CN102260711A - 利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因(Myostatin)的方法，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入牛的成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞。利用ZFNs介导的基因敲除，可以实现一次转染，得到双等位基因敲除的细胞克隆，这在常规基因打靶过程中是难以实现的，省去了药物筛选过程，有利于细胞单克隆的形成，避免了细胞需要对抗药物毒害的过程，对于后续的体细胞核移植和胚胎的发育质量起到了关键作用，同时不含有抗性基因，大大简化了生物安全评价过程。

Description

利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法。

背景技术

基因打靶技术是一种定向改变生物体遗传信息的技术，常规基因打靶动物生产的两大限制因素为：第一，动物体细胞基因打靶效率很低，10^-6～10^-7；第二，生产双等位基因敲除的动物时间周期长，克隆效率低。伴随着分子生物学的不断发展，涌现出很多新的技术和方法来提高基因打靶效率，如采用无启动子筛选的基因打靶策略，动物中干细胞的分离及诱导等。但是这些改进对于生产基因打靶动物并没有显著的推动作用，所以基因打靶动物的生产一直处于缓慢发展阶段。最近几年，锌指蛋白核酸酶(ZFNs)的出现极大地提高了基因打靶的效率，其将成为生产基因敲除动物的一个重要的突破口。

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)是转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)超家族成员，是一种作为肌肉生长负调控因子的分泌型蛋白。在胚胎发育过程中，myostatin在生肌节细胞和发育的骨骼肌中表达，调控形成肌纤维的最后数量。在成年动物体内，myostatin主要在骨骼肌中特异表达，并控制肌纤维的生长。myostatin的基因敲除和自然纯合突变在小鼠、牛、狗和人类均表现出骨骼肌的显著增加。

myostatin以一种前体蛋白的形式被合成，经历一系列蛋白水解过程产生具有生物活性的分子，或者称其为成熟区域。第一次水解去除了由24个氨基酸组成的信号肽，这个信号肽对于蛋白进入分泌旁路是必需的。接着，在位于第240-243位氨基酸的RSRR(精氨酸-丝氨酸-精氨酸-精氨酸)位点发生第二次水解，产生一个分子量27，680道尔顿的N-端片段(被称作前肽)以及12，400道尔顿大小的C-端片段。根据对其它TGF-β成员的了解，前肽对于C-端区域正确折叠成为半胱氨酸结结构具有重要的作用。而C-端片断是具有生物活性的部分。它通过二硫键连接形成C-端片段二聚体，并且折叠为半胱氨酸结结构，继而发挥作用。

肌肉生长抑制素基因人工敲除的小鼠(McPherron AC等，1997，nature.387：83-90)，表现出骨骼肌显著、广泛的增加，包括胸部、前肢、后肢以及整个身体被层，单个肌肉重量约为野生型小鼠的二倍。所有被检的骨骼肌都受到了基因突变的影响而发生了增加，并且雄性和雌性增加与其体型和体重按一定比例。对纯合突变小鼠肌肉制备的切片观察分析则表明这些小鼠既有肌纤维数量的增多，又有肌纤维的肥大，肌肉量的增加是肌纤维数量以及肌纤维大小增加的双重结果。

myostatin的生物学功能提示我们，对myostatin的敲除可以成为农业生产中一种增加肌肉的有效策略。通过基因打靶技术，将该基因失活，是研究其功能和和验证其生产应用价值一个理想的手段。

锌指蛋白核酸酶(ZFNs)融合了DNA调控元件特异性的结合DNA的特性以及内切核酸酶的催化活性，N末端的锌指蛋白能够特异的结合DNA序列，通过C末端内切核酸酶FokI的催化作用，使得DNA双链分子产生断裂(DSB)，紧接着DSB就会启动细胞内自身修复机制。目前主要的修复机制有两种：一种是非同源重组的末端连接修复机制，另一种是同源重组修复机制。前一种修复机制是一种易错修复常常会产生遗传信息的改变，而利用同源重组修复机制来修复DSB是一种高保真的修复方式，一般以另一条姐妹染色体为模板进行精确修复。在哺乳动物细胞内，前一种修复机制占主导作用，借助ZFNs特异性产生DSB，引发细胞非同源重组的末端连接修复，在DSB位点引入小片段删除，或者插入，造成移码突变，或者蛋白关键序列的缺失达到基因敲除目的(图1)。

应用ZFNs介导基因敲除或者修饰在斑马鱼，拟南芥等模式生物中已经成功实现，并且效率较高10～50％(Doyon，Y.等，Nat.Biotech.2008，26：702-708；Lloyd，A.等，PNAS 2005，102：2232-2237)。本发明证实了利用ZFNs在动物体细胞内进行基因的删除或者精细修饰是一种行之有效的方法，能够成功获得基因敲除克隆牛。

常规基因打靶克隆牛的生产流程，包括构建基因打靶载体，载体转染，细胞药物筛选，细胞单克隆的鉴定，体细胞核移植，克隆牛的鉴定。如果需要对第二个等位基因也进行敲除，需要经历上述同样的过程，即需要进行两次细胞克隆，并且最后得到的克隆牛含有药物筛选时所必须的抗性基因，最后要得到不含有抗性基因的动物个体还要经历一次体细胞克隆。以牛为例完成上述过程需要的时间为：载体构建3个月，细胞筛选1个月，体细胞核移植、胚胎发育1个月，胚胎移植妊娠到小牛出生10个月。这样，一次克隆至少需要14个月的时间。并且在细胞筛选过程中，有些甚至无法得到阳性单细胞克隆。如果实现无抗性基因的基因敲除牛需要进行三次克隆，则所需时间就至少需要42个月，周期长、风险高。而研究证明，利用ZFNs技术，可以在12个月内得到双等位基因完全敲除并且不含有抗性基因的克隆牛。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入牛的成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞，其中，设计特异的锌指结合蛋白酶ZFNs，其作用的DNA序列为：

ZFNs-Set1：GTCATTACCATGCCCACGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGGT。

前述的方法，包括如下步骤：

1)构建MSTN-ZFN-Set 1真核表达载体。ZFNs以二聚体(异型)形式发挥作用(图1)，故每一个作用位点需要两个锌指蛋白核酸酶表达元件；二聚体(异型)在锌指蛋白结合位点的锌指蛋白不同，即结合的DNA序列不同，在FokI酶切结构域有共同的DNA切割域。以MSTN-ZFN-Set 1为例，MSTN-ZFN-Set 1-pZFN1和pZFN2两个锌指蛋白核酸酶需要同时表达才能一起发挥敲除MSTN基因的功能，因此在构建载体时可分别构建MSTN-ZFN-Set1-pZFN1和MSTN-ZFN-Set1-pZFN2的真核表达载体，将两个载体同时转染到细胞中实现两个锌指酶同时表达。

以下为表达载体的构建原理：MSTN-ZFN-Set1-pZFN1和MSTN-ZFN-Set1-pZFN2表达载体，碱基序列(编码区)分别如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。锌指蛋白核酸酶编码部分，由两部分组成：结合特异染色体序列的锌指蛋白结合域；非限制性内切核酸酶Fok I切割域。锌指蛋白结合域的设计和构建可参考美国No.6,453,242和6,534,261。本发明ZFNs设计含有5个锌指蛋白单体，可特异结合15个碱基对。锌指蛋白的作用机理可参考miller等(1985)EMBO J.4：1609；Rhodes(1993)Scientific American Feb.：56-65。非限制性内切核酸酶FokI切割域，由IIS型Fok I内切核酸酶构成，其作用方式和机理可参考Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.UAS 89：4375-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.UAS 90：2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.UAS 91：883-887；结合域和切割域两部分构成融合表达蛋白，通过酶切连接的方法连接到表达载体上。

2)将上述表达载体分别转入牛的成纤维细胞中，PCR检测肌肉抑制素基因发生敲除的细胞。其中，PCR检测使用的引物为F：5’-GAATGAGAACAGCGAGCAG-3’和R：5’-ATAGGCTTCAACCTCTACAGA-3’。

本发明还提供通过上述方法获得的基因敲除细胞。

本发明还提供利用锌指核酸酶生产肌肉抑制素基因敲除克隆牛的方法。

本发明还提供一种制备肌肉抑制素基因敲除的牛克隆胚胎的方法，其以前述的基因敲除细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得牛克隆胚胎。

本发明进一步提供一种制备转基因牛的方法，其是将前述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入牛子宫内进行妊娠，获得转基因牛。

本发明首次利用锌指核酸酶(ZFNs)成功敲除牛成纤维细胞中的肌肉抑制素基因，由此获得基因敲除克隆牛，与常规的通过基因打靶技术获得克隆牛相比，利用ZFNs介导的基因敲除，在单细胞克隆中的敲除效率在14％～20％之间，而常规的基因打靶效率仅为10^-6～10^-7，效率提高了10⁴～10⁵，为生产基因敲除动物提供了极大的便利。

另外，利用ZFNs介导的基因敲除，可以实现一次转染，得到双等位基因敲除的细胞克隆，这在常规基因打靶过程中是难以实现的，省去了药物筛选过程，有利于细胞单克隆的形成，避免了细胞需要对抗药物毒害的过程，对于后续的体细胞核移植和胚胎的发育质量起到了关键作用，同时不含有抗性基因，大大简化了生物安全评价过程。

附图说明

图1为ZNFs介导肌肉抑制素基因基因敲除示意图。

图2为MSTN-ZFN-Set1-pZFN1/pZFN2表达载体结构示意图。

图3为ZFNs介导肌肉抑制素基因基因敲除突变类型，其中WT为野生型对照，…为缺失碱基，括号数字代表缺失或者插入碱基个数，上角标为该突变类型重复出现次数。

图4为发生基因敲除单细胞克隆测序结果峰图，其中在作用位点附近出现双峰(下划线部分)表明发生基因敲除，否则为野生型序列。

图5为基因敲除牛测序结果。

图6为ZFNs-Set 1作用位点在不同物种之间的同源性比较，其中框内为ZFNs切割位点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中ZFNs设计由Sigma公司完成，引物合成由上海生工完成，序列测定由北京华大完成。Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均来自大连TaKaRa公司，体外转录试剂盒、mRNA纯化试剂盒均购自Applied Biosystems公司，体细胞克隆所用试剂均购自Sigma公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

实施例1ZFN表达载体的筛选及敲除效率

1、ZFN表达载体构建

MSTN(NC 007300.4)基因序列信息从NCBI网站中获得，ZFNs设计由Sigma公司完成，设计ZFNs位点位于第1、3外显子上。MSTN-ZFNs-Set 1作用于第一外显子上，MSTN-ZFNs-Set 2和MSTN-ZFNs-Set 3作用于第三外显子上。它们作用的DNA序列分别为：

ZFNs-Set1：GTCATTACCATGCCCACGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGGT；

ZFNs-Set 2：CTCATCAAACCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGG；

ZFNs-Set 3：TTCCCAGAACCAGGAGAAGATGGACTGGTA

下划线部分分别为锌指蛋白结合序列，中间部分为FokI内切核酸酶切割位点。对应的三个ZFNs表达载体分别为：MSTN-ZFN-Set1-pZFN1/pZFN2，MSTN-ZFN-Set2-pZFN1/pZFN2和MSTN-ZFN-Set3-pZFN1/pZFN2。

ZFN表达载体构建过程：以MSTN-ZFN-Set 1为例，表达载体骨架为pAVX(Sigma)，该载体含有pUC oir启动该质粒在原核细胞中的复制，具有卡那霉素抗性基因；在多克隆位点上游含有一个广谱启动子CMV序列，能使克隆到该多克隆位点基因高效表达。利用体外化学合成的方法构建锌指蛋白表达元件(ZFP)，如SEQ ID NO：1(第110～642位为化学合成的锌指蛋白表达元件)和SEQ ID NO：2(第107～639位为化学合成的锌指蛋白表达元件)所示，合成的锌指蛋白表达元件两侧含有EcoRI和BamHI酶切位点，可以利用EcoRI和BamHI酶切位点将锌指蛋白表达元件(ZFP)克隆到载体pAVX的多克隆位点上。同样，利用BamHI和XhoI酶切位点将FokI内切核酸酶表达元件克隆到该载体上，这样将锌指蛋白DNA结合域以及FokI DNA切割域相互结合，构成了一个嵌合的限制性核酸内切酶。此外，在锌指蛋白DNA结合域的5’端含有核定位信号(NLS)可引导该下游表达蛋白进入核区，更好的在DNA水平上发挥作用。MSTN-ZFN-Set 1含有两个表达质粒MSTN-ZFN-Set1-pZFN1和MSTN-ZFN-Set1-pZFN2，其碱基序列(编码区)分别如SEQ ID NO：1(其中第110到第642位碱基为锌指蛋白表达元件)和SEQ ID NO：2(其中第107到第639位碱基为锌指蛋白表达元件)所示。两质粒在锌指蛋白表达元件(ZFP)序列上存在差异，在FokI内切核酸酶表达元件中含有同样序列信息(图2)。MSTN-ZFN-Set 2和MSTN-ZFN-Set 3表达质粒构建过程同MSTN-ZFN-Set 1。

2、ZFN的筛选

在牛的成纤维细胞系中检测三对表达载体是否能在对应的细胞基因组DNA序列发挥切割作用。在ZFNs位点两侧设计引物，set1-F：5’-GAATGAGAACAGCGAGCAG-3’；set1-R：5’-ATAGGCTTCAACCTCTACAGA-3’；set2/3-F：5’-TCCTTTCCAGAGAACTGTGGA-3’；set2/3-R：5’-AGGTGCCTTTGTCTGGCTTA’

电转(AMAXA公司)三对ZFNs的mRNA，电转参数为T-016，转染剂量为4μg mRNA每10⁶个细胞，电转24小时后提取总细胞基因组；进行细胞PCR产物回收纯化，纯化产物测序。如果ZFNs发挥切割作用，细胞会启动自身修复机制，在切割位点会出现小片段的删除或者插入，PCR产物测序结果峰图为杂合峰图，即该ZFNs可用于后续基因敲除。

以CEL-I酶为主要检测ZFNs是否发挥作用的依据，CEL-I检测需要突变类型占据一定比例，否则不能检出，本发明证实，当敲除效率为6％时(TA克隆统计测序结果)，CEL-I检测结果为阴性。

3、ZFN敲除效率

敲除效率的统计采用TA克隆测序的方式计算，电转24小时后提取总细胞基因组；进行细胞PCR产物回收纯化，T载体连接，测序，序列比对分析，突变类型与总有效测序总数(野生型与突变型克隆的总和)的比值则为敲除效率。在三对ZFNs中，第一对有较高的敲除效率(14％～20％)，测序得到多种敲除基因类型(图3)。第二对效率较低(0～6％)，第三对不发挥作用。

实施例2单细胞克隆的获得以及基因敲除克隆的鉴定

1、单细胞克隆的获得

利用AMAXA电转仪电转牛的成纤维细胞，选用优化电转参数T-016，基因转染效率可以达到90％以上。转染的遗传物质为mRNA，在细胞内的半衰期约为8小时，不会存在转DNA时随机插入细胞基因组的情况，对于动物的遗传稳定性有良好的保证。同时不会有抗性基因的随机整合，符合生物安全方面的要求。

具体操作方法：用Applied Biosystems公司试剂盒回收纯化体外转录的mRNA，DEPC水洗脱溶解，使其终浓度在500ng/μl左右。一对ZFNs对应的mRNA各2μg，总的mRNA量为4μg，转染细胞数量为1×10⁶，电转染后将细胞接种于T25细胞培养皿中，培养24小时后，细胞计数，按照每500个细胞/10cm皿密度将细胞接种于10cm培养皿中，补充含有15％FBS的DMEM培养基10毫升，在含有5％CO₂的37℃细胞培养箱中培养6-7天后，瓶皿表面会形成分散的单细胞克隆，在显微镜下挑选细胞分裂相多、细胞轮廓清晰、细胞之间紧密、光泽度好的单细胞克隆，扩繁到48孔板培养，培养条件不变。3-4天后细胞铺满整个孔，消化细胞，取出1/10的细胞进行细胞PCR，用于鉴定细胞单克隆是否发生基因敲除；剩余细胞接种于6孔板，用于后续阳性克隆的细胞冻存。

2、基因敲除单细胞克隆的鉴定

单细胞克隆分子的鉴定采用测序技术，能够准确判定基因的DNA序列。具体的操作方法：单细胞克隆在48孔板铺满孔后，消化细胞，取出1/10的细胞进行细胞PCR，PCR产物回收纯化，分成两部分检测，一部分直接进行PCR产物测序工作。若该克隆发生了基因敲除，则PCR产物测序峰图呈现在切割位点后双峰的结果，如图4所示。针对含有特异双峰结果的细胞克隆，将另一部分PCR产物进行TA克隆，精确定位基因敲除位点以及详细的序列信息。

常规ZFNs介导基因敲除的分子检测为CEL-I检测，本发明证实，通过测序方法得到的结果更加直接，容易操作，并且准确率可以达到100％。

实施例3基因敲除单细胞克隆的胚胎及克隆牛的制备

1、基因敲除牛的制备

具体过程包括：

(1)荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞培养

取40日龄荷斯坦奶牛胎儿耳组织，经原代培养、传代培养、冷冻等体外培养操作，建立牛胎儿成纤维细胞系。

(2)基因敲除单细胞克隆

基因敲除单细胞克隆的获得同实施例2。

(3)转基因克隆胚胎制备及胚胎移植

从屠宰厂收集成年牛的卵巢，取直径2～8毫米的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体，将卵丘-卵母细胞-复合体以50-60枚/孔放入含成熟液(M199+10％胎牛血清+0.01U/ml牛促卵泡激素+0.01U/ml牛促黄体生成激素+1μg/ml雌二醇)的四孔板，在38.5℃、5％CO2培养箱中成熟培养18～20h后，将成熟的卵母细胞放入含有0.1％透明质酸酶的管内振荡2～3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞作为体细胞核移植受体。

将带有第一极体的卵母细胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml细胞松驰素B的操作液中，在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口，然后用内径为20μm的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培养箱中备用。

将血清饥饿2～4d的供体细胞(及上述转有抗体双链基因及标记载体的转基因细胞)用0.25％胰蛋白酶消化2～4min，选择直径为10～12μm的体细胞用20μm直径玻璃管将其移入去核的卵母细胞透明带内，然后将其放入Zimmerman液(Brophy B等.2003.Nat Biotechnol21(2)：157-162.)中平衡3～5min后放入融合槽内，转动卵细胞使供体细胞与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5kV/cm，脉冲时间为10μs，脉冲次数为2次，脉冲间隔为1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入M199+10％FBS液中。将重构胚放入5μmol/L离子霉素液中，4min后移至1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CR1aa+5％FBS液中，在38.5℃，5％CO₂培养箱中培养2天。

将形态优良的第7天的克隆囊胚移入同期受体母牛的子宫角内。受体母牛选择的都是经产母牛，在移植后的第60天进行直肠检测，以确定妊娠率。

2、基因敲除牛的分子鉴定

基因敲除牛的分子鉴定具体操作过程为：取牛耳部组织黄豆粒大小，消化提取耳组织基因组DNA，实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。用上、下游检测引物F：5’-GAATGAGAACAGCGAGCAG-3’和R：5’-ATAGGCTTCAACCTCTACAGA-3’扩增MSTN基因目的序列。纯化回收PCR产物，进行TA克隆并对菌落单克隆测序分析。

结果表明，出生的4头牛犊均为双等位基因敲除的克隆牛，MSTN基因敲除类型与细胞水平的鉴定结果一致。

实施例4ZFNs敲除细胞off-targeting效应检测

ZFNs敲除细胞off-targeting效应，是指在ZFNs除了特异性很强的结合靶序列同时，也会作用于其他的相似序列，这样就会产生不想要的敲除类型，同时也可能影响个体的生长发育，对于试验结果可信度造成较大负面影响。靶位点选择过程当中已经排除大量off-targeting位点，在表1中，以set 1为例，除了在牛的全基因组内含有1个特异的靶位点之外，其相似序列相对较少，只有在含有9个碱基不同时才会出现，这样ZFNs的off-targeting效应在一定程度上被减小。

表1ZFNs作用位点以及相应的off-targeting位点

为了更好的检测ZFNs的off-targeting效应，本发明还比较了在不同物种之间MSTN基因序列的相似性，在牛和羊中我们发现ZFNs作用位点相似性很高(图6)，在羊的序列中，只含有3个碱基的差异，ZFNs作用位点相似性高达91.7％，猪和人中含有7个碱基的不同，因此，用相同条件检测ZFNs在这两种细胞中的作用情况，大量测序结果表明，在牛细胞中发挥作用的MSTN-ZFNs-Set 1在羊的细胞系中作用微弱(1.04％)在猪、人、鼠和兔子中均没有作用，间接证明了ZFNs作用的特异性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入牛的成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞，其特征在于，设计特异的锌指结合蛋白酶ZFNs，其作用的DNA序列为：

ZFNs-Set1：GTCATTACCATGCCCACGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGGT。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)构建MSTN-ZFN-Set1-pZFN1和MSTN-ZFN-Set1-pZFN2表达载体，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

2)将上述表达载体分别转入牛的成纤维细胞中，通过PCR产物测序检测肌肉抑制素基因发生敲除的细胞。

3.通过权利要求1或2所述的方法获得的基因敲除细胞。

4.权利要求1或2所述的方法在生产基因敲除克隆牛中的应用。

5.一种制备肌肉抑制素基因敲除的牛克隆胚胎的方法，其以权利要求3所述的基因敲除细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得牛克隆胚胎。

6.一种制备转基因牛的方法，其是将权利要求5所述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入牛子宫内进行妊娠，获得转基因牛。

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