CN104630272A - 一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体及其应用，该载体包裹于慢病毒之中，载体上携带有mTet1基因。所述的载体为慢病毒载体，所述的mTet1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明提供的基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体，通过慢病毒表达之后使得mTet1基因整合到奶山羊雄性生殖干细胞的基因组。对稳转的阳性细胞进行培养，表现出漩涡状成簇生长，细胞形态学良好，流式分析细胞增殖周期，发现S期细胞数量增加，表明增殖能力增强，而且转录水平发现雄性生殖干细胞相关基因和自我更新相关基因表达上调，分化相关基因表达下调。

Description

一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体及其应用

技术领域

本发明属于转基因技术领域，涉及一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体及其应用，尤其是作用于奶山羊雄性生殖干细胞。

背景技术

奶山羊是我国重要的经济动物，生产中发生的巨胎症，致死率高和发育迟缓等疾病严重阻碍了优良动物品种的保持和优化。而这些疾病很大程度上与精子发生和胚胎发育异常相关。因此提高精子质量和胚胎质量，在减少疾病发生，促进优良品种的遗传与繁育等技术难题都是家畜大动物的遗传育种领域亟待解决的。哺乳动物精子发生过程中DNA甲基化的建立是一个独特的动态变化过程，适当的DNA甲基化对建立正确的表观修饰模式，维持胚胎后期正常发育具有重要作用。

小鼠、人等胚胎生殖细胞和雄性生殖干细胞的培养体系已被初步建立，并了解了其基本的生物学特性(Kubota H,Avarbock MR,Brinster RL.2004.Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonialstem cells.Proc Natl Acad Sci USA.101(47):16489-16494；Oatley JM,AvarbockMR,Telaranta AI,Fearon DT,Brinster RL.2006.Identifying genes important forspermatogonial stem cell self-renewal and survival.Proc Natl Acad Sci USA.103(25):9524-9529)，并分别从成年小鼠睾丸组织分离得到多能性的雄性生殖干细胞。后期研究发现CD49f、CD90(Thy1)、C-kit(CD117)、GFRa1等可作为雄性生殖干细胞的特异性标记，并已用于纯化小鼠和人的雄性生殖干细胞。体外培养为研究mGSCs功能调控的分子机制及细胞信号通路提供了新的方法。目前，虽然体外培养和扩增多能性ES细胞已经日趋常规化，但成体组织干细胞(包括mGSCs)体外培养技术的建立却依然较困难。尽管在过去的10年间，已报道了许多关于小鼠和大鼠mGSCs体外培养的进展(Kanatsu-Shinohara M,Lee J,et al..2008.Pluripotency of a singlespermatogonial stem cell in mice.Biology Of Reproduction.78(4):681-687；Oatley JM,Avarbock MR,Telaranta AI,Fearon DT,Brinster RL.2006.Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal andsurvival.Proc Natl Acad Sci USA.103(25):9524-9529)。目前，啮齿类动物的mGSCs可以在体外培养很长的时间，细胞的增殖也很显著。有报道认为mGSCs具有转化为多能性干细胞的潜能(Kanatsu-Shinohara M,Lee J,et al..2008.Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice.Biology OfReproduction.78(4):681-687)。这一特性使得mGSCs具有巨大的优势，然而其具体的遗传、表观遗传及其发育潜能等机制还需要进一步研究。

Tet(Ten-eleven translocation)蛋白家族在胚胎干细胞(ESCs)中高表达，Tet1可以结合到基因CG富含区的CXXC区域，优先结合有转录功能的基因和转录抑制的基因的启动子区和转录起始位点(TSS)。Tet1的靶基因在个体发育、分化和神经发生过程中参与多个细胞通路。Tet1蛋白在表观修饰的过程中并不参与全基因组范围内的广谱去甲基化，而是在primordial germ cells(PGCs)发育进程中位点特异性的进行适当的印记抹除(Clark et al.,2013；Vincent etal.,2013)，以确保后续两性生殖细胞的正常发育。在小鼠精子发生过程中，Tet1在二倍体细胞中比单倍体表达量高，提示Tet1表达的动态变化参与精子发生的表观修饰调控进程(Gan et al.,2013)。

Tet1能特异性抹除基因组印记(Dawlaty et al.,2013)，成功迁徙的精原干细胞在成体精子发生的后续生命周期中都通过甲基化动态变化维持自我更新与分化(Gan et al.,2013)。目前，Tet1缺失的ESCs和裸鼠都已获得，研究发现Tet1缺失的ESCs仍然保持全能性状态，Tet1缺失的裸鼠健康并有繁殖能力，但存在出生重比较低的缺陷，而且中性粒细胞和种内杂交同胎生仔数相对要少，说明Tet1在胚胎发育和精子发生过程中发挥了作用(Dawlaty et al.,2011)。但是，Tet1异常高表达会引起生殖细胞癌变，证明Tet1的主动去甲基化在细胞癌化的恶意增殖过程中发挥功能(Nettersheim et al.,2013)。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体及其应用，通过构建mTet1慢病毒表达载体并转染到奶山羊精原干细胞，促进奶山羊精原干细胞的自我更新能力及细胞增殖能力。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体，该载体包裹于慢病毒之中，载体上携带有mTet1基因。

所述的载体为慢病毒载体，所述的mTet1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的慢病毒载体上还设有抗生素筛选基因和标记基因。

所述的载体为慢病毒载体pCDH-mTet1，是将mTet1基因克隆到基础载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro中的多克隆位点而得到。

一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的重组慢病毒，该重组慢病毒是由慢病毒载体pCDH-mTet1与辅助质粒PAX和VSVG转染293T细胞，经孵育后获取的；

所述的慢病毒载体pCDH-mTet1，是将mTet1基因克隆到基础载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro中的多克隆位点而得到。

所述的基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体在促进奶山羊雄性生殖干细胞的自我更新、维持多能性和增殖中的应用。

所述的载体通过慢病毒包装转染奶山羊雄性生殖干细胞，上调与自我更新和多能性相关基因的表达，促进奶山羊雄性生殖干细胞进行细胞增殖的S期。

所述的自我更新和多能性相关基因包括Oct4、Plzf和和Gfra1。

一种促进奶山羊雄性生殖干细胞的自我更新和增殖的方法，包括以下操作：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的mTet1基因，并将其克隆到慢病毒表达载体中构建mTet1慢病毒表达载体；

2)将待转染的293T细胞加入到DMEM培养液中；将构建的mTet1慢病毒表达载体与辅助质粒PAX和VSVG在Opti-MEM中混匀，然后加到转染试剂TurboFect中吹打混匀，室温孵育后得到病毒感染液，再加入到DMEM培养液中，进行细胞转染；转染12h后更换新鲜的病毒感染液继续转染；转染36h后收取包含重组了mTet1的慢病毒的毒液；

3)将收取的毒液和新鲜DMEM-F12培养液混合后加入接种有奶山羊雄性生殖干细胞的培养板中，12h后转换为含血清的正常DMEM-F12细胞培养液继续培养，48h后加入抗生素进行抗性筛选；

4)mTet1阳性表达的奶山羊精原干细胞，其自我更新能力增高，细胞增殖加快。

所述的mTet1慢病毒表达载体与PAX和VSVG的质量比例为4:3:2。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体，通过将mTet1基因通过多克隆位点克隆到慢病毒表达载体上，通过慢病毒包装后转染奶山羊雄性生殖干细胞，实现mTet1在奶山羊雄性生殖干细胞的整合与表达，这样的整合使得mTet1基因发挥其去甲基化作用，能够促进奶山羊精原干细胞的自我更新能力及细胞增殖能力。

本发明提供的基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体，通过慢病毒表达之后使得mTet1基因整合到奶山羊雄性生殖干细胞的基因组。对稳转的阳性细胞进行培养，表现出漩涡状成簇生长，细胞形态学良好，流式分析细胞增殖周期，发现S期细胞数量增加，表明增殖能力增强，而且转录水平发现雄性生殖干细胞相关基因(PLZF和Gfra1)和自我更新相关基因(Oct4)表达上调，分化相关基因(Scp3)表达下调。

慢病毒载体介导的基因表达作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。因此，在本发明中选用作用稳定的慢病毒载体转导mTet1基因，表达效果良好。

附图说明

图1慢病毒表达载体pCDH-mTet1的质粒图谱；

图2BamHI单酶切(Marker右侧)、BamHI和NotI双酶切(Marker左侧)鉴定阳性重组质粒pCDH-mTet1；

图3荧光显微镜观察病毒包装过程中pCDH-mTet1载体阳性表达的293T细胞及报告基因GFP的表达；

图4荧光显微镜观察pCDH-mTet1载体阳性表达的奶山羊雄性生殖干细胞及报告基因GFP的表达；

图5流式细胞仪检测pCDH-mTet1载体阳性表达的奶山羊雄性生殖干细胞的报告基因GFP表达的阳性率；

图6对pCDH-mTet1载体阳性表达的奶山羊雄性生殖干细胞cDNA的mTet1基因扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图7对pCDH-mTet1载体阳性表达的奶山羊雄性生殖干细胞的经典标记基因的相对表达量检测结果；

图8以pCDH空载体转导的宿主细胞为对照，用流式细胞仪检测对pCDH-mTet1载体阳性表达的奶山羊雄性生殖干细胞进行细胞周期检测的结果。

具体实施方式

本发明首先构建含有mTet1和绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒表达载体pCDH-mTet1，其次用慢病毒载体法将慢病毒表达载体pCDH-mTet1导入奶山羊雄性生殖干细胞，荧光显微镜观察标记基因GFP的表达情况，并经嘌呤霉素筛选获得阳性细胞，进行PCR鉴定，证实目的基因mTet1整合到奶山羊雄性生殖干细胞的基因组。

具体所涉及的主要试剂如下：嘌呤霉素、DMEM、DMEM-F12培养基均购自美国GIBCO(Invitrogen)公司，EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，胎牛血清为美国HYCLONE(HYCLONE)公司，细胞培养板和培养皿为丹麦Nunclon公司产品，质粒提取试剂盒购自天根公司，反转录试剂盒和TurboFect转染试剂均购自Thermo公司。DNA聚合酶购自全式金公司。

下面结合附图和实验对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明解释的而不是限定。

1、慢病毒表达载体pCDH-mTet1的构建

a、目的基因mTet1的克隆

根据GeneID:GU079948所公布的mTet1mRNA序列设计引物P1和P2，以小鼠ES细胞的cDNA为模板用引物P1、P2进行PCR扩增，引物序列如下：

前向引物P1:ATGTCTCGGTCCCGCCCCGCAAAGCCTTC 29

后向引物P2:TTAGAACCAACGATTGTAGGGTCCCG    26

25μL的PCR反应体系为：5×Fly Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：2μL，P1(5mol/L)：1μL，P2(5mol/L)：1μL，FastPfu聚合酶(5U/μL)：0.15μL，模板：1.5μL，Mg²⁺(50mmol/L)：1μL，加超纯水至25μL。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸6min，30个PCR循环，72℃再延伸7min；α

PCR产物与pMD-18T Vector 4℃连接过夜,转化感受态细胞E.coliDH5α,通过α-互补的蓝白斑筛选挑选重组子，经NotI酶切鉴定阳性重组质粒pCDH-mTet1并送交上海生物工程技术服务有限公司测序。mTet1基因测序结果如SEQ.ID.NO.1所示，与公布的mTet1mRNA序列(GeneID:GU079948)同源性为99.7％，因此，所克隆的基因为mTet1基因。

b、pCDH-mTet1的载体结构

如图1所示，本发明具体以pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro慢病毒基础载体和pMD-18T-mTet1载体构建包含目的基因mTet1的慢病毒表达载体pCDH-mTet1。

pCDH-mTet1载体的构建如下：

将SEQ.ID.NO.1所示的mTet1片段TA克隆到pMD-18T载体(购自大连宝生物公司)上，获得的载体命名为pMD-18T-mTet1。

pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro载体包含嘌呤霉素抗性筛选基因Puro和带有EF1启动子的标记基因GFP；标记基因GFP可在哺乳动物细胞中高表达并产生荧光；pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro载体商购就可以获得。

用BamHI和NotI双酶切载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro，胶回收片段，按照重组载体中的酶切位点BamHI和NotI设计引物，以pMD-18T-mTet1为模板用引物进行PCR扩增，其中，引物对为：

前向引物P3:GGATCCATGTCTCGGTCCCGCC          22

后向引物P4:AAGCGGCCGCTTAGAACCAACGATTGTAGGG 31

按照a步骤中的PCR体系，胶回收纯化PCR产物，用BamHI和NotI双酶切mTet1片段，胶回收，用T4DNA连接酶4℃连接过夜，并转化感受态细胞E.coli DH5α，经BamHI单酶切、BamHI和NotI双酶切鉴定阳性重组质粒，如图2所示，其中，泳道2Marker，为DL15000，大小分别代表250bp，1000bp，2500bp，5000bp，7500bp，10000bp和15000bp；泳道3为BamHI单酶切鉴定，可以看到一条约为13479的条带；泳道1为BamHI和NotI双酶切鉴定，可以看到7377bp和6120bp的两条条带，说明mTet1通过BamHI和NotI酶切位点克隆到了载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro上，将获得的重组质粒命名为pCDH-mTet1(检测图中标示为mGSC-mTet1)。

由于质粒在大肠杆菌中增殖，用普通的质粒提取方法容易将细菌内毒素带到终产物中，细菌内毒素的存在会影响质粒转染效率和细胞生长，所以本研究使用了去内毒素的质粒提取试剂盒，以减少内毒素对试验结果的负面影响。用天根公司的去内毒素的质粒纯化试剂盒提取质粒后用核酸蛋白测定仪测定质粒的浓度和纯度，经测定，质粒的浓度为489ng/l，OD260/280为1.91，说明质粒较纯，可用于转染。

本发明通过多克隆位点BamHI和NotI将目的基因mTet1插入到pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro上的多克隆位点，使mTet1基因在转染阳性细胞中持续表达。

2、pCDH-mTet1慢病毒表达载体转导奶山羊雄性生殖干细胞及细胞筛选

c、293T细胞和奶山羊雄性生殖干细胞的培养

从液氮中分别取一管293T细胞和奶山羊雄性生殖干细胞于38℃解冻，分别加入0.8ml的DMEM和DMEM-F12细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取4ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO₂培养箱中38.5℃条件下培养。

待293T细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞,加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于多聚赖氨酸处理皿底的60mm皿中，放入CO₂培养箱中培养。培养至细胞达到80％汇合用于病毒包装。

待奶山羊雄性生殖干细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞,加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM-F12细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于12孔板，放入CO₂培养箱中培养。奶山羊雄性生殖干细胞，培养至细胞达到80％汇合时用于转导。

本发明以嘌呤霉素作为筛选药物，由于载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro的骨架上含有嘌呤霉素抗性基因Puro，外源基因mTet1得到表达的奶山羊雄性生殖干细胞能够在含有一定浓度嘌呤霉素的培养液中存活下来，而未转导的正常细胞会在该浓度下死亡，因此，需要确定正常细胞嘌呤霉素的最小致死浓度来作为筛选浓度。

嘌呤霉素最小致死浓度的测定：在奶山羊雄性生殖干细胞培养液(DMEM-F12细胞培养液)中分别加入浓度梯度的嘌呤霉素筛选1周,测定正常细胞的嘌呤霉素最小致死浓度。当细胞培养液中嘌呤霉素的浓度>900g/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡,所以嘌呤霉素的最小致死浓度为900g/ml。

e、pCDH-mTet1慢病毒表达载体转导奶山羊雄性生殖干细胞

转基因的方法有很多种，包括电穿孔法、显微注射法、基因枪法、病毒载体法、受体介导法等。本发明具体采用病毒载体法，用pCDH-mTet1慢病毒表达载体转导奶山羊雄性生殖干细胞，转染试剂TurboFect是一种独特的阳离子多聚物水溶液，其与强效缓冲液配合使用可高效地将蛋白、抗体和多肽导入细胞质中。无论培养基中是否含有血清，该试剂均能转染蛋白。用TurboFect进行基因转移与其它方法相比，操作简便、重复性好、不受DNA大小限制、毒性小,转导效率高。具体为：

包毒前一天，将293T细胞以2×10⁶接种于60mm皿中，培养过夜使细胞达到70-80％汇合。包装病毒前换预热的新鲜DMEM培养液，分别将8gpCDH-mTet1与辅助质粒PAX和VSVG(CLONTECH)按照4:3:2的质量比例加入100μl Opti-MEM中进行混匀，然后加入18μl的TurboFect吹打混匀，室温孵育20min后，缓慢将其加入到细胞培养液中；12h后换新鲜的病毒包装液；pCDH-mTet1转导细胞24h后，在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光，如图3所示，转基因的293T细胞发出绿色荧光，36h后收取包含重组了mTet1的慢病毒的毒液，于-80℃冰箱保存待用。

接种前一天，将奶山羊雄性生殖干细胞以1×10⁵接种于12孔板中，培养过夜使细胞达到70-80％汇合。对于每孔细胞，分别将恢复室温的毒液和新鲜DMEM-F12培养液按照1:1的比例加入每孔，12h后转换为含血清的正常DMEM-F12细胞培养液继续培养，48h后加入嘌呤霉素至终浓度900μg/ml。

f、pCDH-mTet1载体阳性表达的细胞筛选

pCDH-mTet1载体转导奶山羊雄性生殖干细胞24h后，在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况，并在48h后在含血清的DMEM-F12细胞培养液中添加900μg/ml的最小致死浓度的嘌呤霉素筛选；以未转染pCDH-mTet1的奶山羊雄性生殖干细胞为阴性对照，其细胞培养液加有同样浓度的嘌呤霉素(900μg/ml)。

pCDH-mTet1转导细胞24h后，在荧光显微镜下可以看到绿色荧光，如图4所示，转基因的奶山羊雄性生殖干细胞发出绿色荧光，说明pCDH-mTet1已经进入细胞且阳性表达；pCDH-mTet1转染细胞7d后，对照组的细胞全部死亡，将包含pCDH-mTet1转染阳性的细胞组的嘌呤霉素浓度减半持续筛选直到细胞长满皿底，可见到阳性细胞形成岛屿状细胞群，在荧光显微镜下仍然可以看到绿色荧光；然后消化细胞，用不加嘌呤霉素的正常培养液扩大培养。

本发明筛选的阳性细胞都是稳定转导pCDH-mTet1的细胞，目的基因mTet1整合到细胞的基因组上，而不是游离于基因组之外；在稳定转导的过程中，质粒pCDH-mTet1上携带的基因会整合到宿主细胞的基因组上，整合的位置是随机的；通过嘌呤霉素筛选7天，再半剂量持续筛选来达到稳定转染的目的，表现为报告基因在被转导的阳性细胞内持续表达，因此，筛选的阳性细胞持续发出绿色荧光并呈现嘌呤霉素抗性，结果如图4所示。采用流式细胞仪方法检测阳性细胞GFP表达比例，结果如图5所示，阳性率高于93％，证明细胞的纯度很高，可以用于后续试验。

g、pCDH-mTet1载体阳性表达细胞的PCR鉴定

取扩大培养后的pCDH-mTet1阳性表达的奶山羊雄性生殖干细胞，提取细胞RNA，以cDNA为模板，PCR鉴定mTet1基因是否整合到细胞基因组中，阴性对照为未转染的正常奶山羊雄性生殖干细胞，PCR鉴定所用引物对为P1和P2；

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸6min，30个PCR循环，72℃再延伸7min；回收PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图6所示，其中，泳道1为DNA MarkerDL15000，泳道2为pCDH-mTet1转导的奶山羊雄性生殖干细胞，明显可以看到一条6120bp左右的条带，说明目的基因mTet1整合到了宿主细胞奶山羊雄性生殖干细胞的基因组。

3、pCDH-mTet1转导奶山羊雄性生殖干细胞的功能检测

h、pCDH-mTet1载体阳性表达细胞的基因表达鉴定

取扩大培养后的pCDH-mTet1阳性表达的奶山羊雄性生殖干细胞，提取细胞总RNA，以cDNA为模板，q-RT-PCR鉴定mTet1超表达后细胞相关基因的表达变化，对照组为未转染的正常奶山羊雄性生殖干细胞，q-RT-PCR鉴定所用引物对为下表所示；

Gapdh：前向引物P1:CCACGCCATCACTGCCACCC   20

       后向引物P2:CAGCCTTGGCAGCGCCAGTA   20

Oct4：前向引物P3:AAGCAGTGACTACTCCCAACG   21

      后向引物P4:GGGAATGGGACCGAAGAGTA    20

PLZF：前向引物P5:CACCGCAACAGCCAGCACTAT   21

      后向引物P6:CAGCGTACAGCAGGTCATCCAG  22

Gfra1：前向引物P7:GGACAGGCAGCAGGAAATA    19

       后向引物P8:GTCTCCTGTCCCAGTCAAA    19

Scp3：前向引物P9:GTATGGAGGACTTGGAGA      18

      后向引物P10:GAGACTTTCGGACACTTGC    19

PCNA：前向引物P11:AGTGGAGAACTTGGAAATGGAA 22

      后向引物P12:GAGACAGTGGAGTGGCTTTTGT 22

q-RT-PCR以Gapdh为内参，反应条件为：94℃退火5min，循环包括：94℃变性20s，59℃退火30s，72℃延伸10s，40个PCR循环；溶解曲线的步骤为70℃到95℃，每个梯度隔0.5℃采集一次荧光，用时10s，PCR反应体系(15μL)如下：ddH2O 6.3μL，2×SYBR 7.5μL，cDNA 0.5μL，上下游引物(10μmol/L)0.6μL，Taq DNA聚合酶0.1μL；检测结果通过软件GraphPad Prism分析，结果如图7所示，Oct4、PLZF和Gfra1表达均有一定程度的上调；而Plzf和Oct4是非常重要的自我更新和多能性相关基因，同时，PLZF和Gfra1作为雄性生殖干细胞的特异标记基因；结果表明Tet1通过去甲基化的修饰使得奶山羊生殖干细胞更加能够维持自身干性，有助于其自我更新；分化标记基因Scp3表达下调，说明mTet1表达之后，通过去甲基化修饰，促使分化基因表达下调，降低分化程度，增加多能性，促进自我更新的能力增强；而这些相关基因的表达上调显然会促进奶山羊精原干细胞的自我更新和多态性的维持。

i、pCDH-mTet1载体阳性表达细胞的细胞活力检测

取扩大培养后的pCDH-mTet1阳性表达的奶山羊雄性生殖干细胞，以同样细胞数的未转染的正常奶山羊雄性生殖干细胞作对照，待细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用预冷的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞,加入胰蛋白酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM-F12细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，应用联川生物技术公司的细胞周期试剂盒对细胞进行避光孵育30min，然后用流式细胞仪进行分析，结果如图8所示，A图为同等条件培养和药物处理的宿主细胞mGSC-mTet1，S期细胞比例为39.3％；B图为转导pCDH-mTet1的阳性细胞，S期细胞比例为44.9％，说明mTet1超表达的细胞增殖能力高于阴性细胞，mTet1基因的调控对细胞的自我更新发挥正向功能。

以上结果说明在mTet1通过慢病毒转染之后，奶山羊雄性生殖干细胞的自我更新能力增高，细胞增殖加快；mTet通过去甲基化作用能发挥调节和维持自我更新和多能性的作用，可能在构建永生化奶山羊精原干细胞的研究中发挥潜在的积极作用。

Claims (10)

1.一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体，其特征在于，该载体包裹于慢病毒之中，载体上携带有mTet1基因。

2.如权利要求1所述的基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体，其特征在于，所述的载体为慢病毒载体，所述的mTet1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.如权利要求2所述的基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体，其特征在于，所述的慢病毒载体上还设有抗生素筛选基因和标记基因。

4.如权利要求1所述的基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体，其特征在于，所述的载体为慢病毒载体pCDH-mTet1，是将mTet1基因克隆到基础载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro中的多克隆位点而得到。

5.一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的重组慢病毒，其特征在于，该重组慢病毒是由慢病毒载体pCDH-mTet1与PAX和VSVG转染293T细胞，经孵育后获取的；

所述的慢病毒载体pCDH-mTet1，是将mTet1基因克隆到基础载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro中的多克隆位点而得到。

6.权利要求1所述的基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体在促进奶山羊雄性生殖干细胞的自我更新、维持多能性和增殖中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的载体通过慢病毒包装转染奶山羊雄性生殖干细胞，上调与自我更新和多能性相关基因的表达，促进奶山羊雄性生殖干细胞进行细胞增殖的S期。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的自我更新和多能性及雄性生殖干细胞相关基因包括Oct4、Plzf和和Gfra1。

9.一种促进奶山羊雄性生殖干细胞的自我更新和增殖的方法，其特征在于，包括以下操作：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的mTet1基因，并将其克隆到慢病毒表达载体中构建mTet1慢病毒表达载体；

2)将待转染的293T细胞加入到DMEM培养液中；将构建的mTet1慢病毒表达载体与辅助质粒PAX和VSVG在Opti-MEM中混匀，然后加到转染试剂TurboFect中吹打混匀，室温孵育后得到病毒感染液，再加入到DMEM培养液中，进行细胞转染；转染12h后更换新鲜的病毒感染液继续转染；转染36h后收取包含重组了mTet1的慢病毒的毒液；

3)将收取的毒液和新鲜DMEM-F12培养液混合后加入接种有奶山羊雄性生殖干细胞的培养板中，12h后转换为含血清的正常DMEM-F12细胞培养液继续培养，48h后加入抗生素进行抗性筛选；

4)mTet1阳性表达的奶山羊精原干细胞，其自我更新能力增高，细胞增殖加快。

10.如权利要求9所述的促进奶山羊雄性生殖干细胞的自我更新和增殖的方法，其特征在于，所述的mTet1慢病毒表达载体与辅助质粒PAX和VSVG的质量比例为4:3:2。