CN103923940A - 一种定点整合外源基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定点整合外源基因的方法。本发明公开了一种定点整合外源基因到牛β-酪蛋白基因的第二外显子的方法,包括如下步骤:使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在离体的牛细胞中表达,得到第二外显子靶序列发生突变的细胞;同时将外源基因同源重组到靶序列位置,实现外源基因在牛β-酪蛋白基因的第二外显子上的定点整合。本发明的人溶菌酶基因或其它目的基因在乳腺中转录非常活跃的β-酪蛋白基因座定点整合,克服位置效应,避免目的基因表达沉默,可以实现人溶菌酶或其它重组蛋白在乳腺中较高水平表达,提高了转基因育种的成功率,同时可以节约后期生产纯化重组蛋白的成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种定点整合外源基因的方法。
背景技术
溶菌酶是人乳中重要的抗菌因子,对大部分革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌均具有杀灭作用,对于增强婴幼儿免疫力有着重要的作用,同时溶菌酶在医疗保健,轻工业、食品业等方面也被广泛应用。2009年美国FDA批准了世界上首例乳腺生物反应器生产的抗凝血酶转基因药物上市,这标志着利用转基因动物生产重组蛋白真正迈入产业化阶段。
利用乳腺生物反应器生产重组蛋白具有广阔的市场应用前景,但是传统的转基因技术在乳腺生物反应器研究中仍存在一定的不足。传统的转基因研究中,由于外源基因在基因组中是一种随机插入,受到位置效应的影响以及载体自身大小限制,不能包含完整的调控元件往往使外源基因的表达量水平较低,甚至不表达或者异位表达(Clark,1994;Dobie1996;Kim,2007)。同时,由于外源基因的多拷贝随机插入到宿主基因组中,这种整合对宿主自身来说可能也存在一定风险(Seggewis,2006;McCormack,2004)。这些不利因素大大降低了转基因动物育种的可靠性,提高了成本,不利于转基因育种的发展。食品规范委员会和美国FDA颁布的转基因动物规范条例中也明确提出需充分重视这个问题。因此需要我们寻找使外源基因表达量更高,同时具有较高育种安全性和可靠性的新方法去改变传统的转基因育种。
为了提高外源基因的表达量,克服转入基因受到位置效应的影响,人们尝试了多种方法,如在载体中加入了核基质附着元件(MAR)、位点控制元件(LCR)、绝缘子(Insulator)等元件来克服外源基因表达受到位置效应的影响,但是由于基因表达调控的复杂性,仍不能取得很好的效果,而且外源基因在基因组上仍是随机插入,降低了转基因的可控性和安全性,这仍是在传统转基因研究急待解决的问题。基因打靶是基因靶向操作的一门转基因技术,利用外源基因与基因组序列间的同源性进行同源重组(homologous recombination)来实现定点对染色体进行修饰的一门技术,具有位点专一性强,可以稳定遗传以及外源基因不受位置效应影响,对邻近基因也没有影响等优点,将成为今后一种较理想的改造物种基因的操作方法。2000年K.J.McCreath利用基因打靶的方法将人抗胰蛋白酶基因(AAT)定点整合到羊原胶原基因座上(COL1A1),羊乳中人抗胰蛋白酶表达量为650μg/ml(McCreath,2000),远高于之前McClenaghan随机整合表达人抗胰蛋白酶的转基因羊乳中18μg/ml的表达量(McClenaghan,1991),克服了传统转基因受位置效应影响使蛋白低水平表达的弊端。
牛乳中酪蛋白含量占乳蛋白含量的76-86%,而且αs1、αs2、β、Κ是以基因簇的形式位于染色体中,研究发现存在一些类似LCR的序列来调控乳四种蛋白基因的协调表达(Curtin et al.1989;Rijnkels et al.2003)。
利用常规基因打靶进行转基因动物生产的效率很低,只有10-6-10-7的效率(HansonK D et al.1995),而且最后得到的克隆动物通常会带有药物筛选所必须的抗性基因,最后要得到不含抗性基因的动物个体还要经历一次体细胞克隆。近年来,基于TALE结构的人工核酸内切酶已经被成功地应用于包括芽殖酵母、果蝇、斑马鱼、线虫、大鼠、水稻、蟋蟀、家蚕、非洲爪蟾与热带爪蟾、猪和牛、拟南芥在内的多个物种,以及体外培养的哺乳动物细胞(包括人类细胞)。类转录激活样因子效应物核酸酶(TALEN)技术被用来产生位点特异的双链断裂,当这一断裂通过具有同源臂的外源供体载体进行同源重组修复时,便可实现基因定点插入。
发明内容
本发明的目的是提供一种定点整合外源基因的方法。
本发明提供了一种定点整合外源基因到牛β-酪蛋白基因的第二外显子的方法,包括如下步骤:使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在离体的牛细胞中表达,得到第二外显子靶序列发生突变的细胞;同时将外源基因同源重组到靶序列位置,实现外源基因在牛β-酪蛋白基因的第二外显子上的定点整合;
所述TALE蛋白-Ⅰ的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示;
所述TALE蛋白-Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示;
所述靶序列如SEQ ID No.1所示;
所述TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ能分别与所述牛β-酪蛋白基因的第二外显子靶序列特异结合,TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ中的Fok I功能域形成二聚体,发挥非特异性内切酶活性,使得TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ分别与牛β-酪蛋白基因的第二外显子靶序列特异结合位点之间的序列发生突变;
所述TALE蛋白-Ⅰ与所述牛β-酪蛋白基因的第二外显子靶序列特异结合的序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第1位至第16位核苷酸所示;
所述TALE蛋白-Ⅱ与所述牛β-酪蛋白基因的第二外显子靶序列特异结合的序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第36位至第52位核苷酸所示。
上述方法中,所述使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在牛细胞中表达的方法为将分别含有TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ编码基因的重组表达质粒导入牛细胞中;
所述含有TALE蛋白-Ⅰ编码基因的重组表达质粒具体为将SEQ ID No.2所示的DNA分子插入pCS2-Fok Ⅰ骨架载体的Nhe Ⅰ位点得到;
所述含有TALE蛋白-Ⅱ编码基因的重组表达质粒具体为将SEQ ID No.3所示的DNA分子插入pCS2-FokⅠ骨架载体的NheⅠ位点得到;
所述将外源基因同源重组到靶序列位置为将所述外源基因通过线性化的同源重组载体整合在靶序列位置上;
所述同源重组载体上具有靶序列同源左臂-外源基因-靶序列同源右臂的片段。
上述任一所述的方法中,所述同源重组载体的构建方法如下:将所述靶序列同源左臂序列插入pL452的KpnI和SalI位点间得到重组质粒,将其命名为L-pL452;再将所述靶序列同源右臂序列插入L-pL452的NotI和Sac Ⅱ位点间得到重组质粒,将其命名为L-pL452-R;最后将所述外源基因插入SalI和NotI位点间即得;
所述线性化为用限制性内切酶SacⅡ线性化所述同源重组载体。
上述任一所述的方法中,所述同源重组载体是将所述外源基因插入SEQ ID No.15所示的DNA分子的SalI和NotI位点间得到;
所述靶序列同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示;
所述靶序列同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
上述任一所述的方法中,所述外源基因为人溶菌酶基因;
所述人溶菌酶基因如SEQ ID No.14所示;
所述靶序列同源左臂-外源基因-靶序列同源右臂的片段如SEQ ID No.16中自5’末端起第2654-10890位核苷酸所示;
所述同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。
上述任一所述的方法中,所述牛细胞为牛胎儿成纤维细胞。
一种试剂盒也属于本发明的保护范围,该试剂盒由SEQ ID No.4所示的蛋白或SEQID No.4所示的蛋白的编码基因、SEQ ID No.5所示的蛋白或SEQ ID No.5所示的蛋白的编码基因、SEQ ID No.15所示的DNA分子组成;
或,
SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白也属于本发明的保护范围;
或,
SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围;
所述SEQ ID No.4所示的蛋白的编码基因具体如SEQ ID No.2中自5’末端起第4位至第1533位所示;
所述SEQ ID No.5所示的蛋白的编码基因具体如SEQ ID No.3中自5’末端起第4位至第1635位所示;
或,
含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围;
或,
SEQ ID No.10所示的DNA分子也属于本发明的保护范围;
和/或,
SEQ ID No.11所示的DNA分子也属于本发明的保护范围。
SEQ ID No.15所示的DNA分子也属于本发明的保护范围。
SEQ ID No.16所示的DNA分子也属于本发明的保护范围。
SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的蛋白、SEQ ID No.10所示的DNA分子、SEQ IDNo.11所示的DNA分子、SEQ ID No.15所示的DNA分子和/或SEQ ID No.16所示的DNA分子在将外源基因定点整合在牛β-酪蛋白基因的第二外显子上的应用也属于本发明的保护范围;
所述外源基因具体为人溶菌酶基因;
或,
SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的蛋白、SEQ ID No.10所示的DNA分子、SEQ IDNo.11所示的DNA分子、SEQ ID No.15所示的DNA分子和/或SEQ ID No.16所示的DNA分子在利用牛β-酪蛋白基因制备人溶菌酶和/或人溶菌酶转基因牛中的应用也属于本发明的保护范围;
或,
上述任一所述的方法在制备人溶菌酶和/或人溶菌酶转基因牛中的应用也属于本发明的保护范围;
或,
上述试剂盒在制备人溶菌酶和/或人溶菌酶转基因牛中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明具有如下优点:
(1)人溶菌酶基因或其它目的基因在乳腺中转录非常活跃的β-酪蛋白基因座定点整合,该位点位于β-酪蛋白基因第二外显子翻译起始位点ATG之前,这不仅克服了位置效应,避免目的基因表达沉默,还可以实现人溶菌酶或其它重组蛋白在乳腺中较高水平表达,提高了转基因育种的成功率,同时可以节约后期生产纯化重组蛋白成本;
(2)目的基因在染色体定点整合,避免了随机插入以及多拷贝插入对邻近重要基因表达的影响(如插入突变、多拷贝的插入引起染色体不稳定、邻近基因功能失活、激活原癌基因、失活抑癌基因等),提高了转基因的安全性、可控性,消除部分人群对转基因食品安全性顾虑;
(3)利用β-酪蛋白基因座完整的内源性启动子指导外源基因表达,可以实现人溶菌酶基因或其它目的基因较高水平的表达,同时减少了由于传统转基因研究中调控元件不完整造成的异位表达,提高转基因成功率;
本发明首次利用类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)成功介导人溶菌酶基因定点插入牛β-酪蛋白基因第二外显子,由此获得转基因克隆牛,与常规的通过同源重组技术获得克隆牛相比,利用TALENs介导的同源重组,在单细胞克隆中的重组效率在1%-4%之间,而常规的基因打靶效率仅为10-6-10-7,其打靶效率提高了104-105,为生产定点转基因动物提供了极大的便利。
另外,所构建的载体不含抗性基因,省去了药物筛选过程,有利于细胞单克隆的形成,避免了细胞需要对抗药物毒害的过程,对于后续的体细胞核移植和胚胎发育质量起到关键作用,大大简化了生物安全评价过程。
附图说明
图1为094牛胎儿。
图2为094牛胎儿成纤维细胞。
图3为β-酪蛋白基因序列同源左臂PCR扩增。
图4为β-酪蛋白基因序列同源右臂PCR扩增。
图5为人溶菌酶基因PCR扩增。
图6为pL452-LYZ质粒结构图。
图7为同源重组示意图。
图8为人溶菌酶阳性PCR鉴定。
图9为跨同源左臂PCR鉴定。
图10为跨同源右臂PCR鉴定。
图11为跨同源臂产物测序鉴定。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
pL452载体在文献“Pentao Liu,Nancy A.Jenkins,and Neal G.Copeland.AHighly Efficient Recombineering-Based Method for Generating ConditionalKnockout Mutations.Genome Res.200313:476-484”中公开过,公众可从中国农业大学获得。
pMD19-T购自Takara公司,产品目录号为D102A。
pCS2-FokⅠ骨架载体在文献“沈延,黄鹏,张博.TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程.遗传,2013,35(4):533-544”中公开过,公众可从中国农业大学获得。
下述实施例中牛胎儿成纤维细胞建立采用胰酶消化法。具体方法如下:
(一)屠宰妊娠期第42天的母牛,取出胎盘放入DMEM培养基中,12h内送回到实验室,牛胎儿如图1所示。
(二)在含有5×DPBS的细胞培养皿中剔除胎儿头、四肢、内脏及软骨组织,将剩余组织放入一个新的10cm细胞培养皿中,用眼科剪尽量剪碎。
(三)加入1mlDMEM完全培养基,用剪头的1ml枪头将组织碎块及培养基转移到15ml的离心管中,加入7ml DPBS,用移液器吸打几下,待组织块沉下后,吸弃上清,重复洗涤一次。
(四)向15ml离心管中加入10ml0.25g/100ml胰酶,37℃水浴消化30min。
(五)小心吸取上清细胞悬液到另一个15ml离心管中,室温1200rpm,离心5min收集细胞。重复步骤(四)和(五)各一次并收集细胞。
(六)将离心获得的细胞按照1×106/瓶的浓度接种到T25细胞培养瓶中,置于37.5℃、5%CO2培养箱中培养,每隔两天换一次培养液,待细胞长满后冻存,并将其命名为094牛胎儿成纤维细胞系,如图2所示。
Nucleofector转染试剂盒购自德国Lonza公司,产品目录号为VPI-1002。
实施例1、TALENs表达载体的构建
一、筛选靶点区域
基于大量分析筛选与验证,确认将牛β-酪蛋白基因(AC_000163)第二外显子上的一段序列作为靶点,该靶序列如下:
5’-TGAGAGCCATGAAGGTCCTCATCCTTGCCTGCCTGGTGGCTCTGGCCCTTGC-3’(SEQ IDNo.1)
SEQ ID No.1中带下划线部分为可被TALENs蛋白中的结合功能域特异结合的部分,结合位点中间部分为FokⅠ内切核酸酶切割识别位点。
二、合成TALEs蛋白
基于SEQ ID No.1所示的靶序列,设计一对TALE蛋白(TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ)。
(一)合成TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ的编码基因,分别如SEQ ID No.2(SEQID No.2中自5’末端起第4位至第1533位为TALE蛋白-Ⅰ的编码基因)和SEQ ID No.3所示(SEQ ID No.3中自5’末端起第4位至第1635位为TALE蛋白-Ⅱ的编码基因)。
TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ的氨基酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。
(二)制备重组质粒
Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切SEQ ID No.2所示的DNA分子,得到基因片段;用Nhe Ⅰ单酶切pCS2-Fok Ⅰ骨架载体,得到载体大片段;将基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为TALENs-LF6。
Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切SEQ ID No.3所示的DNA分子,得到基因片段;用Nhe Ⅰ单酶切pCS2-Fok Ⅰ骨架载体,得到载体大片段;将基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为TALENs-RF2。
将重组质粒TALENs-LF6和TALENs-RF2进行测序,结果正确。
三、TALENs蛋白的敲除效率
如果TALENs蛋白发挥切割作用,细胞会启动自身修复机制,在切割位点会出现小片段的删除或者插入,测序结果峰图为杂合峰图。
(一)将TALENs-LF6和TALENs-RF2电击转化094牛胎儿成纤维细胞系,每106个细胞转染3μg TALENs-LF6和3μg TALENs-RF2。
(二)电击72小时后,提取转染后细胞的基因组DNA,采用TALENJD-F和TALENJD-R组成的引物对进行PCR扩增,然后将PCR扩增产物进行测序,测序结果峰图为杂合峰图。
引物如下:
TALENJD-F:5’-GAAGCACGGAGTCTTAGATA-3’;
TALENJD-R:5’-TGTCTGATATACCATCCTCTG-3’。
(三)电击72小时后,采用TA克隆测序的方式计算敲除效率(突变型克隆与总有效测序总数的比值即为敲除效率;其中有效测序总数为野生型克隆与突变型克隆的总和)。计算得到TALENs蛋白(TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ)的敲除效率为28%。
实施例2、基因打靶载体的构建
一、β-酪蛋白基因序列同源臂的扩增和测序
(一)根据GeneBank公布的牛β-酪蛋白序列(Genebank号:NW_003103978.1)设计上游引物1和下游引物1用来扩增部分β-酪蛋白基因序列的同源左臂。
上游引物1:5′-CGGGGTACC AGAGATGTTGATGGCAAGAAC-3′;(SEQ ID No.6)
(下划线所示序列为KpnI酶切识别位点)
下游引物1:5′-GCGTCGACCTCTCAATTCCTGGGAATGGG-3′。(SEQ ID No.7)
(下划线所示序列为SalI酶切识别位点)
(二)设计上游引物2和下游引物2用来扩增部分β-酪蛋白基因序列的同源右臂。
上游引物2:5′-ATTTGCGGCCGCTTGCAAGAGAGGTAAATACAG-3′;(SEQ ID No.8)
(下划线所示序列为NotI酶切识别位点)
下游引物2:5′-TCCCCGCGGTCATTCAGAGGCAATTTCCC-3′。(SEQ ID No.9)
(下划线所示序列为SacⅡ酶切识别位点)
(三)提取094牛胎儿成纤维细胞基因组DNA,以基因组DNA为模板,以上游引物1和下游引物1为引物进行PCR扩增,得到同源左臂,琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示;
图3中,M:250bp marker;1-3:同源左臂PCR扩增产物,其序列如SEQ ID No.10所示。
以094牛胎儿成纤维细胞基因组DNA为模板,以上游引物2和下游引物2为引物进行PCR扩增,得到同源右臂,琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示;
图4中,M:100bp marker;1-5:同源右臂PCR扩增产物,其序列如SEQ ID No.11所示。
将同源左臂和同源右臂分别与pMD19-T载体连接分别得到重组质粒Left arm-T和Right arm-T,将Left arm-T和Right arm-T进行测序,结果正确。
二、人溶菌酶基因序列扩增和测序
(一)根据GeneBank公布的人溶菌酶序列(Genebank号:X14008)设计上游引物3和下游引物3。
上游引物3:5′-GCGTCGACAACATGAAGGCTCTCATTGTTC-3′;(SEQ ID No.12)
(下划线所示序列为SalI酶切识别位点)
下游引物3:5′-ATTTGCGGCCGCTAGAAGTGTAATATGAGGCCAG-3′;(SEQ ID No.13)
(下划线所示序列为NotI酶切识别位点)
(二)提取人基因组DNA,以其为模板,上游引物3和下游引物3为引物进行PCR扩增,得到人溶菌酶基因序列,该序列包括溶菌酶自身加尾信号,琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5所示。
图5中,M:1kb marker;1-4:人溶菌酶基因PCR扩增产物,其序列如SEQ ID No.14所示。
(三)将步骤2得到的人溶菌酶基因序列连接pMD19-T载体,得到重组质粒LYZ-T,将LYZ-T进行测序,结果正确。
三、基因打靶载体的构建
KpnI和SalI双酶切Left arm-T,得到同源左臂片段;KpnI和SalI双酶切pL452,得到载体大片段;将载体大片段与同源左臂片段连接得到重组质粒,将其命名为L-pL452;
NotI和SacⅡ双酶切Right arm-T,得到同源右臂片段;NotI和SacⅡ双酶切L-pL452,得到载体大片段;将载体大片段与同源右臂片段连接得到重组质粒,将其命名为L-pL452-R;L-pL452-R质粒的序列如SEQ ID No.15所示。
SalI和NotI双酶切LYZ-T,得到人溶菌酶基因片段;SalI和NotI双酶切L-pL452-R,得到载体大片段;将载体大片段与人溶菌酶基因片段连接得到打靶载体,将其命名为pL452-LYZ。对打靶载体pL452-LYZ进行测序验证,结果正确。
pL452-LYZ质粒结构如图6所示,其序列如SEQ ID No.16所示。
实施例3、牛胎儿成纤维细胞中β-酪蛋白基因座定点整合人溶菌酶基因
定点整合策略如图7所示。
一、打靶载体pL452-LYZ与TALENs质粒的细胞共转染
细胞转染采用amaxa nucleofector进行电转。具体流程如下:
(一)将消化并收集的两瓶T25细胞甁的094牛胎儿成纤维细胞(每瓶的细胞数约8×106)和3ug SacⅡ酶切线性化的打靶载体pL452-LYZ及6ug TALENs质粒(TALENs-LF6和TALENs-RF2各3ug)和400μl Nucleofector试剂混匀,得混合液,将混合液分装4个电击杯进行电击,然后分别将电击后的混合液在四个T-25培养皿中培养。
(二)48h后将每个培养皿中培养的细胞消化并分别铺到15个10cm的皿中,培养约10天后挑取单克隆共15个到48孔板培养。
(三)待各克隆的细胞90%汇合后将其扩繁至24孔板培养,选108个生长状态较好的克隆点,然后将这108个克隆长满后的细胞一半冻存,一半用于基因组提取和PCR鉴定。
二、同源重组鉴定
(一)首先进行溶菌酶阳性检测,将得到的108个克隆点的细胞提取基因组,分别取50ng的基因组DNA用于PCR检测,同时以094牛胎儿成纤维细胞的基因组、基因打靶载体pL452-LYZ和水作为对照。
PCR检测引物如下:
溶菌酶jd-F:5′-AGAGAAGGAAGAAGAAGAAGG-3′;
溶菌酶jd-R:5′-AGCACGAGAATCACTTGAG-3′;
该对引物设计在人溶菌酶序列中,扩增的片段大小为516bp,只要发生了人溶菌酶整合,无论是随机整合还是定点插入,都能检测出来,这样可以排除大部分的阴性克隆,PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测的部分结果如图8所示。
图8中,1-12分别代表不同的克隆,M为DNA marker。
经过检测,一共获得了7个溶菌酶阳性克隆分别为103、81、61、42、41、38和15。
(二)对这7个溶菌酶阳性克隆点分别进行跨同源臂的PCR检测,PCR检测引物如下:
KZB-F:5′-CTTCACTTCTTGTCCTCTACT-3′;
KZB-R:5′-CCTTCTTCTTCTTCCTTCTCT-3′;
KYB-F:5′-CTTATATCGTCACTTACCTCAC-3′;
KYB-R:5′-TCATTCTCACTGCCTCTTG-3′。
跨同源左臂的上游引物KZB-F设计在同源左臂外侧牛β-酪蛋白基因序列中,下游引物KZB-R设计在人溶菌酶基因序列中,目的片段大小为2226bp,只有发生了同源重组的细胞才能扩增出目的条带。跨同源右臂的上游引物KYB-F设计在人溶菌酶基因序列中,下游引物KYB-R设计在同源右臂外侧的牛β-酪蛋白基因序列中,目的片段大小为2065bp,只有发生了同源重组的细胞才能扩增出目的条带。跨同源左臂的PCR检测结果如图9所示,跨同源右臂的检测结果如图10所示。
图9和图10中,15、38、41、42、61、81、103分别表示7个人溶菌酶阳性的细胞克隆点,M:1kb marker。
图9和图10的结果表明,在得到的7个克隆点中,61号克隆点细胞发生了同源重组,扩增检测得到了跨同源左臂和跨同源右臂的目的片段。对这两个片段回收测序,结果显示,跨同源左臂PCR片段的5’端为β-酪蛋白基因序列,3’端为人溶菌酶基因序列,跨同源右臂PCR片段的5’端为人溶菌酶基因序列,3’端为β-酪蛋白基因序列,测序结果如图11所示。PCR产物的序列与同源重组后预期序列相一致,这表明61号克隆点确实为中靶的阳性细胞,即人溶菌酶基因定点整合到了牛β-酪蛋白基因座上。
Claims (10)
1.一种定点整合外源基因到牛β-酪蛋白基因的第二外显子的方法,包括如下步骤:使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在离体的牛细胞中表达,得到第二外显子靶序列发生突变的细胞;同时将外源基因同源重组到靶序列位置,实现外源基因在牛β-酪蛋白基因的第二外显子上的定点整合;
所述TALE蛋白-Ⅰ的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示;
所述TALE蛋白-Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示;
所述靶序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在牛细胞中表达的方法为将分别含有TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ编码基因的重组表达质粒导入牛细胞中;
所述含有TALE蛋白-Ⅰ编码基因的重组表达质粒具体为将SEQ ID No.2所示的DNA分子插入pCS2-FokⅠ骨架载体的NheⅠ位点得到;
所述含有TALE蛋白-Ⅱ编码基因的重组表达质粒具体为将SEQ ID No.3所示的DNA分子插入pCS2-Fok Ⅰ骨架载体的Nhe Ⅰ位点得到;
所述将外源基因同源重组到靶序列位置为将所述外源基因通过线性化的同源重组载体整合在靶序列位置上;
所述同源重组载体上具有靶序列同源左臂-外源基因-靶序列同源右臂的片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述同源重组载体的构建方法如下:将所述靶序列同源左臂序列插入pL452的KpnI和SalI位点间得到重组质粒,将其命名为L-pL452;再将所述靶序列同源右臂序列插入L-pL452的NotI和Sac Ⅱ位点间得到重组质粒,将其命名为L-pL452-R;最后将所述外源基因插入SalI和NotI位点间即得;
所述线性化为用限制性内切酶Sac Ⅱ线性化所述同源重组载体。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于:所述同源重组载体是将所述外源基因插入SEQ ID No.15所示的DNA分子的SalI和NotI位点间得到;
所述靶序列同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示;
所述靶序列同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于:所述外源基因为人溶菌酶基因;
所述人溶菌酶基因如SEQ ID No.14所示;
所述靶序列同源左臂-外源基因-靶序列同源右臂的片段如SEQ ID No.16中自5’末端起第2654-10890位核苷酸所示;
所述同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法,其特征在于:所述牛细胞为牛胎儿成纤维细胞。
7.一种试剂盒,该试剂盒由SEQ ID No.4所示的蛋白或SEQ ID No.4所示的蛋白的编码基因、SEQ ID No.5所示的蛋白或SEQ ID No.5所示的蛋白的编码基因、SEQ IDNo.15所示的DNA分子组成;
或,
SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白;
或,
SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白的编码基因;
所述SEQ ID No.4所示的蛋白的编码基因具体如SEQ ID No.2中自5’末端起第4位至第1533位所示;
所述SEQ ID No.5所示的蛋白的编码基因具体如SEQ ID No.3中自5’末端起第4位至第1635位所示;
或,
含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌;
或,
SEQ ID No.10所示的DNA分子;
和/或,
SEQ ID No.11所示的DNA分子。
8.SEQ ID No.15所示的DNA分子。
9.SEQ ID No.16所示的DNA分子。
10.SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的蛋白、SEQ ID No.10所示的DNA分子、SEQ ID No.11所示的DNA分子、SEQ ID No.15所示的DNA分子和/或SEQ ID No.16所示的DNA分子在将外源基因定点整合在牛β-酪蛋白基因的第二外显子上的应用;
所述外源基因具体为人溶菌酶基因;
或,
SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的蛋白、SEQ ID No.10所示的DNA分子、SEQ IDNo.11所示的DNA分子、SEQ ID No.15所示的DNA分子和/或SEQ ID No.16所示的DNA分子在利用牛β-酪蛋白基因制备人溶菌酶中的应用;
或,
权利要求1-6任一所述的方法在制备人溶菌酶中的应用;
或,
权利要求7所述的试剂盒在制备人溶菌酶中的应用。
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