CN101918557A - 遗传改变和产生无变应性猫的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种转基因猫，其具有特征为基本上没有猫主要变应原Fel d I的表型。通过用专用构建体中断靶基因的编码序列而在转基因猫中提供该表型。这种转基因猫的表型可传递给其子代。
Description
相关专利申请的引用
本申请要求享有2007年10月31日提交的美国申请No.11/979,151的优先权，其公开内容全部引入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及转基因动物的产生，其中所识别的编码已鉴定变应原的基因序列被失活。更具体地，本发明涉及转基因猫，其中编码猫主要变应原Fel d I的基因序列被中断(破坏或断裂，disrupt)。
背景技术
大约600万美国人对猫具有变应性(过敏，allergic)，并且尽管许多对猫具有变应性的人自己家中并不养猫，但接近三分之一的人家中养猫。已表明，在美国有28％的家庭养有至少一只猫(相当于至少5000万只猫)。对猫具有变应性的患者经常报告在进入有猫的房子后快速发作哮喘和鼻炎。测试时，几乎所有这些患者对猫毛皮屑提取物测试都表现为阳性立即超敏性皮肤并且具有针对猫变应原的血清IgE抗体。
迄今为止，对猫敏感性的大多数治疗集中于回避和免疫疗法。回避可能意味着显著改变人们的居住环境和日常起居。例如，为了避免过多暴露于户内变应原，建议：将地毯从地板上移走、床上覆盖专用的床单、定期清洁空调机、以及用昂贵的空气过滤器过滤空气。花费的时间、精力和金钱常常使得这种治疗对于变应性患者没有吸引力。
免疫化可能是一种有效的变应性治疗。但遗憾的是，定期变应注射(allergy shot)的花费、接受治疗涉及的时间、以及效力的可变性对于某些患者而言是相当大的阻碍。此外，存在这样的风险：患者可能对免疫化具有严重反应并且甚至可能发生过敏性休克。
发明内容
本发明涉及一种对于变应性的传统治疗的新型替代方案。并非建议回避或免疫治疗，本发明在其源头消除变应原。在猫的情况下，敏感性归属于猫的一种主要变应原(Fel d I)(Ohman，JACI，1977)。利用新开发的基因靶向技术，可“敲除”胚胎细胞，即，胚胎干(ES)细胞中的Fel d I基因。这些修饰的ES细胞随后可引入发育的卵裂球中。在正常胚胎发育过程中，ES细胞然后将被引入部分种系中(Capecchi，Science，June 1989)，(Robbins，Circulation Research，July 1993)。
本发明的一种实施方式涉及一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO.7中示出的序列的至少一部分。在另一种实施方式中，所述“一部分”包含SEQ ID NO.7中的至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约60个、至少约70个、至少约80个、至少约90个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约800个、至少约900个、或至少约1000个连续核苷酸。
本发明的另一种实施方式涉及一种同源重组载体，包含：(1)第一同源臂，(2)期望多核苷酸(所需多核苷酸，desired polynucleotide)，以及(3)第二同源臂，其中，期望多核苷酸位于第一和第二同源臂之间，并且其中，第一和第二同源臂中的每一个均包含SEQ ID NO.7中的至少约1kb序列。在另一种实施方式中，同源重组载体包含SEQ ID NO.7中的至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、或至少约50个连续氨基酸。
在一种实施方式中，第一同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸1至约核苷酸8,800之间的任意序列。在另一种实施方式中，第一同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸1至约核苷酸10,000之间的任意序列。在又一种实施方式中，第一同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸1至约核苷酸10,800之间的任意序列。在另一种实施方式中，第一同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸1至约核苷酸14,800之间的任意序列。在另一种实施方式中，所述“任意序列”包含SEQ ID NO.7中的至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约60个、至少约70个、至少约80个、至少约90个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约800个、至少约900个、或至少约1000个连续核苷酸。
在一种实施方式中，第二同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸16,000至核苷酸22,182之间的任意序列。在一种实施方式中，第二同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸14,700至核苷酸22,182之间的任意序列。在另一种实施方式中，第二同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸10,800至核苷酸22,182之间的任意序列。在另一种实施方式中，所述“任意序列”包含SEQ ID NO.7中的至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约60个、至少约70个、至少约80个、至少约90个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约800个、至少约900个、或至少约1000个连续核苷酸。
在一种实施方式中，任一个同源臂或两个同源臂包含SEQ ID NO.7序列，其具有选自由约1kb长、约2kb长、约3kb长、约4kb长、约5kb长、约6kb长、约7kb长、约8kb长、约9kb长、以及约10kb长组成的组中的长度。
在另一种实施方式中，期望多核苷酸是一种可选标记。
本发明的另一个方面是一种用于中断猫细胞基因组中的靶Fel d I序列的方法，包括将权利要求1的同源重组载体引入猫细胞中，其中：(a)载体中的同源臂起作用以与所述细胞基因组重组，且(b)期望多核苷酸在靶序列位点整合至细胞基因组中，从而中断该靶序列。
本发明的另一个方面是一种包含本文中所描述的任何期望多核苷酸的猫细胞。在一种实施方式中，期望多核苷酸被整合至猫细胞基因组中。在一种实施方式中，含有期望多核苷酸的猫细胞不表达Fel d I RNA或蛋白。在另一种实施方式中，已暴露于如本文中所描述的同源重组载体的猫细胞不产生Fel d I蛋白，或者产生失活的Fel d I蛋白。因此，在一种实施方式中，由不表达Fel d I蛋白的猫细胞产生的猫是不产生Fel d I变应原的猫。因此，本发明预期这样一种猫，其不产生Fel d I蛋白，因为该猫的细胞已根据本发明进行处理从而使Fel d I蛋白的表达减少或不表达。因此，与含有未经受本文中所描述的同源重组载体(作用)的细胞的猫相比，所产生的猫具有不同的Fel d I蛋白表达表型。因此，与不是由根据本发明进行处理的细胞产生的非转基因猫相比，本发明的猫具有不同的或异常的Fel d I表达特性。
所得的嵌合子代对于无活性Fel d I基因是杂合的。当与另一只杂合猫杂交时，四分之一的后代与无活性Fel d I基因将是纯合的。这些纯合猫没有主要变应原，并且对变应性猫所有者的免疫疗法是一种革命性替代。
本发明可应用于其中特定变应原能够被鉴别且其中编码该特定变应原的基因序列的中断对动物没有引起伤害的所有动物。
本发明是基于产生这样的转基因动物，其中用于特定变应原的基因序列已被专用(专化，specialized)构建体中断而使该基因失活。在优选的实施方式中，改变的基因可传递至子代。
胚胎干细胞是源于胚泡的内细胞团(inner cell mass)的多能细胞。这些细胞保留分化为发育主体中任何组织型的能力。ES细胞的基因组序列的改变将被传递至直接来源于该改变的ES细胞系的所有其他细胞。
在猫的胚胎干细胞中，编码猫主要变应原的Fel d I基因被中断或“敲除”。这是通过用基因组DNA的新序列插入或替代该功能基因的一部分，使得该基因无活性。修饰的ES细胞可随后通过多种公认技术之一引入发育的卵裂球中，并随后移植到代孕猫中。在正常的胚胎发育过程中，来源于该改变的ES细胞的细胞被引入部分种系和身体组织中。
获得的嵌合子代对于无活性Fel d I基因是杂合的。当与另一只杂合猫杂交时，约四分之一的后代对于无活性Fel d I基因将是纯合的。这些猫没有猫主要变应原。改变的基因以及随后的表型可传递至将来的子代。
本发明提供一种编码中断的Fel d I基因的分离多核苷酸序列。根据本发明，这样的序列能够通过全部或部分Fel d I基因的序列替代、序列插入、或缺失而中断。在本发明的又一种实施方式中，编码可选标记的核苷酸序列被插入Fel d I基因中或用于替代全部或部分Fel d I基因。这样的可选标记基因的一个实例是赋予新霉素抗性的基因。
在本发明的另一种实施方式中，提供了一种重组多核苷酸载体，其包含中断的Fel d I基因的全部或部分。在本发明的又一方面，提供了一种包含中断的Fel d I基因的猫胚胎干细胞，以及一种包含载体的猫胚胎干细胞，该载体又包含中断的Fel d I基因。
在又一种实施方式中，本发明提供一种包含中断的Fel d I基因的转基因猫。这样的转基因猫的体细胞、种系细胞(生殖谱系细胞，germ line cell)、或体细胞和种系细胞二者的Fel d I基因可被中断。根据本发明，提供了一种转基因猫，其对于中断的Fel d I变应原基因是杂合的。还提供了一种转基因猫，其对于中断的Fel d I基因是纯合的。还提供了具有中断的Fel d I基因的转基因猫，其是可繁殖的并能够将中断的Fel d I基因传递至其子代中。
本发明还提供一种用于产生包含中断的Fel d I基因的转基因猫的第一方法，包括以下步骤：
(a)将含有中断的Fel d I基因的猫干细胞引入猫胚胎中；
(b)将该胚胎移植入代孕猫(pseudopregnant cat)中；以及
(c)允许该猫胚胎成熟为猫。
按照该方法产生的转基因猫对于中断的Fel d I基因可以是杂合的或纯合的。纯合的转基因猫将不产生Fel d I猫变应原。
最后，在本发明的另一种实施方式中，提供了一种用于产生包含中断的Fel d I基因的转基因猫的第二方法，其中所述猫不产生猫变应原Fel d I，并且其中所述猫对于中断的Fel d I基因是纯合的，该方法包括以下步骤：
(a)按照上述第一方法产生第一杂合转基因猫；
(b)按照上述第一方法产生第二杂合转基因猫，其中第二猫与第一猫性别不同；
(c)使第一猫与第二猫交配；以及
(d)选择对于中断的Fel d I基因是纯合的且不产生Fel d I抗原的转基因猫。
前面的一般性描述及以下对附图的简要描述和详细描述均是示例性和解释性的，旨在提供对要求保护的发明提供进一步的解释。根据以下对本发明的详细描述，其他目的、优点和新特征对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
图1是由含有靶基因中断的胚胎源干细胞产生猫种系嵌合体的示意性概括。
图2示出了猫中的Fel d I基因的链1(Ch 1)的核苷酸序列。Ch 1由70aa的成熟蛋白亚单元组成。编码Ch 1的基因的测序表明，存在两个可替换的Ch 1前导序列，其中前导B外显子与前导A外显子的起始间隔46bp的内含子。前导B(外显子)或前导A(外显子)与外显子3的接合导致产生编码Asp(前导B)或Asn(前导A)的可替换的密码子。这些接合(外显子1/3和外显子2/3)位于距离成熟Ch 1的N端2aa处，其起始于Glu1。结构基因仅由两个外显子3和4(它们编码成熟蛋白)组成。
图3示出了猫中Fel d I基因的链2(Ch 2)的核苷酸序列。Ch2由92aa的成熟蛋白亚单元组成。前导序列和成熟蛋白的前3个aa由外显子1(61个核苷酸(nt)：20aa)编码。成熟蛋白大部分由外显子2和3(分别为aa 4-64和65-90)编码。Griffith公布的序列的前18nt的外显子3编码残基IAINEY(aa 65-70)(Expression and Genomic Structure of the Genes Encoding FdI，the Major Allergen from the Domestic Cat，Gene(1992))，而非Morgenstern公布的序列TTISSSKD，表明Ch 2具有两种形式(Morgenstern，et al.，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，88：9690(1991))。
图4绘出了用于序列替代载体的示意图。序列替代载体设计为使得在线性化后，该载体序列与内源性序列保持共线。载体和基因组序列之间同源配对后，重组事件用含有neor(新霉素抗性)基因的载体序列替代基因组序列。strps(链霉素敏感性)基因可置于该替代载体的同源编码区的外部以使进一步筛选ES细胞集落更方便。空白框表示内含子；封闭框表示外显子；画有阴影交叉线的框表示neor基因。
图5绘出了用于序列插入载体的示意图。序列插入载体设计为使得线性化载体的两端在Fel d I图谱上彼此邻近。这些载体与它们的基因组同源物的配对，随后在双链断裂处的重组，导致整个载体被插入内源性基因中。这产生一部分Fel d I基因的复制。空白框表示内含子；封闭框表示外显子；画有阴影交叉线的框表示neor基因。
图6绘出了neor基因的构建。结构基因和其控制元件包含在由pUC来源质粒中的Xhol位点(x)和Sall位点(s)侧挂的1kb盒上。(a)来自多瘤病毒突变体PYF441、由碱基5210-5274组成的增强子区的衔接重复。(b)HSV-tk启动子，来自碱基92-218。(c)合成的翻译初始序列GCCAATATGGGATCGGCC。(d)来自Tn5的neor结构基因，包括碱基1555-2347。
图7绘出了Fel d I基因座的示意图，其中示出了链1和链2与Fel d I启动子，以及可用于设计适用于重组载体同源臂的序列的序列区域。
具体实施方式
I.转基因学
尽管本发明披露内容涉及转基因猫，但并不局限于猫。本发明涉及其中编码变应原性蛋白的基因能够被鉴别且失活而无害于动物的所有动物。本文中术语“动物”用于包括所有脊椎动物，除人之外。其还包括在所有发育阶段，包括胚胎和胎儿阶段的个体动物。转基因“动物”是任何包含带有通过在亚细胞水平的精细基因(遗传)操作，如通过微注射、注射重组病毒、或电穿孔而直接或间接接受的遗传信息的一种或多种细胞的动物。基因操作可以直接定向于染色体或者其可以定向于染色体外复制的DNA。“转基因动物”是指这样的动物，其中遗传信息被引入种系细胞中，从而赋予将该信息传递至子代的能力。如果这样的子代实际上具有某些或全部该信息，则它们也为转基因动物。
以下通过举例方式呈现并且不应解释为对本发明范围的限制。
II.胚胎干细胞
产生无变应性猫的关键是将新DNA成功引入ES细胞中。胚胎干(ES)细胞系或克隆和胚胎之间的嵌合体的产生是这些过程中的基本步骤，成功时其导致获得具有改变基因组的新的猫系。
目前应用的大多数ES系具有XY或雄性基因型。这有两个优势。第一个优势在于雄性XY ES系，当注入雌性XX胚泡中时，将倾向于使获得的嵌合体的发育偏向于雄性表型。在表型为雄性的嵌合体中，仅带有XY的生殖细胞(即，那些源于ES细胞的细胞)将形成功能性配子。XX原始生殖细胞(即，那些源于宿主胚泡的细胞)将不形成功能性配子并被丢失。因此，这将有利于源于ES细胞的配子的发育。第二个优势在于，雄性嵌合体在其育龄期间能够产生比雌性更多的子代，使得甚至是具有相对较低百分数的ES细胞对种系的贡献的嵌合体，也能够被检测。
自从ES细胞衍生开始，培养ES细胞所花费的时间长度也能够影响它们形成种系嵌合体的能力。最强壮且具有最高频率的嵌合体通常是那些用早代克隆(即，最高10-15代)的嵌合体；之后，已经注意到，嵌合的程度和频率可能常常，但并不总是，开始下降。
为了有效地产生种系嵌合体，在任何操作或筛选之前，测试ES系以高频率产生嵌合体的能力，是基本的。标准是：出生的超过50％的子代应当是嵌合的，其中，这些中的大多数能够将ES表型在种系中传递。另外建议在注射入胚泡之前，确定通过选择而分离的任何后继克隆的核型(染色体组型，karyotype)，从而避免具有不会产生种系嵌合体的非整倍体(异倍体)核型的任何克隆。这一程序将导致很大程度上节省时间和精力，并且如果使用的ES细胞系已经评估其产生种系嵌合体的能力，则仅需涉及使用C-带染色技术来计数染色体。与染色体平均数的任何偏离几乎都将不可避免地导致产生弱的嵌合体，其中ES细胞贡献于种系的可能性较小。然而，例外是从雄性ES系中丢失Y染色体。这样的克隆能够产生非常好的嵌合体，导致通过雌性的种系传递。
A.胚胎干细胞的衍化
以下程序是由在Abbondanzo，Gadi，and Stewart，“Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.”Methods in Enzymology，1993中描述的方案改编的。胚胎干(ES)细胞是胚泡的内细胞团(ICM)的多能性衍生物。ES细胞直接来源于体外移植的胚泡的ICM。已经采用各种各样的程序来获得ES细胞，包括使用已进行延时移植的胚泡以及直接由分离自免疫手术后的胚泡的ICM而培养细胞。胚胎干细胞的衍化完整披露于Abbondanzo，Gadi，and Stewart，“Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.”Methods in Enzymology(1993)中。
ES细胞的体内生长依赖于细胞因子白血病抑制因子(LIF)。这种蛋白对于维持体外ES细胞的生长是必须的，因为在其缺乏的情况下，ES细胞分化并最终将停止增殖。
白血病抑制因子能够以不同方式供给ES细胞。目前最佳途径、并且对于长期培养是最有效的途径，是在成纤维细胞的饲养层上培养ES细胞。饲养层合成并分泌LIF至培养基中，并且，另外，也产生LIF的替代形式，其保持与由成纤维细胞沉积的细胞外基质紧密相关联。LIF是由饲养层所产生的唯一因子，其对于ES细胞生长是必需。
胚胎干细胞系也能够在没有饲养层的情况下由胚胎建立和维持。在这些条件下，培养基补充有重组LIF，其可购自供应商(GIBCO-BRL，Grand Island，NY；R and D Systems，Minneapolis，MN)。也可以使用补充有通过生长分泌相对大量LIF至培养基中的某些细胞系(参见下文)进行“调节”的介质的常规培养基。可以收集该介质并以适当稀释用作LIF源。
B.培养条件
为了建立和培养ES细胞，要求配备有标准组织培养设施的实验室，即，无菌/过滤空气培养罩、37CO2-通气孵育箱、以及装配有用于观察细胞的相衬(phase-contrast)光学元件的组织-培养显微镜。此外，需要具有×40放大的良好立体解剖显微镜，连同用于转移胚泡以及用于挑选ICM或ES群的嘴控吸移管(mouth-controlled pipette)。参见(Abbondanzo et al.，Methods in Enzymology，1993)。
C.培养基
ES细胞的有效维持要求所有培养基都用非常纯的水制备。Millipore(Bedford，MA)Five-bowl Milli-Q纯化系统提供质量令人满意的水。各种不同的培养基已用于培养胚胎和ES细胞：Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Glasgow改良的Eagle培养基、以及DMEM/Ham’s F 12混合物。用含有高(含量)葡萄糖(4.5g/升)、L-谷酰胺、以及不含丙酮酸钠的DMEM获得较好的结果。购买的培养基是粉末形式，但可获得1×至10×浓度的液体形式。按照制造商的说明书配制并用2.2g/升的碳酸氢钠缓冲。补充MEM非必需氨基酸至终浓度为0.1mM[这些可作为100×(10mM)溶液获自GIBCO-BRL]。另外，连同终浓度为0.1mM的2-巯基乙醇[通过向10ml的磷酸缓冲盐(PBS)中加入70μl的标准14M溶液(Sigma，St.Louis，MO)而制备0.1M的储液]，添加L-谷酰胺至终浓度为2mM。青霉素(50IU/ml)和链霉素(50IU/ml)也包含在最终的制剂中，并且100×溶液可获自GIBCO-BRL。该制剂被称为ES-DMEM。参见(Abbondanzo et al.，Methods in Enzymology，1993)。
D.饲养层的制备
胚胎干细胞依赖于细胞因子LIF以维持其为未分化的增殖种群。该细胞因子通常通过在产生LIF的G418r成纤维细胞的有丝分裂无活性饲养层上生长细胞而供应。(Ramirez-Solis et al.，Methods in Enzymology，1993)，(Robins，Circulation Research，1993)。重组LIF是可商购获得，但是较为昂贵。在缺少饲养物但具有补充重组LIF的培养基的情况下，ES细胞来源于胚细胞培养物。然而，大多数这些细胞系含有大百分比的非整倍体核型，使得它们不适合用于产生种系嵌合体。仅在少数情况下，种系嵌合体由在无饲养物的含LIF培养基中建立的ES细胞产生。至今仍不清楚饲养物是否提供除LIF之外的有助于建立和维持ES细胞的其他因子。可能地，LIF的基质相关形式，连同由饲养物沉积的细胞外基质，在维持ES细胞方面比单独的可溶形式更加有效。已经发现，当在由成纤维细胞沉积的细胞外基质上而非在单独的明胶(其为标准程序)上培养ES细胞时，在存在LIF的无饲养物条件下，饲养物依赖性ES细胞的维持更加有效(在抑制ES分化方面)。还参见(Abbondanzo et al.，Methods in Enzymology，1993)。
饲养物可以是永久的生长系(例如，STO成纤维细胞)。STO细胞的优点是，它们持续增殖，因此它们不需要重复衍生。用STO细胞的缺点是，不同亚系之间存在变异性，其中在维持ES细胞方面一些亚系比其他亚系更加有效。可使用以下程序，其描述在Ramirez-Solis et al.，Methods in Enzymology，1993中。
1.通过在板底部覆盖0.1％的明胶溶液并在室温下孵育2hr完成用明胶涂覆组织培养板(明胶溶液：1％(w/v)组织培养级明胶混合于水中并对其高压蒸气灭菌；工作溶液为0.1％且通过在无菌水中稀释1％的储液而制备。在室温下储存)。在铺放失活的饲养细胞之前吸出明胶。
2.生长G418r细胞直至在DMEM加7％FCS和1×GPS的15cm明胶化组织培养板上汇合。为了使细胞失活，将丝裂霉素C储液(0.5mg/ml)加入培养基中以达到10μg/ml的终浓度，并将板于37℃、5％(v/v)CO2孵育2hr。
3.吸出含有丝裂霉素的培养基并用PBS洗板两次。
4.加入2ml的胰蛋白酶溶液并在37℃、5％CO2孵育5min。
5.加入5ml培养基并通过剧烈吸打来悬浮细胞。将细胞转移至50-ml的无菌离心管中。再次用培养基洗板。集中所有经丝裂霉素处理的细胞并在室温下以1000rpm离心5min。
6.吸出上清液并在5-10ml的培养基中重悬浮沉淀物。计数细胞并加入培养基(介质，medium)至达到3.5×105细胞/ml的浓度。
7.将饲养物等份样转移至明胶化板上，每10-cm板12ml(4.2×106细胞/板)、每6-cm板4ml(1.4×106细胞/板)等。使用前将板置于孵育箱中过夜，以给予细胞附着至板上的时间。饲养板可在孵育箱中储存3-4周，但在使用前应在显微镜下进行检测以确认饲养层的完整性。
E.从胚泡分离胚胎干细胞
可使用以下程序，其描述在Ramirez-Solis et al.，Methods in Enzymology，1993中：
1.按照14h光照和10h黑暗的光照安排圈养实验猫。每天饲喂猫一次并允许随意饮水。每天检查猫一次以确保它们未处于发情期或邻近下次发情期。允许处理开始距离上次发情期间隔2周。
2.将没有LH活性的pFSH在生理盐水中重构至浓度为2iu/ml(1iu＝10μg)。可将溶液等分并储存于-20℃备用。
3.每天向每只猫皮下注射2.0iu的pFSH，共注射五天(每只猫接受总共10.0iu的pFSH)。
4.第六天皮下注射1.0iu的pFSH并肌内注射250.0iu的人绒促性素(hCG)。第七天重复这些注射。
5.在第5、6、7和8天，将雌猫与育龄雄猫安置在一起直至发生至少四次交配。
6.在处理开始后的第11天和第13天之间通过子宫灌洗实施手术取回胚胎。用100μg美托咪定/kg和5mg氯胺酮/kg经肌内注射麻醉动物。
7.中线切割后，将卵巢、子宫输卵管接合处以及子宫体从腹部取出。
8.在子宫体中切割1.0mm切口并插入三通Swan-Ganz儿科用导管至一个子宫角中。膨胀管头(cuff)以密封该子宫角的远端。在子宫输卵管接合处，将无损伤缝合针引入子宫腔内并将20ml加热至39℃的磷酸缓冲盐水(PBS)[无Ca和Mg，加上丙酮酸-Na(0.36g/l)、硫酸卡那霉素(0.25g/l)和酚红(0.05g/l)]两次注射至子宫角中。借助在无菌小瓶中的Swan-Ganz导管回收冲洗液体。
9.回收后，用vicryl(一种可吸收的缝合材料)缝合切口。
10.将胚胎转移至35-mm的含有具有10％胎牛血清的PBS(PBS-FCS)的培养皿中。
还进行以下附加步骤，其描述在Abbondanzo et al.，Methods in Enzymology，1993中。
11.利用立体解剖显微镜以×20或×40放大来定位胚胎。一旦鉴别胚胎/胚泡，则使用嘴控吸移管将其从培养皿中移出。
12.将胚胎转移至新的PBS-FCS皿中以洗去任何污染的血细胞或子宫组织并丢弃任何未受精的卵/胚胎。
13.将胚泡转移至60-mm皿中，其中包含预修边(pre-pared)的饲养物，向每个皿中添加不超过20。向ES-DMEM中补充1000IU的重组LIF(鼠或人同样有效)。将具有胚胎的皿转至37℃孵育箱中并在无干扰下放置2天。
14.在该期间之后，胚胎从透明带(zona pellucida)孵化并附着于皿的表面。营养细胞(滋养层，trophoblast)向外蔓延而形成细胞单层，在其上能够看到内细胞团(ICM)。在接下来的2天(即，直至移植胚泡时间后的第4天)后，ICM生长并在营养细胞单层上形成特定的细胞堆。4天结束时以及在培养第五天的前半天，应挑选ICM进行解聚。似乎存在较佳的时间窗，此时ICM最适于产生ES系。通常，如果在移植5天后的任意时期挑选，则胚泡发育太久，且形成ES系的频率降低。这个点常常能够通过ICM核心周围的内胚层的形成而识别。
15.为了挑选ICM，吸出培养基并在无Ca2+/Mg2+的PBS中清洗皿两次，其中胚胎保持用PBS覆盖。在石蜡油中固定含0.25％胰蛋白酶和1.0mM EDTA加1％鸡血清的微滴。鸡血清包含在胰蛋白酶-EDTA溶液中，与FCS不同，其不包含胰蛋白酶抑制剂，并且所加蛋白质防止细胞溶解。
使用嘴控吸移管，通过轻轻移出ICM而从营养细胞中挑选出ICM。随后将每个ICM转移至胰蛋白酶-EDTA溶液加1％鸡血清的单个微滴中并放置约3-5min。ICM团丛中的细胞开始不再彼此接触。使用另一个嘴控吸移管，其尖端已进行火焰抛光以去除任何尖锐边缘并且其直径为50至100μm，通过上下吸打几次，将ICM团打碎为较小的细胞簇和单个细胞。将整个细胞悬浮液转移至16-mm组织培养皿的单个孔中，该培养皿已含有成纤维细胞饲养层。培养基(1ml)是补充有1000IU LIF的ES-DMEM。使用Nunclone 4×16mm多孔皿(Nunc)作为解聚ICM的培养容器，允许每个ICM一个孔。当所有ICM已解聚且每个已被转移至孔中时，将培养皿放回至孵育箱中。
16.在移植ICM后第3至4天之间，应检查孔以核实ICM细胞确实存在并已开始形成集落。移植的ICM细胞不只产生ES细胞。在许多情况下，通过持续培养初始外植体而出现其他细胞类型。这些集落可能首先类似于ES集落。然而，随着时间过去，它们分化并停止增殖。具有特征形态的ES细胞集落，通常作为具有平滑边缘的紧密圆形集落而继续增殖。很难区分该集落中的个体细胞，尽管它们的细胞核能够被识别且包含一个或两个明显的核。通过每日的观察孔，可以了解集落是否随着其增殖(无分化)而继续增大尺寸。这些集落最经常在孔的周边发现，有时利用组织培养显微镜很难对其进行观察。因此应当仔细检查周边以确保没有错过任何集落。在挑选和解聚(分解，disaggregate)ICM后7-10天内，ES集落应当是明显的。
看起来使用早代(P2-3)成纤维细胞以及将重组LIF包含在培养基中能够有助于从解聚的ICM建立ES细胞。大体上，ES系能够从挑选的ICM以10-30％的频度建立。
F.胚胎干细胞的扩增(expansion)
当ES细胞集落已经在初始外植体(primary explants)中鉴别出时，它们的数量可以被扩增。不必将初始培养物中的ES细胞与可能存在的其他分化细胞类型分离，因为ES细胞的特征之一是快速且持续的增殖。
含有ES集落的整个孔在PBS中清洗2次，并吸出PBS。向每个孔中，加入0.2ml的胰蛋白酶溶液加1％鸡血清，并使孔胰蛋白酶化5min。然后加入0.5ml的ES-DMEM，并通过轻轻吸打悬浮液而将所有细胞团打碎，其中需小心确保不要将气泡引入孔中。如果孔中仅存在一个或两个ES集落，则将细胞悬浮液留在孔中以再附着。第二天用1ml的ES-DMEM加1000IU/ml LIF替换培养基。在接下来的3-5天，如果正确鉴别ES集落，则许多新的ES细胞集落应当是可见的。然后可再次使孔胰蛋白酶化并将内含物转移至含有成纤维细胞饲养层的60-mm皿中。ES细胞集落应继续增殖而不分化。在这点上，不再必须包含LIF且细胞能够在ES-DMEM中的饲养层上维持。参见上述Abbondanzo中描述的程序。
G.胚胎干细胞的扩增、冷冻和常规培养
一旦已发现ES系含有高百分比的具有正常二倍体核型的细胞，应当进行扩增以使尽可能多的早代细胞在液氮中冷冻。这将为将来的实验提供足够的资源，因为相比于使用15-20代及更晚代，早代ES细胞倾向于以较高频率形成较好的嵌合体。然而，没有绝对的相关性，因为已报道相对晚代的系如D3产生种系嵌合体。
如果以足够低的密度将细胞涂布开，那么通过每5-6天将细胞胰蛋白酶化和重涂布于含有新鲜饲养物的皿中，ES细胞能够维持为未分化的细胞群。60-mm皿以最大密度将含有约1-2×107个ES细胞，而150-mm皿以最大密度可含有多达2-3×108个细胞。如果细胞超过最大密度水平，则细胞将开始分化或死亡，因此在它们必须传代之前所能维持的最佳时间段是约5-7天。为了维持细胞系，使半汇合(semiconfluent)皿胰蛋白酶化并将稀释度为1∶100至1∶500的单个细胞悬浮液涂布开是足够的。如果以合理低的密度再涂布细胞，则需要每隔一天更换培养基以保持细胞在最佳的条件下。如果要求更多细胞和更高密度，则应当每天重新饲养细胞。如果条件是亚最佳，则将出现分化的衍生物，并且ES细胞堆将开始变平，伴随个体细胞变得更加明显。在极端条件下，大多数细胞将已发生分化。关于这种技术的全面描述，参见在前的Abbondanzo。
H.胚胎干细胞的冷冻
可使用上述Abbondanzo描述的以下程序。
1.ES细胞的培养物应当处于log生长阶段(对数生长阶段)，即，未处于最大密度。在PBS中清洗皿2次并进行胰蛋白酶化。
2.收集细胞，重悬浮于培养基(介质，medium)中，并用血球计进行计数。
3.用于冷冻细胞的培养基由DMEM和FCS的50∶50混合物构成，其含有终浓度为10％(v/v)的二甲亚砜(DMSO)(Sigma)。
4.1ml含1-5×106ES细胞的介质被等分至1-ml的具有螺旋盖和橡皮密封的无菌冷冻小瓶(Nunc)中。
5.在小瓶上标记ES系以及代数，将其置于支撑架上，并在-70℃冷冻机中存放过夜。
6.第二天应当将该经冷冻的小瓶转移至液氮容器中用于长时间保存。
7.为了解冻ES细胞，应当提前准备含有ES-DMEM培养基中的饲养层的60-mm组织培养皿。取出具有ES细胞的小瓶并将其置于具有预热至37℃的无菌蒸馏水的烧杯中直至小瓶中内含物融化。取出小瓶，用100％的乙醇擦洗以消毒外部，并用无菌巴斯德(Pasteur)吸移管移出细胞悬浮液。可将细胞立即涂布在60-mm皿中。第二天用新鲜ES-DMEM替换培养基以除去所有DMSO和任何死细胞。如果ES细胞的冷冻和解冻都正确完成，那么在培养皿中应该已经可看到ES集落。
III.基因靶向
基因靶向、或定点重组是标准实验室技术，其利用天然细胞机制已知的用于交换DNA序列的同源性重组，从而用另一种期望的多核苷酸替换或中断(打乱)内源基因组序列的全部或部分。因此，基因靶向能够用于例如敲除、缺失、或防止整个基因或其外显子的正常表达或者用于引入点突变。
在天然细胞机制下，共享序列同一性的任何DNA序列对(即，它们是“同源”序列)都能够相互作用而形成新的重组DNA物种(species)。然而，随着共享核苷酸DNA序列长度的增加，所期望的这种同源重组事件的成功率也增加，并且利用线性化质粒分子比利用环形质粒分子成功率更高。在同一性较低的两条DNA序列之间可以发生同源重组，但重组频率随着两序列之间的趋异(分歧)增大而降低。
因此，感兴趣的多核苷酸能够在载体中连接至与宿主细胞的内源序列共享同源性的序列。这些序列在本文中被称为“同源臂”。最后，同源序列(载体中的那些同源序列及其基因组对应序列)相互作用或“重组”，以在同源基因组DNA序列的位置处插入期望多核苷酸(在载体中它们连接于该期望多核苷酸)。因此，对于作为同源臂的序列的选择将决定期望多核苷酸整合至基因组中的位置(位点)。
如果期望多核苷酸插入子(insert)连接于与单拷贝基因共享同源性的同源臂，那么该期望多核苷酸将经由同源性重组仅在单个特定位点被插入。另一方面，如果期望多核苷酸连接于与多拷贝基因共享同源性的同源臂，那么该期望多核苷酸可能经由同源性重组在基因拷贝所定位的每一个特异性位点处被插入。
期望DNA序列能够通过涉及(1)单相互重组(其导致插入引入DNA的全长)、或(2)双相互重组(其导致插入仅仅定位在两次重组事件之间的DNA)的同源重组反应而被插入基因组中。
为了将外来基因插入基因组位点(如，Fel d I)中，引入的载体应当包含与基因组Fel d I基因同源的序列。单次同源重组事件会导致整个引入的DNA序列被插入至基因组Fel d I基因座中。可替换地，双重组事件可以通过用与Fel d I基因的序列同源的同源臂来侧接将要被插入基因组中的期望多核苷酸的每一端而实现。同源臂中的一个或两个也可包含位于Fel d I基因或基因座以外的序列，例如处于感兴趣的具体Fel d I基因的5’-端或3’-端的上游或下游的邻近侧接序列。涉及侧接期望多核苷酸的这两个同源臂中的每一个的同源重组事件，将导致将期望多核苷酸插入至基因组中。
依据这种背景，并且根据本发明，Fel d I基因座的任何部分可以被中断。即，基因靶向技术可用于(A)敲除或缺失整个Fel d I基因座，其包括编码“链1”和“链2”的Fel d I基因序列(参见下面的B)；(B)敲除编码链1的基因的全部或部分或者编码链2的基因的全部或部分；(3)敲除一条链的全部以及另一条链的部分；(4)敲除来自任一条Fel d I链序列的一个或多个特异性外显子；(5)敲除Fel d I启动子序列的全部或部分；(6)用另一不同的核苷酸、其他多个不同的核苷酸、或与靶序列的序列同一性不为100％的另一段连续核苷酸，取代(即替换)一个或多个核苷酸或者存在于Fel d I基因座中的一段连续核苷酸；(7)将期望多核苷酸插入基因组序列中。本发明并不限于这些示例性基因靶向事件。
因此，本发明考虑了敲除、缺失、替换、取代、或以其他方式中断至少某个部分的Fel d I基因序列，其包括编码链1的Fel d I序列的外显子和内含子、编码链2的Fel d I序列的外显子和内含子、以及Fel d I基因的启动子序列。本发明还考虑了将期望序列插入基因组中。这些方法中的任一种可以中断内源基因组Fel d I序列的正常表达，中断程度为不产生或仅产生部分Fel d I RNA转录本，使得如果有，也只产生极少量的Fel d I蛋白。这可能是因为链1和2中的任一条不表达或两条都不表达，或是因为这种中断引起Fel d I突变蛋白被表达。因此，基于本发明期望的是，在根据本发明靶向动物基因组后，任何Fel d I基因序列的表达产生(如果有)极少量的天然Fel d I蛋白变应原。
在这种情况下，可以靶向和中断Fel d I基因的任何外显子，只要该中断的作用是减少或防止功能性和正常Fel d I蛋白的表达。可以通过仅靶向一个或少数外显子的中断(由此可产生突变Fel d I蛋白，其仍然包含变应原表位)。然而，在Fel d I系统中，中断第一外显子可能是非常期望的，因为该基因的起始密码子存在于该外显子中，其操控用于转录和翻译目的的阅读框。因此，中断该特定外显子以去除起始密码子能够很好地防止该基因序列完整地表达。还可期望的是，去除Fel d I的两条链(链1和链2)基本上所有的编码序列以及也去除Fel d I启动子的所有序列。
Fel d I长度中约21,939bp的核苷酸序列通过本发明鉴别并示出在SEQ ID NO.7(图7)中。其包含由本申请发明人鉴别的DNA序列，该序列用于实施这些同源重组事件中的任一个。如图7中所示出的，上链为正链，而最下链为代表基因组Fel d I序列的DNA双链中的负链。包含Fel d I链1的外显子和内含子的编码序列在正链上从位于SEQ ID NO.7的约14,410的核苷酸延伸至约核苷酸16,028。包含Fel d I链2的外显子和内含子的编码序列在负链上从核苷酸位10,520延伸至约8,437。在链1和链2各自的起始密码子之间间隔约3,888核苷酸。Fel d I启动子大约位于10,521-14,409的区域中。该单独启动子驱动链1和链2的表达。参见图7，是Fel d I基因组座位组织的示意图。
如果期望在整个Fel d I基因上进行同源重组，即，敲除链1和链2以及启动子，那么可以由侧接于所指示的链端点的SEQ ID NO.7的任意部分来产生同源臂。因此，根据本发明，可以由从SEQ ID NO.7的核苷酸1延伸至约核苷酸8,437的任意序列(其邻接链2的序列)或者由约16,029至核苷酸21,939(SEQ ID NO.7的末端)产生同源臂。因此，用于此目的的第一同源臂可包含1-8437序列的任意长度。用于此目的的第二同源臂可包含16029-21939序列的任意长度。当然，在本发明的任何实施方式中，任何特定同源臂的序列不包括特定的链DNA序列并不是关键的。也就是说，在这种具体的实施方式中，其中链1和2以及启动子将被敲除，如果一个或两个同源臂的序列分别延伸到链1或链2中，则对于重组或本发明来说并非致命的。例如，第一同源臂可从核苷酸7,000延伸至核苷酸9,000，并因此延伸进入链2编码序列的3’-端，但在功能上仍然可用于同源重组目的。事实上，本发明明确考虑了这样的序列设计。
因此，本发明用于敲除链1、链2、以及启动子的同源重组构建体可包括(1)第一同源臂，其例如包含SEQ ID NO.7的核苷酸5,000-8,000；(2)第二同源臂，其例如包含核苷酸15,000-18,000；以及(3)期望多核苷酸，其位于第一和第二同源臂之间。
通过类似方法，可将同源臂设计为侧接于内源基因组中期望靶向的任何部分。因此，为了仅中断链1，例如，可将第一同源臂设计为包含在SEQ ID NO.7的核苷酸5,000-8,000之间的序列，并将第二同源臂设计为包含在SEQ ID NO.7的核苷酸11,000-13,000之间的序列。将目的在于整合至天然基因组中的期望多核苷酸再次定位在这两个同源臂之间。重组后，期望多核苷酸将替代链1序列。同样，为了中断链2，可将第一同源臂设计为从SEQ ID NO.7的核苷酸12,000延伸至核苷酸14,000，并将第二同源臂设计为从SEQ ID NO.7的核苷酸17,000延伸至19,000。类似地，为了中断Fel d I启动子，可将第一同源臂设计为包含SEQ ID NO.7中8,000-10,000的序列，并将第二同源臂设计为包含SEQ ID NO.7中15,000-17,000的序列。当然，这些实施例仅为可能同源臂的实例，这些同源臂可被设计为靶向SEQ ID NO.7所示的Fel d I基因序列中的一个或多个区域。
同源臂可以具有任意长度，例如长度小于约1,000个核苷酸、或约1,100个核苷酸、约1,200个核苷酸、约1,300个核苷酸、约1,400个核苷酸、约1,500个核苷酸、约1,600个核苷酸、约1,700个核苷酸、约1,800个核苷酸、约1,900个核苷酸、约2,000个核苷酸、约2,100个核苷酸、约2,200个核苷酸、约2,300个核苷酸、约2,400个核苷酸、约2,500个核苷酸、约2,600个核苷酸、约2,700个核苷酸、约2,800个核苷酸、约2,900个核苷酸、约3,000个核苷酸、约3,100个核苷酸、约3,200个核苷酸、约3,300个核苷酸、约3,400个核苷酸、约3,500个核苷酸、约3,600个核苷酸、约3,700个核苷酸、约3,800个核苷酸、约3,900个核苷酸、约4,000个核苷酸、约4,100个核苷酸、约4,200个核苷酸、约4,300个核苷酸、约4,400个核苷酸、约4,500个核苷酸、约4,600个核苷酸、约4,700个核苷酸、约4,800个核苷酸、约4,900个核苷酸、约5,000个核苷酸、约5,100个核苷酸、约5,200个核苷酸、约5,300个核苷酸、约5,400个核苷酸、约5,500个核苷酸、约5,600个核苷酸、约5,700个核苷酸、约5,800个核苷酸、约5,900个核苷酸、约6,000个核苷酸、约6,100个核苷酸、约6,200个核苷酸、约6,300个核苷酸、约6,400个核苷酸、约6,500个核苷酸、约6,600个核苷酸、约6,700个核苷酸、约6,800个核苷酸、约6,900个核苷酸、约7,000个核苷酸、约7,100个核苷酸、约7,200个核苷酸、约7,300个核苷酸、约7,400个核苷酸、约7,500个核苷酸、约7,600个核苷酸、约7,700个核苷酸、约7,800个核苷酸、约7,900个核苷酸、约8,000个核苷酸、约8,100个核苷酸、约8,200个核苷酸、约8,300个核苷酸、约8,400个核苷酸、约8,500个核苷酸、约8,600个核苷酸、约8,700个核苷酸、约8,800个核苷酸、约8,900个核苷酸、约9,000个核苷酸、约9,100个核苷酸、约9,200个核苷酸、约9,300个核苷酸、约9,400个核苷酸、约9,500个核苷酸、约9,600个核苷酸、约9,700个核苷酸、约9,800个核苷酸、约9,900个核苷酸、约10,000个核苷酸、约10,100个核苷酸、约10,200个核苷酸、约10,300个核苷酸、约10,400个核苷酸、约10,500个核苷酸、约10,600个核苷酸、约10,700个核苷酸、约10,800个核苷酸、约10,900个核苷酸、约11,000个核苷酸、约12,000个核苷酸、约13,000个核苷酸、约14,000个核苷酸、约15,000个核苷酸、约16,000个核苷酸、约17,000个核苷酸、约18,000个核苷酸、约19,000个核苷酸、约20,000个核苷酸、约21,000个核苷酸、约22,000个核苷酸、或大于约22,000个核苷酸。
第一和第二同源臂的长度不必须彼此相同。此外，根据本发明，同源臂不必须在其序列的整个长度上100％与其将重组的Fel d I基因的对应序列相同。因此，同源臂与内源序列可共享一定百分比的序列同一性，约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％与其将要重组的内源序列相同并仍然履行功能以促进同源重组。
从上文可以看出，同源臂可以非常长。因此，根据本发明，同源臂可以包含仅在其长度的一部分上与内源序列的100％序列同一性，而同源臂的其他部分与内源序列共享小于100％的序列同一性，但这样的臂对于同源重组目的仍然是功能性的。因此，本发明考虑了含有与内源序列具有高序列同一性和低序列同一性的区域的同源臂，但其仍然具有实施同源重组的功能。
如本文中所使用的，在两个核酸或多肽序列的情况下，“序列同一性”或“同一性”包含这样的含义：当在指定区域上以最大对应性比对时，两条序列的残基是相同的。当序列同一性百分比用于提及蛋白时，应当理解：不相同的残基位置常常不同在于保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基被取代为其他具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基，因而不改变分子的功能特性。当序列的不同在于保守性取代时，序列同一性百分比可向上调整以校正取代的保守特性。不同之处在于这样的保守性取代的序列被说成是具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的方式是本领域技术人员所熟知的。通常这涉及将保守性取代评分为部分错配而非完全错配，从而提高序列同一性百分比。因此，例如，在对相同氨基酸评分为1而对非保守取代评分为0的情况下，对保守性取代评分为0至1之间。保守性取代的评分，例如按照Meyers and Miller，Computer Applic.Biol.Sci.，4：11-17(1988)的算法，例如以程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，加利福尼亚，USA)执行，而计算得出。
如本文中所使用的，“序列同一性的百分比”意指通过在比较窗中比较两条最佳比对(对齐，align)的序列而确定的值，其中针对两条序列的最佳比对在比较窗中的多核苷酸序列部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包含添加或缺失(即，间隙)。这样计算百分比：通过确定两条序列中相同核酸碱基或氨基酸残基出现的位置数以产生匹配位置的数目；匹配位置数除以比较窗中总的位置数并将结果乘以100而获得序列同一性的百分比。
用于比较的序列的比对方法是本领域已知的。用于比较的序列的最佳比对可通过Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源算法；通过Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源比对算法；通过Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444(1988)的搜索相似性方法；通过这些算法的计算机实施(包括但不限于：Intelligenetics，Mountain View，加利福尼亚的PC/Gene程序中的CLUSTAL；Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、以及TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，Wisconsin，USA；CLUSTAL详细描述于Higgins and Sharp，Gene 73：237-244(1988)；Higgins and Sharp，CABIOS 5：151-153(1989)；Corpet，et al.，Nucleic Acids Research 16：10881-90(1988)；Huang，et al.，Computer Applications in the Biosciences 8：155-65(1992)以及Pearson，et al.，Methods in Molecular Biology 24：307-331(1994))而进行。
能够用于数据库相似性搜索的BLAST系列程序包括：BLASTN，用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸询问序列；BLASTX，用于针对蛋白质数据库序列的核苷酸询问序列；BLASTP，用于针对蛋白质数据库序列的蛋白质询问序列；BLASTN，用于针对核苷酸数据库序列的蛋白质询问序列；BLASTX，用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸询问序列；参见，Current Protocols in Molecular Biology，第19章，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)；Altschul et al.，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；以及Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)。
用于进行BLAST分析的软件可公开获得(例如通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))。这种算法涉及首先通过鉴别询问序列中的长度W的短字(当与数据库序列中相同长度的字相比对时，其匹配或满足某个正值阈值分值T)来鉴别高评分序列对(HSP)。T是指相邻字分值阈值。这些起始的相邻字命中(word hits)用作启动搜索的种子以寻找含有它们的更长HSP。字命中随后在两个方向上沿每条序列而延伸，直至累积比对分值增加。累积分值对于核苷酸序列使用参数M(对于匹配残基对奖分；总是＞0)和N(对于错配残基罚分；总是＜0)计算。对于氨基酸序列，利用评分矩阵来计算累积分值。当：累积比对分值从其最大实现值下降量X时；由于一个或多个负计分残基比对的累积，累积分值变为0或更低时；或者到达任一序列的末端时，每个方向上字命中的延伸被停止。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用字长(W)11、预期值(E)10、截止值100、M＝5、N＝-4，以及两个链的比较作为默认值(缺省值)。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用字长(W)3、预期值(E)10、以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)作为默认值。
除了计算序列同一性百分比，BLAST算法还进行两条序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5877(1993))。通过BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小和概率(P(N))，其提供对于两条核苷酸或氨基酸序列偶然匹配的概率的指示。
BLAST搜索假定可将蛋白模拟为随机序列。然而，许多真正的蛋白包含非随机序列的区域，其可能是均聚束、短周期重复、或者富集一种或多种氨基酸的区域。这样的低复杂性区域可在不相关的蛋白之间进行比对，即使蛋白的其他区域完全不同。许多低复杂性过滤程序可用来减少这样的低复杂性比对。例如，SEG(Wooten and Federhen，Comput.Chem.，17：149-163(1993))和XNU(Claverie and States，Comput.Chem.，17：191-201(1993))低复杂性过滤程序(filters)可单独使用或组合使用。
序列的多重比对可利用CLUSTAL比对方法(Higgins and Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)、利用默认参数(GAP PENALTY(间隙罚分)＝10，GAP LENGTH PENALTY(间隙长度罚分)＝10)而进行。利用CLUSTAL方法用于成对比对的默认参数(缺省参数)是KTUPLE 1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5。
因此，基因靶向同源重组载体可利用本文中所提出的原则和原理而产生，从而将实施期望靶基因组中断的DNA序列连接在一起。以下更加详细地讨论这样的同源重组载体构建体，但其可包含(1)感兴趣的多核苷酸序列，其侧接于(2)第一同源臂和(3)第二同源臂，如本文中所述。如上所述，本发明的同源臂例如可按照以上段落描述的原理而设计，以包含SEQ ID NO.7中的任意序列，且具有任意长度，如上述的那些长度。此外，本发明并不限于仅靶向基因组序列。为了方便描述本发明，使用术语“基因组”和“内源(性)的”，但用于这些环境下靶向DNA序列的构思也在本发明中考虑，例如靶向其他DNA源，如线粒体DNA、染色体外DNA、来自另一载体的DNA或者已感染特定细胞的DNA，如病毒、真菌或细菌DNA。
如在本文中使用的，期望多核苷酸、基因、或者Fel d I基因的“一部分”或“片断”，可包含任意延伸的连续核苷酸。因此，含有Fel d I基因的“一部分”的核酸或核苷酸例如可包含约10个连续核苷酸、约15个连续核苷酸、约20个连续核苷酸、约25个连续核苷酸、约30个连续核苷酸、约35个连续核苷酸、约40个连续核苷酸、约45个连续核苷酸、约50个连续核苷酸、约55个连续核苷酸、约60个连续核苷酸、约65个连续核苷酸、约70个连续核苷酸、约75个连续核苷酸、约80个连续核苷酸、约85个连续核苷酸、约90个连续核苷酸、约95个连续核苷酸、约100个连续核苷酸、约110个连续核苷酸、约115个连续核苷酸、约120个连续核苷酸、约125个连续核苷酸、约130个连续核苷酸、约135个连续核苷酸、约140个连续核苷酸、约145个连续核苷酸、约150个连续核苷酸、约200个连续核苷酸、约300个连续核苷酸、约400个连续核苷酸、约500个连续核苷酸、约600个连续核苷酸、约700个连续核苷酸、约800个连续核苷酸、约900个连续核苷酸、约1,000个连续核苷酸、约2,000个连续核苷酸、约3,000个连续核苷酸、约4,000个连续核苷酸、约5,000个连续核苷酸、约6,000个连续核苷酸、约7,000个连续核苷酸、约8,000个连续核苷酸、约9,000个连续核苷酸、或约10,000个连续核苷酸、或多于约10,000个连续核苷酸，包括落入本文中所述核苷酸的任意范围中的任意数量的连续核苷酸，即Fel d I基因的“一部分”包括，但不限于这样的长度，其某种程度上在约100-1,000核苷酸之间、在约1,000-5,000核苷酸之间、或在约5,000-10,000或更多核苷酸之间。
连接至同源臂的期望多核苷酸可以是任意DNA序列，如不同的基因、或者阳性或阴性可选标记，或者期望多核苷酸可以是内源序列的突变形式。在Fel d I基因的情况下，例如，期望多核苷酸可基本上与天然编码链1的DNA序列的部分相同，但包含一个或多个点突变、缺失或插入，因此，利用针对Fel d I序列而设计的侧接特定靶位点的同源臂的同源重组，将有效导致天然的链1DNA序列替代如设计成期望多核苷酸的突变形式。以下的其他实施方式对敲除某些或全部Fel d I基因序列的这一总体设计进行详细描述。
A.胚胎干细胞的培养
以下程序是基于在Ramirez-Solis，Davis，and Bradley，“Gene Targeting in Embryonic Stem Cells.”Methods in Enzymology，(1993).中描述的方案改编的。
利用US细胞用于基因靶向的目的是将培养中产生的突变转移至猫种系中。由于这一原因，防止异常细胞过度生长的培养条件是关键。ES细胞应当在有丝分裂失活的饲养细胞层上生长。另外，细胞应当以高密度以及1∶3至1∶6的传代频率生长；这通常意味着每日更换培养基。ES细胞应当在传代前饲养4小时。为了传代，应当将细胞用PBS清洗两次并胰蛋白酶化(用胰蛋白酶处理)10min；无需预热胰蛋白酶。加入ES-DMEM培养基，通过剧烈吸打(抽吸，pipetting)来机械地打乱细胞团。重要的是，在传代前产生单个的细胞悬浮液作为具有分化趋势的细胞团。应当记录细胞系的传代数以估测细胞培养的时间。如果不是立即使用细胞，则应将它们冷冻并在需要时恢复。
培养的ES细胞群包括全能性细胞，以及具有贡献于猫的所有组织的有限潜能的细胞。由于靶向事件通常是罕见的而单个细胞克隆是必需的，因而建议优化靶向载体及条件，以使得能够重新获得多个靶向克隆。另外，克隆涉及低细胞浓度下并且可能为长期地进行培养，同时筛选期望克隆。
B.编码Fel d I的基因
两种基因编码包含猫主要变应原Fel d I的蛋白链。将蛋白链指定为“链1”(或Ch1)和“链2”(或Ch2)。Fel d I基因的一条已公开的多核苷酸序列描述在Griffith，et al.Expression and Genomic Structure of the Genes Encoding Fdl，the Maj or Allergen from the Domestic Cat，Gene，113(2)：263-8(1992)中，其在图2和图3中示出。另外参见Morgenstern et al.，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，88：9690(1991)。
Ch 1由70aa的成熟蛋白亚单元组成。对编码Ch 1的基因的测序表明：存在两种可替换Ch 1前导序列，其中前导B外显子与前导A外显子起始间隔46bp的内含子。前导B(外显子1)或前导A(外显子2)与外显子3的接合导致产生编码Asp(前导B)或Asn(前导A)的可替换密码子。这些接合(外显子1/3和外显子2/3)位于距成熟Ch 1的N末端的2aa处，其起始于Glu1。结构基因仅由两个外显子3和4(其编码成熟蛋白)组成(图2)。
Ch 2由92aa的成熟蛋白亚单元组成。前导序列和成熟蛋白的前3aa由外显子1(61nt；20aa)编码。成熟蛋白大部分由外显子2和3(分别为aa 4-64和65-90)编码。外显子3的前18nt编码残基IAINEY(aa 65-70)，而非公开的序列TTISSSKD，这表明Ch 2具有两种形式(图3)。
尽管载体构建体能够靶向任何外显子，但优先允许在所靶向外显子的任一侧上具有至少1000bp的同源性。已经证实这有助于重组事件的更大成功率。
C.载体设计
1.具有可选突变的一般载体设计
通常，通过同源重组的基因靶向相比于随机整合事件以较低频率发生。对于大多数基因，如前述段落中描述的载体，可以设计为降低随机整合事件残存选择的频率。ES细胞中表达的基因可使用不合启动子的可选标记进行靶向。可选标记可具有其自身的翻译启动信号或者与所靶向基因形成融合蛋白。可替换地，可选标记可置于基因内，以使多腺苷酸化信号必须通过基因组整合位点提供。
对于任何基因，阴性可选标记(即，strps)可在靶向载体的同源区外部使用。在正确的靶向事件中，阴性可选标记将被切除并且细胞将对链霉素具有抗性，但在随机事件中，阴性标记通常被整合并表达，使得经由有毒核苷类似物的代谢而导致细胞死亡。这些策略可单独使用或联合使用以有助于提高相对的基因靶向频率。残存选择的利用随机整合事件的克隆数将减少，这将使所靶向的事件更易于检测。
决定基因组座位的靶向频率的因素目前还没有完全确定。真正影响靶向频率的因素包括靶向载体和基因组座位之间具有理想同源性的长度、可选标记在同源段内的放置、以及载体的线性化位点。利用阳性-阴性选择的标准替代载体已表现出对于许多基因的1/10至1/1000G418r-strps集落的靶向频率。关于靶向载体中同源序列的长度，载体构建、靶向事件的诊断、以及靶向频率之间的一种适当折衷，可以例如为约3kb，其中至少约1kb在可选标记的任一侧上，但本发明并不限于如上阐述的这种具体实施方式。
在这方面，本发明考虑了来自SEQ ID NO.7的任意序列在用于构建这样的同源重组载体中的应用。SEQ ID NO.7是用于这方面的22,250核苷酸长度的基因组Fel d I DNA序列。Fel d I链1编码序列，包括内含子和外显子，在SEQ ID NO.7的正链(上方)上位于核苷酸14,720至16,338之间。Fel d I链2编码序列，包括内含子和外显子，位于SEQ ID NO.7的负链(下方)的核苷酸10,830至8,747之间。Fel d I启动子位于核苷酸10,831-14,719之间。
SEQ ID NO.7的任意连续核苷酸段可用于构建同源重组载体，随后可将其用于靶向猫基因组中的内源Fel d I基因或Fel d I的内源RNA转录本，从而减少、中断或消除Fel d I及所得蛋白的表达。因而，SEQ ID NO.7提供可用于产生同源“臂”的有用序列，该同源“臂”可被设计为侧接期望Fel d I核苷酸靶位点。因此，本发明考虑了通过载体靶向内源Fel d I，该载体具有定向于侧接靶位点的两个同源臂。同源臂的长度可以是如上所述的任意长度。
期望构建所具有的DNA来自与ES细胞系相同的猫系的靶向载体，因为多态性可以中断具有理想同源性的长度并导致较低的靶向频率。应当仔细考虑期望重组事件之后的座位的结构，尤其是当需要无效等位基因时。对于小基因，替代载体可设计为其中编码序列被可选标记替代。对于较大的基因，第一编码外显子的中断最可能产生无效等位基因。
也可通过缺失全部或部分Fel d I基因来中断Fel d I基因并失活，以便防止产生功能性Fel d I蛋白。
在首轮靶向之后，通过“mini-Southern(微小DNA)”分析(F部分)常规筛选500个集落。如果发现靶向的克隆，应将它们通过几次消化，利用特异于内源序列的5’和3’端的探针和酶在Southern分析中进行检测，以确保已发生期望重组事件。如果没有鉴别到克隆，则最好重新设计载体而不是继续进一步的筛选。
已表明插入载体比替代载体的靶向频率高5至12倍，并且能够用于随后的靶向尝试中。取决于原始替代载体的设计，可能可以在同源区域内线性化相同的载体以利用插入事件的较高靶向频率。载体设计的总体性讨论参见Ramirez-Solis et al.，Methods in Enzymology，1993。
2.Fel d I载体设计
Fel d I具有这样的优势：具有两个编码主要变应原的基因。这意味着可以设计构建体以中断链1(Ch 1)、或链2(Ch 2)、或这两条链的编码序列。对于靶基因的定位点诱变的总体性讨论参见Thomas and Capecchi，“Site-Directed Mutagenesis by Gene Targeting in Mouse Embryo-Derived Stem Cells”Cell(1987)。
将新霉素抗性(neor)基因的专用构建体引入Ch 1或Ch 2的克隆片段的外显子之一中。然后这种构建体用于转染ES细胞。neor基因既用于中断靶基因的编码序列又用作标签以监控新引入的DNA整合于受体基因组中。neor基因作为标签的有效应用需要基因在适当的Fel d I座位的表达。
新霉素基因被设计以优化在ES细胞中的表达同时维持其最小尺寸。为此目的已对neor进行修饰并称为pMC1Neo，该构建体的整体结构示于图6中。新霉素蛋白编码序列(d)来自于细菌转座子Tn5，包含碱基1555-2347。驱动neor基因的启动子(b)获自单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的碱基92-218。这种启动子看起来在胚胎癌(EC)细胞中有效。为了提高tk启动子的效力，引入由PyF441多瘤病毒增强子的碱基5210-5247组成的合成65bp片段(a)的复制体(双重体)。该片段涵盖允许多瘤突变体有效感染EC细胞的DNA序列改变。最后，由于天然neor基因翻译起始信号对于哺乳动物翻译是特别不利的，因此合成翻译初始序列(c)(GCCAATATGGGATCGGCC)利用Kozak规则为指导被取代(Kozak，1986)(图6)。参见上述Thomas and Capecchi关于该构建体的讨论。
有两种中断Fel d I基因的方案：一种是通过序列替代载体、一种是通过序列插入载体。两种载体均含有用neor基因中断的外显子。
序列替代载体设计为使得在线性化后，载体序列与内源序列保持共线。在载体与基因组序列之间同源配对后，重组事件用含有neor基因的载体序列替代该基因组序列(图4)。
序列插入载体设计为使得线性化载体的末端在基因图谱上彼此相邻。这些载体与它们的基因组类似物的配对，以及随后在双链断裂处的重组，导致整个载体被插入内源基因中(图5)。
电穿孔后，成功的同源重组使得ES细胞对药物G418r具有抗性。为了使最初的筛选更加方便，可在替代载体的同源编码区域外部添加链霉素敏感基因。在成功的基因替代后，该strps基因丢失且ES细胞集落在含有链霉素的培养基上生长。如果重组在基因组DNA中是随机的，则strps基因将保留并且ES细胞将不生长。
D.电穿孔
任何靶向实验的第一步都是将DNA引入受体细胞中。对于ES细胞，DNA微注射和电穿孔已表明可用于允许进行基因靶向。DNA微注射在技术上时困难的并且具有可导致严重的染色体中断的可能，这可能降低ES细胞形成嵌合体种系的潜力。另一方面，电穿孔已广泛用于产生经历种系的靶向克隆。使用的电穿孔方案基本上类似于那些用于其他细胞型的那些，但某些事情对于ES细胞的特定情形是特别重要的。细胞应当在电穿孔时正在积极地生长；这可通过在电穿孔前一天传代ES细胞并在收集细胞前几个小时添加新鲜培养基而实现。胰蛋白酶处理时间应当足够长以允许细胞团的机械解聚从而避免分化。经电穿孔的细胞应在5-10min内涂布在具有M15培养基的饲养细胞上。可以利用以下程序，其描述在Ramirez-Solis et al.，Methods in Enzymology，1993中：
1.通过CsCl绑扎(CsCl banding)技术制备靶向载体。
2.用适合的限制性酶切割200μg的靶向载体DNA以将其线性化。通过琼脂糖凝胶电泳来评估限制性消化的完成情况。
3.用苯酚-氯仿、氯仿清洗DNA并用NaCl和乙醇使其沉淀。将DNA重悬浮于无菌的0.1×Tris-EDTA缓冲液(TE)中并调节浓度至1mg/ml。
4.在电穿孔前一天，传代积极生长的ES细胞(～80％融合)1∶2。
5.收集细胞用于电穿孔前4小时用新鲜M15培养基饲养细胞。
6.用PBS清洗板两次并通过用胰蛋白酶溶液(1ml胰蛋白酶溶液用于10-cm板)在37℃下处理10min使细胞脱附。
7.通过加入1体积的M15培养基终止胰蛋白酶的作用并通过用转移吸移管上下移动悬浮液而使细胞团离解。
8.在临床离心机中以1000rpm离心细胞5min并去除上清。将细胞重悬浮于10ml的PBS中并确定细胞总数。
9.重离心细胞，吸出上清，并将细胞以1.1×107细胞/ml的终密度重悬浮在PBS中。
10.在电穿孔槽中混合25μg线性化的靶向载体与0.9ml的细胞悬浮液。在室温下孵育5min。
11.在230V、500μF的Bio-Rad基因脉冲仪中进行电穿孔。在室温下孵育5min。
12.将槽中全部内含物涂布在10-cm具有饲养细胞的组织培养板上。饲养板上的培养基应当在涂布细胞前更换为M15。
13.在电穿孔后24小时施加G418选择。如果遵循的是利用单纯疱疹病毒-1胸苷激酶(HSV-1 tk)基因的阳性-阴性选择方案，那么也可以施加FIAU选择。
14.当培养基开始变黄时，重新饲养细胞，在开始的5天通常为每天进行。
15.电穿孔后10天，准备进行集落挑选。
E.电穿孔后集落的挑选和扩增
电穿孔后，ES细胞集落生长8-12天而变得肉眼可见，并在此时进行挑选。应当注意的是，每孔只接种单个集落以避免进一步的克隆步骤。参见Ramirez-Solis et al.，Methods in Enzymology，1993。
1.用PBS清洗含有集落的板两次并加入PBS以覆盖板。
2.通过在每孔中加入25μl胰蛋白酶溶液而制备96-孔U-底板。
3.将最初的10-cm板置于倒置显微镜上并用微量吸移管及最大体积为10μl的一次性无菌管头(tip)挑选单个集落。将每个集落转移至步骤2中制备的板孔中的胰蛋白酶溶液中。
4.在已挑选96个集落后，将96-孔板置于37℃、5％CO2孵育箱中达10min。
5.孵育期间，取之前制备的96-孔饲养板(平底孔)、吸出培养基、并在每孔中加入150μl的M15。将多通道吸移管(12通道)用于所有以下步骤。
6.从孵育箱中取回胰蛋白酶化的集落并在每孔中加入25μl的M15。通过用多通道吸移管上下移动悬浮液大约5-10次来破碎细胞团。
7.将每孔中的全部内含物转移至步骤5中制备的96-孔板的孔中，每次更换管头。
8.将板置于孵育箱中并生长3-5天，需要时更换培养基。
9.当孔接近汇合时，用PBS清洗两次并在10min内每孔用50μl的胰蛋白酶溶液进行胰蛋白酶化。加入50μl的M15并通过剧烈吸打来破坏细胞团。重新涂布50μl至没有饲养细胞的明胶化96-孔板上。在原来的96-孔板中剩余的细胞可通过加入50μl的2×冷冻培养基并进行步骤4以后的方案而进行冷冻。
明胶化板可生长至DNA制备物汇合并通过“mini-Southern(微小DNA)”印迹(G部分)进行分析。一旦已鉴别靶向的克隆，可从冷冻机中取回合适的孔并扩增用于胚泡注射以及后续的DNA分析(F部分)。
F.在96-孔板中冷冻和解冻ES细胞
在单个小瓶中冷冻ES克隆同时靶向克隆的筛选，是费力且耗时的工作，尤其是如果待筛选的克隆数非常大的时候更是如此。已建议在96-孔组织培养皿中冷冻ES细胞，这可一直允许解冻的克隆100％回收。参见Ramirez-Solis et al.，Methods in Enzymology，1993。
1.冷冻前4小时更换细胞上的培养基。
2.通过吸出而去除M15培养基并用PBS漂洗细胞两次。
3.用多通道吸移管每孔加入50μl的胰蛋白酶溶液并在37℃、5％CO2下孵育板10min。
4.每孔加入50μl的2×冷冻培养基并使集落离解。
5.每孔加入100μl的无菌轻质石蜡油以防止在-70℃保存期间脱气和挥发。
6.用封口膜(Parafilm)密封96-孔板并将其置于泡沫聚苯乙烯箱中；封闭该箱并将其保存在-70℃下至少24小时。为了长期保存，将板转移至零下135℃的冷冻机中。
7.为了解冻，将96-孔板从冷冻机取出并将其置于37℃孵育箱中10-15min。
8.鉴别所选的克隆并将孔中全部内含物置于具有饲养细胞且含2ml的M15培养基的1-cm板(24-孔)中。第二天更换培养基以去除DMSO和油。
G.使用在多孔板上直接制备的DNA进行Southern印迹(DNA印迹)分析
通过Southern印迹进行筛选，必需对集落进行体外扩增以提供足够的DNA进行这样的分析。在这种情况下，非常重要的是，提高提取过程中DNA回收的效率，这将因此减少细胞进行扩增的时间。克隆的复制品可在进行该分析时冷冻。已给出在96-孔板中直接冷冻细胞的方案(F部分)。为了进一步提高基因靶向方案的效率，开发了一种DNA提取技术，该技术提供快速、简单并且可信赖的方式以通过Southern分析筛选大量的克隆。在将细胞悬浮液分为两个半份且一个半份已冷冻后，将另一半份涂布在明胶涂覆的96-孔复制板上(E部分)。这一最后的板提供用于DNA微量提取程序的起始材料。细胞的溶解在板中通过加入溶胞缓冲液并在潮湿气氛下于60°孵育过夜而实施。核酸在板中沉淀并保持附着于其上，同时通过快速翻转板而去除溶液；然后漂洗核酸、干燥、并在板中用限制性酶切割DNA。所有96个样品通过在同一块胶中进行电泳而分离。这大大加快了通过Southern印迹进行筛选的速率。这种方案已用于测试多种限制性酶，并且使用这种方法全都获得完全的DNA限制性酶切。然而，应当在大量筛选前与所选酶进行先导反应。当处理大量板时，标记底部和盖以避免混淆。参见Ramirez-Solis et al.，Methods in Enzymology，1993。
1.每天(4-5天)允许明胶涂覆的板上的细胞生长直至它们使培养基变黄。
2.当细胞准备用于DNA提取程序时，用PBS漂洗孔两次并向每孔中加入50μl的溶胞缓冲液。
3.在潮湿气氛下于60°孵育板过夜。这可通过在密闭容器(Tupperware)用湿纸巾于常规60°箱中孵育板而容易地实现。
4.第二天，使用多通道吸移管向每孔加入100μl的NaCl和乙醇(150μl的5M NaCl至10ml冷的无水乙醇中)的混合物。
5.在室温下同时没有混合地将96-孔板置于试验台上30min。核酸沉淀为丝状网络。
6.小心翻转板以去除溶液；核酸保持附着于板。在纸巾上印迹过量液体。
7.使用多通道吸移管，通过每孔滴入150μl的70％乙醇漂洗核酸3次。通过每次翻转板去除乙醇。
8.在最后清洗后，翻转板并使其在试验台上干燥。DNA准备用限制性酶切割。
9.制备限制性消化混合物，包含以下成分：1×限制性(酶)缓冲液、1ml亚精胺(spermidine)、牛血清白蛋白(BSA，100μg/ml)、RNA酶(100μg/ml)、以及10单位的每种限制性酶。
10.用多通道吸移管每孔加入30μl的限制性消化混合物；使用吸移管管头混合孔中内含物并在湿润气氛下于37℃孵育该反应过夜。
11.向样品中加入凝胶电泳上样缓冲液并进行常规电泳，并将DNA转移至印迹膜。使用6x10英寸的1％(w/v)琼脂糖凝胶，其具有3个33-齿的梳子，每个之间间隔3.3英寸。每个梳子提供足够的空间用于96个样品加1个分子量标记物泳道。于80V在1×TAE中进行凝胶电泳4-5小时，获得在1-10kb范围内良好分离。
H.在小瓶中冷冻和解冻胚胎干细胞
应该扩增看起来具有期望突变的克隆并在小瓶中进行冷冻。参见Ramirez-Solis et al.，Method in Enzymology，1993。
1.在37℃用0.2ml的胰岛素溶液将已经在1-cm平板(E部分)中扩增的细胞解离10分钟，然后通过加入1体积的M 15使胰蛋白酶的作用停止并如前文所述使细胞团解聚。
2.取用于胚泡注射和用于进一步DNA分析扩增所需的细胞，并将其他细胞如下冷冻。
3.缓慢加入1体积的2x冷冻介质(培养基)并将细胞悬浮液温和地与其混合。
4.在无菌冷冻小瓶中将细胞悬浮液分配成等分试样。将小瓶置于泡沫聚苯乙烯(tyrofoam)容器中，将容器封闭，并在-70℃储存过夜。第二天，将小瓶转移到-135℃的冷冻器或液氮中。
5.为了解冻，将装有冷冻细胞的小瓶转移到37℃的水浴中。
6.当细胞悬浮液解冻时，将其转移到无菌的15-ml试管中。边摇动试管边缓慢加入M 15介质；用M 15介质填充试管并通过在室温下1000rpm离心5分钟来收集细胞。
7.通过吸出而去除上清，将细胞沉淀重悬浮于2ml的M 15介质中，确保没有细胞簇，并将细胞悬浮液与饲养细胞(feeder cell)一起铺到1-cm平板上。在37℃孵育。
IV.使突变进入到种系中
至此，所描述的方案的目的均在于，在ES细胞中产生突变，其方式是细胞保持全能并因此能够有助于猫的体细胞组织，并且更重要的是，有助于猫的种系。因此，使ES细胞在饲养层上生长、保持培养的时间最短(尤其是在低密度下)、以及在每次传代时使细胞的团簇解离总是十分重要的。为了测试每一靶向克隆的多能性，应注射足够的胚泡以达到两升。应确定后代的性别。
ES细胞系通常来源于雄性胚泡，并且广泛有助于注射的胚胎将雌性胚泡转化为雄性动物。这使得一窝幼崽中的雄性的数目不成比例。另外，希望转化为雌性胚泡的雄性，因为它们仅将ES细胞来源基因传递给它们的后代。它们的生育能力通常会下降，而这个缺点在更大程度上被能育动物(fertile animal)的突变的有效传递所抵消。经验表明，如果克隆体不能在10-12个后代中得到高ES细胞贡献的嵌合体或良好的性别反常，那么对该克隆体进行重复注射也不太可能导致生殖种系传递。应对那些克隆体中的雄性嵌合体进行试验繁殖。理想地，对于任何突变，应在种系中构建两个克隆体以确认表型是基因工程改变的结果。在理想的条件下，80-90％的注射克隆体应通过种系传递。对于技术的总体讨论，请参见Ramirez-Solis et al.，Methods in Enzymology，1993。
A.具有胚胎干细胞的8-细胞期胚胎的聚集
以下程序是从在Stewart在″Production of Chimeras Between Embryonic Stem Cells and Embryos.″Methods in Enzymology，1993中所描述的方案改编的。
现在，有三种产生ES细胞嵌合体的方法：(1)胚泡注射，(2)桑椹胚注射(morula injection)，以及(3)桑椹胚聚集。本方案将利用桑椹胚聚集。
对于聚集程序而言，所有必需的是具有放大率为40x的优良的立体解剖显微镜和嘴控微吸移管。也可以对这种程序进行修改，以产生完全来源于ES细胞的胚胎/猫。这涉及ES细胞与两种四倍体4-细胞期胚胎的聚集。四倍体胚胎通常是通过在2细胞期对二倍体卵裂球实施电融合而产生的。二倍体ES细胞与四倍体卵裂球的聚集导致ES细胞形成大多数ICM，而四倍体胚胎的衍生物倾向于形成胚外膜，例如滋养外胚层和卵黄囊内胚层。因此，在出生时，来源于ICM的胚胎将很大程度地或完全来源于ES细胞。来源于四倍体胚胎的胚外膜，以胎盘和卵黄囊的形式，在出生时丧失。
B.用于聚集的8细胞期胚胎的制备
1.想在开始进行FSH和hCG处理后的第11天和第13天之间，通过子宫灌洗实施胚胎的手术回收。分离8-细胞期胚胎。将该胚胎在M2中冲洗两次以除去任何细胞碎屑、血细胞等，并在石蜡油下的CZB液滴加葡萄糖培养基中进行培养。参见上文中提到的Stewart。
以下步骤在Verstegen，Journals of Reproduction and Fertility，1993中描述了：
2.为了使ES细胞与胚胎聚集，有必要除去透明带。这是通过在预热的(37℃)酸化台罗德溶液(Tyrode’s solution)的培养皿中孵育胚胎20-40秒来实现的。在第10批次中，应该将该8-细胞期胚胎引入到含有酸化台罗德溶液的35mm皿中。台罗德溶液的较低pH导致透明带溶解于盐水溶液中。如果胚胎要完全游离于它们的透明带，则酸化的台罗德溶液应为pH 2到3之间。该透明带一消失，就将胚胎从台罗德溶液中取出并在M2培养基中冲洗3次。
3.在60-mm细菌级培养皿中，建立三滴含有50∶50的DMEM加FCS和CZB加葡萄糖的混合物的培养基的20-μl液滴。另外，建立20滴相同培养基的1-μl液滴。用浅色石蜡油覆盖。三滴20-μl的液滴将会保持为与胚胎聚集而成的ES块(见下文)。向每一个1-μl的培养基液滴中转移两个8-细胞期胚胎。小液滴的益处在于它们不仅为过夜培养提供足够的营养，而且还在物理上限制了胚胎。当已建立20对液滴后，将培养皿放回到孵育器中。
C.用于聚集的胚胎干细胞的制备
以下的程序在前文提到的Stewart中已经进行了描述。
1.将ES细胞制成每5至10个细胞的聚集体而不是单个细胞(其很难操作)。
2.用不含Ca2+/Mg2+的PBS清洗35-mm或60-mm的ES细胞培养皿两次，在该培养皿中细胞在饲养器上生长(在对数期)为集落。然后用含有0.5mM EGTA的无Ca2+/Mg2+的PBS覆盖细胞并静置5min。这使得集落中的细胞松开它们彼此之间的附着。利用用嘴控吸移管吸取松开的ES细胞集落，该移液管的内部开口直径约为50-75μm，且尖端边缘通过火焰抛光而变得平滑。然后将集落转移到50∶50的DMEM加10％FCS和CZB培养基混合物的20-μl微滴。通过在移液管和微滴之间温和地来回吹动该集落，使集落破裂为ES细胞块。该团块允许停留在培养皿的表面上。选择5-10个细胞的单个团块，然后将其引入到含有两个8-细胞期胚胎的1-μl液滴中。
3.聚集程序包括利用嘴控吸移管将ES细胞的团块推入到两个卵裂细胞之间的缝隙中。重要的是确保胚胎还没有由于更容易与未紧密结合的胚胎发生聚集并且通常会导致产生粘附于卵裂细胞的细胞团块而开始变得紧密。然后通过将培养基挤压/轻轻地吹动至某个位置来操纵第二个胚胎，以使其夹住附着于第一个胚胎的ES团块。两个胚胎必须彼此接触。ES细胞粘附于胚胎以及随后的聚集是温度依赖性的，并且如果培养皿和胚胎允许显著冷却，则整个过程就变得更加困难。当所有的胚胎已经被聚集时，将培养皿放回到培养箱中。15至20min后，应检查每一个聚集体以确保胚胎仍然彼此附着，并且附着至ES细胞的团块。如果ES细胞的团块没有粘附于胚胎(这能够通过将整个聚集体绕着微滴吹动以确保所有的组分彼此粘附而确定)，则用另一组替代这些细胞。然后将聚集的ES细胞/胚胎培养过夜。第二天早上，大多数聚集体应形成胚泡。然后将这些胚泡通过手术地转移到代孕受体的子宫中。
V.将胚胎转移至代孕受体
A.代孕受体(pseudopregnant recipient)的制备
对于处理的胚胎发育至足月，它们必须回到子宫中用于正确移植和发育。雌猫必须与雄猫交配，以使它们启动与妊娠有关的生理学变化。如果雌猫与正常的雄猫交配，它们就会由于交配而怀上能存活的胚胎。这些胚胎的存在会与转移到受孕雌猫的子宫中的任何实验操作的胚胎进行竞争。为了避免这种竞争但仍诱导妊娠，使雌性受体与输精管被切除的雄猫交配，该雄猫能够与雌性交配，但不会产生受精卵。参见上文中的Stewar。
B.切除输精管的雄猫
以下程序在上文中提到的Stewart中描述。
1.通过单次注射阿佛丁(Avertin)来麻醉4至6个月大的雄猫(Taylor，The Mltimate Cat Book，Dorling and Kindersley Ltd.，N.Y.，N.Y.，1989)。通过将0.5g的2，2，2-三溴乙醇加入到在1-ml微量离心管(eppendorf tube)中的0.63ml叔戊醇中来制备阿佛丁。涡旋震荡以使三溴乙醇溶解。将0.5ml的该溶液加入到19.5ml预热的0.9％盐水溶液中，其中，麻醉剂将在振荡后溶解并将其冷却。注射的剂量为0.012ml/g体重。
2.将麻醉的雄猫仰面放置，用70％乙醇溶液擦拭其腹部，然后用剪刀穿过皮肤横向切开其腹部。所有的手术程序均在具有入射光源的立体解剖显微镜(stereo dissection microscope)下进行。
3.暴露下层的腹膜并进行横切。这应该暴露出两个脂肪垫(髌后脂垫，fat pad)。
4.利用一副平头镊子(blunt forcep)夹住其中的一个脂肪垫并将其拉出体腔外。这导致睾丸也随之被拉出。在脂肪垫之下并与睾丸相连的是一条肌肉管(muscular tube)，即输精管。这能够通过沿着其侧边延伸的一条血管来识别。
5.利用一副精细镊在输精管上形成一个环。镊子的尖端已被预先加热，从而烧灼并切断该输精管的环。这会导致组织的一部分被去除，并且其剩余端被密封。
6.然后将睾丸/脂肪垫轻轻地放回到腹膜腔中，并对另一个睾丸重复进行该处理。
7.一旦操作完成，就利用手术针和线将腹膜切口缝合在一起。然后利用创口夹将皮肤切口夹在一起。
8.然后使雄猫复原。安排该动物与雌猫进行交配以确保其没有生育能力。在手术后10-14天除去创口夹。
C.将经处理的胚胎转移至代孕受体
使注射/聚集的胚胎发育至足月，它们已经被转移到代孕受体(即切除了输精管的雄猫交配后的雌猫)的子宫中。对于桑椹胚注射/聚集，在第二天发生转移，即，一旦它们发育至胚泡期，接着在体外培养过夜。参见前文中Stewart所描述的。
最好将胚泡转移至胚泡期后妊娠期为1天的代孕受体。在正常妊娠期中，在13只怀孕的猫的子宫中发现了胚泡，因此将该经处理的胚胎转移到1天的代孕受体的子宫中。这显然为从体外处理到体内恢复提供了时间。(Verstegen，Journals of Reproduction and Fertility，1993)。向12天的受体的转移还导致了与将胚泡转移到同步受体(即，怀孕第12天的雌猫)时相比较的高移植发生率。
如果可能，6-7个胚胎应转移至每个子宫角(uterine horn)。如果可用的子宫角较少，则仅向一个角转移也是满足要求的。
1.通过注射阿佛丁来麻醉与之前已切除输精管的雄猫交配后12天的雌猫。雌猫的年龄应为18至36个月(Taylor，The Mltimate Cat Book，Dorling and Kindersley Ltd.，N.Y.，N.Y.，1989)。
2.称重后，对雌猫腹膜内注射适当体积的阿佛丁(参见关于切除雄猫输精管的部分)。动物应被完全麻醉2-3分钟，这通过轻轻挤压其中一只后爪来确定。如果动物出现迅速地反复摇动的反应，则动物没有被麻醉，并且需要更长时间的麻醉以取得完全麻醉的效果或再给予原始剂量的约三分之一的额外注射。
3.一旦完全麻醉，将雌猫仰面放置，用70％乙醇溶液擦拭其腹部，然后用剪刀穿过皮肤横向切开其腹部。所有的手术程序均在具有入射光源的实体解剖显微镜下进行。打开切口，切除或拨开一些使皮肤附着于紧贴在皮肤下方的腹膜的透明肠系膜。皮肤切口使腹膜移动至能够看到右侧卵巢就在腹膜下方的位置处。通过辨认浅樱桃红色(由于含有大量的黄体酮(copora lutea))来识别卵巢。穿过腹膜的切口不大于0.5厘米，小心操作以避免切到腹膜中的任何血管。卵巢附着于脂肪垫并附着于输卵管和子宫。通过抓住脂肪垫，用一副平头镊子将卵巢、输卵管、和子宫拉出腹膜腔，暴露子宫的卵巢一侧。为了防止子宫滑回到腹膜腔内，用一对小的动脉瘤夹夹住脂肪垫，该动脉瘤夹足够重而防止该器官滑回。在手术过程中不接触子宫是非常重要的，因为外伤会导致胚胎移植的失败。
4.将子宫的卵巢端放置在腹膜壁上，利用新的(灭菌的)25号注射针头在子宫-输卵管接合处上方的子宫中开一个小孔。只需要用该极其锋利的针头的尖端贯穿子宫即可，针的插入应不超过1-2mm。
5.在此处，已经取得了待转移的胚泡并置于转移管中。这些转移管能够容易地在气体或酒精灯火焰上拉紧。其内径应为约100μm，并且尖端的长度应不超过2-4cm。用嘴将浅色的石蜡油吸入到吸移管的腔内。石蜡油的粘度能够在吸移培养基中获得更精细水平的控制，这需要拾起胚泡并将其转移至子宫内腔中。将待用于转移的胚胎置于其中装有预热的M2培养基、其中未用石蜡油覆盖培养基的35-mm培养皿中。将尖端填充有石蜡油的吸移管引入到M2培养基中。将少量的培养基吸入到尖端中，之后产生一个小气泡。吸取更多的培养基至约0.5-1cm，然后产生第二个小气泡。然后以尽可能小体积的M2培养基吸取6-7个胚泡，之后形成第三个气泡。气泡充当用于确定胚胎位置的标记，因为它们在吸移管中比胚胎更容易被观察到。夹住胚胎的两个最下端的气泡指示吸移管中胚胎的位置。第一个最上端的气泡起到指示所有的胚胎都已经被转移到子宫中的标记的作用。
6.用一副精细镊夹住输卵管以稳定子宫。将转移管的尖端插入到子宫壁中的小孔中，并向子宫内腔中推进约3-5mm。这种操作应轻轻地进行；任何抵抗表明接触到了子宫内膜。将吸移管足够深地插入到子宫中之后，将其抽回1-2mm以确保尖端(仍在腔内)处的开口不与子宫内膜接触，与子宫内膜的接触会阻断胚胎离开吸移管进入子宫内腔中。将胚胎排入到子宫内腔中，之后通过观察气泡来进行转移。当观察到最后一个气泡(即距石蜡油最近的气泡)进入子宫时，抽回吸移管。尖端立即放入含有剩余胚泡的培养皿中，使培养基通过该尖端逐渐反复吸放。这样就清除了可能附着于尖端的任何血液，如果血液凝结，就会堵塞尖端。这样的清洗还确保了所有的胚胎都被转移到子宫中。然后利用相同的培养基和气泡的安排，将下一组胚泡吸入到吸移管中。
7.在从脂肪垫将动脉瘤夹除去后，将转移到子宫中的胚胎温和地推回腹膜腔内。将壁夹在一起并将其缝合，尽管这通常不是必需的。对剩余的子宫角重复该过程。当手术完成后，通过两个或三个0.9mm创口夹将形成切口处的皮肤边缘钉在一起(Clay Adams，Becton-Dickinson and Co.，Parsippany，NJ)。将受体置于37℃的暖箱中以保持猫的温暖，直至其恢复意识。经过处理的胚胎应在转移后的60-70天内出生(Taylor，TheMltimate CatBook，Dorling and Kindersley Ltd.，KY.，KY.，1989)。
可以在ES细胞水平敲除两个等位基因并直接产生纯合的动物。然而，在正常情况下，注入杂合细胞，然后繁育携带期望靶位点的猫以产生纯合体。一般参见Robbins，Circμlation Research 73：3-9(1993)。
已经描述了本发明的优选实施方式，对于本领域普通技术人员明显地，对所披露的实施方式可以进行各种修改，并且这样的修改也包含在本发明的范围内。
VI.利用包括核移植的其他技术来产生无变应原的转基因动物
尽管以上的程序描述了胚胎干细胞在产生无变应原动物中的应用，但是其他克隆技术也能够用于产生转基因动物。一种这样的技术是核转移。在这种程序中，例如能够通过用包含灭活的变应原基因的靶载体来转染成熟的体细胞而改变来自发育成熟的体细胞的DNA。当确认基因失活后，通过血清饥饿3-4天使供体细胞在G0-G1期休眠。这些技术都是本领域中公知的，参见例如Wilmut et al.(1997)，Nature 385：810和Kato et al，(1998)，Science282：2095-2098，它们均具体结合于本文作为参考。使这些供体细胞与来自相同动物种类的摘除细胞核的卵母细胞(oocyte)融合。胚胎环境中的分子使分化的成熟DNA恢复成胚胎DNA。然后这些细胞开始分开，就好像它们是新发育中的胚胎的一部分。因此，将这种衍生的核移植体在体外培养成胚泡，并将胚泡通过上文中描述的手术方法或非外科手术方法在发情期开始后的适当时间转移到代孕母体内。所得到的怀孕胚胎能够怀孕至足月并且分娩得到转基因动物，优选通过引导分娩或利用本领域已有的公知技术通过外科手术辅助分娩。
作为一种用于研究胚胎发生的工具并且作为一种倍增胚胎的方法，核转移已经被用于哺乳动物。已经从所构建细胞系获得了核转移后得到的各种活的哺乳动物幼崽。例如，在来自绵羊胚胎的细胞出生后，在将细胞核摘除到卵母细胞中之前通过血清饥饿诱导已培养6至13代的小羊沉默。供体细胞中的沉默的诱导可以更改供体染色体结构，从而有助于细胞核的程序重排并且能够发育。参见Campbell等人，Nature 380，64-66(1996)。据预测，核转移将为分析和修改其他牲畜物种的基因功能提供强有力的机会。
实际上，在工作之前和之后，科学家已经能够使用核转移来产生非小鼠动物克隆。因此，Sims et al，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6143-6147通过从培养的内部细胞团细胞转移细胞核来产生幼崽(calve)；Wilmut et al.(1997)，Nature 385：810和Schnieke et al.(1997)Science 278：2130指出，来自胎儿成纤维细胞的细胞核直接形成小羊；Cibelli et al.(1998)Science 280：1256利用来自胎儿成纤维细胞的细胞核克隆了家牛幼崽；Wakayama et al.(1998)Nature394：369使用核转移由细胞分裂中期II的卵母细胞收集的卵丘细胞(cumμlus cells)来产生具有生育能力的小鼠；Kato et al.，(1998)，Science 282：2095-2098利用核转移技术由单个成体的卵丘细胞和输卵管细胞克隆了八只幼崽；以及Chesne et al.，(2002)，Nature Biotechnology，vol.20：366-369利用核转移技术产生克隆家兔。此外，Kuroiwa et al.，Nature Genetics，vol.36，no.7，第775-780页(2004)和Yang et al.，Nature Genetics，vol.36.，no.7，第671-672页报道了经由同源重组在牛中成功基因靶向，而特定地修饰了免疫球蛋白基因。因此，已知核转移和同源重组产生具有修饰的基因型的克隆动物。
核转移还成功应用于克隆猫科动物猫。因此，Gomez et al.，Biology Of Reproduction 69，1032-1041(2003)，使用核转移来克隆非洲野猫，其全部内容结合于本文作为参考。在该报道中，通过以下处理之一使非洲野猫和家猫成纤维细胞同步化：(1)接触抑制、(2)血清饥饿、或(3)roscovitine(细胞周期蛋白依赖激酶)；并且然后在37℃利用附着于装配有Hoffman调节对照目镜和温度控制台装置的倒置显微镜(Olympus，Tokai Hit，日本)的显微操作器(Model MMO-202D；Narishige Instrument，东京，日本)来实施核转移。裸露的M-II卵母细胞在补充有非必需氨基酸和其他营养物质的盐溶液中孵育15分钟，然后从卵母细胞摘除细胞核。将第一极化体和约10％的下层细胞质吸入到摘除吸移管中，随后通过表面荧光显微镜(epifluorescence microscopy)证实除去了分裂中期纺锤体。
然后，Gomez将非洲野猫成纤维细胞引入到在体内或在体外成熟的摘除细胞核的卵母细胞的卵黄周空间中。通过将每个核移植偶联体置于附着于显微操作器的两个不锈钢电极之间而在融合介质中发生融合，然后向供体细胞/细胞质的共享膜空间垂直地递送各种脉冲。
在这些融合脉冲之后，冲洗核移植偶联体并进行培养，然后通过确认在卵黄周空间中存在或不存在供体细胞来可视地评价融合。为了确定细胞融合方法是否诱导同时发生的卵母细胞活化，通过与上文所述相同的程序使体外成熟的DSH卵母细胞在存在或不存在钙的融合培养基中经受电脉冲，并进行培养以确定卵裂频率。
融合偶联体的活化是通过进一步施加脉冲，然后重新构建偶联体来实现的，并且对单性生殖活化的卵母细胞进行培养直至胚胎转移的那一天或直到第8天。参见Gomez(在前文提到)的材料和方法部分。
此外，Gomez之后报道了成功产生了克隆的非洲野猫幼崽。参见Gomez et al，Cloning Stem Cells.2004；6(3)：247-58(″Birth of African Wildcat cloned kittens born from domestic cats″)。Gomez利用核转移并通过使非洲野猫成纤维细胞核与家猫的细胞质融合而产生克隆的胚胎。克隆的胚胎是通过使一个非洲野猫体细胞在体内或体外融合到摘除细胞核的家猫细胞质中而产生的。总共出生了17只克隆的小猫，其中7只生下来就是死胎，8只在分娩后数小时内死亡或活到6周，两只健康并存活。围产期死亡是由于早产分娩的肺部发育不成熟、胎盘分离以及细菌性败血症。随后对12只猫进行的特异性小随体基因座(microsatellite loci)的DNA分析证实了所有的17只小猫都是非洲野猫雄性供体的克隆体。因此，Gomez(2004)报道了通过核转移成功产生了存活的非洲野猫小猫。因此，Gomez最近报道的核转移在猫类中的成功应用通过以与其他哺乳动物种类相同的效率水平出生家猫和非家猫而得到证实。在猫类中，已经证实在体内或体外成熟的卵母细胞都能够用作供体细胞质。参见Gomez et al.，Theriogenology，Volume 66，Issue 1，2006年7月1日，第72-81页。
此外，Choi et al.，Cloning and Stem Cells，Vol.9，No.2，第281-290页(2007)最近报道了来源于成体体细胞核转移的克隆的雄性猫成功地具有繁殖能力，其披露内容结合于本文作为参考。它们已经被用于核转移而成功地产生了四只克隆的猫。参见Yin et al.，Reproduction，129，第245-249页。其中，Yin利用上文中所述的各种猫的卵母细胞，通过使猫细胞经受核转移、核转移胚胎的体外培养以及细胞计数、受体雌猫的同步化和胚胎转移、小随体分析、以及统计分析的步骤来处理各种猫的卵母细胞。简言之，通过轻轻地吸移而除去来自卵母细胞的卵丘细胞并对得到的裸露卵母细胞进行培养。然后利用显微操作将单个核供体细胞置于去除细胞核的卵细胞的卵黄周空间中，然后经由电融合来融合。然后对克隆的胚胎进行培养直至胚胎转移。
然后，对融合的偶联体进行培养并且在当利用荧光显微镜评价胚泡中的细胞数时的第二天评价核转移胚胎的卵裂和胚泡发育。然后通过手术将这些克隆的胚胎转移到受体雌猫的输卵管中。在融合后的单细胞期或在培养后的二细胞或四细胞期将克隆的胚胎转移到同步化的雌猫的输卵管中，并稍后在胚胎转移后第40天或第45天通过触诊来确定怀孕并在第60天通过X射线照相来证实。
Yin确认了通过核转移和代孕受体雌猫成功获得的猫家系分析以证实用于核转移的供体细胞的同一性。从每一只新生猫、受体和供体细胞的耳穿孔器或尾截取物提取DNA。五种猫DNA小随体标记(FCA229、FCA290、FCA441、FCA201、和FCA224)用于确认克隆猫、胎儿和作为供体细胞的皮肤细胞的基因(遗传)同一性。因此，Yin推断他们已经从雄性供体的胎儿成纤维细胞生产出了克隆猫并通过自然分娩形成了雌性供体的成体体细胞。
因此，已知同源染色体重组和核移植的组合靶向并将特异性突变体引入到体细胞中，其然后能够经受核移植的克隆。因此，Wang&Zhou，Reproductive Biology and Endocrinology，1：103，2003，综述了用于不同动物物种的同源染色体重组和核移植的这种成功组合方法。
因此，根据本发明的一种实施方式，产生了移植转基因非人脊椎动物，其中该动物的基因组包含失活的等位基因。更优选地，根据本发明的转基因动物不产生等位基因的功能性产物。根据本发明的另一种实施方式，所产生的转基因动物的体细胞和生殖谱系细胞的等位基因是失活的。根据本发明的另一种实施方式，转基因动物是猫科动物并且能够将失活的等位基因传递给它的后代。
因此，如下文的实施例部分中将要详细描述的，本发明构建了猫体细胞系，其提供了用于靶向FeI d I的目的的可替代猫胚胎干细胞的可行替代。简言之，本发明通过在怀孕第3周至第6周利用标准的卵巢子宫切除术从怀孕的母猫的子宫角分离胎儿组织而得到了猫体细胞系。然后分离结缔组织，将其切碎，并进行培养，之后从剩余的未消化的组织分离胚胎成纤维细胞。然后如在本申请其他地方描述的，在描述用于使胚胎干细胞生长的条件下对原代猫体细胞进行连续培养、扩增并冷冻。基本地，使猫科动物胚胎成纤维细胞生长然后连续培养并连续冷冻和解冻。然后用FeI d I的外源性DNA靶标构建体对这些细胞实施电穿孔。保留可选阳性标记基因(新霉素抗性基因)的猫细胞存活，而不具有Neo基因的细胞死亡。类似地，由于不存在HSV-I tk基因，阴性可选标记对于更昔洛韦(ganciclovir)上的存活，有助于进一步确证和鉴别成功的同源重组事件。因此，随后鉴别了存活阳性/阴性选择的猫体细胞系的集落。
本发明还教导了一种用于产生包含失活等位基因的转基因非人脊椎动物的方法，该方法包括：(a)将包含失活等位基因的动物干细胞引入到动物胚胎中；(b)将动物胚胎移植到代孕动物体内；以及(c)允许动物胚胎成熟成为动物。
根据本发明，用于产生包含失活等位基因、而不产生等位基因，并且其是失活等位基因的纯合体的转基因非人脊椎动物的另一种优选方法，包括(a)将失活动物等位基因引入到动物的细胞中；(b)筛选仅包含失活等位基因但不包含功能性等位基因的动物细胞；(c)分离步骤(b)中的包含失活等位基因的细胞的细胞核；(d)将步骤(c)中的细胞核转移到动物的去核卵细胞中；(e)将该卵细胞移植到代孕动物体内并使该动物怀孕；以及(f)使动物妊娠至足月并获得转基因动物。还可以根据本发明选择具有失活等位基因和功能性等位基因的细胞，即该细胞是杂合的，然后如前面的段落中描述的，孵育克隆动物至纯合(homozygosity)。
以下的实施例仅仅是出于举例说明本发明的目的。然而，应该理解，本发明不限于这些实施例中的特定条件或细节。本文中引用的所有公开文献，包括但不限于美国专利，均特别地结合于本文作为参考。
实施例1
靶载体的构建
A.同源臂
分离并鉴别包含并围绕FeI d I的链1和链2的连续延伸的22182个碱基对的DNA序列。每个链的启动子序列，并发现两条链共用该启动子。链1和链2在互补DNA链上编码，并在相反方向上转录(图7)。另外，鉴别了链1和链2基因的3′端的序列下游。
利用聚合酶链反应(PCR)扩增和DNA测序来实施含FeI d I的序列数据(i)链1、(ii)链2、(iii)启动子和(iv)下游同源臂的组装。公开的FeI d I基因的多核苷酸序列(Griffith et al.，Gene，113(2)：263-8，1992，和Morgenstern et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，88：9690，1991)被用作在Liu&Whittier，Genomics 25(3)：674-81，1995中描述的热不对称交错的PCR(TAIL-PCR)的变异的起始点。
B.同源臂的产生
1.在公开的FeI d I链1和链2的序列上设计具有高退火温度的三个单向巢式正向引物。参见图2和图3。
2.具有低退火温度的随机引物用于在反方向上扩增未知序列。正向引物和反向引物的热不对称性允许从由在FeI d I链1和链2中的已知序列的控制扩增。对于正向引物，通过利用高退火温度来控制扩增的方向，然后用低退火温度来控制反向引物的扩增方向。
3.一旦扩增，就利用所得扩增的PCR产物作为用于第二轮扩增的模板，利用第二巢式引物作为其他特异性的来源，接着利用第三巢式引物进行第三轮扩增。
4.利用凝胶电泳对PCR产物进行分析，将产物从琼脂糖凝胶上切下，克隆到DNA质粒中，并利用自动化的二脱氧核苷酸染料-终止子测序进行测序。
5.然后合成与新产生的序列匹配的寡核苷酸测序引物以完成PCR产物的测序，并组装一个连续序列。
6.一旦DNA测序完成，组装体的末端用作TAIL-PCR反应其他循环的起始点。将其他的重叠序列组装成一个长度为x个碱基对的连续序列。链1和链2的上游启动子序列的序列同一性使得能够正确定位两条链的序列数据。
7.设计与链1和链2的下游序列匹配的巢式PCR引物，利用长范围的PCR扩增来分离侧接链1和链2的同源臂。利用在25μL的反应体积中在含有10mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2(pH 8.3)的反应缓冲液中的Taq聚合酶，在20ng猫基因组DNA上进行初始PCR反应。以各自最终浓度为0.4mM加入dNTP。1.5μL的第一反应(产物)用作利用巢式引物或半巢式引物的第二反应的模板。以最终浓度为0.4μM加入正向引物和反向引物
8.所有反应的循环条件是：在95℃3分钟的初始变性步骤；之后20个循环的在98℃10秒钟的变性步骤；在60℃20秒的退火步骤；以及在72℃6分钟的伸展步骤。在72℃10分钟的最后伸展步骤以终止反应。
引物序列：
链1同源臂：
第一反应：
正向：ATGACAGAAGAGGATAAGGAGAATGC
反向：GTAGGCCATTAGATTTTGTATTTGG
第二反应：
正向：GGATCTTCAAACTGTTTGCACTAGG
反向：GTTCTTTTTTTCCTTTTAAAAAATGTG
链2同源臂：
第一反应：
正向：AGTGTTTCTGATACTAAACAAAGTCCAG
反向：GTTCTTTACACCTAAAGCTGGAATCC
第二反应：
正向：GCATTTCTCTGGAATTAAGTGGC
反向：GTTCTTTACACCTAAAGCTGGAATCC
C.选择标记
为了有助于检测哪些细胞被正确靶向，将选择标记加入到载体中。将新霉素抗性(neo.sup.r)和胸苷激酶(HSV-I tk)整合到载体中分别作为阳性和阴性选择标记。对于猫体细胞系而言，已经确定了选择试剂庆大霉素(G418)和更昔洛韦的具体浓度。
1.通过克隆鼠3′-磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子的新霉素抗性基因下游，以及牛生长激素多核苷酸化位点(bGH-pA)的上游来构建阳性选择盒。PGK启动子已经证实在几乎所有真核细胞，包括胚胎细胞中被表达(Adra et al.，1987，Gene 60：65-74)。bGH-pA位点作为转染的终止子是高度有效的，并且在mRNA的3′端加入多聚腺苷酸尾(Campbell，N.A.1996.Biology，Fourth Edition.Menlo Park，CA：Benjamin/Cummings Publishing Company p.370-374)。
2.在FeI d I链1和链2同源臂之间克隆阳性选择盒。同源臂的相对取向是保守的，使得链1和链2的编码序列以及它们的启动子在靶载体中被阳性选择盒代替。在猫基因组中正确重组后，两种基因和启动子的整个编码序列由阳性选择盒代替。
3.通过克隆MCl启动子的HSV-I tk基因下游来构建阴性选择盒。MC1启动子在几乎所有类型的细胞中均表达(Thomas&Capecchi，1987，Cell 51：503-512)。
4.在靶载体的同源臂外部克隆阴性选择盒，使得在猫基因组正确克隆后切去阴性选择盒，同时阳性选择盒保持完整。参见图9。
实施例2
胚胎成纤维细胞系
已经构建了猫体细胞系，其为用于靶向FeI d I基因目的的猫胚胎成纤维细胞提供了一种可行的替代选择。
A.猫体细胞系的衍化-猫胚胎成纤维细胞FEF
1.通过标准的卵巢子宫切除术在妊娠的第3周-第6周之间从怀孕的母猫的子宫角中分离胎儿组织。从胎儿组织切除外胚膜。
2.然后分离结缔组织，将其切碎，并在含有2mg/ml胶原酶和0.25％胰蛋白酶的DMEM基础培养基中在37℃在周期性搅拌下孵育15分钟。
3.通过50微米孔拉紧、用PBS冲洗并通过离心浓缩从残余的未消化组织分离胚胎的成纤维细胞。
B.猫胚胎成纤维细胞的培养和扩增
在上文中所描述的G部分中的生长胚胎干细胞的条件下对原代猫体细胞进行连续培养、扩增和冷冻。
1.FEF在具有5％二氧化碳的湿润保温箱中在37℃迅速生长
2.FEF在ES-DMEM培养基但没有添加白血病抑制因子(LIF)中生长。在不使用小鸡血清的情况下，在分别稀释1/4或1/8的条件下每2或3天对FEF进行传代。
3.然后成功地对FEF进行15至20个传代，同时保持稳定的核型。这些FEF被成功地冷冻和解冻。
实施例3
胚胎体细胞系的靶向
体细胞中的基因靶向已经在许多不同的物种中成功进行了许多年。我们使用上文中描述的载体来靶向猫成纤维细胞系中的靶标FeI d I。
A.电穿孔
如上文中描述的用于猫胚胎干细胞，用外源性DNA靶向构建体来对猫胚胎体细胞系(FEF)实施电穿孔。
B.选择
1.FEF用庆大霉素(G418)的阳性选择：在电穿孔24小时后，当在500微克G418/ml ES-DMEM中进行培养时，保持新霉素抗性基因(Neo)的FEF细胞存活。而没有新霉素基因的FEF在G418中培养2-7天后死亡。
FEF用更昔洛韦的阴性选择：随后在含有500纳克更昔洛韦的ES-DMEM中培养2-7天内，保留HSV-I tk基因的FEF细胞在电穿孔后24小时死亡。而缺少HSV-1tk基因的FEF细胞在更昔洛韦中培养后存活。
2.如上文中所述，在电穿孔和扩增8-10天后取得存活的阳性/阴性选择的猫体细胞系的集落。
C.通过PCR基因分型确认成功重组
1.从在阳性/阴性选择中存活的扩增细胞系制备DNA，并使用PCR扩增来验证在内源性FeI d I基因座中的正确整合。PCR引物被设计成与FeI d I链1同源臂的右侧外部以及阳性选择标记的多腺苷酸化位点(bGH-pA)中的DNA序列；以及与链2同源臂的右侧外部和阳性选择标记内部的启动子序列(PGK)相匹配。只有正确靶向的FeI d I，其中在两个同源臂中的重组事件替代FeI d I链1、链2和启动子，携带具有足够短距离以能够进行PCR扩增的正向引物和反向引物。
2.如上文所述的实施PCR反应。所有反应的循环条件如下：95℃3分钟的初始变性步骤；接着是40个循环的98℃10秒钟的变性步骤；60℃20秒钟的退火步骤；以及72℃7分钟的伸展步骤。在72℃10分钟的最后伸展步骤终止每一个反应。
引物序列：
bGH-pA位点-链1同源臂：
正向：CGACTGTGCCTTCTAGTTGCC
反向：GTAGGCCATTAGATTTTGTATTTGG
链2同源臂-PGK：
正向：AGTGTTTCTGATACTAAACAAAGTCCAG
反向：TTGTGTAGCGCCAAGTGCC
D.利用荧光原位杂交确认FEF中的FeI d I基因座的成功重组
1.猫胚胎成纤维细胞的有丝分裂伸展体(嵌合伸展体，mitotic spread)的制备
FEF的积极生长板在含有1.5mg秋水仙酰胺(colcemid)/ml的ES-DMEM中培养2小时。除去培养基并用PBS代替。轻轻地敲打板以分离分裂的细胞，其更容易地从板上脱离。通过离心使上清中的细胞沉淀并除去上清。将细胞重悬浮于1ml 0.075M KCl的低渗溶液中并在室温下孵育20分钟，以使细胞质膜溶解。用1滴含3份甲醇和1份乙酸的溶液固定该细胞悬浮液。将沉淀物在1000RPM离心5分钟，并重悬浮于2ml固定剂中。重复该程序3-5次，直至悬浮液中没有团块。通过将几滴细胞悬浮液滴加在玻璃载片上并使其风干来制备有丝分裂染色体伸展体。
2.用于双色FISH的探针的制备
绿色荧光探针由克隆的FeI d I链1和链2同源臂制备，并通过在平移缓冲液(translation buffer)(New England Nuclear)中的用荧光素-dUTP和DNA聚合酶I的缺口平移(nick translation)来进行标记。通过生物素化-dUTP的缺口平移产生第二红色荧光探针，以用于含PGK-Neo盒的靶向构建体的外来基因部分。该探针被可视化并通过与结合于德克萨斯红的链霉素一起孵育而使信号放大。绿色荧光探针用作用于成功杂交至FeI d I基因座的阳性对照，因为其结合于靶向等位基因和非靶向等位基因。红色探针结合于靶向等位基因中的外来PGK-NEO序列。两个探针共同定位于适当的靶FeI d I基因座，并且它们出现重叠，作为在荧光显微镜下的黄色信号。
3.探针与载片的杂交
用200微克的胰核糖核酸酶A(RNAse-A)/ml的2X SSC溶液(0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠、pH 7.0)在37℃处理有丝分裂伸展体1小时。然后将载片在2X SSC冲洗5分钟，重复4次，然后在一系列70％、80％、90％和95％的乙醇溶液中脱水并在室温下分别用水冲洗5分钟。然后使载片在2X SSC的70％甲酰胺溶液中变性2分钟，然后再次在相同的乙醇系列中在4℃再次脱水。将10纳克的每一标记的探针样品在含有50％甲酰胺、10％硫酸右旋糖苷、2X SCC、20mM磷酸钠、10x Denhardt′s溶液、和5mg剪切的鲑鱼精液DNA的杂交溶液中稀释。探针混合物在70℃下变性5分钟，然后将其置于冰上。通过在37℃孵育16小时而使载片与探针溶液杂交。在用荧光显微镜可视化之前，用含50％甲酰胺的2X SSC冲洗载片5分钟，重复5次，然后再在40℃用2X SSC冲洗5分钟重复5次。
E.利用DNA印迹分析确认体细胞系(FEF)中的FeI d I基因
座的成功重组
体细胞系中的FeI d I基因座的成功重组能够容易地利用常规的DNA印迹分析来确定，例如，通过采用以下步骤：
1.允许置于涂覆有明胶的板上的细胞生长，直至其每天都使培养基变黄(4-5天)。
2.当细胞准备用于DNA提取程序时，用PBS漂洗孔两次并向每个孔中加入50μl的溶胞缓冲液。
3.在潮湿的环境下在60℃孵育板过夜。这可通过将板在具有潮湿纸巾的封闭容器(Tupperware)中在常规的60℃烘箱中孵育而容易地实现。
4.第二天，利用多通道吸移管向每一个孔中加入100μl的NaCl和乙醇的混合物(150μl 5M NaCl加入到10ml冷无水乙醇中)。
5.在室温下将96孔板置于工作台上30分钟同时不进行混合。核酸沉淀为丝状网络。
6.小心地将板倒置以去除溶液；核酸保持附着于板。在纸巾上印迹过量液体。
7.利用多通道吸移管向每个孔中滴加150μl的70％乙醇来漂洗核酸3次。每次将板倒置来除去酒精。
8.在最后一次冲洗后，将板倒置并允许其在工作台上干燥。DNA备用以用限制性酶对其进行切割。
9.制备含有以下物质的限制性消化混合物：每份样品1x的限制性(酶)缓冲液、1mM亚精胺、牛需求白蛋白(BSA，100μg/ml)、核糖核酸酶(100μg/ml)以及10单位的每一种限制性酶。
10.用多通道吸移管向每个孔中加入30μl限制性消化混合物；利用吸移管尖端将孔中的物质混合并在潮湿的环境下在37℃下孵育反应过夜。
11.向样品中加入凝胶电泳负载缓冲液并进行常规电泳，并将DNA转移到印迹膜上。使用6×10英寸的1％(w/v)的3.3英寸间隔的33齿梳的琼脂糖凝胶。这为96孔板加上每个梳子的一个分子量标记泳道提供了足够的空间。凝胶电泳在1x TAE中在80V进行4-5hr，获得在1-10kb范围的良好分离。
对于本领域技术人员来说很明显地，在不背离本发明的精神或范围的前提下，能够对本发明的方法和组合物进行各种改变和变化。因此，本发明计划包括在所附权利要求和其等同替换的范围内所提供的本发明的各种改变和变化。
序列表
序列描述：SEQ ID NO：1：
TTACTAGAGG ATCCTGCCCA CACATACATC TCCCTCCCTC CAGCCCCCAG GCAGTTCTGA 60
GAAGCAGCCC AGAGAGGCCT GCGGTGCCTC CTGGAAAAGG ATG TTA GAC GCA GCC 115
Met Leu Asp Ala Ala
1 5
CTT CCA CCC TGC CCT ACT GTT GCG GCC ACA GCA GGTACAAAAG GGTTCCAGGC 168
Leu Pro Pro Cys Pro Thr Val Ala Ala Thr Ala
10 15
TGGGGAGGGA GCACCTGCCA CTGCATC ATG AAG GGG GCT TGT GTT CTC GTG 219
Met Lys Gly Ala Cys Val Leu Val
20
CTT CTC TGG GCT GCC TTG CTC TTG ATC TCG GGT GGA A GTAGGTGTCT 266
Leu Leu Trp Ala Ala Leu Leu Leu Ile Ser Gly Gly
25 30 35
GGGACATGAG TGTCTGGGAC ACAGATTCTC CAGGGGTTCA AACACCTTCC CAGGGCACTT 326
CTGAGCATGG CGGGAAGGGG AAGGGAAGAA TGTGTCCTGA TGAGGTCTTT CAAAAGGGAG
386
GGTCAGCTTG TCTTGTGTTC CAG AT TGT GAA ATT TGC CCA GCC GTG AAG 435
Asn Cys Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys
40 45
AGG GAT GTT GAC CTA TTC CTG ACG GGA ACC CCC GAC GAA TAT GTT GAG 483
Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu
50 55 60
CAA GTG GCA CAA TAC AAT GCA CTA CCT GTA GTA TTG GAA AAT GCC AGA 531
Gln Val Ala Gln Tyr Asn Ala Leu Pro Val Val Leu Glu Asn Ala Arg
65 70 75
ATA CTG AAG AAC TGC GTT GAT GCA AAA ATG ACA GAA GAG GAT AAG GAG 579
Ile Leu Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu
80 85 90
AAT GCT CTC AGC GTG CTG GTGGGTCTAG CTCTGTGTCT GTGCCTCTGA 627
Asn Ala Leu Ser Val Leu
95
CGCCTGTCTG GGGGGTCTGC TCAGGGCAGT GCAGGAGGGG GGTTGCTCAT GTTTGTTCTC 687
CACCATGGCC CTTCCCTGGG AATCTGGGAG GAGAAAGACG CCATGGCTGG GGAAGTAGAG
747
GGGCACTCAT GTGGGGCAAG ACTCAGCCTA CCCCTCAAGC TTTGGGGCTG GCCCAGGCTG 807
CTCAACGCTG CTTGGCCACC AGCTTGGGGG GCTGCAGGCC CTCCTATATC CCTGGCATCA 867
CTTGGCCTCA GTGTCAGGCC CTCAGCTCTG GCCTTCCTGA CTCCAGCCTC TCCAGCACGT 927
GAGACTGGAT CTTCAAACTG TTTGCACATA GATGCTTCCT ATCTCCAAAC GTCAGTTCCT 987
TTTCTCTTAA CTCCTCAAGT TCCATATTCC ACCCCCCCCC CCAAAAAAAA CCTCATCTGA 1047
GTCGTCATTC CCTGGGTCCC AGAGGCCATT CTGTGCCTCA AATACTGAGA GAGGAGGAGG
1107
GGAGGGGAGG GGAGAGGAGA GGAGAGGAGA GGAGAGGAGA GGAGAGGAGA GGAGAGGAGA
1167
GGAGAGGAGA GGAGAGGAGA GGCAGCTTCC AAAAAGTTCT CCTGCCCTGC CCAGGCCTGG
1227
GATGCCTGAG TGGAGAATTC CAGTGAATCC TCTCTCTGCT GTCCCAAAGT AGGAACAAGC
1287
TACTGCTTCA GCAACAAGTG TTCAAAGGAC AGAAGAAGGA AGCAGGCTGG ACCAGCTCAT
1347
TCCTGGAGTC TCCAGATGCC CACAGGTGCA TCTGGAGCCC TGCCAGGACC TTCTTGCCAG 1407
CGTCTTTCTA ACCAAGTCTA CCACTTCTAT CCGAGACTGC CCTCCATCCC ATCATAGTCA 1467
CCCCTCTTCT TCACTCTGTT TCATTGGAGG AAGCTTCTAG GCACACCCTG GGATTCTCTT 1527
GTTGTGCAGT AGATTGGGAA GAACCACCTT GGCCTGCTCA GATCCAGAAG CCACCCTCCA
1587
AACAAGCCTG CAGGCTCCTC CCCACAAAGT GTCCAGTGCG TGCTCAGTAG TGTTTGTCCG 1647
TTCTCACGTA CCCCTCAAGG TCTCACCAGG TCTCCTGACT TTCTCTTTGC AG GAC 1702
Asp
100
AAA ATA TAC ACA AGT CCT CTG TGT TAAAGGTAAC T 1737
Lys Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys
105
(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列表特征：
(A)长度：108个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Met Leu Asp Ala Ala Leu Pro Pro Cys Pro Thr Val Ala Ala Thr Ala
1 5 10 15
Met Lys Gly Ala Cys Val Leu Val Leu Leu Trp Ala Ala Leu Leu Leu
20 25 30
Ile Ser Gly Gly Asn Cys Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp Val
35 40 45
Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln Val Ala
50 55 60
Gln Tyr Asn Ala Leu Pro Val Val Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys
65 70 75 80
Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu
85 90 95
Ser Val Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys
100 105
(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：2425个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
(A)名称/码：CDS
(B)定位：接合(215..275，788..969，2221..2298)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
CACATCCTCT CCAAGAGCTT TGTCCTCAAG AGTAGAAGGG CTTCCCACTC TTAACAGCCA 60
AGGGTTGAGG AGCCACCCAC ATGTGCCAGG TCCCTGCCCA CAGGCCTTTG GAGCTTCTGG 120
CGGGGGGGGG GTGTGTGGGC TGGGCTTAGG GTGCTAGTAG TTTATAAAGC AGCAGAAATC
180
CTGTCCTGAG CAGAGCATTC TAGCAGCTGA CACG ATG AGG GGG GCA CTG CTT 232
Met Arg Gly Ala Leu Leu
1 5
GTG CTG GCA TTG CTG GTG ACC CAA GCG CTG GGC GTC AAG ATG G 275
Val Leu Ala Leu Leu Val Thr Gln Ala Leu Gly Val Lys Met
10 15 20
GTGAGAGCAG ATGGAGGGAC AGAGGACCTT CCTGATCCTT GCCCTGCTCT ATCTCACTCC 335
TTCACCTCCC ATGGTGATCT CCAAACAGGT TCTAGCCACA AAGTTAAGCG GCCATGGGGA 395
GATCATTGTC CAGGAGTCCT GCAGAACCCC CCTGATGTTT TTAGTCGTTG AATGGAGGGA 455
GAGGTTTGGA GATGGAGGGG TCATTAGTCG TGCACACAAT AGGGGAGAGT TAGTTGGGGG
515
TAGTGGTGCT TATTTGAAAG GCAGAAACAG GCAGGCTGGG ATGCCCGGAG CACCGGTCAG
575
GGGTCTCTCC GGCTGCTCTC TTCTGCTGAG AGTGCCTCAT AGAAAATGTT CCGTCTGTCT 635
GGGATGTAAG CAGTCCTGGG AGTGGGCAGG TCTCCGCGGA AGGTGAGTCA GAAGACCCTG
695
GATATATGTG AGTTGCTCTC AAGTGGCGGG CAAACAGGAA CCTCCTGCTC TGCTGATTCT 755
TTTGTGAAGG TGTTTTCTGT TTGTGTCTTC AG CG GAA ACT TGC CCC ATT TTT 807
Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe
25
TAT GAC GTC TTT TTT GCG GTG GCC AAT GGA AAT GAA TTA CTG TTG GAC 855
Tyr Asp Val Phe Phe Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp
30 35 40
TTG TCC CTC ACA AAA GTC AAT GCT ACT GAA CCA GAG AGA ACA GCC ATG 903
Leu Ser Leu Thr Lys Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met
45 50 55
AAA AAA ATC CAG GAT TGC TAC GTG GAG AAC GGA CTC ATA TCC AGG GTC 951
Lys Lys Ile Gln Asp Cys Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val
60 65 70 75
TTG GAT GGA CTA GTC ATG GTAATTTCCT ATCCTTCCCC GCCTCCCCAA 999
Leu Asp Gly Leu Val Met
80
CCTTCACGTT GCGCGTGCAG CATATTGTAA TATTCCACAT ACAGACCATG CAGTCAGGGG 1059
CTAATGGCAG GTAAGAGCTA TAAACAATCG AGCACATAAA CCTTTGCTCC GCGCTCTACA
1119
GCACATAGAA TACGCAACCT CACGCCATGT GCACACCCAG CCTGTTCTTC TACCACACGT 1179
GTCCCTTGTG TGCGAATTAC CTTACGCACA GTTGGAAAAT AGGGGACTAA TATCGGTGTG 1239
GCATAGAAAG CGTGTTGACT CGTAGGATTT TTTTCTTTCT AGGTTAGGGG TGTCAGAATT 1299
GCAGGAGTAG GATTTTAGCC TTCCACAGGA AAGAGAAAGT TCTTCATTCA GCTCCTGCAC 1359
ATGTAGGAGC CTTGTCAGTT CTAGTTGAGG AATATTGAAA CTAAGCACCT GCCCTCAGAC 1419
TCTCTTCCCA GGAAGGGACT CCCTGGCTTT GGGAAGCTTC TGGTTTTTGG CTTCTGTTTT 1479
ACTTCCCCTT GTGCCCACCT TGATGGCTGC TATTCCTTTG GTTCAGAGTC TCACTTCCTT 1539
CTGTATCAAT TCAGGGTCTA AAGTCAGTTT CCACTCTGTT TGTTCTGGTG CCTGAGGCCC 1599
TCGAGGCAGC TCCTAGCTAC GTGCAGCTGC ACCCCAGGGC TGGTCAGTGT ATTTCTGGTG 1659
AACTATCTTT TTCTGTTATT TTTCTTGTTG CACAGTTAGG TCGATTTTGG TTAGTCTGTC 1719
TCTTACCTCT ACTTGCCGTT AAGTGCTGAT TCTGTAAAAT GAGAGCTTTG TGAAGAAGTG 1779
GAATTTCTTG CATGACTACG GGCACCCAGG GCACATGGGA TTGTTCACAA CACACACATA
1839
CACATTCCAT ACATCCAGTA CACCTGACAG ATGAGTCTCA GGTGAGGGAG ACATCGCATG
1899
GACCCAGACT CAGCTACCTT GCCCCTCACC CAGGCCATCC CCATCGCGCC CTCCAGAATC 1959
TTCTCCTCTT CTTGCCTCCT CACTGGTTGT TCAGGACTCC TCTGGCACAG GTGCGTGGGT 2019
GACGGGGGGG GGGGGGGGGG GCGTCTCCAT CCTGGTCTGA CTGATCGCGG CCCTCTCTCC
2079
AGAAATCGGT CTGTGGGCTA GAGGTTCTTG CTAGGGACGG AGCGGAATCA CTGGGGATGA
2139
GGCATGAGGT GATCCTGGGG GAATGGATAC GCTGCCATGC GCTCAGGTCT TCTGTCCCTC 2199
CTCGTCTTAC TCTCTCCCCA G ATA GCC ATC AAC GAA TAT TGC ATG GGT GAA 2250
Ile Ala Ile Asn Glu Tyr Cys Met Gly Glu
85 90
GCA GTT CAG AAC ACC GTA GAA GAT CTC AAG CTG AAC ACT TTG GGG AGA 2298
Ala Val Gln Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg
95 100 105
TGAATCTTTG CCGCTGATGC CCCTTCTGAG CCCCATCCTC CTGTCCTGTT CTTTACACCT 2358
AAAGCTGGAA TCCAGACACC TGTCCTCACC TAATTCACTC TCAATCCAGG CTGACTAGAA 2418
TCTGCAG 2425
(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：107个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Met Arg Gly Ala Leu Leu Val Leu Ala Leu Leu Val Thr Gln Ala Leu
1 5 10 15
Gly Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe
20 25 30
Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys
35 40 45
Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gln Asp
50 55 60
Cys Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val
65 70 75 80
Met Ile Ala Ile Asn Glu Tyr Cys Met Gly Glu Ala Val Gln Asn Thr
85 90 95
Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg
100 105
(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
GCCAATATGG GATCGGCC 18
(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp
(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：22182个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ix)特征
(A)名称/码：CDS
(B)定位：
(xi)SEQUENCE DESCRIPTION：SEQ ID NO：7：
ATTCAAATACAAACTTTACCCTCAACAACATTTCATTATATTCAAATATACATAAATTATAATAATT
CTAAATAAAAAAACACGGAAATAATACAATTAATTGATATAAATTATCACAAATATAAAGATTAA
AAATTCCATTTACTAAATACTCAATCTAAATTATTAATCTTACTATTAAAACCTATTTCATATATAA
TTTTAACTCATCTTCAACTTTAATTAAATATGTCACTTTATTAAATCTTATTACTTAACACTAACATT
ATATATTCCACTATGTAACCTAGTAATAATACATATAATGTCACAACTGAAAAACATATCATATAA
AAAAAAAAAAAATTTCAAAACAAAACGCGATAAAGAACAACACCAGCATCGGACCAGAAAACAG
CCAAAACTATACCCTCAACCATGTACAGAAATTTACCAACAAATCAAAGTCCAACGCCGTATTTGT
AGTCTCTAGAAGTGAGATCAAGTCCGAAGCTATAGTCGGACACTCACCCCATCGTTCCGCACAGAC
GCCCCAACCAAGAACTATTTTAAACGATACAACCAGACATCCGGAAAGGTTCACAGCAACATTAT
TTGTCGTAGCCAAAAAAGGTGGGAAGGACCCAGATGCCCATCACAGATGAACGGATAAATAAGA
AGTGGTCTCTCCAAGCAATGGGATATGATTTGACTCTAAGAAGGAATCAAGTAGTAATGTATACTA
CCACATGGAAGAATCTTGAACAAGTGCTGAGCACAAGAAGCCAGTCACAAAAGGCCTGATTCTAT
CCACAGGAAACGTCCAGAACAGGCAAATCCAGACTGGTGGTTGCCAGGGCCTGGGAGAGGTGAAT
GGGGAGTGATAGCTAACAGGCACAGCGTTTATTTTGGGGGTGAATAAAATGTCTGGAATTCAAGA
ACTGTGATGGTTGTACAACCTGATGAATATACCAGAAAACACTGAACTGTCCTCAAGAGTAAATG
AACTTACAGGACATGAGTTGTATCACGATAAAGCTGTTACACCTGTTTGCAGACAGCTGTGGAGAA
ACAGGCCCATCCCTCCACTTCCAGAGCTTTCTGCGTTGGCCAGACCTCCAAAGAGTCACTTGGCCG
AGGAAGAGCGCTCTGGGAATGTAGCCCAAAGAAAACCACACACAGCTGGGCATGGCAGGCTGCA
GCCACAGTGTTTCTGATACTAAACAAAGTCCAGCTAGCTCAGGGGCCCTGGGCATGGGCGAGGTT
GCGTCTGGTGTGCATTTCTCTGGAATTAAGTGGCAACCCTTCTGTTCAGCTTTCAAAGGCATCCGG
AAGCTGACAAAGGTCGAGAGACGCATCAGGCTCTCTGCTGTCAGCTTGAAGCCTGCTTCTGATCCT
CGGTCCCCCTCTCTCTCTGCCCCTCACCTGCTTGCCCTGTCTCTCTCTCTCTCAAAAATAAAAACAT
AATAATAATAATTTTTAAAAACTTAAAAAAAAAAAAAGAGTAAGAGGCAAGCCACGGACCGGGA
GGAAACGTTTACAAAACACGTATCTGATGAAGGACTTGTATCCAAAATAAATGAAGAGCTCTTAA
AATTCTATGATAACGACCAACATGAAAACGGGCAAAAGGTATGGACACCTCATGAAACAAGACAC
ACAGACGGTAAATAAGCATATGGGAAGATGTGCACCATCACAGGCCACCAGGGGACTGCAAATTA
GAACCACGGCAGTGACACCACTGTCAGGAGTGGAACAGCAGGACCTCTCTCACTGCTGGTGGGGA
CGCAACACGGTGTGGCCGCTTTGGAAGACGGTTTGGCAGTTTCCTACAAAACTAACTACCCGGGGT
GCCTGCGGGGGGGCTCAGTCAGTTAGGCGTCCAACTTCAGCTCAGGTCATGATCTCTCAGTCTGTG
AGTTCGAGCCCCGCATCGGGCCCTGTGCTGACAGCTTGGAGCCCGGAGCCTGCTTCAGATTCTGTG
TCTCCCTCTCTCTCTGCCCCTCCCTTGCTCATGCTCTGTCTCTCTGTCTTTCAAAAACAAATAAATGT
TAAAAAAAAATTTTTTTAACCGAACTGTACCCTTTAATTTTAACTAACTATATTCTACTCTCTACTG
CATTAATGATGTAAAATTTAGTAGGTACATGGAAGCAATTAAAGAAAAATCAAGTAAAAAAAACT
ATTGTTGGTTTGAATTGTTGGTTATTGAATTAAGAATCTTAGTGGGGCGCCTGGGTGGCTCAGTTG
AGCGTCCCACTCTTGATCGCAGCTCAGGTCAGATCTCACGGTTTGTGAGTTCGAGCCCCACATCGG
GCTCCACACTGACAACACACAGCCTGCTTGGGATTCTTTCTCTCTCCTTCTCTCTCCCCTCCCCCAC
TCGCATGCACTCTCTCTCTCTCAAAACAAACTTTAAAAAAAAAGAATAAAAATTTAAAAAAAGGA
TCAATAACCACGATCGAGTGGGATTTGATCCAGAGACTCAAGGATGATTCAATATCCTACAAATCA
ATCAACGTGACATACCACAAGAACAAAAAAATGAAGGAAGAAGTGAAATCGACCAAAACAAATC
ATACAAATACTGTATGATTTCCCTTATGCGTAGAATCTAAAAAAATAAAACAAAAAACCAACAAG
ATAACAGACTCATAAATAGAGACAAATATCATCAAGAATAGTGTAATAACTCCGTATGGTAACAG
ACGGTCACGGCACTTAGGGTGAACATTTCGTCACGTATGTAAATGTCCATCCACTATGTTGTACAC
CTGAAACTAATACAATAGTGTGACAACTACGCTCAATTAAAAAAAAGAATATTGGCAACATGTTT
CAGATACCACGGGATCAATTAGGCAGCTTCAGGCTGGCTTGTGAGTGTTACCACCTCAGCTTTCAT
AAGGCACACGACATAGTGGGCTCAGCCTGTCATCAACGGAGGCAGAGCACCAATCAAACAGGACT
TAGTTTCCTGAGACACGGGAGGACACCAGAAAGCAGTGTCGCCGTTAAAGCTCTGGATTCCAAAC
ACAAGCCACATCTGAGCGAACACAGCACCAGCACAGCCAAAAACACACACAAAAAGTGTGGCAT
TTACTGAGAATGATGGCCACCCACGCTCGCTCACCCTGATCAGTTACAAGGCTACAATTTCCATCT
GCTAAGTGCCCACAAGGTAATGAAATATTTAGCTGGCTCGAAGAGAGACTGGATTGGAAGCCTGG
GGACTTTCAATAGGTGGAGAGAGGGGCAGGGTACGTCTCCAGCATGCCCCCTACAGACCCCAGCT
GGGGTGTGCCAAGGCAGGCCAGGACAGGGGTTGAGGGATCAGAAACGAACCCCAAGCATTTTCCA
GTCCCGTGCCCTGAATGACAGCAAAGCACTCACACCAGGTGCCCTTCTAAGACCCATCAGACAAA
TCTTACGGGGGCGAGGACTTCAGGGTCTTCTCCCAGACCCAGGGAGCAACGCCCTGACCTCGCGG
CATCAGGACACGCATGTTCCCTAAGGCTCAGAGACGCCCTCAGCATCGTGCTGACTTTGGGAGACA
CATCACACCTTAGACTTTTAATCCTACCCATTCATAAGCCAAAGTAAACAACAGGCCATTTCTGGG
GCAGCGGGCGGGCTGGAGCTGTCTCCACCACCTGCCCCCTCCCTTTACAGCAGCATTTGCCCCTGG
TCAGGGCAGGCGATGAGGTACAGAGACTCGGTGTCAAGACCTGGGTTTCAGTGTCCACTGGTCAC
TCCCGCACTCGGTTTACCCTATCCCTAAAACGAGGGTGATTCCTGTGCACCCCCCCCCCCCCGGGG
CTGAGAGCTACGCAAGCGAGCTTGAAGGGTGCAGGGTGTAGATGGGAGCCGGGGCGAGCTCTCAG
AACGCAGGTTTTGCCCCTGAACACAGGGCCGCTCCCCTGTCAGCTGATGTCAGGCTTTGCTCCACA
TCAAGACGGTGAGAAAATAAGTTTTATTACAAAAGCAGTTCTTTCTCCCGATGCTTCAACCTCCCA
GTCTGATGTTATCTCCCCGGCTGGATTAAAATTCTGATTTGCTAGGGCGCCTGGGTGGCTCAGTTG
GTGAAACATCTGACTTTGGCTCAGGTCATGATCTCGCAGTTCATGAGTTCAGGCCCCATGTCCACC
TCTGTGCTGACAGCTCAGAGCCTGGAGCCTGCTTCGGATTCTGTGTCTCCCTCTCTCTGTCTCCCAC
TCACACTCTGTCTCCCTCTCAAAAATAAATAAACATGAAAAAGAAAATTCTAATTTCCCTGGGGCA
CCTGGGCAGCTCAGTTAGTTAAGCATCTGACTTTGGCTCAGGTCATGATCTCTTAGTTCGTGAGTTC
AAGCCCCTCATTGCATCGGGCTGTCTGCTCTCAGCTGTCTGCTCTCAGCACAGAGCACGCTTTGGA
TCCTCTGTCTCCCTCTCTCTCTGCCCCTCCCCAGCTTGTTCTCTCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC
TCTCTCTCAAATAAATAAATAAACATTAAAAAAGATTAAGATATATGAGATCTCTCTAGATGAAAA
TATGGGGCCGTTGGATGTAATAAAATGAAAATTCAGGAAGAAATCTCATCAAATGACATCAATAG
CTACAATATTCAAATAGAAGATTAACCAAAAGTCCTTAATTACGAAGCTCAAAGTTCAGGGCTATC
TACAAACTCACGAAAACGTCCAAAGTCGAAATGCGTGGCAGGTGAGGCCTGAACGGACGGCTGCC
CCCACCGTGCTGCATGCACTGCCCCCCCACAGAGAGGCCGCCCCGATGACACTCCCCTGACCTCAG
CTAGCCTGACATTCAGATGACCCATCCAGGGCGGGCACAGGAAGCCCCTTCCCACTTCAAACTTGC
GGCCCCACAGCGTCACAGTCCCCTGCACCACATCCTGAGGGGAGAGGAGAGGCCACCCAGGCGGG
TCAGGGAGCATCTGGCTTTAGTGGACAGTGGACAGTGTCCCTTTGCCGGGTTCCATTCCGCCGTGA
CCACAGGCACATTTACCGACTCGGAGCCAGAGGCACCGCTTTTAAAAAATGCTGCTTCTTGGGACG
CCTGGGTGGCTCAGTGGGTTAAGTGTCTGACTTCGGCTCAGGTCATGATCTCACAGTCCGTGAGTT
CCAGCCCTGTGTCGCGCTCCATGCTGACAGTTCGGAGCCTGCTTGGGATTCTCTGTCTTCCTCTCTC
TTTGCCCCTCCTCCACTTGCGCTGTCTCTGTCTTTCTCAAAATAAATAAACTTAAAACATCTTTTAA
TATGTAAGACTTTAACTTATCTGGAGTTTATTTTGAAGAAAACTGTAAGTGAGGTATCCAATAGTT
TGATTTCCCCAAATGTTCAATCAATTGATCCAGCACCATTCCACTTATGAAATAATCCTAATTTCTT
CACTTACTTGCAAGTTACCTTTATCATAAAATCCAGGATTATTTACACCTATGTCTGGCCTTCTTTT
CGCAGTCCATTTATCTGCCTGTGTTTATGTTTTAATATTTCATAGGGGCACCTAGGTGGCTCAGTCA
GTTGAGCATCCAACTCTTGGTTTCAGTTCAGGTCATGATCCCAGGGTCGAGCCCCGAGTCGGGATC
CGTGCTGGGCATGGAGGCTGCTTGGGATTCTCTCTCTCCCTCTGACCCTCTCCCCTGCTCATGTGCG
CTCTCTCTCTCTCAAATATAAGTAAATAAATAAATTTTAGTATTTCATAGGCCTTGCTGCCCCTGAT
TTTGTTTTAAAATTTTTGTTCAGGGGCGCCTGGTGGCTCAGTTGGTTAAGTGGCCAACTCTTGATTG
CAGCTCAGGTCATGATCTCAAGATTCGTGGGATTGAGTCCCATGTCAGGCTCTGCGCTGGACATGA
AAACTGCTTAAGATTCTCTCTCCCTCTCCCTCTCCCTCTGCCTCTCCCCTGCTCACTCTCTCTCTTTC
AAAAAAATTTTTTTAAATAAAGTACTTTTTTCTTCAAAAAAATCCTGTTCAAAAATCCAGTTTATAA
AAAAATAAATAAACTGTTATTTTTGGAGGGAAATGACATATTTATGCTGTTCAAAATTCCCATTCA
AATCTTTTGTTTATTTAAGTCCTCTGTATATTTGGGCCTGAGGAGGAATTTAGGGTTTTTTCAATAT
TAATTAATTCAACAAATATTTAGTGAGAGCCAATTTTGTGCCTTTAAGTGTTTTAGTACTGGGTTTG
GAGATTTAAATTTGGAAGAAAGTAAGTCTGTATAGAAAAGAGATGCAAAGACAATGATCGCTTGT
GTAAGACACAAGTAACCAGAAAAAAAGCTGAGAAAGATGCCCCAATAAGAGAGAGAAAAACCAA
CAGACTATGATATCACGGAAGTCAAAAGAGAGAGACAGAGATCACTCATGACAAATGGATAATTA
ACTATTGGAACTTTGGCAATTAAGTCATTAATCCACAGGGAAAGGCTTGGCAGATCCATCTTCATT
TCTTAAATATTTTGGTCATTTTGTTCAATGCCACTTAAAAAAAATCCATTCTTTCTCCATGACTCAA
TAAGCTGTCACTATTATATCTTAAACTTTCTTTGAGTCTATTTGTGTGTTTTCTCTTCTATCACAACG
ACCATCCATTTCTCTACTGAAACTAGATTAATTGTTAGTCTTATACCTATGTTGTGATACCTGGTGA
GAAAGATCTTGCTCATGGTTCTTATTTTTCTAAATTGTCTTGCTTGATGTCAATTCAAGAATTTATTC
TTGGGGCGCCTGGGTGGCGCAGTCGGTTAAGCGTCCGACTTCAGCCAGGTCACGATCTCGCGGTCT
GTGAGTTCGAGCCCCGCGTCGGGCTCTGGGCTGATGGCTCAGAGCCTGGAGCCTGTTTCCGATTCT
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CCCGGGCGTCAGGACCTGCTGCATCTGTGCACCCACTGCCAGAGACGGCTCAGCTCACCGTGTGGC
TGTGCATGTGTTAGTCCTTCTCTGGGCCTCTGATTCCCACCTAGAAAATGGAAATACCTCCCCTCTC
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ACACTGCAGGGCTTCCCCCAGGAGGGGTATCTCTGTGATCATTTTGGTGAAGAGGCTGAGGAAAG
GTTCCCAGAGGGGATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGTGGAGCACGTCATGGGGACAGGA
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GGAGTGAGGGGCACCCCACCCAAAGGTGAGAAGGTGATGAGCAACGGGCAGTTTGTCCTCACCAA
GACACAACCAGCCCCCCAACTGCTGCTAGACTCGCACAGAACTCCCTGGGGACTGATGGCACCTA
TGACATCTGGACGCTTTCTGTGTAATCCCTCCCCTCTGGCTGCGTTCCAAACAGCCAGATGGCTGTC
TGACATCCAAACCTCAGATAGCTGAAAGGTAAATATCAGGAACATAAGGGTGACGCTTTTGATCT
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CGACTGAGCCACCCAGGTGCTCCAAAAATACACATTTTTTAAAAGGAAAAAAAGAACGATGCAGC
AAAGTCAGTACTAAGAAGAAAATACAATGCAATCCAGGCCTATCTCAAGAAACAAGAAAAATCCC
AAATACAAAATCTAATGGCCTACCTAAAGGAACTAGAAGCAGAACAGCAAACACACCGCAAACC
CAGCAGAAGAAGAGAAATAATAAAGATAAGAGCATAAATAAACAATATAGAATCAAAAAAAAAA
AAAAAACCCAGTAGAACAGATCAATTAAACCAAGAGTTGGTTTTTTGAAAAAATAAACAAAATTG
ATAAACCTCTAGCCAGGCTTCTCAAAAAGAAAAGAGAGAGGACCCAAATAGATAAAATCATGGAT
GAAAATGGAATTATTACAACCAATCCCTCAGAAATACAAGCAATTATCAGGGATGTACAATGAAA
AATTGTATGCCAACAAACTGGACAACCTGGAAGAAATGGACAAATTCCTAAACACCCACACACTC
AAAAGGGAAGAAATCAAAAATTTGAACAGACCCATAACTAGTGAAGAAATTGAATCAGTTATCAA
AAATCTCCCAACAAATAAGAGTCCTGGACCAGAAGGCTTCCCTGGGGAATTCTACCAGACATTTA
AAGCCGAGTTAATACCTATCCTTCTCAAGCTGTTCCAAAAAATAGAAAGGGAAGGAAAACTTCCA
GACTCATTCTATGAAGCCAGCATTACTTTGATTCCCAAACCAGACAGAGACCCAGCAAAAAAAAA
AGAGAACTACAGGCCAATATCCCTGATGAATATGGATGCAAAAATTCTCAACAAGATACTAGCAA
ATCAAATTCAGCAGTATATAAAAAGAATTATTCACTATGATCAAGTGGGATTCATTCCTGGGCTGC
AGGCTGGTTCAATATTCACAAATCAATCAATGTGATACATCACATTAATAAAAGAAAAGATAAGA
ACCATATGATCCTGTCAATAGATGCAGAAAAAGCATTTGACAAAATTCAGCATCCTTTCTTAATAA
AAACCCTCAAGAAAGTCAGGATAGAAGGAACATACTTAAACATCATACAATCCATTTAT
Claims (13)
1.一种分离的核酸，包含在SEQ ID NO.7中示出的序列的至少五个连续核苷酸。
2.一种同源重组载体，包含：(1)第一同源臂、(2)期望多核苷酸和(3)第二同源臂，其中，所述期望多核苷酸位于所述第一同源臂和第二同源臂之间，并且其中所述第一同源臂和第二同源臂中的每一个包含SEQ ID NO.7中的至少约1kb序列。
3.根据权利要求2所述的同源重组载体，其中，所述第一同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸1至约核苷酸8,800之间的任意序列。
4.根据权利要求2所述的同源重组载体，其中，所述第一同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸1至约核苷酸10,000之间的任意序列。
5.根据权利要求2所述的同源重组载体，其中，所述第一同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸1至约核苷酸10,800之间的任意序列。
6.根据权利要求2所述的同源重组载体，其中，所述第一同源臂包含在SEQ ID NO.7的核苷酸1至约核苷酸14,800之间的任意序列。
7.根据权利要求2所述的同源重组载体，其中，所述第二同源臂包含在SEQ ID NO.7的约核苷酸16,000至约核苷酸21,939之间的任意序列。
8.根据权利要求2所述的同源重组载体，其中，所述第二同源臂包含在SEQ ID NO.7的约核苷酸14,700至约核苷酸21,939之间的任意序列。
9.根据权利要求2所述的同源重组载体，其中，所述第二同源臂包含在SEQ ID NO.7的约核苷酸10,800至约核苷酸21,939之间的任意序列。
10.根据权利要求1所述的同源重组载体，其中，所述同源臂中的一个或二个包含长度选自由约1kb长、约2kb长、约3kb长、约4kb长、约5kb长、约6kb长、约7kb长、约8kb长、约9kb长以及约10kb长组成的组中的SEQ ID NO.7序列。
11.根据权利要求1所述的同源重组载体，其中，所述期望多核苷酸是一种可选标记。
12.一种用于中断猫细胞基因组中的靶FeI d I序列的方法，包括将权利要求1所述的同源重组载体引入到猫细胞中，其中，(a)所述载体的同源臂用于与所述细胞基因组进行重组，以及(b)所述期望多核苷酸在所述靶序列位点整合到所述细胞基因组中，从而中断所述靶序列。
13.一种猫细胞，包含权利要求12所述的期望多核苷酸。
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Cited By (1)
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