CN113207808A - 一种柯乐猪的选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柯乐猪的选育方法，包括以下步骤：（1）组建基础群，从柯乐猪分布区引进毛色特征为黑色、棕色和“六白”的柯乐猪，组成各自的零世代基础群；（2）闭锁选育，对各自毛色特征的零世代基础群实行系群闭锁；（3）开放式选育，在开放式繁殖期间，引入柯乐猪外血参与繁育；（4）再次闭锁选育，第5世代对各自毛色特征的种群再次实行系群闭锁，只允许群内公母猪交配繁殖，不允许再向外引入柯乐猪血源；在上述各步骤中，同时采用PCR‑RFLP技术剔除含有Halnn、HalNn基因型和携带RN基因的个体，并用群体继代选育、阶段选择和同质选配进行横交固定，直至选育出遗传稳定的黑色柯乐猪、棕色柯乐猪和“六白”柯乐猪。

Description

一种柯乐猪的选育方法
技术领域
本发明涉及一种柯乐猪的选育方法，属于猪育种技术领域。
背景技术
柯乐猪是贵州省黔西北高寒山区的一个地方优秀猪品种，是产区内各族人民在当地社会经济条件和自然环境下，经长期自发选育而成的珍贵猪种资源，属西南山地放牧型猪种，具有肉质优良、抗逆性强、母性好、性成熟早、抗病能力强、适宜放养等特点，是乌蒙喀斯特山区真正的“乌金猪”，也是贵州省不可多得的宝贵猪种资源。
从上世纪80和90年代开始，当地研究所对柯乐猪进行了种质资源的保种、选育和利用的研究工作，但均未开展柯乐猪品系选育，研究缺乏系统性。2000年到2010年间，柯乐猪产区加大国外猪种引进和推广，由于柯乐猪不具有引入猪种(长白猪、约克猪、杜洛克猪等)生长速度快、饲料报酬高的优势，原饲养柯乐猪的养殖场(户)转而饲养国外猪种及其杂交猪，导致柯乐猪从原有(1998年)年出栏35万头急剧下降至2010年3万头，柯乐猪无计划性杂交利用严重，导致纯种柯乐猪仅在产区交通不便的偏远乡村得到有效保存，种质资源面临挑战。
贵州省赫章县以养殖柯乐猪为主，调查期间有六曲河和兴发2个养殖场，总存栏7000头，能繁母猪500头，建有4个品系:分别为黄毛、六白、鼠毛、全黑。针对稀少的黄毛系柯乐猪研究发现，经过长期的野外放牧训练，结合规范的保种选育，屠宰率较高，达74.46％，瘦肉率适中，肌内脂肪为(3.83±1.03)％，肉质细嫩，肉糯味香，是腌制肉类和特色产品加工的优质材料。氟烷基因(Hal)和酸肉基因(RN)对猪肉质影响较大，氟烷基因使肌肉的PH值在屠宰后迅速下降，酸肉基因则使肌肉PH值更大范围地下降并使其最终PH值降低，但有研究表明杂合个体在生长、胴体和繁殖性状上优于显性纯合体和隐性纯合体。因此，就目前市场需求来看，单纯地剔除这两个有害基因是不利的，应充分利用杂合个体的优势。可以考虑通过合理的选种选配，提高柯乐猪体中杂合个体所占比例，以提高柯乐猪的胴体品质，同时避免隐性纯合个体的产生，以控制猪应激综合症导致的劣质猪肉。然而，由于对柯乐猪的研发层次深度不足，缺乏系统的选育和适宜于贵州高寒山区养殖的技术，限制了柯乐猪的产业化进程。
发明内容
基于上述，本发明提供一种柯乐猪的选育方法，保留其作为地方优质品种的特殊毛色性状，对三种存在的毛色选择提纯，并降低劣质肉基因频率、改良肉质性状，适于扩繁和推广应用。
本发明的技术方案是：一种柯乐猪的选育方法，包括以下步骤：
(1)组建基础群
从柯乐猪分布区引进毛色特征为黑色、棕色和“六白”的柯乐猪，公母比例1:5，组成黑色柯乐猪、棕色柯乐猪和“六白”柯乐猪的零世代基础群；
(2)闭锁选育
对各自毛色特征的零世代基础群实行系群闭锁，只允许群内公母猪交配繁殖，不允许再向外引入柯乐猪血源；
(3)开放式选育
闭锁繁育4个世代采用开放式繁殖，在开放式繁殖期间，引入黑色柯乐猪、棕色柯乐猪和“六白”柯乐猪公猪各2头，降低近交系数；
(4)再次闭锁选育
第5世代对各自毛色特征的种群再次实行系群闭锁，只允许群内公母猪交配繁殖，不允许再向外引入柯乐猪血源；
在上述各步骤中，同时对群内抗应激敏感基因猪进行选育，剔除含有Halnn、HalNn基因型和携带RN基因的个体，余者参加配种；并用群体继代选育、阶段选择、同质选配进行固定，直至选育出遗传稳定的黑色柯乐猪、棕色柯乐猪和“六白”柯乐猪；
可选的，选育过程中选择柯乐猪母猪和公猪进行配种时，用被毛颜色为全黑的柯乐猪同质选配；用被毛颜色为棕色的柯乐猪同质选配；用以额白、尾尖白、四蹄白的柯乐猪同质选配。
可选的，群体继代选育的方法包括：
时间要求：同期发情，同期配种，使各世代间隔一致，以便进行同期测定，消除环境所造成的偏差；
环境要求：对测定猪舍、设备条件、环境条件，饲料及管理条件尽可能一致，而且每世代的条件亦应一致和稳定；
留种选择：培育选育群中的公猪和母猪并进行选配产仔；培育仔猪并进行选种，检测每一仔猪的肉质性状、酮体性能、繁殖性能、饲喂性能及生长性能是否满足基本条件；其体型外貌表现为：体质粗状结实，头大小适中，额宽有菱形皱纹，额心有旋毛，耳下垂，面微凹，嘴筒较粗且直，一般有三条皱褶，俗称“三道箍”；体躯稍窄，背腰平直，腹大较紧凑，后躯比前躯高，四肢健状，肢蹄结实，大腿皮肤多有皱褶；被毛为黑色、棕色或“六白”特征的柯乐猪。
可选的，阶段选择的方法包括：
从每窝仔猪中选留1头小公猪和3头小母猪，根据所划分阶段：从初生至3月龄、4-8月龄和9月龄到出栏，每个阶段对其后代黑色、棕色和六白特征的仔猪进行选育；其中，
28日龄断奶时进行第一次选留，选择断奶时体重大于4公斤，体型、体质好，发育良好以及被毛为黑色、棕色和六白特征的猪进入留种群；
4月龄时进行第二次留选，淘汰发育不良，体重较轻和毛色不纯的柯乐猪；
6月龄选留根据个体多性状综合指数选择，该阶段需重点注重肉质和毛色的挑选；
9月龄时进行严选，再根据综合选择指数的高低进行选择，同时还参考其父母和同胞的表现；后备猪测定前每窝留1公3母，测定后公猪以5：1的比例，母猪3:1的比例强度选留，选择好最终的黑色、棕色和六白柯乐猪品种。
可选的，抗应激敏感基因猪的选育方法为：
在建立基础群时，对群内个体均进行应激基因氟烷基因Hal和酸肉基因RN检测，将含有Halnn、HalNn基因型和携带RN基因的后备猪淘汰，余者参加配种，产生后代，然后随着群体继代选育再进入阶段选择；
在28日龄时，淘汰Halnn、HalNn基因型的猪和携带RN基因的猪，组建抗应激品系，对于氟烷基因Hal和酸肉基因RN的检测，要覆盖种群的第一代、第二代、第三代，至少有三个世代的多世代挑选，对引入的柯乐猪公猪不含有氟烷基因Hal和酸肉基因RN，适时对测定公母猪群中的Halnn基因进行完全清除，并彻底淘汰携带有RN基因的猪。
可选的，对柯乐猪个体进行应激基因氟烷基因Hal和酸肉基因RN检测的方法包括以下步骤：
(1)采样
在不影响柯乐猪耳号的地方取猪耳组织，置于含70％乙醇的离心管中，于-20℃保存备用样品备用；
(2)DNA的提取
取猪耳组织样品，置于75％乙醇中洗净，在离心管中剪碎，并提取DNA，于-20℃保存备用；
(3)PCR扩增
以DNA作为模板，以HAL引物对或RN引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR产物；PCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测，取目的片段，选择扩增条带清晰、明亮且无杂带的PCR产物进行下一步酶切鉴定；
(4)酶切鉴定
酶切反应：酶切反应缓冲液Buffer1.5μL，扩增产物溶液10μL，酶0.5μL，DEPC水3.0μL；酶切反应条件：37℃水浴过夜；酶切产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，判断基因型。
(5)数据的统计处理
对测得的基因型进行计数，计算其基因频率和基因型频率，通过检测所得各基因型和基因频率变化判断Halnn、HalNn基因型和RN劣势等位基因是否被完全清除。
可选的，所述HAL引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即：
5'-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA-3'；
所述HAL引物对的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，即：
5'-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3'。
可选的，所述RN引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，即：
5'-GCAGGTGTAGATAGTCTTGTTTAGG-3'；
所述RN引物对的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，即：
5'-CCGCCTGTCCTCTTCTTACTT-3'。
本发明的有益效果是：本发明深入发掘柯乐猪开发利用的特点和育种方向，根据柯乐猪的毛色差异，产区典型群体引种，建成1个柯乐猪资源保护场，组建3种不同毛色的柯乐猪群体，按照毛色遗传理论，采用群体继代选育法+阶段选择法+分子标记法相结合，完成了柯乐猪的世代选育，剔除了氟烷基因(HAL)和酸肉基因(RN)，毛色趋于稳定，选育出3个柯乐猪品系：黑毛柯乐猪、棕毛柯乐猪和“六白”柯乐猪。本发明保留了柯乐猪作为地方优质品种的特殊毛色性状，对三种存在的毛色选择提纯，并降低劣质肉基因频率、改良肉质性状，适于扩繁和推广应用，同时也为深入发掘地方猪种柯乐猪的开发利用提供有利参考。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明实施例一种柯乐猪的选育方法，包括以下步骤：
(1)组建基础群
从柯乐猪分布区引进毛色特征为黑色、棕色和“六白”的柯乐猪，公母比例1：5，组成黑色柯乐猪、棕色柯乐猪和“六白”柯乐猪的零世代基础群。
具体而言，从本地柯乐猪所分布的各县引进不同血统的可乐母猪及公猪；对其杂交后代柯乐猪体型外貌、生产性能、杂交配套等进行系统评价，选出毛色为黑色、棕色和有六白特征的柯乐猪，组成零世代基础群。
选育过程中选择柯乐母猪和公猪配种时，用被毛颜色为全黑的柯乐猪同质选配；用被毛颜色为棕色的柯乐猪同质选配；用以额白、尾尖白、四蹄白，即“六白”的柯乐猪同质选配。应当注意的是，同质选配贯穿整个选育过程。
适宜的群体规模是以每世代群体近交率(△F)的上升多少为依据，每一世代群体适宜的近交增加量以2％～3％或3％～4％为宜。选择经过5～6个世代，加上选择的作用，使群体近交系数达到10％～15％。以10♂×50♀的群体规模为准，群体有效含量Ne＝33，群体每代近交增量△F＝1.5％。
(2)闭锁选育
对各自毛色特征的零世代基础群实行系群闭锁，只允许群内公母猪交配繁殖，不允许再向外引入柯乐猪血缘。例如：黑色被毛的群体，仅在黑色被毛群体内闭锁繁殖；棕色色被毛的群体，仅在棕色被毛群体内闭锁繁殖；六白特征的群体，仅在六白群体内闭锁繁殖。
(3)开放式选育
闭锁繁育4个世代采用开放式繁殖，在开放式繁殖期间，引入黑色柯乐猪、棕色柯乐猪和“六白”柯乐猪公猪各2头，降低近交系数；。例如：对于闭锁繁育了4个世代的黑色柯乐猪群体，开始引入外来的、被毛颜色全黑的种猪与该群体进行杂交繁殖。同样，对于棕色柯乐猪群体，引入被毛颜色全棕的种猪进入该群体进行开放式繁殖。
(4)再次闭锁选育
第5代对各自毛色特征的种群再次实行系群闭锁，只允许群内公母猪交配繁殖，不允许再向外引入柯乐猪血缘；
在上述各步骤中，同时对群内抗应激敏感基因猪进行选育，剔除含有Halnn、HalNn基因型和携带RN基因的个体，余者参加配种；并用群体继代选育、阶段选择、同质选配进行固定，直至选出遗传稳定的黑色柯乐猪、棕色柯乐猪和“六白”柯乐猪；本发明中，群体继代选育的方法包括时间要求、环境要求和留种选择。其中，时间要求为：同期发情，同期配种，使各世代间隔一致，以便进行同期测定，消除环境所造成的偏差；环境要求为：对测定猪舍、设备条件、环境条件，饲料及管理条件尽可能一致，而且每世代的条件亦应一致和稳定；留种选择为：培育选育群中的公猪和母猪并进行选配产仔；培育仔猪并进行选种，检测每一仔猪的肉质性状、胴体性状、繁殖性状、采食性状及生长性状是否满足基本条件；其体型外貌表现为：体质粗状结实，头大小适中，额宽有菱形皱纹，额心有旋毛，耳下垂，面微凹，嘴筒较粗且直，一般有三条皱褶，俗称“三道箍”；体躯稍窄，背腰平直，腹大较紧凑，后躯比前躯高，四肢健状，肢蹄结实，大腿皮肤多有皱褶；被毛为黑色、棕色或“六白”特征的柯乐猪。
本发明中，阶段选择的方法包括：
1、从每窝仔猪中选留1头小公猪和3头小母猪，根据所划分阶段：从初生至3月龄、4-8月龄和9月龄到出栏，每个阶段对其后代黑色、棕色和六白特征的仔猪进行选育；其中，
2、28日龄断奶时进行第一次选留，选择断奶时体重大于4公斤，体型、体质好，发育良好以及被毛为黑色、棕色和六白特征的猪进入留种群；
3、4月龄时进行第二次留选，淘汰发育不良，体重较轻和毛色不纯的柯乐猪；
4、6月龄选留根据个体多性状综合指数选择，该阶段需重点注重肉质和毛色的挑选；
5、9月龄时进行严选，再根据综合选择指数的高低进行选择，同时还参考其父母和同胞的表现；后备猪测定前每窝留1公3母，测定后公猪以5：1的比例，母猪3:1的比例强度选留，选择好最终的黑色、棕色和六白柯乐猪品种。窝中其余的公母猪,供作同胞肥育测定。
重复选配和选种，最终选育出3个性能遗传稳定的黑色、棕色及六白特征的柯乐猪品系。
本发明中，抗应激系的选择采用分子标记辅助选择同常规育种技术相结合的方法，对2月龄选留的测定公母猪逐一采血或采取耳组织检测氟烷基因型，进行PcR—RFLP分析，分析基因型，并根据不同的基因型进行标记辅助选择(MAS)。淘汰Halnn、HalNn个体及携带RN基因的个体，Hal基因和RN基因频率逐代降低，并最终彻底清除Haln基因和RN基因。具体步骤如下：
1、在建立基础群时，对群内个体均进行应激基因氟烷基因Hal和酸肉基因RN检测，将含有Halnn、HalNn基因型和携带RN基因的后备猪淘汰，余者参加配种，产生后代，然后随着群体继代选育再进入阶段选择；
2、在28日龄时，淘汰Halnn、HalNn基因型的猪和携带RN基因的猪，组建抗应激品系，对于氟烷基因Hal和酸肉基因RN的检测，要覆盖种群的第一代、第二代、第三代，至少有三个世代的多世代挑选，对引入的柯乐猪公猪不含有氟烷基因Hal和酸肉基因RN适时对测定公母猪群中的Halnn基因进行完全清除，并彻底淘汰携带有RN基因的猪。若后代检测全部为HALNN(显性纯合子)，表明核心群已排除了氟烷敏感基因。
本发明中，对柯乐猪个体进行应激基因氟烷基因Hal和酸肉基因RN检测的方法包括以下步骤：
(1)采样
在不影响猪耳号的地方用耳号钳剪一小块耳组织，置于含70％乙醇1mL的1.5mL离心管中带回实验室，于-20℃保存，备用。
(2)DNA的提取
取火柴头大小的猪耳组织样品,置于75％乙醇中洗净，在1.5mL的离心管中剪碎，利用TIANGEN DNA提取试剂盒提取DNA，按照试剂盒说明书进行操作。获取的DNA样品置于-20℃保存，备用。
(3)PCR扩增
以DNA作为模板，以HAL引物对或RN引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR产物；PCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测，取目的片段，选择扩增条带清晰、明亮且无杂带的PCR产物进行下一步酶切鉴定。
PCR扩增反应(25μL)：TIANGEN 2×Pre MasterMix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，加DEPC水8.5μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火30s(HAL基因55℃,RN基因60℃)，72℃延伸5min，共35个循环；72℃再延伸5min；12℃保存。
其中，HAL引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即：
5'-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA-3'；
HAL引物对的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，即：
5'-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3'。
RN引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，即：
5'-GCAGGTGTAGATAGTCTTGTTTAGG-3'；
RN引物对的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，即：
5'-CCGCCTGTCCTCTTCTTACTT-3'。
(4)酶切鉴定
酶切反应(15μL)：酶切反应缓冲液Buffer1.5μL，扩增产物溶液10μL，酶0.5μL[HAL基因用HhaⅠ酶，RN基因用Mbil(Bsr Bl)酶]，DEPC水3.0μL；酶切反应条件：37℃水浴过夜(8h以上)；酶切产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，判断基因型。
(5)数据的统计处理
对测得的基因型进行计数,计算其基因频率和基因型频率,通过检测所得各基因型和基因频率变化判断Halnn、HalNn基因型和RN劣势等位基因是否被完全清除。
本发明针对柯乐猪的选育方法，是在坚持其肉质优良、抗逆性强、母性好、性成熟早、抗病能力强的前提下，对毛色遗传的稳定性及肉质的提高，选育出黑毛柯乐猪、棕毛柯乐猪和“六白”柯乐猪三个品系，并剔除氟烷基因(RYR1)和酸肉基因(RN)。
本发明对基础群进行先封闭后开放式选育，用被毛颜色为黑色、棕色及有六白特征的柯乐猪在其各自的基础群内进行同质选配，从上世代选出下一世代一定数目的优良个体留种，阶段选育。结合PCR-RFLP(限制性片段长度多态性聚合酶链式反应)技术，进行毛色基因选留出生长性能优秀的黑色、棕色和六白的柯乐猪品系，保留了柯乐猪作为地方优质品种的特殊毛色性状，对三种存在的毛色选择提纯，并降低劣质肉基因频率、改良肉质性状，适于扩繁和推广应用，同时也为深入发掘地方猪种柯乐猪的开发利用提供有利参考。
Figure BDA0003099849810000091
Figure BDA0003099849810000101
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州大学
<120> 一种柯乐猪的选育方法
<160> 4
<210> 1
<211> DNA
<212> 24
<213> 人工序列
<400> 1
TCCAGTTTGC CACAGGTCCT ACCA 24
<210> 2
<211> DNA
<212> 24
<213> 人工序列
<400> 2
ATTCACCGGA GTGGAGTCTC TGAG 24
<210> 3
<211> DNA
<212> 25
<213> 人工序列
<400> 3
GCAGGTGTAG ATAGTCTTGT TTAGG 25
<210> 4
<211> DNA
<212> 21
<213> 人工序列
<400> 4
CCGCCTGTCC TCTTCTTACT T 21

Claims (8)

1.一种柯乐猪的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)组建基础群
从柯乐猪分布区引进毛色特征为黑色、棕色和“六白”的柯乐猪，公母比例1:5，组成黑色柯乐猪、棕色柯乐猪和“六白”柯乐猪的零世代基础群；
(2)闭锁选育
对各自毛色特征的零世代基础群实行系群闭锁，只允许群内公母猪交配繁殖，不允许再向外引入柯乐猪血源；
(3)开放式选育
闭锁繁育4个世代采用开放式繁殖，在开放式繁殖期间，引入黑色柯乐猪、棕色柯乐猪和“六白”柯乐猪公猪各2头，降低近交系数；
(4)再次闭锁选育
第5世代对各自毛色特征的种群再次实行系群闭锁，只允许群内公母猪交配繁殖，不允许再向外引入柯乐猪血源；
在上述各步骤中，同时对群内抗应激敏感基因猪进行选育，剔除含有Halnn、HalNn基因型和携带RN基因的个体，余者参加配种；并用群体继代选育、阶段选择、同质选配进行固定，直至选育出遗传稳定的黑色柯乐猪、棕色柯乐猪和“六白”柯乐猪；
2.根据权利要求1所述的柯乐猪的选育方法，其特征在于，选育过程中选择柯乐猪母猪和公猪配种时，用被毛颜色为全黑的柯乐猪同质选配；用被毛颜色为棕色的柯乐猪同质选配；用以额白、尾尖白、四蹄白的柯乐猪同质选配。
3.根据权利要求1所述的柯乐猪的选育方法，其特征在于，群体继代选育的方法包括：
时间要求：同期发情，同期配种，使各世代间隔一致，以便进行同期测定，消除环境所造成的偏差；
环境要求：对测定猪舍、设备条件、环境条件，饲料及管理条件尽可能一致，而且每世代的条件亦应一致和稳定；
留种选择：培育选育群中的公猪和母猪并进行选配产仔；培育仔猪并进行选种，检测每一仔猪的肉质性状、胴体性状、繁殖性状、采食性状及生长性状是否满足基本条件；其体型外貌表现为：体质粗状结实，头大小适中，额宽有菱形皱纹，额心有旋毛，耳下垂，面微凹，嘴筒较粗且直，一般有三条皱褶，俗称“三道箍”；体躯稍窄，背腰平直，腹大较紧凑，后躯比前躯高，四肢健状，肢蹄结实，大腿皮肤多有皱褶；被毛为黑色、棕色或“六白”特征的柯乐猪。
4.根据权利要求1所述的柯乐猪的选育方法，其特征在于，阶段选择的方法包括：
从每窝仔猪中选留1头小公猪和3头小母猪，根据所划分阶段：从初生至3月龄、4-8月龄和9月龄到出栏，每个阶段对其后代黑色、棕色和六白特征的仔猪进行选育；其中，
28日龄断奶时进行第一次选留，选择断奶时体重大于4公斤，体型、体质好，发育良好以及被毛为黑色、棕色和六白特征的猪进入留种群；
4月龄时进行第二次留选，淘汰发育不良，体重较轻和毛色不纯的柯乐猪；
6月龄选留根据个体多性状综合指数选择，该阶段需重点注重肉质和毛色的挑选；
9月龄时进行严选，再根据综合选择指数的高低进行选择，同时还参考其父母和同胞的表现；后备猪测定前每窝留1公3母，测定后公猪以5：1的比例，母猪3:1的比例强度选留，选择好最终的黑色、棕色和六白柯乐猪品种。
5.根据权利要求4所述的柯乐猪的选育方法，其特征在于，抗应激敏感基因猪的选育方法为：
在建立基础群时，对群内个体均进行应激基因氟烷基因Hal和酸肉基因RN检测，将含有Halnn、HalNn基因型和携带RN基因的后备猪淘汰，余者参加配种，产生后代，然后随着群体继代选育再进入阶段选择；
在28日龄时，淘汰Halnn、HalNn基因型的猪和携带RN基因的猪，组建抗应激品系，对于氟烷基因Hal和酸肉基因RN的检测，要覆盖种群的第一代、第二代、第三代，至少有三个世代的多世代挑选，对引入的柯乐猪公猪不含有氟烷基因Hal和酸肉基因RN，适时对测定公母猪群中的Halnn基因进行完全清除，并彻底淘汰携带有RN基因的猪。
6.根据权利要求5所述的柯乐猪的选育方法，其特征在于，对柯乐猪个体进行应激基因氟烷基因Hal和酸肉基因RN检测的方法包括以下步骤：
(1)采样
在不影响柯乐猪耳号的地方取猪耳组织，置于含70％乙醇的离心管中，于-20℃保存备用样品备用；
(2)DNA的提取
取猪耳组织样品，置于75％乙醇中洗净，在离心管中剪碎，并提取DNA，于-20℃保存备用；
(3)PCR扩增
以DNA作为模板，以HAL引物对或RN引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR产物；PCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测，取目的片段，选择扩增条带清晰、明亮且无杂带的PCR产物进行下一步酶切鉴定；
(4)酶切鉴定
酶切反应：酶切反应缓冲液Buffer1.5μL，扩增产物溶液10μL，酶0.5μL，DEPC水3.0μL；酶切反应条件：37℃水浴过夜；酶切产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，判断基因型。
(5)数据的统计处理
对测得的基因型进行计数,计算其基因频率和基因型频率,通过检测所得各基因型和基因频率变化判断Halnn、HalNn基因型和RN劣势等位基因是否被完全清除。
7.根据权利要求6所述的柯乐猪的选育方法，其特征在于，所述HAL引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即：
5'-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA-3'；
所述HAL引物对的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，即：
5'-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3'。
8.根据权利要求6所述的柯乐猪的选育方法，其特征在于，所述RN引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，即：
5'-GCAGGTGTAGATAGTCTTGTTTAGG-3'；
所述RN引物对的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，即：
5'-CCGCCTGTCCTCTTCTTACTT-3'。
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