,10×Reaction Buffer 2μL,Nuclease-free Water 补足至20μL。
混匀后至于37℃恒温水浴锅中孵育2.5小时；然后加入1μL TURBO DNase，在37℃条件下孵育15分钟，取1μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认 mRNA是否成功合成出来，以及模板DNA是否去除完全；随后加入50μL的氯化锂和30μL DEPC处理后的ddH2O，-20℃条件下沉淀过夜；4℃条件下， 13200×g离心10分钟；弃上清，加入1mL 70％的乙醇，上下颠倒8-10次后在4℃条件下，13200×g离心10分钟；小心吸取上清，在室温下晾5分钟，加入20μL DEPC处理后的ddH2O；最后用超微量分光光度计检测mRNA的浓度，分装后置于-80℃条件下保存。
将浓度均为80ng/μL的靶向双臂mRNA注入拉针仪制成的毛细管中，通过显微注射仪注入到1-2细胞期的斑马鱼受精卵中。尽量将mRNA注射到受精卵的动物极中，每个受精卵大约注射1-2nL的mRNA。
2.斑马鱼pomca基因敲除的突变体的检测和筛选
为检测基因敲除的效果，采用NaOH碱裂解法提取斑马鱼的基因组，具体方法步骤如下：
(1)向斑马鱼幼鱼中加入20μl/尾50mM的NaOH溶液；
(2)在95℃的金属浴中裂解，期间涡旋2-3次，直至斑马鱼被完全裂解。
(3)冷却至室温后加入十分之一体积的1M Tris-HCl(pH＝8.0)，充分混匀后瞬时离心。
将3dpf(days post fertilization，受精后天数)时期F0代斑马鱼的基因组作为模板，通过PCR扩增包含敲除位点的目的基因片段，然后用限制性内切酶Eco31Ⅰ酶切以及测序检测该靶向区域是否发生了突变。PCR扩增引物如为：正向引物：5’-ACTATTGGGTTATTTGATTC-3’；反向引物：5’- CTAATTTTCTAATGGGAGTT-3’。确认TALENs在F0代中敲除有效以后，将其它F0代鱼苗养殖至性成熟(约三个月)。将F0代的嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼进行交配获得F1代，取10条3dpf时期F1代斑马鱼提取基因组，PCR 扩增后切胶回收，连接PGEM-T质粒并测序，挑选出有突变的F0代斑马鱼。将有突变的F0代与野生型交配，得到F1代，待F1代斑马鱼养殖至性成熟后，将具有相同突变的杂合子斑马鱼进行交配，获得F2代斑马鱼。在F2代中获得了约1/4比例数量的纯合子突变的斑马鱼，即为pomca基因敲除的突变斑马鱼。在本发明中，为了避免性别对代谢造成的影响，如果没有特别说明，全部采用雄鱼作为实验材料。
3.pomca突变品系与野生型斑马鱼基因型的对比分析
利用TALENs技术获得了两个可以稳定遗传的突变品系，在靶位点分别缺失8个碱基和增加8个碱基，并分别命名为M1和M2。M1和M2编码的 POMC蛋白的氨基酸序列分别如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。如图 2所示，这两个突变品系均发生了移码突变，M1和M2分别有37和38个氨基酸和野生型的POMC相同，并且在第51个氨基酸和第89个氨基酸之后翻译提前终止。与野生型斑马鱼相比，编码的POMC蛋白的氨基酸序列发生变化，导致两个突变品系均缺失了α-MSH，β-MSH以及ACTH等活性激素分子。
图2为野生型、M1和M2的POMC蛋白质比对示意图。M1和M2中的白色部分表示与野生型相同的氨基酸，黑色部分表示翻译错误的氨基酸。
4.斑马鱼pomca突变体HPI轴信号通路的检测
具体方法是检测了HPI轴信号通路的关键产物皮质醇，为了避免节律导致皮质醇含量的不稳定，统一在上午9:00左右取样。对斑马鱼幼鱼和成年阶段样品的准备，采取两种不同的方法，具体步骤如下：
(1)斑马鱼幼鱼：将6dpf的斑马鱼用MS-222麻醉后，每30条混为一组，装进匀浆预装管中，吸干管中的液体，加入500μl预冷的PBS；然后用匀浆器匀浆，直至斑马鱼全部裂解，将裂解液作为后续实验的样品。
(2)成年斑马鱼：将5mpf的斑马鱼用MS-222麻醉后，用剪刀剪去尾巴，在伤口处用肝素处理后的枪头收集血液，然后在4℃条件下，1500×g离心10min，收集上层血浆，并置于-80℃条件下保存。
皮质醇的含量用Cayman Chemical公司的Cortisol express ELISA Kit检测，具体方法步骤按照试剂盒提供的说明书操作，结果如表1所示，pomca 突变斑马鱼相较于野生型斑马鱼，其皮质醇含量在幼鱼时期(6dpf)全鱼以及成鱼时期(5mpf)血浆中显著性降低，分别下降了75.59％和85.33％。
结果表明，斑马鱼pomc基因的敲除可以降低HPI轴信号，进而抑制HPI 轴信号通路。
表1为pomca突变斑马鱼中皮质醇的含量
表中的数据均用平均值±标准差表示，**P≤0.01,***P≤0.001。
5.pomca突变品系与野生斑马鱼进行表型对比
(1)pomca突变型和野生型斑马鱼的应激反应对比分析
斑马鱼幼鱼的运动行为量化分析采用Noldus公司的动作行为分析系统测定。系统装有可见光光源和红外线光源。高分辨率摄像头则会记录斑马鱼仔鱼的运动轨迹。
斑马鱼的幼鱼光暗刺激实验参考Peng等人描述的方法(Peng et al.,2016)，具体的步骤如下：将4dpf的斑马鱼放进96孔板中，用系统水填满后放进View Point ZebraBox中。光暗的设置如下表所示：
表2为光暗设置
| 时间 | 光暗条件 |
| 15:30-22:00 | 光 |
| 22:00-8:00 | 暗 |
| 8:00-8:10 | 光 |
| 8:10-8:20 | 暗 |
| 8:20-8:30 | 光 |
| 8:30-8:40 | 暗 |
| 8:40-8:50 | 光 |
| 8:50-9:00 | 暗 |
| 9:00-9:10 | 光 |
| 9:10-9:20 | 暗 |
| 9:20-9:30 | 光 |
| 9:30-9:40 | 暗 |
| 9:40-9:50 | 光 |
| 9:50-10:00 | 暗 |
| 10:00-12:30 | 光 |
斑马鱼成鱼的行为学实验具体步骤如下：将5mpf的斑马鱼放进装有2L 系统水的缸中(25×15×15cm)，然后置于View Point Tower下，每5s记录一次数据，每条鱼共记录10分钟。设定合适的阈值(20-40)，大运动(红色轨迹)设置为8cm/s，小运动(灰色轨迹)设置为1cm/s。结果显示，在4-5dpf 时期，pomca突变斑马鱼的运动速率在正常光照和黑暗的条件下没有显著性差异，但是在光暗交替的过程中，pomca突变斑马鱼的运动速率显著性下降(图3)。而在成年时期，pomca突变斑马鱼的运动量显著性低于野生型斑马鱼(图4)。结果说明，pomc基因突变可以导致斑马鱼应对外部刺激的应激能力下降。
图3为4dpf时期斑马鱼的光-暗刺激实验。横坐标轴下面的白色方框表示光照，黑色方框表示黑暗(n＝48/组)。图4为野生型和pomca突变鱼在10min 内的运动轨迹图。红色轨迹表示斑马鱼的运动速度大于8cm/s，绿色轨迹表示斑马鱼的运动速度在1-8cm/s之间，灰色轨迹表示斑马鱼的运动速度小于1 cm/s。对照组斑马鱼(n＝6)和pomca突变鱼(n＝6)在10min内运动的总距离。
(2)pomca突变型和野生型斑马鱼的基础耗氧率对比分析
斑马鱼的应激反应以及日常运动属于有氧代谢，需要消耗水中的溶解氧，而鱼的基础代谢率可以用基础耗氧量来评估(Rosa et al.,2008)。基础耗氧率的测定参考Li等人描述的方法(Li et al.,2014)，具体步骤如下：将3-4条5mpf 的斑马鱼混为一组，放进1L左右锥形瓶中(具体体积为V)，饥饿4天；然后更换新的系统水，用便携式溶解氧测定仪测定水中的溶解氧浓度C1，密封 6h后，再次测定水中的溶解氧浓度C2；以不放斑马鱼的瓶子为空白对照，测定6h前后水中的溶解氧浓度C3和C4；称量斑马鱼的体重m后计算斑马鱼的基础耗氧率R，计算的公式如下：R＝[(C1-C2)-(C3-C4)]×V/6m，单位为mg/(h·g)。结果表明，相较于对照斑马鱼，pomca突变鱼在成鱼时期(5mpf)的基础耗氧量显著性降低(图5)，这说明，pomca突变会导致斑马鱼基础耗氧量下降，进而导致斑马鱼基础代谢率下降，从而促进鱼类的个体生长。
图5为5mpf时期，对照组斑马鱼和pomca突变鱼饥饿5天后的基础耗氧率(n＝4/组)。
(3)pomca突变型和野生型斑马鱼的个体生长性状对比分析
饲养同一批产的F2代(约150条)斑马鱼，从一个月起，每隔一个月对每一条斑马鱼剪尾鳍提取基因DNA，逐条进行基因型分析，筛选出野生型和纯合突变体然后分别测量、记录这两种基因型斑马鱼的体重和体长(3个月后只测量雄鱼的体长体重)。结果显示，pomca突变鱼和野生型斑马鱼在35dpf 时期之前，体重和体长没有显著性差异，而在65dpf时期，pomca突变鱼的体重和体长相较于野生型斑马鱼显著性地增加了18.01％和5.75％(图6和图 7)。
图6和图7分别为斑马鱼从青年到成年时期的体重和体长的生长曲线图 (n＝20-30/组)。
在人和小鼠中，POMC的缺陷会导致体重增加以及肥胖(Krude et al.,1998；Yaswen et al.,1999)。采用Folch等人描述的方法(Folch et al.,1957)和凯氏定氮法分别对5mpf时期正常喂养的雄性斑马鱼粗脂肪和粗蛋白含量进行了测定，统计分析发现pomca突变型斑马鱼的粗脂肪和粗蛋白的含量相较于野生型斑马鱼没有显著性差异(图8)。
图8为野生型和pomca突变鱼的体成分对比。
进而又对其进行过量喂养实验，结果显示pomca突变鱼和对照组的体重、体长和脂肪含量在过量喂养条件下相较于正常喂养时显著性的增加(图9，图 10，图11)，但是依然没有发现pomca突变斑马鱼表现出肥胖(图9)，其脂肪在脑、肌肉和内脏中的分布也没有明显变化(图12)。
图9-11野生型斑马鱼和pomca突变鱼在正常喂养下和饱食喂养条件下的总体脂(图9)、体长(图10)和体重(图11)(n＝6-10/组)。图12野生型斑马鱼和pomca突变鱼的头部、内脏、肌肉和尾部的脂肪含量(n＝4-5/组)。图中的数据均用平均值±标准差表示，**P≤0.01；***P≤0.001NS；二者之间没有显著性差异；柱状图上的不同的字表示二者有显著性差异。
对比结果说明，pomc突变可以导致斑马鱼个体生产速度加快，加速斑马鱼个体体重增加，而且不导致肥胖，进而说明pomc突变是斑马鱼育种培育上的一个优良性状，具有显著的水产育种价值。
结果表明，通过抑制鱼类下丘脑-垂体-肾上腺轴信号通路的方法得到的 pomc基因突变斑马鱼的生长性状显著优于野生斑马鱼，说明pomc基因敲除能够快速提高鱼类的生长速度，增加鱼类个体体重，在水产养殖领域具有很大的经济价值。
实施例二：
HPI轴信号分子基因多态性和鲫鱼生长性状的关联分析
1.2b-RAD测序和饲料转化率性状的关联分析
本发明将洞庭鲫的雌鱼和中科三号雄鱼进行交配，获得了F1代杂交鱼，选择其中体重相近的57条杂交鱼进行为期60天的FCE实验。FCE实验前后，杂交鱼的平均体重分别为62.66g和87.95g。F1代杂交鱼的FCE的平均值为35.20％(图13)。提取了F1代杂交鱼的基因组并进行2b-RAD测序和饲料转化率性状的关联分析。过滤掉一些低质量和不含BcgⅠ酶切位点的reads后，共获得了1.1161亿个reads，平均每个样品包含195.8万个reads。在洞庭鲫和中科三号异育银鲫亲本中，分别获得了1082802和2129411个reads，并且形成了88500个含有BcgI酶切的位点。在第二年，从F1代中挑选8条杂交鱼作为亲本，以雌核发育的方式繁殖得到F2代。我们在F2代中挑选了61条鱼进行FCE实验。FCE实验开始前后，它们的平均体重分别为6.86g和11.87g。 F2代鱼的FCE的平均值为57.26％(图13)。同样提取了F2代的基因组并进行2b-RAD测序和饲料转化率性状的关联分析，共得到233701015个reads。通过两次实验的关联分析，发现鲫鱼基因组上的ref-21037位点上的SNP与 FCE有显著的相关性(图14)。在F2代中，ref-21037位点上基因型为ABC 的鱼的FCE显著性高于基因型为abc的鱼(图14)。对这个位点的序列与鲫鱼的基因组序列比对时，发现ref-21037位点位于crhr2基因上。
图13为119条杂交鱼饲料转化率；图14为crhr2基因的多态性。
结果表明，通过两次2b-RAD测序和饲料转化率性状的关联分析，crhr2 基因的多态性与鱼类饲料转化率的生长性状密切相关，筛选促进鱼类生长的 crhr2基因型，可以作为鱼类遗传育种改良的辅助分子标记，促进鱼类生长性状的遗传改良。
2.中科三号异育银鲫crhr2基因多态性降低了HPI轴信号
CRHR2作为CRH的受体，可以通过促进POMC(ACTH)的表达来调控应激反应。我们检测了crhr2基因的mRNA的相对表达量，结果发现中科三号异育银鲫的脑和肌肉组织中的crhr2mRNA的表达量显著性低于洞庭鲫(图 15)。随后又利用免疫荧光技术检测中科三号和洞庭鲫垂体中POMC蛋白的表达量，结果显示中科三号异育银鲫的垂体中POMC表达量显著性低于洞庭鲫 (图16)。发现中科三号异育银鲫和洞庭鲫相比，血浆中皮质醇含量显著性下降(图17)。另外，还发现中科三号异育银鲫的活动量也显著性少于洞庭鲫(图 18)。以上的结果表明中科三号异育银鲫中crhr2基因上的SNP通过降低HPI 轴的信号，从而促进了饲料转化率的提高。同野生型洞庭鲫相比，中科三号异育银鲫的表型与pomca突变斑马鱼的表型高度相似，这说明HPI轴信号的降低或者HPI轴功能的抑制与钝化同样可以促进养殖鱼的生长。
图15为洞庭鲫和中科三号鲫鱼的脑和肌肉组织中crhr2基因mRNA相对表达量；图16为洞庭鲫和中科三号鲫鱼垂体组织中POMC蛋白相对含量；图 17为洞庭鲫和中科三号鲫鱼血浆中皮质醇含量；图18为洞庭鲫和中科三号鲫鱼日常活动量。
结果表明，同野生型洞庭鲫相比，中科三号异育银鲫crhr2基因多态性降低了HPI轴信号。这也进一步证明了HPI轴信号的降低或者HPI轴功能的抑制与钝化可以促进鱼类的生长。
实施例三：
用于鱼类促生长育种的分子标记试剂盒
本发明具体涉及一种鱼类育种分子标记的试剂盒，以HPI通路上的分子为检测对象，检测出HPI通路信号分子缺失的促生长鱼类品种。分子标记试剂盒主要是对HPI轴中相关基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测或者HPI轴中相关基因的mRNA和蛋白质水平检测。
本发明具体涉及HPI轴中相关基因的SNP基因分型技术，主要原理是 PCR扩增HPI轴信号分子基因组片段，以此检测信号分子基因的多态性。HPI 轴中相关基因的mRNA检测的方法具体是先提取HPI轴信号mRNA，反转录成cDNA，然后根据目的基因设计PCR引物，通过半定量RT-PCR确定HPI 轴中信号分子的基因表达。HPI轴中相关基因的蛋白质检测的方法具体是通过分子生物学方法对HPI轴中信号分子编码的蛋白质含量进行测定，检测相关蛋白质含量上升或者下降，确定HPI轴中信号分子是否存在基因的多态性。通过本发明所述的鱼类育种分子标记的试剂盒，检测出HPI通路信号分子缺失的促生长鱼类品种。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种促进鱼类生长性状改良的方法，其特征在于：抑制鱼类下丘脑-垂体-肾上腺轴通路；用基因编辑的方式敲除鱼类下丘脑-垂体-肾上腺轴通路相关信号分子的基因，以此抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴信号通路；所述下丘脑-垂体-肾上腺轴通路信号分子为POMC。
2.根据权利要求1所述的促进鱼类生长性状改良的方法，其特征在于：应用基因编辑技术敲除鱼类信号分子基因，具体步骤包括设计TALENs或者CRISPR-Cas9靶位点，体外合成mRNA或者gRNA及显微注射1-2细胞期的受精卵，使其发生移码突变，然后检测筛选出信号分子敲除成功的突变体。
3.根据权利要求1所述的促进鱼类生长性状改良的方法，其特征在于：所述鱼类为鲤科鱼类。
4.根据权利要求3所述的促进鱼类生长性状改良的方法，其特征在于：所述鱼类为斑马鱼。
5.一种鱼类促生长育种的方法，其特征在于：筛选下丘脑-垂体-肾上腺轴通路信号分子基因多态性的鱼类，通过遗传改良的方式选育出促进鱼类生长的优良品种；通过下丘脑-垂体-肾上腺轴信号分子基因多态性和鱼类生长性状的关联分析，得到下丘脑-垂体-肾上腺轴中促进鱼类生长相关联的基因型，并以该基因型作为育种筛选的分子标记；所述下丘脑-垂体-肾上腺轴通路信号分子为CRHR2，筛选CRHR2表达量低于野生型鱼类的方法，可以促进鱼类的生成性状改良。
6.根据权利要求5所述的鱼类促生长育种的方法，其特征在于：所述鱼类为鲤科鱼类。
7.根据权利要求6所述的鱼类促生长育种的方法，其特征在于：所述鱼类为鲫鱼。
8.一种鱼类促生长育种的分子标记试剂盒，其特征在于：以下丘脑-垂体-肾上腺轴通路信号分子为检测对象；该分子标记为下丘脑-垂体-肾上腺轴通路的信号分子，为POMC、CRHR2中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的鱼类促生长育种的分子标记试剂盒，其特征在于：对下丘脑-垂体-肾上腺轴中相关信号分子基因的SNP检测或者下丘脑-垂体-肾上腺轴中相关信号分子基因的mRNA和蛋白质水平检测。
10.根据权利要求8所述的鱼类促生长育种的分子标记试剂盒，其特征在于：所述鱼类为经济鱼类。
11.根据权利要求10所述的鱼类促生长育种的分子标记试剂盒，其特征在于：所述鱼类为鲤科鱼类。
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| CN104131098A (zh) * | 2014-07-28 | 2014-11-05 | 福建农林大学 | 一种检测肉牛pomc基因单核苷酸多态性的方法 |
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