CN116240276B - 鲇雄性特异性分子标记、引物、试剂盒、应用及雄性或伪雄性鉴定和全雌鱼的生产方法 - Google Patents

鲇雄性特异性分子标记、引物、试剂盒、应用及雄性或伪雄性鉴定和全雌鱼的生产方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种鲇雄性特异性分子标记、引物、试剂盒、应用及雄性或伪雄性鉴定和全雌鱼的生产方法，涉及分子育种技术领域。所述雄性特异性分子标记选自下述3个标记序列的特异性分子标记，分别命名为AC_M3、AC_M4和AC_M9，其中，所述AC_M3的雄性特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AC_M4的雄性特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述AC_M9的雄性特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本申请可准确鉴定鲇的遗传性别，应用鲇的性别标记，从自然种群中发现了天然的“伪雄”鱼，应用天然的“伪雄”鲇与雌性个体繁殖，成功获得了遗传性别全为雌性的苗种，显著缩短育种时间和节约研发成本。

Description

鲇雄性特异性分子标记、引物、试剂盒、应用及雄性或伪雄性 鉴定和全雌鱼的生产方法
技术领域
本申请涉及分子育种技术领域，具体涉及一种鲇雄性特异性分子标记、引物、试剂盒、应用及雄性或伪雄性鉴定和全雌鱼的生产方法。
背景技术
鲇(Silurus asotus)，肉嫩味美、刺少、营养丰富，是一种优良的淡水经济鱼类，广泛分布于我国东部和南部省份。据中国渔业统计年鉴统计，2021年全国鲇鱼总产量为34.6万吨。鲇鱼养殖业具有良好的市场前景和重要的经济意义。鲇的生长具有雌雄二态性(Sexual dimorphism)，雌性的生长速度显著大于雄性，成年雌鲇的平均体重可达雄鲇的两倍以上。该特性使其商品鱼规格参差不齐，降低饲料效率和经济效益。因此，开展鲇的性控育种研究，培育“全雌”苗种，对促进鲇养殖业发展具有重要的意义。然而，目前尚无鲇的性别特异性分子标记，无法准确鉴定其遗传性别，使其性控育种研究无法顺利进行。
雄性异配(XY性别决定型)鱼类“全雌”苗种培育的技术方案中，通常是先通过激素诱导，获得“伪雄”个体，用“伪雄”个体的精子与雌性的卵子授精，从而产生“全雌”的后代。因此，准确鉴定“伪雄”鱼是培育“全雌”鲇苗种的技术瓶颈。虽然目前已经开发了与鲇为同一个属的兰州鲇(Silurus lanzhouensis)和大口鲇(Silurus meriordinalis)的性别标记，但尚无鲇的性别特异性分子标记。
因此，开发鲇的性别特异性分子标记，可解决“全雌”鲇培育中准确鉴定亲本遗传性别的技术难题。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于能够提供一种鲇(Silurus asotus)雄性特异性分子标记、引物、试剂盒、应用及雄性或伪雄性鉴定和全雌鱼的生产方法，该方法应用简化基因组测序(Restriction site-associated DNA sequencing，RAD-seq)技术获得了鲇的性别特异性分子标记，可准确鉴定鲇的遗传性别，解决了“全雌”鲇育种中鉴定“伪雄”鱼的技术难题，同时应用鲇的性别标记，从其自然种群中发现了天然的“伪雄”鱼，应用天然的“伪雄”鲇与雌性个体繁殖，成功获得了遗传性别全为雌性的苗种，该方法省去了常规单性育种中的激素诱导步骤，可显著缩短育种时间和节约研发成本。
第一方面，本申请实施例公开了一种鲇雄性特异性分子标记，所述雄性特异性分子标记选自下述3个标记序列的雄性特异性分子标记，分别命名为AC_M3、AC_M4和AC_M9，其中，所述AC_M3的雄性特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AC_M4的雄性特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述AC_M9的雄性特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本申请实施例公开了一种鲇伪雄性特异性分子标记，所述伪雄性特异性分子标记为AC_M9的伪雄性特异性分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
第三方面，本申请实施例公开了一种扩增第一方面所述的鲇雄性特异性分子标记的引物，当雄性特异性分子标记为AC_M3时，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第四方面，本申请实施例公开了一种扩增第一方面所述的鲇雄性特异性分子标记的引物，当雄性特异性分子标记为AC_M4时，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
第五方面，本申请实施例公开了一种扩增第一方面所述的鲇雄性特异性分子标记的引物，当雄性特异性分子标记为AC_M9时，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
第六方面，本申请实施例公开了一种用于鲇性别鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括第三方面、第四方面或第五方面任一项所述的引物。
第七方面，本申请实施例公开了第六方面所述的试剂盒在鲇性别鉴定中的应用。
第八方面，本申请实施例公开了一种鲇雄性或伪雄性鉴定的方法，包括如下步骤：
PCR扩增：取可明确观察到精液的待测生理雄鲇的尾鳍组织，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用第三至五方面任一项所述的引物，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与第一方面所述的鲇雄性特异性分子标记或第二方面所述的鲇伪雄性特异性分子标记进行对比；
结果判断：若PCR扩增产物如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，则所述鲇为雄性；若PCR扩增产物如SEQ ID NO.4所示，则所述鲇为伪雄性。
第九方面，本申请实施例公开了一种全雌鲇的生产方法，包括如下步骤：用标记扫描器挑出具有第二方面所述的核苷酸序列的“伪雄”鱼，与正常雌鱼繁殖，即得全雌鲇。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请应用简化基因组测序(Restriction site-associated DNA sequencing，RAD-seq)技术获得了鲇的性别特异性分子标记，可准确鉴定鲇的遗传性别，解决了“全雌”鲇育种中鉴定“伪雄”鱼的技术难题，同时应用鲇的性别标记，从其自然种群中发现了天然的“伪雄”鱼，应用天然的“伪雄”鲇与雌性个体繁殖，成功获得了遗传性别全为雌性的苗种，该方法省去了常规单性育种中的激素诱导步骤，可显著缩短育种时间和节约研发成本。
附图说明
图1为本申请实施例提供的性别特异性标记序列的组装过程。其中，(A)候选标记序列的组装：蓝色示鉴定到的候选标记(Read1)，灰色示包含候选标记DNA片段另一端的序列(Read2)；Assembled contig为Read1和多条Read2组装成的一致序列；(B)M1(Marker#1)及其旁侧序列(Flanking sequence)；M1-F和M1-R为扩增标记的引物。
图2为本申请实施例提供的候选性别特异性标记的初步验证。其中，(A)对11个候选标记的验证；(B)对雄性特异性标记M3、M4和M9的进一步验证；F：雌性，M：雄性。
图3为本申请实施例提供的鲇雄性特异分子标记的大样本验证。其中，M为DNA分子量标准，“*”表示生理性别为雄性，遗传性别为雌性的“伪雄”个体。
图4为本申请实施例提供的大口鲇(Silurus meriordinalis)和兰州鲇(Siluruslanzhouensis)的性别标记不能准确鉴定鲇的遗传性别。其中，M为DNA分子量标准，SC_M1到SC_M8为鲇的性别标记，LC_X-F/R、LC_Y-F/R和LC_XY-F/R为兰州鲇的性别标记。
图5为本申请实施例提供的用黄河种群验证鲇性别特异标记和鉴定“伪雄”个体。其中，M为DNA分子量标准，♀为雌性样品，1-23为雄性样品，“*”表示“伪雄”个体。
图6为本申请实施例提供的“全雌”鲇的验证图。其中，M为DNA分子量标准，为雄性样品，♀为雌性样品，1-22为“伪雄”鱼与正常雌鱼的后代。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
为准确鉴定鲇的遗传性别，本申请实施例提供了一种鲇(Silurus asotus)雄性特异性分子标记，所述雄性特异性分子标记选自下述3个标记序列的特异性分子标记，分别命名为AC_M3、AC_M4和AC_M9，其中，所述AC_M3的雄性特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述AC_M4的雄性特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述AC_M9的雄性特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本申请实施例提供了一种鲇伪雄性特异性分子标记，所述伪雄性特异性分子标记为AC_M9的伪雄性特异性分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
基于上述的分子标记，本申请实施例提供了一种扩增所述的鲇雄性特异性分子标记的引物，当雄性特异性分子标记为AC_M3时，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本申请实施例提供了一种扩增所述的鲇雄性特异性分子标记的引物，当雄性特异性分子标记为AC_M4时，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本申请实施例提供了一种扩增所述的鲇雄性特异性分子标记的引物，当雄性特异性分子标记为AC_M9时，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
基于上述引物，本申请实施例提供了一种用于鲇性别鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括上述任一项所述的引物。
基于上述试剂盒，本申请实施例提供了所述的试剂盒在鲇性别鉴定中的应用。
本申请实施例提供了一种鲇雄性或伪雄性鉴定的方法，包括如下步骤：
PCR扩增：取可明确观察到精液的待测生理雄鲇的尾鳍组织，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用所述的引物，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与所述的鲇雄性特异性分子标记进行对比；
结果判断：若PCR扩增产物如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，则所述鲇为雄性；若PCR扩增产物如SEQ ID NO.4所示，则所述鲇为伪雄性。
本申请实施例提供了一种全雌鲇的生产方法，包括如下步骤：用标记扫描器挑出具有如所述的核苷酸序列的“伪雄”鱼，与正常雌鱼繁殖，即得全雌鲇。
在一些实施例中，所述生产方法具体如下：
选择发育成熟的鲇雌性亲鱼，于水温22-25℃时，向每千克亲鱼注射1000国际单位绒毛膜促性腺激素(HCG)和20μg促黄体素释放激素类似物(LRH-A)，“伪雄”鱼剂量减半；注射15-17h后达到效应时间，捞出雌性亲鱼，用毛巾擦干鱼体，轻压腹部，将鱼卵挤入干燥的器皿中；将“伪雄”鱼的精液挤入干培养皿中，用吸管将精液滴加在卵子上，立即加入清水与卵粒充分混合，随后将受精卵泼撒到湿润的棕榈片上；整个过程避免强光直射，将受精卵移入清水池中孵化，水温22-25℃时，受精卵40-50小时出膜，即得全雌鲇。
下面结合附图对本发明的应用原理做进一步详细说明。
1.样本采集
为鉴定鲇的性别特异性分子标记，2018年2月在淇河鹤壁段采集鲇约200尾(称为淇河种群)，在池塘中暂养后用作研究样本。取样时将实验鱼在80mg/L MS-222溶液中麻醉，解剖、观察性腺准确鉴定表型性别。选雌、雄鱼各20尾，分别取约100mg肝脏组织，置于2mL无水乙醇中保存，用于提取基因组DNA。
2.基因组DNA提取
用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。将组织块在乙醇中用组织研磨仪(Monad，LyserPro)磨碎(1500rpm，2min)后，10000rpm离心5min沉淀样品，弃去乙醇。用1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)重悬沉淀，并混合均匀，10000rpm离心5min，弃去PBS。用400μL裂解液(10mM Tris pH 8，100mM EDTA pH 8.0，0.5％SDS，200μg/ml Proteinase K)重悬样品后于50℃水浴，期间多次上下颠倒离心管混匀样品。待液体澄清后，加入400μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，用力摇匀后静置1min，10000rpm离心5min；将上层水相转移到新的离心管中，加入400μL氯仿后用力摇匀；取上层水相到新的离心管中，加入800μL无水乙醇，上下颠倒混匀。用灭菌的枪头将絮状的基因组DNA沉淀挑出，放入装有1mL 75％乙醇的离心管中清洗沉淀。离心去除乙醇后，打开离心管盖，室温干燥5min，加入50μL TE缓冲溶液(Tris-EDTAbuffer solution)溶解基因组DNA。用Quawell Q5000分光光度计测量样品DNA浓度，用琼脂糖凝胶电泳方法检测基因组DNA样品完整性。
3.简化基因组测序及数据分析
3.1简化基因组测序
将获得的40份基因组DNA样品送武汉菲莎基因信息有限公司进行简化基因组测序(Restriction site-associated DNA sequencing，RAD-Seq)。具体步骤如下：首先用EcoRI对基因组DNA样品进行酶切，将酶切后的DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断，随后依次进行3′端加A、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段等步骤构建测序文库；文库质检合格后用Illumina平台进行双端150bp高通量测序，各文库平均测序深度5M reads。
3.2标记鉴定
用RADSex-v1.2.0析测序数据，鉴定性别特异性标记。先将同一样品两端的测序数据合并，用radsex process命令处理原始数据(主要参数：--min-depth 1)，得到标记深度表(Marker depth table)。执行radsex distrib命令(主要参数：--min-depth 5--groupsM,F)，由标记深度表计算标记在雌(F)、雄(M)性别之间的分布。最后，执行radsex signif命令(主要参数：--min-depth5--groups M,F--disable-correction--signif-threshold0.00001)，共获得11个候选的雄性特异性标记。
3.3序列组装
由于所得标记序列长度仅为150bp，不便于设计PCR引物，且扩增产物长度太短，难以用常规琼脂糖凝胶电泳方法区分雌雄差异。根据RAD-seq技术特点，测序文库中富集的DNA片段一端由限制性内切酶(EcoRI)切割产生，另一端则由超声断裂随机产生。因此，通过双端测序可以得到一端固定为标记序列(Read1，带EcoRI酶切位点)，而另一端序列(Read2)不同、且长度也不同的片段。选择测序深度最高的雄性样本，搜寻得到各候选标记的所有Read2序列，应用Vector NTI的assemble工具进行序列组装，得到包含候选标记及其旁侧序列的标记序列片段。如图1所示。其中，图1中A示M1标记旁侧序列(Flanking sequence)的组装，图1中B示组装获得的序列包含标记序列及其旁侧序列。
表1引物序列及其扩增片段长度
4.鲇性别特异性标记的验证
根据组装的标记序列分别设计引物，引物序列及扩增产物长度见表1。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系：I-5TM2×High-Fidelity MasterMix 10μL，正、反向引物各0.5μL(10μM)，基因组DNA样品1μL，基因组DNA样品1μL，加水补足20μL。反应条件：95℃变性5min；95℃30sec，60℃25sec，72℃45sec，扩增30个循环；最后72℃延伸5min。用2％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检测PCR产物，比较候选标记在雌、雄样本中的检出情况。先选择雌雄样本各2份对候选标记分别进行测试，发现标记AC_M3、AC_M4和AC_M9(AC为Amur catfish的缩写)具有雄性特异性(如图2中A所示)，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
进一步用雌雄各6份未用于RAD-seq的样本验证AC_M3、AC_M4和AC_M9为雄性特异性分子标记；其中AC_M3和AC_M4仅在雄性样品中有扩增，而AC_M9在雄性样本中的扩增片段比雌性样本的扩增片段短(如图2中B所示)，且AC_M9在雌性样本中的扩增片段如SEQ IDNO.4所示。
为了进一步验证以上标记的可靠性，用上述方法提取了100尾鲇(淇河种群)的基因组DNA样品，其中雌性27尾，雄性73尾，均通过解剖观察性腺准确鉴定生理性别。PCR分析结果表明，标记AC_M3、AC_M4和AC_M9的鉴定结果完全一致；其中雌性个体的生理性别与遗传性别完全一致(27/27，100％)，而雄性中有部分个体(6/73，8.22％)生理性别为雄性，但遗传性别为雌性.如图3所示，说明这些个体可能是“伪雄”鱼。
5.鲇属不同种类性别标记的交叉验证
在本申请的研究尚在进行中时，我国学者分别报道了大口鲇(Silurusmeriordinalis)和兰州鲇(Silurus lanzhouensis)的性别标记。大口鲇、兰州鲇与鲇均为鲇属鱼类，亲缘关系很近。文献中共鉴定了8个鲇(命名为SC_M1-SC_M8，SC为South catfish的缩写)和3个兰州鲇(命名为LC_X-F/R、LC_Y-F/R和LC_XY-F/R，LC为Lanzhou catfish的缩写)的雄性特异分子标记。申请人用文献中报道的大口鲇和兰州鲇的性别标记引物(表1)分别检测了鲇的样本(雌雄各12尾)。结果表明，大口鲇和兰州鲇的性别标记均不能准确鉴定鲇的遗传性别，如图4所示。
6.“伪雄”鲇的鉴定
鲇性别特异分子标记鉴定结果表明其野生种群中可能存在“伪雄”个体。为进一步验证鲇的性别标记和鉴定“伪雄”个体，2022年2月在黄河小浪底段采集鲇约500尾(称为黄河种群)，在池塘中养殖4个月后用于实验。2022年6月，通过挤压腹部、观察精液的方法选择生理雄鲇，将可明确观察到精液的个体判定为生理雄性，并在其背鳍基部注射Animal ID芯片(品牌WYUAN，尺寸1.4mm×8mm)进行标记。对每尾雄鲇均剪取约100mg尾鳍组织，置于无水乙醇中保存，共采集163份样品。将组织在乙醇磨碎后，取1/10的组织悬液，离心去除乙醇，并用1mL PBS(pH 7.4)清洗后，加入100μL 50mM NaOH重悬样品，将样品在95℃处理10min裂解后，加入10μL 1M Tril-HCl(pH 8.0)中和NaOH。充分混匀后用作PCR模板，分别用AC_M3、AC_M4和AC_M9鉴定遗传性别。结果表明，AC_M4为非特异性扩增，AC_M3和AC_M9可准确鉴定个体的性别；同时还获得了4尾“伪雄”个体，如图5所示，比例仅为2.45％(4/163)。
7.用天然“伪雄”鲇繁殖“全雌”后代
用标记扫描器挑出“伪雄”鱼，与正常雌鱼繁殖，理论上可获得“全雌”的后代。选择发育成熟的鲇雌性亲鱼，采用绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体素释放激素类似物(LRH-A)进行人工催产和半干法人工授精。具体操作如下：水温22-25℃时，每千克亲鱼注射1000国际单位HCG和20μg LRH-A，雄鱼剂量减半；注射15-17h后达到效应时间，捞出雌性亲鱼，用毛巾擦干鱼体，轻压腹部，将鱼卵挤入干燥的器皿中；将雄鱼的精液挤入干培养皿中，用吸管将精液滴加在卵子上，立即加入清水与卵粒充分混合，随后将受精卵泼撒到湿润的棕榈片上(人工鱼巢)；整个过程避免强光直射。将受精卵移入清水池中孵化，水温22-25℃时，受精卵40-50小时出膜。
为了验证“伪雄”鱼与正常雌鱼繁殖的后代是否全为遗传雌性，受精后24h时将胚胎收集到200μL PCR管中，每个胚胎1管。用移液器将残留的水吸干后，加入10μL 50mMNaOH，95℃处理10min裂解样品，加入1μL 1M Tril-HCl(pH 8.0)中和NaOH，充分混匀并离心后用作PCR模板。用LC_XY-F/R检测验证DNA样品质量可靠，用AC_M3和AC_M9鉴定遗传性别，共检测105个胚胎。结果表明，“伪雄”鱼与正常雌鱼繁殖的后代全部为遗传雌性，如图6所示。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种鲇雄性特异性分子标记，所述雄性特异性分子标记通过如SEQ ID NO.5和6所述的引物扩增得到；或通过如SEQ ID NO.7和8所述的引物扩增得到；或通过如SEQ ID NO.9和10所述的引物扩增得到。
2.一种扩增如权利要求1所述的鲇雄性特异性分子标记的引物，包括如SEQ ID NO.5和6所示的DNA分子。
3.一种扩增如权利要求1所述的鲇雄性特异性分子标记的引物，包括如SEQ ID NO.7和8所示的DNA分子。
4.一种扩增如权利要求1所述的鲇雄性特异性分子标记的引物，包括如SEQ ID NO.9和10所示的DNA分子。
5.一种用于鲇性别鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2-4中任一项所述的引物。
6.如权利要求5所述的试剂盒在鲇性别鉴定中的应用。
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