CN106172237A - Ghr基因敲除纯合香猪的选育方法 - Google Patents

Ghr基因敲除纯合香猪的选育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种GHR基因敲除纯合香猪的选育方法，本发明采用从江香猪作为母本，利用锌指核酸酶(ZFN)基因组编辑技术对生长激素受体基因(GHR)进行修饰敲除的香猪作为父本，选育获得纯合GHR基因敲除(GHR‑/‑)的香猪，该方法选育获得的香猪具有体型更小的优点，为小型猪在生命科学研究中的应用奠定基础。本发明简单易行，使用效果好。

Description

GHR基因敲除纯合香猪的选育方法
技术领域
本发明涉及家畜选育技术领域，尤其是一种GHR基因敲除纯合香猪的选育方法。
背景技术
生长激素受体(Growth hormone receptor，GHR)是一种跨膜蛋白，由单一基因编码而成，是细胞因子受体超家族成员之一，GHR在动物的发育生长过程中及新陈代谢中发挥重要作用，其功能缺失会导致动物发育生长变慢。猪GHR基因位于第16号染色体上，包含10个外显子，全长16.14kb，cDNA共编码638个氨基酸，长为1925bp，包括245个氨基酸构成的胞外域(生长激素结合域)、30个氨基酸构成的跨膜域和345个氨基酸构成的胞内域，胞外区缺失是GHR基因功能缺失的主要原因，GHR基因胞外区包含1～6号外显子。
从江香猪产地位于贵州省从江县，是我国优良的小型猪种，具有体型矮小的特点，是理想的实验动物，具有较高的科研价值和经济价值。
发明内容
本发明的目的是：提供一种GHR基因敲除纯合香猪的选育方法，根据该方法能选育获得体型更小、更适合用于实验与科研的香猪。
本发明是这样实现的：GHR基因敲除纯合香猪的选育方法，包括如下步骤：
1)父母本的选择：将香猪利用锌指核酸酶基因组编辑技术对生长激素受体基因GHR进行修饰敲除，获得父本；以从江香猪作为母本；
2)F1代的选育：将父本与母本进行杂交，获得F1代，对F1代的血液样品进行DNA提取、PCR扩增、测序，选留F1中测序结果为阳性杂合子的群体；
3)F2代的选育：将F1代选留的群体进行群内杂交，获得F2代，对F2代的血液样品进行DNA提取、PCR扩增、测序后，选留出测序结果中缺失了4bp的碱基的群体，即获得GHR基因敲除纯合香猪。
用于PCR扩增GHR的引物序列为：上游引物:5，
-AAGCGGTGTCTATGTGCTGATTCTC-3，，
下游引物:5，-TCAGTGGCTAGACTATATGATGTTG-3，。
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明采用从江香猪作为母本，利用锌指核酸酶(ZFN)基因组编辑技术对生长激素受体基因(GHR)进行修饰敲除的香猪作为父本，选育获得纯合GHR基因敲除(GHR-/-)的香猪，该方法选育获得的香猪具有体型更小的优点，为小型猪在生命科学研究中的应用奠定基础。本发明简单易行，使用效果好。
附图说明
图1为F2代香猪体尺指标趋势变化图；
图2为猪基因组DNA；
图3为F1代和F2代猪GHR基因PCR产物电泳图；
图4为F2代GHR基因4bp碱基插入序列(GATG)测序结果图。
具体实施方式
本发明的实施例：GHR基因敲除纯合香猪的选育方法，在2013年6月贵州大学香猪育种场开始进行试验，
1)父本母本的选择：以贵州大学香猪场提供的从江香猪母猪为母本，中国农业大学农业生物技术国家重点实验室制备的GHR敲除杂合子(GHR+/-)的香猪为父本；(父本3头，母本6头)
2)F1代的选育：2013年11月，上述父本母本杂交获得F1代群体43头，以数字标记，每头均取血液样品进行进行DNA提取、PCR扩增、测序后，检测得知，其中20头为阳性杂合子，其余为阴性杂合子，选留所有阳性杂合子，淘汰所有阴性杂合子。
3)F2代的选育：2015年5月，选留的F1代群体群内杂交获得F2代30头，以英文字母标记，每头均取血液样品进行进行DNA提取、PCR测序后，检测得知，其中8头为缺失了4bp的碱基的群体，选留该群体，淘汰其余的，即获得GHR基因敲除纯合香猪；
上述试验中，母猪圈舍为单列式，钢筋混凝土结构，水泥地面的普通级猪舍。圈栏由采食区、卧息区和运动场三部分组成。采用单圈饲养公猪；母猪5头左右一圈，产仔前45天左右对孕猪进行分栏，其中分娩栏为独立圈舍，并安装有保暖灯。从江香猪饲料分为种母猪料、种公猪料和哺乳仔猪料，日饲喂粮量按体重的4％左右进行调整，日喂三次，分别为上午9:00、下午3:00和晚上8:00，每天冲洗圈舍一次，用鸭嘴饮水器自由饮水。
提取的GHR基因敲除香猪F1代和F2代基因组DNA取5μL DNA样与1μL 6×LoadingBuffer充分混合后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，提取的DNA条带整齐、完整、明亮，可直接用于PCR扩增(见图2)。用于PCR测序的引物为上游引物:5’-AAGCGGTGTCTATGTGCTGATTCTC-3’，下游引物:5’-TCAGTGGCTAGACTATATGATGTTG-3’，由生工生物工程(上海)有限公司合成，ddH2O溶解，-20℃保存。20μL反应体系为PCR Master Mix 10ul，ddH2O 7ul，DNA模板1ul，上游引物1ul，下游引物1ul；GHR基因PCR扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。GHR基因PCR产物片段大小于预期大小一致(见图3)。PCR产物送北京诺塞生物有限公司测序，从测序结果可知成功选育获得了GHR基因敲除纯合香猪(见图4)。
为了进一步验证本发明的技术效果，申请人对结果进行了如下对比验证：
对比1、F2代选留的GHR基因敲除纯合香猪(GHR-/-)；
对比2、F1代选留的阳性杂合子(GHR+/-)；
对比3、F1代淘汰的阴性猪(GHR+/+)；
对比4、F2代淘汰的阳性杂合子猪(GHR+/-)；
对比5、从江香猪纯繁后代(从江♂×从江♀)；
根据观察对比，F2代GHR基因敲除香猪体尺指标随年龄增加F2代阳性猪体重明显小于阴性猪，6月龄时，GHR基因敲除阳性猪体重减少了35％；阳性猪的体长，胸围，腹围等指标随年龄增加同样明显小于阴性猪；但随年龄增加，阳性猪的体高与阴性猪相比变化不大，6月龄时趋向一致(见图1，表1)。F1代GHR基因敲除阳性猪与阴性猪在体重、体尺方面的差异均不显著(P>0.05)(见表2)。2、3、4、5、6月龄时体重、体长、体高、胸围GHR+/+香猪与GHR+/-香猪差异不显著(P>0.05)，GHR+/+香猪、GHR+/-香猪均小于从江香猪且差异显著(P<0.05)；GHR+/+香猪、GHR+/-香猪、从江香猪在2-4月龄生长速度逐渐加快，5-6月龄逐渐降低，最高出现在4月龄。
表1 F2代GHR基因敲除猪生长指标测定结果
备注：同行带*者表示差异显著(0.01＜P＜0.05)，带**者表示差异极显著(P＜0.01)
表2 F1代GHR基因敲除香猪、从江香猪生长发育指标测定结果
注：1,2,3分别代表GHR+/-香猪，GHR+/+香猪，从江香猪；表中数值为最小二乘均数±标准误。同时期时同列中不同肩标小写字母表示差异性显著(P<0.05)。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州大学
<120> GHR基因敲除纯合香猪的选育方法
<130> nm:
<160> 2
<170> PatentIn version
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据猪GHR基因片段序列设计1对特异性引物，用Primer5.0软件设计,以用于PCR扩增。
<400> 1
AAGCG GTGTC TATGT GCTGA TTCTC 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据猪GHR基因片段序列设计1对特异性引物，用Primer5.0软件设计,以用于PCR扩增。
<400> 2
TCAGT GGCTA GACTA TATGA TGTTG 25

Claims (2)

1.一种GHR基因敲除纯合香猪的选育方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)父母本的选择：将香猪利用锌指核酸酶基因组编辑技术对生长激素受体基因GHR进行修饰敲除，获得父本；以从江香猪作为母本；
2)F1代的选育：将父本与母本进行杂交，获得F1代，对F1代的血液样品进行DNA提取、PCR扩增、测序，选留F1中测序结果为阳性杂合子的群体；
3)F2代的选育：将F1代选留的群体进行群内杂交，获得F2代，对F2代的血液样品进行DNA提取、PCR扩增、测序后，选留出测序结果中缺失了4bp的碱基的群体，即获得GHR基因敲除纯合香猪。
2.根据权利要求1所述的GHR基因敲除纯合香猪的选育方法，其特征在于：用于PCR扩增GHR的引物序列为：上游引物：5’
-AAGCGGTGTCTATGTGCTGATTCTC-3’，
下游引物：5’-TCAGTGGCTAGACTATATGATGTTG-3’。
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