CN101892264A - 肌生成抑制素mstn基因敲除猪的建立 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肌生成抑制素MSTN基因敲除猪的建立，其特征在于具体制备方法如下：1、基因打靶载体的构建；2、MSTN基因敲除的猪胎儿成纤维细胞的构建；3、利用体细胞核移植技术构建MSTN基因敲除猪；4、对MSTN基因敲除猪的鉴定其应用基因敲除和转基因技术，可以获得高瘦肉率动物，构建MSTN基因敲除模型动物，为进一步研究该基因的功能具有重要意义。

Description

肌生成抑制素MSTN基因敲除猪的建立

技术领域：

本发明涉及一种肌生成抑制素MSTN基因敲除猪的建立，属于动物科学领域。

背景技术：

肌肉的生长受到多种因素的调控，其中肌生成抑制素起着主要的负调控作用。肌生成抑制素(Myostatin，MSTN)或生长分化因子-8(GDF-8)，属TGF-β(转化生长因子-β)超家族，是肌肉的主要负调控因子。敲除肌生成抑制素基因的小鼠肌纤维发生广泛性的增生和肥大，骨骼肌量显著增加，平均体重超过正常小鼠的261％，但不存在其它表型差异。而且肌生成抑制素基因敲除小鼠肌量增加的表型可终生维持，年老的肌生成抑制素基因敲除鼠比对照鼠肌肉量与肌力都增加。

培育瘦肉率高、节粮型猪品种是国家的重大需求，瘦肉率的提高一直是遗传育种的重点与难点。因此，通过对肌生成抑制素的突变、缺失等遗传修饰，结合克隆猪制备技术，获得肌生成抑制素基因缺失克隆猪，能在较短的时间内培育出瘦肉率高、饲料转化率高、繁殖性能好、节粮型猪种。此方面的研究国内外未见相同报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种肌生成抑制素MSTN基因敲除猪的建立，基因工程技术构建pSSC-Larm-Sarm质粒。其中Larm约4.3kb，Sarm约1.4kb，分别是猪MSTN的同源序列，作为同源重组序列。

本发明的另一个目的在于提供将构建的MSTN基因敲除的载体转染至猪胎儿成纤维细胞的方法，即在细胞水平通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出MSTN基因敲除的猪胎儿成纤维细胞；并利用体核移植和胚胎移植技术制备MSTN基因敲除猪的方法；并利用PCR的方法鉴定基因敲除猪。

本发明的技术方案是这样实现的：肌生成抑制素MSTN基因敲除猪的建立，MSTN基因敲除载体是猪MSTN的同源序列，作为同源重组序列，其特征在于具体制备方法如下：

1、基因打靶载体的构建

以猪基因组DNA为模板，用引物P1、P2、P3、P4(如表1)，PCR扩增1.4kb和7.5kb片段。分别连接至pGEM-T载体；然后用BamH I和Hind I双酶切重组质粒pGEM-Sarm和通用基因敲除载体pSSC-9载体质粒，琼脂糖凝胶电泳后，分别回收1.4kb目的片段和7.5kb的载体片段。用T4DNA连接酶连接目的片段和载体片段，得到中间重组质粒pSSC-Sarm。再用Sal I和Xho I分别酶切pSSC-Sarm重组质粒和纯化的同源长臂PCR产物，琼脂糖凝胶电泳后，回收8.9kb载体片段和4.3kb的目的片段，T4DNA连接酶连接目的片段和载体片段，转化大肠杆菌HB101宿主菌，随机挑选单菌落，经长臂PCR鉴定初步筛选阳性克隆菌，为确保长臂插入pSSC-Sarm载体中，利用长臂内部扩增引物进行PCR反应，同时对该质粒上的短臂也进行PCR反应，均表现出阳性，表明成功构建猪肌生成抑制素基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm。

表1引物序列

引物P1 5′-TAGCATCCGTCGACTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAG-3′，含Sal I酶切位点(下划线部分，以下同)

引物P2 5′-CATAGCCGCTCGAGTGGTGGCTAAATATGTCTGATGGG-3′，含Xho I酶切位点

引物P3 5′-GGATCCCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGCTC-3′，含BamH I酶切位点

引物P4 5′-AAGCTTACAGCCATCATGAATCCATAAGTGAATG-3′，含Hind III酶切位点

2、MSTN基因敲除猪胎儿成纤维细胞的构建

本发明将构建MSTN基因敲除的载体线性化后，利用FuGENE HD转染长白猪胎儿成纤维细胞，用G418筛选7～9天后，获得抗性细胞。对所获的细胞在基因水平、转录水平和翻译水平进行鉴定，获得了MSTN基因敲除的猪的成纤维细胞。

3、利用体细胞核移植技术构建MSTN基因敲除猪

本发明采用体细胞核移植技术，以长白猪母猪做代孕母猪，构建MSTN基因敲除猪，产生转基因猪为白色。

4、对MSTN基因敲除猪用PCR方法通过鉴定引物sp1、sp7、sp2、sp8、spn1、spn2、spn3、spn4进行鉴定。

本发明采用PCR法验证猪MSTN基因敲除情况。

以下试验例证明本发明的效果：

试验例1基因打靶载体的鉴定

1、猪myostatin基因敲除载体构建策略图(如图1)

2、同源长臂的PCR电泳图谱(图2)

3、同源短臂的PCR电泳图谱(图3)

4、pSSC-Larm-Sarm的PCR鉴定(图4)

试验例2细胞水平的鉴定-PCR

1成纤维细胞系将所构建的载体pSSC-Larm-Sarm稳定转染中国长白猪胎儿成纤维细胞。

2试验过程取新生猪脐带提取的基因组作为模板，同时设立非转基因猪的基因组为模板和不加模板只加水的阴性对照。

3试验结果外侧引物在2100bp处出现特异性条带，结果如图5；内侧引物在1553bp处出现特异性条带，结果如图6，证明MSTN基因得以敲除。

试验例3基因敲除猪的制备

1细胞所构建MSTN基因敲除的猪胎儿成纤维细胞

2动物健康的长白母猪(白色)

3试验过程采用体细胞核移植技术，构建MSTN基因敲除猪。

4试验结果

2009年12月10日，耳号为0953的长白猪(白毛)怀孕116天，顺利产下3头表型正常、健康的长白猪。平均体重为：1.2kg。

2009年12月11日，耳号为1324的长白猪(白色)怀孕115天，顺利产下2头健康的白色小猪。平均体重为：1.3kg。

结论：本发明掌握了基因敲除猪的制备技术，成功制备了MSTN基因敲除猪

本发明的积极效果在于应用基因敲除和转基因技术，可以获得高瘦肉率动物，构建MSTN基因敲除模型动物，为进一步研究该基因的功能具有重要意义。

附图说明

图1、猪myostatin基因敲除载体构建策略图

图2、同源长臂的PCR电泳图谱

图3、同源短臂的PCR电泳图谱

图4、pSSC-Larm-Sarm的PCR鉴定

图5、两套引物外侧PCR结果。

M：MarkerIII  1：1号猪；2：2号猪；3：3号猪；4：4号猪；5：5号猪；

非：非转基因猪；水：水为模板。

图6、两套引物内侧PCR结果。

M：MarkerIII  1：1号猪；2：2号猪；3：3号猪；4：4号猪；5：5号猪；

非：非转基因猪；水：水为模板。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

实施例1引物设计与合成

依据已完成的测定猪肌生成抑制素基因组序列，结合GenBank上提供的牛肌生成抑制素基因序列(6691bp，序列号：AF320998)，利用Oligo 6.0软件设计两对引物。引物P1在上游启动序列上，引物P2在内含子II上游5′端，扩增同源长臂(long arm，简称Larm，约4.3kb)；引物P3在外显子III下游3′端，引物P4在肌生成抑制素基因编码区域的3′外端，扩增同源源短臂(Short arm，简称Sarm，约1.4kb)。两对引物在猪肌生成抑制素基因组序列上的相对位置如表1所示，均由赛百盛生物工程公司合成。

实施例2同源短臂的制备

2.1同源短臂PCR扩增

以猪基因组DNA为模板，用引物P3、P4进行PCR扩增，反应体系：模板1μl(50～100ng)，10×PCR Buffer 2.5μl，dNTPs(25mM)2μl，上下游引物(10pM)各1μl，加ddH₂O至25μl。反应条件：94℃预变性5min后，加入ExTaq酶1μl，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环，最后72℃延伸10min。取PCR产物5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.2同源短臂的克隆

将短臂PCR产物50μl经琼脂糖凝胶电泳后，对特异性目的DNA条带进行切胶回收(用天根公司的DNA快速回收/纯化试剂盒回收，方法参见说明书)。回收产物与

载体4℃下连接过夜，构建重组质粒pGEM-Sarm。连接产物转入按常规方法制备的新鲜感受态DH5α大肠杆菌中。

2.3阳性克隆的筛选和序列测定

将转化的受体菌涂布于含氨苄青霉素(Amp)、X-gal和IPTG的LB固体平板上，37℃培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h。用碱裂解法小提质粒，限制性内切酶鉴定、PCR鉴定均为阳性的重组克隆菌进行核酸序列测定。

实施例3同源长臂的PCR扩增

由于同源长臂片段较长，难于克隆，故本实验通过在长臂酶切位点前加保护性碱基的方法来绕过克隆的过程。

3.1同源长臂的PCR扩增

以猪基因组DNA为模板，用引物P1、P2进行长片段PCR反应：DNA模板1μl(50～100ng)，10×PCR Buffer 2.5μl，dNTPs(25mM)2μl，引物(10pM)各1μl，加ddH₂O到25μl。反应条件：94℃预变性5min，加入LA Taq酶1μl，94℃变性2min，64℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸20min。取PCR产物5μl进行0.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

3.2同源长臂的PCR产物的酶切

将50μl的PCR产物纯化(用TaKaRa公司的PCR产物纯化试剂盒纯化，方法参见说明书)，之后直接进行酶切，1％琼脂糖凝胶电泳后，对特异性目的DNA条带进行切胶回收(方法同前)。即可用于下一步实验需要。

3.3同源长短臂序列测定及分析

同源短臂将重组质粒pGEM-Sarm按ABI BigDye Terminator Kit操作说明进行测序；同源长臂用PCR产物直接测序。利用生物信息学软件WDNASIS v2.5对DNA序列测定结果与所设计的DNA序列进行同源性分析。测序完全正确的用于片段的连接试验。

实施例4pSSC-Larm-Sarm载体的构建

将重组质粒pGEM-Sarm及pSSC-9载体分别用BamHI和HindIII消化后，回收各目的片段，用T4 DNA ligase连接，构建出质粒pSSC-Sarm。经PCR和BamHI+HindIII酶切双鉴定后的阳性菌进行培养，提大量质粒，用SalI和XhoI双酶切回收约8.9kb的片段，与经实施例3中3.2处理的片段连接，构建出质粒pSSC-Larm-Sarm，即构建出猪肌生成抑制素基因敲除载体，构建过程如图1所示。采用天根公司的大提质粒试剂盒大提质粒之后，用SfiI单酶切线性化，用于细胞转染。

实施例5细胞的转染与筛选

本发明采用FuGENE HD介导DNA的猪胎儿成纤维细胞的转染，操作步骤按FuGENEHD说明书进行。转染前一天将原代培养的胚胎成纤维细胞用无抗生素的培养液复苏至100mm平皿中，当细胞达到80％～90％融合时即可进行细胞转染。转染24小时后，细胞经胰酶消化1∶26传代。转染48小时后，加入G418选择培养基(浓度为300μg/ml)。待有细胞单个克隆集落出现时，去掉培养液，用39℃的PBS洗2遍，将自制的玻璃细胞克隆环套在细胞集落上，加适量的胰酶于克隆环内，消化约1分钟后，加入筛选培养基终止反应。用移液器小心吹打细胞后转入24孔板扩大培养，待长满以后，转入6孔细胞培养板中扩大培养。待细胞长满以后，一部分细胞用于细胞鉴定，一部分细胞冻存。

实施例6细胞水平的鉴定-PCR

表2PCR引物设计

引物名称    引物序列

sp1         5’-CTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCAT-3’

sp7         5’-GTTGGCTACCCGTGATATTGCTG-3’

sp2         5’-CCATGTCCCTGTGGCTTAGTAGAAC-3’

sp8         5’-CCAAACTCGGATAAATGTGCCTGT-3’

spn1        5’-ACATCGCATCGAGCGAGCACGTACT-3’

spn2        5’-ATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGT-3’

spn3        5’-ACCATTAGCATATGGAGTTTTAAGACCACT-3’

spn4        5’-ACAGGAGTCTCACTCTAGTAGCAGACT-3’

反应条件如下表

1、将细胞裂解液作为初始模板进行第一轮PCR

表3第一轮PCR反应体系

Cell lysis    2ul      Cell lysis    2ul

Sp1           0.3ul    Spn1          0.3ul

Sp8           0.3ul    Spn4          0.3ul

Ex taq        0.5ul    Ex taq        0.5ul

dNTP(2.5mM)   1.6ul    dNTP(2.5mM)   1.6ul

10*buffer     2ul      10*buffer     2ul

ddH₂O         13.3ul   ddH₂O         13.3ul

94℃    5min              94℃    5min

(94℃   30s               (94℃   30s

51℃    30s               55℃    30s

72℃    2min30s)          72℃    2min30s)

35个cycles                35个cycles

12℃    forever           12℃    forever

2、将上一步PCR产物分别进行10倍和100倍稀释作为本轮PCR的模板，标号为1*10，1*100，1’*10，1’*100等。

PCR体系及条件如下：

表4第二轮PCR反应体系

1*10/1*100    0.2/0.5ul    1′*10/1′*100    0.2/0.5ul

Sp2           0.3ul        Spn2              0.3ul

Sp7           0.3ul        Spn3              0.3ul

Ex taq        0.3ul        Ex taq            0.3ul

dNTP(2.5mM)   1.6ul        dNTP(2.5mM)       1.6ul

10*buffer     2ul          10*buffer         2ul

ddH₂O         15.3/15ul    ddH₂O             15.3/15ul

94℃    5min               94℃    5min

(94℃   30s                (94℃   30s

52℃    30s                58℃    30s

72℃    2min30s)           72℃    1min50s)

35个cycles                 35个cycles

12℃    forever            12℃    forever

将PCR产物用胶回收试剂盒回收以后，连接到PMD-18T simple上，通过转化实验，获得重组菌后，送北京天根公司测序。待序列测序完毕在NCBI上，与猪的基因组和所构建的载体序列进行比较分析。

实施例7通过体细胞核移植获得转基因猪

步骤分为

1、猪卵母细胞的采集和成熟培养及去核操作

从屠宰场收集猪的卵巢，置于25-37℃含有双抗生理盐水的保温瓶中，在2小时内返回实验室。用37℃含双抗的生理盐水洗涤数次，将卵巢置于37℃水浴锅中。用带有18号针头的20ml注射器抽吸卵巢上2-8mm的卵泡，在实体显微镜下用捡卵针挑选出细胞质均匀，并包裹有两层以上致密卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，在成熟培养基中成熟以后，采用盲吸的方法去除卵丘细胞，准备核移植。

2、供体细胞的制备

将所构建的条件性表达绿色荧光蛋白的猪胚胎成纤维细胞从液氮罐中取出，迅速进行复苏。复苏后的细胞完全汇合后用于核移植操作。在进行核移植操作前，将供体细胞从培养箱中取出，进行消化吹打制成细胞悬液。将细胞悬液分装到1.5ml的离心管中，用含10％血清的TL-HEPES洗一遍，然后250g离心10分钟，重选在0.5ml的DPBS中，备用。放入4℃冰箱内备用。进行核移植操作前20min将细胞从冰箱中取出放入38.5℃培养箱中温热。用时用移液枪吸取离心管底部10ul的细胞悬液加入已经做好的操作滴内，覆盖上石蜡油。

3、卵母细胞的注核操作

在显微操作台上的培养皿中的中间的滴内放去核的卵母细胞，每次放10-15个，另外几个放入供体细胞。首先用内径为10-15μm的注核针吸取小而圆的供体细胞，然后移动操作台使卵母细胞处在视野下面，用固定针固定卵母细胞，用注核针拨动卵母细胞，找到去核时在透明带留下的针口，将注射针插入到透明带下，将供体细胞注入卵母细胞的卵周隙内，构成一个卵-供体细胞复合体，而后缓慢抽出注核针，并对透明带进行整理，使体细胞与卵母细胞膜相互接触，便于随后重组胚的融合。

4、融合

将操作完毕的重构复合体移入融合液，洗涤三次，然后移入融合槽中，使去核卵母细胞和供体细胞的接触面与电流方向垂直，然后进行电击。激活后的复合体迅速移入NCSU-23培养液中洗涤3-5次。然后放置入培养箱中，38.5℃，5％CO2，100％湿度培养箱中培养。

5、激活和胚胎培养

卵-供体细胞复合体在15μM calcium ionomycin(Calbiochem，San Diego，CA)中孵育20分钟，然后放入含1.9mM 6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)的CR2培养基中孵育3-4小时，然后在含有TL-HEPES的35mm的培养皿中洗一遍之后，在含有放置含有3mg/ml BSA的CR2的培养基中孵育48小时，孵育过后，转移到含0.4％BSA的NCSU23的培养集中继续孵育24小时，之后培养，采用含10％的NCSU23的培养基培养。

6、胚胎移植

选择发情合适的母猪，进行麻醉以后。用清水清洗手术部位及四周，消毒后盖上创巾布并暴露手术部位，用手探入腹腔，寻找到子宫和卵巢，固定输卵管，将装有胚胎的外径为2～3mm的玻璃管慢慢从输卵管口插入，经过1～2个弯曲之后小心将胚胎吹入输卵管内，并慢慢撤出玻璃管，我们在移植过程中只对一侧输卵管进行胚胎移植。将输卵管伞重新包住卵巢，回复子宫和输卵管到腹腔，并撒入抗生素抗菌消炎。常规缝合腹腔，术后将受体母猪单独隔离，连续4天使用抗生素消炎。每天仔细观察记录受体猪的生理情况，做好发情观察。

实施例8克隆猪的鉴定-PCR鉴定

提取脐带的基因组，将脐带剪下以后，用含双抗的PBS清洗数遍，洗去血污及赃物。然后利用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)目录号：DP304提取基因组。所提取的基因组用于PCR反应，以非转基因猪的基因组和水为阴性对照。

Application Project

 

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<120>Title：肌生成抑制素(MSTN)基因敲除猪的建立

 

<130>AppFileReference：案卷参考号

 

<160>1

 

<210>1

 

Sequence

 

--------

 

<213>OrganismName：人造序列

 

<400>PreSequenceString：1

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ggggtgcaaa cctagcacag aattgggaaa cagaaaaatg ggcacccttt attatggtgc    1260

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attttaattc aggtcttcct aatttaaatc tgtatttctc tgattacaca ggactaaaaa    1740

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tgaatatttc caggcaggca catgcttaat aagctctaca atattatttt ctttttcata    3480

ggagggagaa agaactatta cctgtagtat ccacattgct tatgaaggac aatatatttc    3540

ataccattcc tattacaatc agttcaaaag tatacacaag gaaagggaga caggcacctt    3600

aacagagaag gcatgacaag aaagattttt gtgccatgtg tctgtgattt tgctttatac    3660

agtgctttac ccactttaaa ctagactcaa aacagtttca aaatattatt cttcttatta    3720

agtaattagg ctataatgca acaaataatt tttcttgaaa actatgctat cagataatcc    3780

tagagtagat ttgccttatt tataaacaat cttggaaaac caaaaggaaa gctgtttcta    3840

aatgcttctg cttacaatga cagcatggcc ttaacaatgt tttctaagtt ttgagatagc    3900

ctgaatgcaa catttaaatt ctggtgctaa gtgccttcta gtttggttcc tttaaaaaag    3960

ctatcccagg ccaaaacata acagatgtac tatattttct actaattccc gaggctcagt    4020

tagttgctca gtgtgtctcg tccccaggta attcaggcct gggggaaggg ttccttcttc    4080

cagactgatt ggtacagctg ctcagtaagt gtaactactc agattcccaa agaattctaa    4140

gtggatgttc ctccacagtg tctcttgttc tctctaatca tcatcatttt aaaatttcat    4200

ccactcttca ttcctttaca gaattttctt tagtctacag ttttctagaa aggaagtagg    4260

tttctcataa acagctgaaa aaacatattg aaaaaaatct gaaaagctat agtaattatt    4320

tcatttgata tttttctgaa ttatgaatga aattctacag tttttcattt taaaagacta    4380

aatatgcatg cactattcca atagaaaaaa agctcactga ttaatatgaa ggagtttgtt    4440

catttttcat gaaacaattt caataactct tttctttttt tactcatttt tagctgatct    4500

tctaatgcaa gtggaaggaa aacccaaatg ctgcttcttt aaatttagct ctaaaataca    4560

atacaataaa gtagtaaagg cccaactgtg gatatatctg agacccgtca agactcctac    4620

aacagtgttt gtgcaaatcc tgagactcat caaacccatg aaagacggta caaggtatac    4680

tggaatccga tctctgaaac ttgacatgaa cccaggcact ggtatttggc agagcattga    4740

tgtgaagaca gtgttgcaaa attggctcaa acaacctgaa tccaacttag gcattgaaat    4800

caaagcttta gatgagaatg gtcatgatct tgctgtaacc ttcccaggac caggagaaga    4860

tgggctggta agagtttact gaaaataaca ctcttaaaat cttgttatgt ttttattcat    4920

aatgtgaatg agtagtagtg gaaaataact accagtttcc taagctagac aaaagtatct    4980

taccccaatg gtagccctgt acccaataaa agtaggtgtt cagtttcata tcctatgaaa    5040

taccctcttg atacttttac tttgcatgag gatttagaag aaaaaagttt tactataatc    5100

cttaacttag gaaattcttt tgaattggaa atgaaacaca aattgctttt cattgatatg    5160

ccatatgatt atatgaataa aacatgaaat cttcatattg gattctagta tatacccaag    5220

taaatatttt ttccctagaa gagtgccaag tgtgttaaaa ccttttggtt taataaagca    5280

gaaaaaaata aactctaaaa atcataatta aaaatgaaat gcttttattt atagcaatta    5340

actacaacat gtttagactt acatactatt aaatataata tatttaagat cccctcatga    5400

taaatatgtt cattattttg taggctgttg atgcactaat atgtatgtag attactttgt    5460

gaattgccct taataaaatt taaaacttta ggctagtaaa cctgtaacac tcaacttagt    5520

tctgaactat ctcactattc ttttgcaaga atttacttag gtaatgccaa ctaatttatt    5580

ccaaggccaa aaagatgaca atgtcttata tattataaaa actaataaaa accattttaa    5640

aacctagtat aaatttaaag gtacttgctc ttctggttca tctcttcttt tgtttacttc    5700

tgctttcaaa aacttattta ttgtgaccat attctttact tccatttatt gttataattt    5760

ataagatact atacttgcaa gcaataaatg ttatcttttt agcttttaaa tggtctcatt    5820

tgaaaagaat atataattag taagtcatag ctactttaaa taaaaactta ttctttaaga    5880

gattaaacac ttctccaagt gatctgtttt tctttaatta aaacgttatt aactcccaaa    5940

atgatgttat tgttttttta taatcttaaa taccaataat taccaggtct attttgattt    6000

tgatacagga taaaaactac tattaattac ttaagaatgt gttctttttt atatgtacca    6060

ttttcatgat caaagttggt gatatgactg aggttttgat tattattaaa cagatagtta    6120

atatgatata ttcctcattt ttccaaatga aaggaaaaat gtcttatatg gaggaaaaga    6180

ttggggcagg gggattagta aattattact taaatatctg aataggagga tttttcaatg    6240

aaaggataaa ggaagaatga ttgtatcatc tgaatctttc cctccctttc ctggagtttg    6300

tcctttcaac ccagtatacc taccactccc ttcatcacct actttcccat tacagtccct    6360

atgtgttggg tggtaactat tttgttttgg tgttaatatc caagtttccc ttaataacac    6420

ctagtgaatg gaggaaggat gagcatacct acccatcaga catatttagc caggtcgacg    6480

ccggccaaga cagcacagac agattgacct attggggtgt ttcgcgagtg tgagagggaa    6540

gcgccgcggc ctgtatttct agacctgccc ttcgcctggt tcgtggcgcc ttgtgacccc    6600

gggcccctgc cgcctgcaag tcggaaattg cgctgtgctc ctgtgctacg gcctgtggct    6660

ggactgcctg ctgctgccca actggctggc aagatctgat caagagacag gatgaggatc    6720

gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag    6780

gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg    6840

gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa    6900

tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc    6960

agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc    7020

ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga    7080

tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa    7140

acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct    7200

ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat    7260

gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt    7320

ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta    7380

tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga    7440

ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg    7500

ccttcttgac gagttcttct gaaagatata aggccaatta ctgctctgga gagtgtgaat    7560

ttgtattttt acaaaaatac cctcacactc atcttgtgca ccaagcaaac cccagaggtt    7620

cagcaggccc ctgctgtact cccacaaaga tgtctccaat caatatgcta tattttaatg    7680

gcaaagaaca aataatatat gggaaaattc cagccatggt agtagatcgc tgtgggtgct    7740

catgagattt atatttggtt cattacttcc taaaacatgg aaggtttttc ccctcaataa    7800

ttttgaaact gtaaattatg taccacaggc tacatgcctg gagtatgcta cagtcactta    7860

agcacaagcg acagtatatg aactaaaaga gagaatatat gcaatggttg gcatttaacc    7920

atcaaaacaa atcatacaat aaaaagtttt tatgatttcc agagtttttg aacgaggaga    7980

tcaaattcca tttatgttca tatatattac aacatatgca ggtaaatgaa agcaattctc    8040

cttgtgttct ggtgaattaa aggagtatgc tttaaagtct atttctttac aattttacta    8100

atatttacag aaaaatctat atgtagtatt gataagatgt aggattgtta tataccatta    8160

tttgagtcat ccttaaacac ttgaattata ttgtatgata gcatacttgg taagagaaga    8220

ttccacaaaa atagggatgg tacaaccata tgcaagttcc cattcctatt ctgattgata    8280

cagtacattg acaattcatg ccaatggtgc taattcaata ggctgaatgg ctggtgttat    8340

caggtttatc aaataaaagc attcagtaaa gttagtaagt ttctcttttc ttcaggggca    8400

ttttcctaca cctccaaatg aggaatggat tttctttaat gtaagaagaa tcatttttct    8460

agaggttggc tttcaattct gtagcatact tggagaaact gcattatctt aaaaggcagt    8520

caaatggtgt ttgtttttat caaaatttca aaattatagc ctgcctttgc aacactgcag    8580

tttttatgat aaaatcatgg caatgactga ttctatcaat attgtataaa aagactttga    8640

aacaattgca tttatataat atgtaaacaa tattgttttg taaataaatg tctccttttt    8700

tatttacttt ggtatatttt tatgtaagga tatttcaaat taagtattaa ggcacaaata    8760

catgtcatgt gacagaaaag caaatgctta tatttcggag caaattagct gattaaatag    8820

tggtcttaaa actccatatg ctaatggtta gatggttata ttacaatcat tttatatttt    8880

tttacattat taacattcac tatggattca tgatggctgt ataatgtgaa tgtgaaattt    8940

caatggttta ctgtcaatgt attcaaatct caacgttcca ttattttaat acttataagt    9000

aagcatacca aaatgattta actcaattat ctgaaatcag aataataaac tgatgatatc    9060

ttaagaattg ttaatttaat tttataattc gataatgaat atatttctcc atatatttac    9120

ttctattttg taaattagga ttttgttaat caaatacatt gtacttatga ctaagtgaaa    9180

ttatttctta catctaatgt gtagaaacaa tataaattat attaaagtgt tttcaccttt    9240

tttgaaagac acaacagttt tatgttataa tgattaattc tgaatttttg gttttcattt    9300

tattataaca gtttaatgat ttagcattga agtttggttt caaaatttta agtctgctac    9360

tagagtgaga ctcctgttta attggttctg gttaggttgc tttaaacata caaaagcaaa    9420

gactagttac atctgtttca tttctcttta tcttgacctg aaaactattt atatgttttc    9480

ataggttcaa tttccaaatg cattgcagtt ggcaagggta tatggtccta gagttacaag    9540

ttctactaag ccacagggac atggggaaac cacatctttt ttctagcact taatgataca    9600

ggcacattta tccgagtttg ggggcaccaa ttttcaaatt gaattgaaaa atgattacaa    9660

agtgcctaga aatactttaa gtgcaacact gtatataaat gtcttcaaaa tgagctctgt    9720

tctctacccc cccatccgtt tagtaaatta gctctaaagc agtgactcaa tctaatagag    9780

gaggtaatta aaattctatc tagtgttatg gttattaaat aaataattta taattattat    9840

aaatataatt tttaaccatg aatggtatta tgctagttta cactcataca aagtgttgta    9900

cttctaattt taatatgtgt ttaatactga caatgctgga gctgt                    9945

 

<212>Type：DNA

 

<211>Length：9945

 

SequenceName：MSTN基因打靶载体序列

Claims (3)

1.肌生成抑制素MSTN基因敲除猪的建立，MSTN基因敲除载体是猪MSTN的同源序列，作为同源重组序列，其特征在于具体制备方法如下：

(1)、基因打靶载体的构建

以猪基因组DNA为模板，用引物P1：5′-TAGCATCCGTCGACTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAG-3′、P2：5′-CATAGCCGCTCGAGTGGTGGCTAAATATGTCTGATGGG-3′、P3：5′-GGATCCCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGCTC-3′、P4：5′-AAGCTTACAGCCATCATGAATCCATAAGTGAATG-3′，PCR扩增1.4kb和7.5kb片段；分别连接至pGEM-T载体；然后用BamH I和Hind I双酶切重组质粒pGEM-Sarm和通用基因敲除载体pSSC-9载体质粒，琼脂糖凝胶电泳后，分别回收1.4kb目的片段和7.5kb的载体片段；用T4DNA连接酶连接目的片段和载体片段，得到中间重组质粒pSSC-Sarm；再用Sal I和Xho I分别酶切pSSC-Sarm重组质粒和纯化的同源长臂PCR产物，琼脂糖凝胶电泳后，回收8.9kb载体片段和4.3kb的目的片段，T4 DNA连接酶连接目的片段和载体片段，转化大肠杆菌HB101宿主菌，随机挑选单菌落，经长臂PCR鉴定初步筛选阳性克隆菌，为确保长臂插入pSSC-Sarm载体中，利用长臂内部扩增引物进行PCR反应，同时对该质粒上的短臂也进行PCR反应，均表现出阳性，表明成功构建猪肌生成抑制素基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm。

(2)、MSTN基因敲除猪胎儿成纤维细胞的构建

将构建MSTN基因敲除的载体线性化后，利用FuGENE HD转染长白猪胎儿成纤维细胞，用G418筛选7～9天后，获得抗性细胞；对所获的细胞在基因水平、转录水平和翻译水平进行鉴定，获得了MSTN基因敲除的猪的成纤维细胞；

(3)、利用体细胞核移植技术构建MSTN基因敲除猪

采用体细胞核移植技术，以长白猪母猪做代孕母猪，构建MSTN基因敲除猪，产生转基因猪为白色。

(4)、对MSTN基因敲除猪用PCR方法通过鉴定引物sp1、sp7、sp2、sp8、spn1、spn2、spn3、spn4进行鉴定；

引物名      引物序列

称

sp1         5’-CTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCAT-3’

sp7         5’-GTTGGCTACCCGTGATATTGCTG-3’

sp2         5’-CCATGTCCCTGTGGCTTAGTAGAAC-3’

sp8         5’-CCAAACTCGGATAAATGTGCCTGT-3’

spn1        5’-ACATCGCATCGAGCGAGCACGTACT-3’

spn2        5’-ATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGT-3’

spn3        5’-ACCATTAGCATATGGAGTTTTAAGACCACT-3’

spn4        5’-ACAGGAGTCTCACTCTAGTAGCAGACT-3’

2.一种肌生成抑制素MSTN基因敲除猪的基因打靶载体序列SEQ ID NO.1。

3.根据权利要求2所述的基因打靶载体序列，其特征在于所述的基因打靶序列中用5％-100％序列进行同源重组制备肌生成抑制素基因敲除猪。

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