CN113699256B - 一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用 - Google Patents

一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113699256B
CN113699256B CN202111126329.9A CN202111126329A CN113699256B CN 113699256 B CN113699256 B CN 113699256B CN 202111126329 A CN202111126329 A CN 202111126329A CN 113699256 B CN113699256 B CN 113699256B
Authority
CN
China
Prior art keywords
koi
gynogenesis
salmon
functional marker
offspring
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111126329.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113699256A (zh
Inventor
关文志
许晓军
牛宝龙
楼宝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Academy of Agricultural Sciences filed Critical Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202111126329.9A priority Critical patent/CN113699256B/zh
Publication of CN113699256A publication Critical patent/CN113699256A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113699256B publication Critical patent/CN113699256B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用，属于分子鉴定技术领域。本发明一方面提供了一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记，另一方面提供了该功能标记的应用及应用方法。本发明利用功能标记PB1‑F和PB1‑R，在苗种阶段只需进行常规PCR扩增及凝胶电泳，即可快速鉴定是否为马口鱼雌核发育个体，从分子水平验证，马口鱼雌核发育个体中是否有锦鲤基因混入。该方法具有快速、准确及高效的特点，弥补了形态学鉴定上的不足，是一种可靠的种质鉴定方法。

Description

一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其 应用
技术领域
本发明属于分子鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用。
背景技术
马口鱼（Opsariichthys bidens），隶属鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae），马口鱼属，多生活于溪流及水库等清澈水体中，尤其喜在水流较急的浅滩、底质为砂石的小溪和江河支流中集群生活，以小鱼、小虾、水生昆虫等为食。马口鱼肉质鲜美、生长速度快，深受广大消费者喜爱，但是其怀卵量较少。近年来, 马口鱼自然资源因过度利用及栖息地水环境污染等原因而衰退，为了尽早恢复浙江地区马口鱼资源，发展马口鱼养殖业，申请人于2020年在浙江德清进行了马口鱼规模化人工繁殖试验，实现了马口鱼苗种的规模化生产。
为改良马口鱼优良种质及扩大马口鱼规模化生产，申请人于2021年采用锦鲤异源精子诱导创制马口鱼雌核发育实验，获得了一批马口鱼雌核发育子代，其外观与其母本相似，但无法确定其为雌核发育个体还是杂交个体，无法确定雌核发育个体中是否混入锦鲤基因。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用的技术方案。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明一方面提供了一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记，该功能标记的正向引物PB1-F序列如SEQ ID No.1所示，反向引物PB1-R序列如SEQ ID No.2所示。
本发明另一方面提供了所述的功能标记在快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代中的应用。
本发明另一方面提供了利用所述的功能标记快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的方法，其包括以下步骤：
1）提取马口鱼雌核发育子代和亲本的DNA；
2）以步骤1）的DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，PCR扩增完成后采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若扩增产物中仅含有500bp条带，不含470bp条带，则确定为雌核发育个体。
进一步，所述PCR扩增中PCR反应体系为：2×Taq PCR mix 10μL；Depc H2O 8μL；DNA模板 1μL；PB1-F/-R 0.5μL/0.5μL；反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s；61.5℃ 30 s；72℃ 30 s；35个循环；72℃延伸10 min。
本发明利用功能标记PB1-F和PB1-R，在苗种阶段只需进行常规PCR扩增及凝胶电泳，即可快速鉴定是否为马口鱼雌核发育个体，从分子水平验证，马口鱼雌核发育个体中是否有锦鲤基因混入。该方法具有快速、准确及高效的特点，弥补了形态学鉴定上的不足，是一种可靠的种质鉴定方法。
附图说明
图1为实施例中PCR电泳检测结果。
图中：M：marker 2000；OB：马口鱼母本；CCH：锦鲤父本；1-7：马口鱼雌核发育个体；-：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体的实例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：功能标记设计开发
根据NCBI数据库马口鱼及锦鲤的基因组信息，分别获得parvalbumin beta-1基因序列，后经序列比对分析筛选能够准确区分马口鱼及锦鲤的功能标记，最后经PrimerPremier 5设计引物：功能标记的正向引物PB1-F序列如SEQ ID No.1所示，反向引物PB1-R序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2：功能标记的应用及应用方法
1. 实验材料
本实施例所用的性成熟雌性马口鱼（50尾）和雄性锦鲤（1尾）均为2龄以上，体格健壮，无病无伤，发育良好。马口鱼雌性亲鱼催产所用的药物及剂量分别为（600IU HCG+5mgDOM+8μg LHRH-A2）/kg（催产药物均购买于宁波第二激素厂），注射完成后将雌性马口鱼单独放于能够流水刺激的水泥池网箱中，锦鲤未注射激素，放置于另一个网箱中。
2.雌核发育诱导
在水温为23℃，马口鱼繁殖效应时间约为15-18h，检查待大多数马口鱼能够挤出卵子时，先取2ml锦鲤的精液放置于直径为90mm的培养皿中进行紫外线灭活实验。精液经Hank’s液稀释（精液与 Hank’s 液的比例为1∶4）后，置于冰上（紫外灯与培养皿的照射距离为35cm）后放置于2根15w的密闭紫外灯下照射15分钟（照射时间为前期确定好的最优时间）。然后与卵子进行人工干法授精，在授精2min后开始冷休克处理，冷休克处理时间为25min，水温为4℃，冷休克完成后放于孵化桶中正常孵化。最后分别对参加繁殖的马口鱼、锦鲤亲本和培育3个月的雌核发育个体（体长约5cm）采样，剪取尾鳍保存于95%乙醇中，-80°C保存备用。
3.基因组DNA提取
马口鱼雌核发育子代和亲本的DNA，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（DNATIANamp Marine Animals DNAKit）提取，试剂货号 Cat No.DP324-03，试剂批号 Lot #Q5202。质检方法采用 1.2%琼脂糖凝胶电泳（110V 恒压电泳 1h；DL2000 Marker）和NanoDrop 2000 检测基因组 DNA 的质量和浓度。结果显示，提取出来的 DNA主条带清晰，无明显降解，OD260/280值为1.8～1.9，OD 260/230 值为 1.9～2.3，纯度符合要求，最后将提取出来的DNA浓度稀释至50ng/μL保存备用。
4. PCR扩增及凝胶电泳检测
利用本发明开发的功能标记PB1-F：GAAGGCTGGAGATTCTGATGGTGA和PB1-R：CTTTTCTTATCGTCCGTTCCCGTA，分别以马口鱼雌核发育子代和亲本的DNA样品为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×Taq PCR mix 10μL；Depc H2O 8μL；DNA模板 1μL；PB1-F/-R：0.5μL/0.5μL。反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s；61.5℃ 30 s；72℃ 30 s；35个循环；72℃延伸10 min，后于4℃保存。PCR扩增完成后采用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，V-110V，A-400mA，T=1h。
5. 结果分析
对马口鱼，锦鲤和雌核发育子代的parvalbumin beta-1基因进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，结果显示检测的雌核发育全部子代仅有母本条带（条带大小约500bp），不含父本锦鲤条带（条带大小约470bp），表明检测个体都是雌核发育个体（图1所示）。
另外，需要补充说明的是：马口鱼与锦鲤（精子未紫外灭活）杂交的受精卵在受精后30min和8h未见发育，成假受精状态，28h后受精卵开始出现死亡，直至36h全部死亡，表明马口鱼和锦鲤正常杂交受精卵不能发育且不活。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
gaaggctgga gattctgatg gtga 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
cttttcttat cgtccgttcc cgta 24

Claims (3)

1.功能标记在快速区别鉴定锦鲤和以马口鱼为母本及锦鲤为父本的马口鱼雌核发育子代的应用，所述功能标记的正向引物PB1-F序列如SEQ ID No.1所示，反向引物PB1-R序列如SEQ ID No.2所示。
2.利用功能标记快速区别鉴定锦鲤和以马口鱼为母本及锦鲤为父本的马口鱼雌核发育子代的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）提取马口鱼雌核发育子代和亲本的DNA；
2）以步骤1）的DNA为模板，利用功能标记进行PCR扩增，PCR扩增完成后采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若扩增产物中仅含有500bp条带，不含470bp条带，则确定为雌核发育个体，所述功能标记的正向引物PB1-F序列如SEQ ID No.1所示，反向引物PB1-R序列如SEQ IDNo.2所示。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中PCR反应体系为：2×Taq PCRmix 10μL；Depc H2O 8μL；DNA模板 1μL；PB1-F/-R 0.5μL/0.5μL；反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s；61.5℃ 30 s；72℃ 30 s；35个循环；72℃延伸10 min。
CN202111126329.9A 2021-09-26 2021-09-26 一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用 Active CN113699256B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111126329.9A CN113699256B (zh) 2021-09-26 2021-09-26 一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111126329.9A CN113699256B (zh) 2021-09-26 2021-09-26 一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113699256A CN113699256A (zh) 2021-11-26
CN113699256B true CN113699256B (zh) 2023-06-20

Family

ID=78661860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111126329.9A Active CN113699256B (zh) 2021-09-26 2021-09-26 一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113699256B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101120660A (zh) * 2007-08-28 2008-02-13 中国水产科学研究院黄海水产研究所 鱼类异源冷冻精子诱导雌核发育的方法
JP2009072074A (ja) * 2007-09-18 2009-04-09 Univ Nagoya 魚類胚の作製方法及びその利用
CN102405858A (zh) * 2011-09-09 2012-04-11 刘文义 马口鱼的人工孵化及养殖方法
CN104904638A (zh) * 2015-06-29 2015-09-16 中国科学院水生生物研究所 一种鲫鱼雌核发育鱼苗的培育方法
CN105384804A (zh) * 2015-12-04 2016-03-09 集美大学 一种低致敏性鱼类过敏原小清蛋白、制备方法及其用途
CN110612931A (zh) * 2019-11-01 2019-12-27 浙江省农业科学院 一种马口鱼的人工催产方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1512695T3 (da) * 2003-09-04 2009-03-16 Biomay Ag Hypoallergeniske polypeptider på fiske-parvalbumin
US20100216717A1 (en) * 2003-09-04 2010-08-26 Rudolf Valenta Hypoallergenic Mutant Polypeptides Based on Fish Parvalbumin
CN102156191A (zh) * 2011-05-18 2011-08-17 上海海洋大学 一种可同步检测Tm和Pa过敏原的磁性免疫层析方法
CN102707064B (zh) * 2011-07-14 2015-04-08 集美大学 一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法
CN102680674A (zh) * 2012-05-17 2012-09-19 集美大学 一种鱼类小清蛋白荧光标记抗体、制备方法及其用途
CN102919185A (zh) * 2012-11-27 2013-02-13 北京市水产科学研究所 一种团头鲂精子诱导锦鲤雌核发育的方法
CN103993081B (zh) * 2014-05-16 2015-11-04 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼的方法
CN107079844B (zh) * 2017-05-08 2018-02-13 中国科学院水生生物研究所 一种超雄鲤鱼和遗传雄性而生理雌性鲤鱼的制备方法
CN107114607A (zh) * 2017-05-08 2017-09-01 广西农业职业技术学院 一种促进鲤鱼生长的饲料及其制备方法
CN109253983B (zh) * 2018-11-30 2021-07-27 上海海洋大学 基于中红外光谱和神经网络技术的快速鉴定和检测小清蛋白的方法
CN110438241A (zh) * 2019-07-17 2019-11-12 江汉大学 一种马口鱼dna条形码序列及其应用
CN111321231B (zh) * 2020-03-14 2023-07-21 甘肃省水产研究所 一种分子鉴别虹鳟雌核发育后代的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101120660A (zh) * 2007-08-28 2008-02-13 中国水产科学研究院黄海水产研究所 鱼类异源冷冻精子诱导雌核发育的方法
JP2009072074A (ja) * 2007-09-18 2009-04-09 Univ Nagoya 魚類胚の作製方法及びその利用
CN102405858A (zh) * 2011-09-09 2012-04-11 刘文义 马口鱼的人工孵化及养殖方法
CN104904638A (zh) * 2015-06-29 2015-09-16 中国科学院水生生物研究所 一种鲫鱼雌核发育鱼苗的培育方法
CN105384804A (zh) * 2015-12-04 2016-03-09 集美大学 一种低致敏性鱼类过敏原小清蛋白、制备方法及其用途
CN110612931A (zh) * 2019-11-01 2019-12-27 浙江省农业科学院 一种马口鱼的人工催产方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113699256A (zh) 2021-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102134593B (zh) 半滑舌鳎性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用
Li et al. AFLP-based genetic linkage map of marine shrimp Penaeus (Fenneropenaeus) chinensis
CN106818552B (zh) 一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法
CN107996468A (zh) 一种乌苏里拟鲿遗传雄性逆转生理雌性鱼育筛方法
CN103798169A (zh) 一种快速建立yy超雄黄颡鱼改良繁育系的方法
CN108753987A (zh) 一种鲢鳙通用微卫星荧光多重pcr的方法
CN102912017B (zh) 一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢的方法
JP7169026B2 (ja) タマナマコの性別を迅速に判別する特異的プライマー、判別方法およびキット
CN109880893A (zh) 用于丝尾鱯性别鉴定的特异性dna片段及应用
CN113699256B (zh) 一种快速鉴定马口鱼及锦鲤雌核发育子代的功能标记及其应用
CN111057771B (zh) 一种用于区分“中洋1号”和普通暗纹东方鲀的snp分子标记及其应用
CN108432671B (zh) 一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法
CN104396812A (zh) 一种通过抑制受精卵极体释放获得异源多倍体泥鳅的方法
CN101984057B (zh) 一种尼罗罗非鱼性别差异性分子标记及其应用
CN109468391B (zh) 应用于青鱼亲缘关系鉴定的双重pcr方法
CN110551823B (zh) 与母鸡储精能力相关的snp分子标记及其应用
CN113699224B (zh) 一种用于中国对虾性别鉴定的分子标记c2及其应用
CN113862379B (zh) 一种长吻鮠雄性性别特异性分子标记及其扩增引物和遗传性别鉴定方法
CN115679004A (zh) 鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和杂交种的引物、方法和试剂盒
CN113930517B (zh) rs81439242 SNP分子标记在体长相关的生猪品系选育中的应用
CN111631174B (zh) 一种金边鲤的育种方法
CN113981103A (zh) 罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对及检测试剂盒和鉴定方法
CN107058572B (zh) 一种鉴别翘嘴鲌与三角鲂杂交个体的方法
CN102534039A (zh) 一种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法及应用
CN112322758A (zh) 一个与红鳍东方鲀耐低温相关的微卫星标记引物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant