CN113462692B - 一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用 - Google Patents

一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113462692B
CN113462692B CN202110817988.0A CN202110817988A CN113462692B CN 113462692 B CN113462692 B CN 113462692B CN 202110817988 A CN202110817988 A CN 202110817988A CN 113462692 B CN113462692 B CN 113462692B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
culter
mstn
sgrna
fertilized egg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110817988.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113462692A (zh
Inventor
郑建波
陈乐然
贾永义
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Original Assignee
Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries filed Critical Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority to CN202110817988.0A priority Critical patent/CN113462692B/zh
Publication of CN113462692A publication Critical patent/CN113462692A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113462692B publication Critical patent/CN113462692B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用，属于基因编辑技术领域，包括将敲除试剂使用显微注射的方法注入翘嘴鲌受精卵胚胎中，获得Mstn基因缺失型翘嘴鲌模型，上述敲除试剂包括sgRNA、Cas9蛋白和酚红指示剂，其中sgRNA的序列如SEQ IDNO.1所示。本发明采用RNP形式通过显微注射直接递送Cas9蛋白和sgRNA到翘嘴鲌的受精卵中，提高了基因编辑效率。显微注射法能够绕过细胞外基质、细胞膜及细胞质等多层屏障，以最直接的方式将sgRNA和Cas9蛋白精确递送到细胞核或细胞质中，因此可以实现对基因编辑的高度控制进而大幅度降低脱靶效应。

Description

一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用。
背景技术
CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种由sgRNA引导的Cas9核酸酶靶向编辑技术，其操作简便快速，成本低，已广泛用于基因的敲除、插入和敲除。自2013年首次应用于真核细胞的基因编辑以来，以日新月异的速度在不断发展。不仅广泛应用于基因功能的研究和疾病的治疗，还在模式生物中用于快速制备突变个体，研究生长和发育的机制以及遗传学规律，以及重要经济物种优良性状的改良。
翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)是我国重要的淡水名优经济鱼类之一，具有生长快、肉质细嫩等特点，深受江浙沪地区消费者喜食。自1999年人工繁殖突破后，其养殖、饲料、加工等得到快速发展，并在江、浙、沪等省市形成了产值超亿元的产业。然而，目前养殖用翘嘴鲌多数是未经选育的野生种，其潜在遗传优势尚未被充分挖掘，加之盲目繁育、引种、杂交和累代养殖，导致养殖翘嘴鲌出现了生长减慢、小型化等种质衰退或混杂现象，种质改良已成为翘嘴鲌养殖业持续健康发展的迫切需求。
肌肉生长抑制素(Myostatin，Mstn)，属于转化生长因子超家族成员，其主要功能是作为肌肉生长的负调控因子，抑制成肌细胞分化增殖。自1997年首次在小鼠中克隆到序列以来，目前已在一些哺乳动物和多种鱼类中克隆到Mstn基因。翘嘴鲌Mstn基因由4个外显子和3个内含子组成，末端具有典型的半胱氨酸残基和RIRR蛋白水解位点。本发明目的在于突破翘嘴鲌受精卵显微注射和胚胎幼体孵化技术，建立基因编辑技术平台，为功能解析和种质创新提供技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得基因编辑翘嘴鲌的方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的sgRNA，序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的gRNA的递送方法为直接递送Cas9蛋白和sgRNA到翘嘴鲌受精卵，递送形式采用RNP形式。
Cas9蛋白主要由α-螺旋识别区域(REC)和具有核酸酶活性区域(NUC)组成。REC区域负责结合gRNA，通过调节结构域的构象可以识别、结合gRNA。NUC区域可与PAM区识别结合并且行使切割DNA的能力。
与基于质粒和RNA的CRISPR/Cas9相比，Cas9-RNP无需进行蛋白的翻译和表达可以在Cas9蛋白末端的核定位序列(NLS)的帮助下进入细胞核直接进行基因编辑，提高了基因编辑效率。基因编辑结束后不会产生新的蛋白，这种基因编辑的方式也被认为可以产生最少脱靶效应。
本发明还公开了一种靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂，包括sgRNA、Cas9蛋白和酚红指示剂。
优选地，靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂中各成分的浓度分别为：Cas9蛋白180-210ng/μL、sgRNA 90-110ng/μL和酚红指示剂0.01-0.1wt％。
更优选地，靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂中各成分的浓度分别为：Cas9蛋白200ng/μL、sgRNA 100ng/μL和酚红指示剂0.05wt％。
优选地，敲除试剂还包括水苏碱。显微注射时添加水苏碱可以极大提高胚胎孵化率以及孵化后幼体的成活率。
更优选地，敲除试剂中水苏碱的浓度为100ng/μL。
本发明还公开了靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂在构建Mstn基因缺失型翘嘴鲌模型中的应用。
本发明还公开了一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法，包括将敲除试剂使用显微注射的方法注射入翘嘴鲌受精卵内，孵化获得Mstn基因缺失型翘嘴鲌模型。
将CRISPR/Cas9系统递送到细胞内最直接的方法是显微注射法。因为它能够绕过细胞外基质、细胞膜及细胞质等多层屏障，以最直接的方式将sgRNA和Cas9蛋白精确递送到细胞核或细胞质中。这种操作方式从本质上来说是在单细胞水平上的逐个编辑，因此可以实现对基因编辑的高度控制进而大幅度降低脱靶效应。此外，该方法不受CRISPR/Cas9系统的分子量和大小限制，因此在对编码Cas9蛋白和gRNA的大分子量pDNA(>7kb)或直接对Cas9蛋白(160kDa)递送时甚至有着高达100％的效率。
优选地，每个受精卵给予2.1-2.5nL靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂。
优选地，受精卵的收集时间为受精卵膜顶起后。
优选地，适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法还包括基因编辑突变效率检测分析：
收集注射后的胚胎，提取基因组DNA，基于靶向位点在其两端设计特异性引物，未处理胚胎作为对照，以基因组为模板进行PCR扩增，PCR产物直接进行Sanger测序，比较注射组和对照组的序列峰图，发现Mstn基因敲除组出现叠峰，提示成功对该基因进行编辑，表明成功在翘嘴鲌中建立基因编辑技术。
优选地，特异性引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
本发明还公开了构建Mstn基因缺失型翘嘴鲌模型的方法在构建其他基因缺失型翘嘴鲌模型中的用途。
本发明具有如下优点：
本发明突破了翘嘴鲌受精卵显微注射和胚胎离体孵化技术，建立基因编辑技术平台，为功能解析和种质创新提供技术支持。本发明采用RNP形式通过显微注射直接递送Cas9蛋白和sgRNA到翘嘴鲌的受精卵中。Cas9-RNP无需进行蛋白的翻译和表达可以在Cas9蛋白末端的核定位序列(NLS)的帮助下进入细胞核直接进行基因编辑，提高了基因编辑效率。同时，基因编辑结束后不会产生新的蛋白，这种基因编辑的方式也被认为可以产生最少脱靶效应。显微注射法能够绕过细胞外基质、细胞膜及细胞质等多层屏障，以最直接的方式将sgRNA和Cas9蛋白精确递送到细胞核或细胞质中。这种操作方式从本质上来说是在单细胞水平上的逐个编辑，因此可以实现对基因编辑的高度控制进而大幅度降低脱靶效应。
附图说明
图1为翘嘴鲌基因编辑及突变检测技术路线；
图2为sgRNA序列在翘嘴鲌Mstn基因的具体位置；
图3为sgRNA序列设计图；
图4为翘嘴鲌Mstn基因突变检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。本发明翘嘴鲌胚胎基因编辑的方法适用于翘嘴鲌的所有基因，以下实施例仅以翘嘴鲌受精卵Mstn基因为例解释说明本发明翘嘴鲌胚胎基因编辑的方法，不作为本发明保护范围的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除
翘嘴鲌基因编辑及突变检测技术路线如图1所示。
一、CRISPR体系的设计与合成
1.gRNA的设计与合成
gRNA序列如SEQ ID NO.1所示。设计的gRNA序列所在区域如图2所示，最终选择的gRNA如图3所示。
2.基因编辑元件的递送形式及注射浓度的确定
将基因公司合成的gRNA序列粉末按照说明书要求定浓，注射所使用的Cas9蛋白直接购买于赛默飞公司(A36497，1mg/mL)，基因编辑元件的递送形式采用RNP形式，翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂显微注射体系终浓度为Cas9蛋白200ng/μL、sgRNA 100ng/μL和酚红指示剂0.05wt％。
二、翘嘴鲌的显微注射与培养
1.翘嘴鲌胚胎的获得及显微注射
实验用翘嘴鲌于繁殖季节取自浙江省淡水水产研究所综合试验基地。选择性成熟度好的翘嘴鲌雌雄若干尾，通过胸鳍基部注射促黄体素释放激素类似物(LRH-A2)和绒毛膜促性腺激素(HCG)进行催产，约10h后用毛巾擦干鱼腹部体表，取翘嘴鲌雄鱼，轻压鱼腹使精液流入离心管中，离心管置于冰盒保存待用。准备一个新的培养皿，加入曝气水，用滴定管滴入2-3滴精液，用同样的方法轻压雌鱼鱼腹，在培养皿内挤入少量卵子，迅速摇晃培养皿，使卵子与精子充分受精并均匀粘附在培养皿内。待受精卵膜顶起后，尽快进行显微注射，本实验显微注射泵是Micro4/nanoliter纳升注射仪，注射体积为2.3nL，注射速度设定为2000MKN；
2.胚胎培育及突变检测；
注射后的胚胎置于含有曝气水的整理箱内培育，充分曝气，出膜后的幼苗先投喂蛋黄，1周后投喂丰年虫，每天换掉1/3的水，待鱼苗可以正常摄食时放养到3m2池子。取10尾鱼苗混为1管，各取四管，提取基因组。设计包含敲除位点的特异性引物。
实施例2
本实施例与实施例1中的不同之处在于：
所使用的翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂显微注射体系终浓度为Cas9蛋白210ng/μL、sgRNA 110ng/μL和酚红指示剂0.1wt％。
进行显微注射时的注射体积为2.5nL。
实施例3
本实施例与实施例1中的不同之处在于：
所使用的翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂显微注射体系终浓度为Cas9蛋白200ng/μL、sgRNA 100ng/μL、水苏碱100ng/μL和酚红指示剂0.05wt％。
试验例1
对实施例1中所得鱼苗基因编辑突变效率检测分析
一、翘嘴鲌胚胎基因组的提取
1.显微注射10天后，随机收集30颗胚胎放入1.5mL离心管；
2.每管加入600μL裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0；100mM EDTA，pH8.0)和6μL蛋白酶K(20mg/mL)，60℃水浴2h(每隔半小时颠倒混匀依次至翘嘴鲌胚胎消化完即可)；
3.室温冷却后，每管加200μL 7.5mol/L醋酸铵，混匀后，冰浴5min；
4. 4℃14000r/min，离心10min，取上清500μL于新1.5mL离心管中；
5.加入等体积预冷的异丙醇，混匀后，室温放置5min；
6. 4℃14000r/min，离心10min，弃上清，观察管底是否有白色沉淀；
7.加入1mL 70％乙醇，移液器吹打沉淀，4℃14000r/min，离心10min，弃上清；
8.加入1mL无水乙醇，移液器吹打沉淀，4℃14000r/min，离心10min，弃上清；
9.干燥10min(干燥器或导致于滤纸上)；
10.加入100μL无菌水或TE溶液，溶解2h，4℃保存；
二、PCR引物设计
基于靶向位点在其两端设计一对特异性引物(正向引物；反向引物)用于PCR检测，引物设计满足以下原则：
靶位点PCR扩增引物对目的序列进行扩增，正、反向引物应与靶位点应间隔100-120bp，为节约反应时间，确保测序反应正确性，PCR产物最好条带单一，长度小于1000bp；
按照上述设计原则设计引物如表1所示。
表1用于基因编辑突变效率检测分析的PCR引物
引物名称 引物序列 SEQ ID NO.1
正向引物 CTCTGTCCATTAGGTTTATTGTTG 2
反向引物 CTGTTTGAGTCGGAGTTTGCTAAG 3
三、PCR扩增
对翘嘴鲌胚胎包含有敲除靶位点基因组DNA序列扩增，扩增使用MCLAB高保真mix，PCR扩增体系如表2所示。未经过显微注射的胚胎作为对照。
表2 PCR扩增反应体系
Figure BDA0003170867340000051
Figure BDA0003170867340000061
PCR扩增反应的条件为预变性98℃2min；(变性98℃10s，退火60℃15s，延伸72℃15s)32个循环；72℃3min。扩增反应结束之后于4℃保存。
PCR产物委托金斯瑞生物科技公司进行Sanger测序。
四、靶位点有效性验证
用设计好的基因组上的检测靶点引物进行PCR扩增后，将产物送至公司测序。测序结果如图4所示，比较注射组和对照组的序列峰图，发现Mstn基因敲除组出现叠峰，提示成功对该基因进行编辑，表明成功在翘嘴鲌中建立基因编辑技术。
试验例2
翘嘴鲌胚胎孵化后存活率测定
翘嘴鲌胚胎孵化率与存活率如表3所示。
表3翘嘴鲌胚胎孵化率与存活率
Figure BDA0003170867340000062
从表3可以看出，相比于对比例1和2，显微注射体系中加入水苏碱的实施例3中，孵化率达到了100％，并且幼鱼孵化一周后的存活率达到了98.88％，远远大于未加入水苏碱的实施例1和2。说明加入水苏碱可以有效提高孵化成功率以及孵化后幼鱼的存活率。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagccttcc acagccacgg 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctgtccat taggtttatt gttg 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgtttgagt cggagtttgc taag 24

Claims (7)

1. 水苏碱在制备靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂中的应用，所述水苏碱的浓度为100ng/μL；所述靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂还包括sgRNA、Cas9蛋白和酚红指示剂；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述敲除试剂中各成分的浓度分别为：Cas9蛋白180-210ng/μL、sgRNA 90-110ng/μL和酚红指示剂0.01-0.1wt%。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法，包括将敲除试剂使用显微注射的方法注射入翘嘴鲌受精卵内，孵化获得Mstn基因缺失型翘嘴鲌模型。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，每个受精卵给予2.1-2.5nL敲除试剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受精卵的显微注射时间为受精卵膜顶起后。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述方法还包括基因编辑突变效率检测分析的步骤：
收集注射后的胚胎，提取基因组DNA，基于靶向位点在其两端设计特异性引物，未处理胚胎作为对照，以基因组为模板进行PCR扩增，PCR产物直接进行Sanger测序，比较注射组和对照组的序列峰图，发现Mstn基因敲除组出现叠峰，提示成功对该基因进行编辑，表明成功在翘嘴鲌中建立基因编辑技术。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
CN202110817988.0A 2021-07-20 2021-07-20 一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用 Active CN113462692B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110817988.0A CN113462692B (zh) 2021-07-20 2021-07-20 一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110817988.0A CN113462692B (zh) 2021-07-20 2021-07-20 一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113462692A CN113462692A (zh) 2021-10-01
CN113462692B true CN113462692B (zh) 2023-03-31

Family

ID=77881274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110817988.0A Active CN113462692B (zh) 2021-07-20 2021-07-20 一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113462692B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104232669A (zh) * 2014-08-25 2014-12-24 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 一种采用基因敲除法构建基于鱼类CRISPR/Cas9系统的载体及其构建方法
CN111560401A (zh) * 2020-05-26 2020-08-21 上海海洋大学 一种翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法
CN113151361A (zh) * 2021-04-30 2021-07-23 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 一种无肌间刺鲫品系培育方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113462692A (zh) 2021-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107287245B (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法
CN105132427A (zh) 一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA
US9187764B2 (en) Controllable on-off method for fish reproduction
CN101962660B (zh) 一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法及其载体和载体的制备方法
CN110643636B (zh) 一种团头鲂MSTNa&amp;b基因敲除方法与应用
CN113088521A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术的Ahnak2基因敲除动物模型的构建方法
CN111549031A (zh) 一种草鱼和青鱼肌间刺变粗的分子育种方法
CN111560401A (zh) 一种翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法
CN112779258A (zh) 一种大黄鱼CRISPR/Cas9基因编辑方法
CN105524941A (zh) 一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统及方法
CN105671084B (zh) 一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类种质构建方法及应用
CN110938629B (zh) 特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA及其应用和产品
CN113462692B (zh) 一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用
CN114480497B (zh) 一种ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建及其应用的方法
CN109439771A (zh) 一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法
CN115720874A (zh) 养殖经济鱼类无肌间刺种质创制方法及应用
CN114438132A (zh) 尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除系的建立方法及以此获得的快速生长品系
CN113234756A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术的LAMA3基因敲除动物模型的构建方法
CN111549030A (zh) 一种鲫鱼肌间刺变粗的分子育种方法
CN109897867B (zh) 基因改造方法
CN105132426A (zh) 一种以RNA介导的特异性敲除FGF5基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA
CN113142105B (zh) 一种黄颡鱼杂交方法及杂交黄颡鱼突变体的培育方法
CN116240276B (zh) 鲇雄性特异性分子标记、引物、试剂盒、应用及雄性或伪雄性鉴定和全雌鱼的生产方法
CN110643605B (zh) 一种团头鲂MSTNa&amp;b基因敲除的gRNA及其模板
CN111849977B (zh) 一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备矮小型转基因鸡的sgRNA和制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant