JP2020536510A - 細胞の遺伝子修飾のための非組込みdnaベクター - Google Patents
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Abstract
Description
の配列モチーフの数は、好ましくは、上記ポリヌクレオチド内の200bpの任意のウィンドウについて決定可能な最大数であり、より好ましくは、上記ポリヌクレオチド内の500bpの任意のウィンドウについて決定可能な最大数である。好ましくは、S/MAR配列は、最大200ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも4つの配列モチーフATTA、より好ましくは最大200ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも5つの配列モチーフATTA、さらにより好ましくは最大200ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも6つの配列モチーフATTAを含む。また好ましくは、S/MAR配列は、最大400ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも3つの配列モチーフATTA、より好ましくは最大400ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも4つの配列モチーフATTA、さらにより好ましくは最大400ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも5つの配列モチーフATTA、最も好ましくは最大400ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも6つの配列モチーフATTAを含む。また好ましくは、S/MAR配列は、最大500ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも3つの配列モチーフATTA、より好ましくは最大500ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも4つの配列モチーフATTA、さらにより好ましくは最大500ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも5つの配列モチーフATTA、最も好ましくは最大500ヌクレオチドのストレッチにわたり、100ヌクレオチドあたり少なくとも6つの配列モチーフATTAを含む。したがって、好ましくは、S/MAR配列は、500ヌクレオチドの配列にわたって少なくとも10個の配列モチーフATTA、より好ましくは500ヌクレオチドの配列にわたって少なくとも20個の配列モチーフATTA、さらにより好ましくは500ヌクレオチドの配列にわたって少なくとも30個の配列モチーフATTAを含む。好ましくは、S/MAR配列中のATTAモチーフの少なくとも80%、
より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%は、それぞれ、9〜13、好ましくは10〜12、最も好ましくは11塩基対だけ離れている。
a)上記宿主細胞を本発明によるポリヌクレオチド、本発明による組成物、及び/又は本発明による宿主細胞と接触させるステップ、並びに
b)それにより、宿主細胞を安定にトランスフェクトするステップ
を含む方法に関する。
a)上記対象を本発明によるポリヌクレオチド、本発明による組成物、及び/又は本発明による宿主細胞と接触させるステップ、並びに
b)それにより、上記対象における遺伝病を治療するステップ
を含む方法にも関する。
1. 少なくとも1つのプロモーターおよびS/MAR要素を含有するポリヌクレオチドであって、前記S/MAR要素が前記プロモーターの下流に配置され、前記S/MAR要素の核酸配列(S/MAR配列)が、最大で200ヌクレオチドの一続きの区間にわたって100ヌクレオチドあたり少なくとも3つの配列モチーフATTA(配列番号1)を含有する、前記ポリヌクレオチド。
a) 配列番号9の配列を含有するピューロマイシン耐性ポリペプチドの発現を引き起こす;
b) 配列番号9の配列と少なくとも70%同一な配列を含有するピューロマイシン耐性ポリペプチドの発現を引き起こす;
c) 配列番号10の配列を含有する;
d) 配列番号10の配列と少なくとも70%同一な配列を含有する;
e) 配列番号9の配列を含有し、好ましくはその配列からなる、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する;および/または
f) 配列番号9の配列と少なくとも70%同一な配列を含有し、好ましくはその配列からなる、ピューロマイシン耐性ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する、
実施形態24のポリヌクレオチド。
a) 前記宿主細胞を、実施形態1〜41のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態42〜45のいずれか1つに記載の組成物、および/または実施形態46に記載の宿主細胞と接触させること、ならびに
b) それによって、宿主細胞を安定にトランスフェクトすること
を含む、前記方法。
a) 前記被験体を、実施形態1〜41のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、実施形態42〜45のいずれか1つに記載の組成物、および/または実施形態46に記載の宿主細胞と接触させること、ならびに
b) それによって、前記被験体において遺伝病を治療すること
を含む、前記方法。
実施例1:遺伝子的に修飾された細胞集団の確立の効率及び分析(図1)
安定に発現する細胞の生成おける効率は、pS/MARt(図4、配列番号14)を用いたコロニー形成アッセイにおいてpEPIと比較して評価された。DNA送達時に、GFP導入遺伝子発現に陽性である細胞をFACS選別(FACS Aria II)を介して単離し、100個の細胞を6cm細胞培養皿に播種した。次に、それらを0.5μg/mlピューロマイシンの存在下で4週間培養した。4週間後、細胞をPFAで固定し、コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。コロニー数は、ベクター確立の効率、すなわち播種されたFACS選別した細胞数あたりのコロニー形成数と見なされる。安定な細胞株の生成は非常に効果的であり、トランスフェクトされた細胞の40%超が確立されるようになる(図1A))。導入遺伝子(GFP)発現細胞の数をフローサイトメトリーによって推定した。図1b)に示されるように、pS/MARtは、導入遺伝子の発現が有意な数の陰性細胞なしで均質である修飾された集団を生成する。
哺乳動物細胞におけるベクターの、エピソーム状態および分子的完全性を判定するために、DNAレスキュー実験を行った。
pS/MARtベクターがエピソームとして哺乳動物細胞を改変していることをさらに立証するために、サザンブロット分析によって構造を物理的に測定した。DNAトランスフェクション後少なくとも30日間培養したHek293T細胞集団を分析した。ゲノムDNAをBlood&Tissue DNAeasyキット(Qiagen)で抽出し、制限酵素BamHI(NEB)により37℃にて一晩消化した。次に、全細胞DNAを1%アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に転写した。ベクターのGFP遺伝子に相当するオリゴヌクレオチドを用いて、細胞DNAに含まれるpS/MARt DNAを検出するために使用する放射性プローブを作製した。対照ベクターと同一サイズの単一バンドがサンプル中に存在することは、確立された哺乳動物細胞集団においてpS/MARtがエピソーム状態であることを示す。スメアおよび/または別のバンドが存在しないことは、そのベクターが細胞ゲノム内に組み込まれることも再構成されることもなかったことを示す。
ApoL-MAR及びベータ-IFN-MARの構成要素を保有する、ある範囲のpS/MARt DNAベクターによる安定発現細胞を生じる効率をコロニー形成アッセイにて評価した。DNA送達後、レポーター遺伝子GFPの発現について陽性の細胞をFACSソーティング(FACS Aria II)により分離し、100を6 cm細胞培養ディッシュ上に播種した。次いで細胞を0.5 g/mlピューロマイシン存在下で4週間培養した。4週間後、細胞をPFAで固定し、コロニーをクリスタルバイオレットで染色し定量した。コロニーの数を、ベクター確立効率と判断した。アッセイは、ApoL MAR、コア配列又は断片2で遺伝子操作されたベクターが、遺伝子的に改変された細胞の生成に最も効率的であったことを示す。
インスレーター配列がDNAベクターのサイレンシングまたは喪失を妨げるかどうかを評価するために、(A) pSMARt-インスレーター-GFP-2a-Puro βインターフェロンMAR、または(B) pSMARt-インスレーター-GFP-2a-Puro ApoL MARでトランスフェクトされた細胞において、抗生物質選択をしない場合のGFPの導入遺伝子発現を測定した。細胞は、DNAベクターでトランスフェクトし、1μg/mlピューロマイシン中で培養した。1週間後、細胞を分割し、それぞれトランスフェクションを代表する細胞群から薬物を除去した。
(2) pSMARt-インスレーター-GFP-2A-Puro βインターフェロンMAR - 選択解除
(3) pSMARt-インスレーター-GFP-2a-Puro ApoL MAR - 連続選択で培養
(4) pSMARt-インスレーター-GFP-2A-Puro ApoL MAR - 選択解除
確立効率に及ぼす選択マーカーの影響を評価するために、図5に示すようにコロニー形成アッセイを行った。図7 (A)は、DNAベクターpS/MARtによる確立効率が抗生物質選択マーカーと無関係であることを示す。選択マーカーは、S/MARモチーフに転写で連結される場合、確立効率を向上させる。図7 (B)は、細菌性の骨格と真核生物プロモーターとの間にインスレーションエレメントを追加で組み入れると、確立効率が改善されることを示す。
本発明のDNAベクター系が初代ヒトCD3+細胞をトランスフェクトする効率を評価し、それらの発現プロファイルを測定するために、pS/MARtベクター系の3つのバリアント、およびGFPをコードするpERIをトランスフェクトし、それらがヒトT細胞においてレポーター遺伝子GFPの持続発現をもたらす能力を調べた。DNAベクターを、電気的導入(Nucleofector Device Y, Lonza)によって、新たに分離されたPBMCに導入し、その細胞をIL-2(5μg/ml、Biolegend)存在下で35日間培養した。7日ごとに、細胞の導入遺伝子発現をチェックし、その増殖を、抗体、抗CD28(Bioegend)および抗CD3(Biolegend)の培地中添加により刺激した。ApoLMARのコアバージョンを保有するpS/MARtは、全長ApoL-MAR配列、βIHN MAR保有pS/MARt、およびpERIと比較して、より多数の導入遺伝子発現細胞を生じることができる。
スプライシング配列の導入によって確立効率を改善できることを示すために、MAR要素に隣接するスプライスドナーおよびアクセプター部位ありおよびなしの、一連のDNAベクターを作製した。確立効率に及ぼすスプライシング要素の影響を評価するために、図5に示すようにコロニー形成アッセイを行った。
pS/MARtが分子の損傷なしに幹細胞を効率よく改変することができるかどうか評価するために、安定な幹細胞株を作製した。pS/MARt-GFPベクターを用いてE14マウス胚性幹細胞(mESC)株を確立した。DNA導入の1か月後に、レポーター遺伝子GFPの発現を蛍光顕微鏡によって測定した(A)。pS/MARt-GFPにより改変されたmESCを、もっとも一般的な多能性マーカーについて染色したが、これは、エピソーム性ベクターの存在が、細胞の多能性を変化させないことを示す。
pS/MARt-GFP標識mESCをC57BL/6マウスの胚盤胞に注入し、結果としてキメラを形成した。このキメラの造血器官、たとえば脾臓および骨髄を、pan血液表面マーカーで染色し(CD45)、それらの蛍光をフローサイトメトリーで分析した。C57BL/6マウスおよび構成的発現UBC::GFPマウスをそれぞれ陰性対照および陽性対照として使用した(図11)。
(A) 2人の異なる健康なドナーから選別されたCD3+細胞を、ヒトCEAエピトープに対するターゲティングをもたらす、CAR272発現S/MARt DNAベクターにより改変し、それらの細胞溶解活性を、MCF-7細胞(乳がん細胞株)において、細胞傷害性およびインターフェロンγ放出アッセイにより確認した。
S/MARt DNAベクター系、レンチウイルス、および次世代NanoS/MARt DNAベクターにより作製されたCAR-T細胞のin vivo分析(図14)。
Claims (18)
- 少なくとも1つのプロモーターおよびS/MAR要素を含有するポリヌクレオチドであって、前記S/MAR要素が前記プロモーターの下流に配置され、前記S/MAR要素の核酸配列(S/MAR配列)が、最大で200ヌクレオチドの一続きの区間にわたって、100ヌクレオチドあたり少なくとも3つの配列モチーフATTA(配列番号1)を含有する、前記ポリヌクレオチド。
- 前記S/MAR要素がスプライスドナーおよびスプライスアクセプターに隣接している、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、ポリペプチド、好ましくは選択マーカー、をコードするコード配列をさらに含有し、ポリペプチドをコードする前記コード配列が前記プロモーターと前記S/MAR要素の間に存在する、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、選択マーカーをコードするコード配列(選択マーカー配列)をさらに含有し、前記選択マーカー配列は前記プロモーターと前記S/MAR要素の間に存在し、前記プロモーターおよび前記選択マーカーは全体として選択マーカー遺伝子を構成しており、前記選択マーカーは真核細胞の選択マーカーである、請求項1〜3のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 前記選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、またはゼオシン耐性遺伝子であり、好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子である、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 転写物が前記プロモーターから転写されるが、その転写物からS/MAR要素の配列がスプライシングで切り出される、請求項2〜5のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、細菌の複製開始点、および/または細菌性選択マーカー遺伝子をさらに含有し、前記の細菌の複製開始点および/または細菌性選択マーカー遺伝子が、少なくとも1つのインスレーションエレメントの存在によって、ポリヌクレオチド内に含まれる残りの配列から隔絶されている、請求項1〜6のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、サルウイルス40(SV40)複製開始点、ウシパピローマウイルス(BPV)複製開始点、およびエプスタイン・バーウイルス(EBV)複製開始点を有しない、請求項1〜6のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドは宿主細胞内でエピソームとして複製するが、好ましくはエピソーム複製が、好ましくは哺乳動物細胞内で安定したエピソーム複製である、請求項1〜8のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜9のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドを含有する組成物であって、好ましくは前記組成物が医薬組成物である、前記組成物。
- 請求項1〜9のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞がCD34+前駆細胞;CD61+血小板;CD19+ Bリンパ球;CD14+単球;CD15+顆粒球;CD3+細胞傷害性Tリンパ球、好ましくは、CD8およびCD45も陽性;CD3+ヘルパーTリンパ球、好ましくはCD4およびCD45も陽性;CD3+活性化Tリンパ球、好ましくはCD25およびCD45も陽性、腫瘍浸潤リンパ球、またはナチュラルキラー(NK)細胞である、前記宿主細胞。
- 医薬に使用するための、好ましくは遺伝病の治療に使用するための、請求項1〜9のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、請求項10に記載の組成物、および/または請求項11に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜9のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、および細胞内移行を媒介する化合物を含む、キット。
- 請求項1〜9のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、請求項10に記載の組成物、および/または請求項11に記載の宿主細胞を含む、デバイス。
- 宿主細胞を安定にトランスフェクトするための方法であって、
a) 前記宿主細胞を、請求項1〜9のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、および/または請求項10に記載の組成物、および/または請求項11に記載の宿主細胞と接触させること、ならびに
b) それによって、宿主細胞を安定にトランスフェクトすること
を含む、前記方法。 - 前記の安定なトランスフェクションが、ポリヌクレオチドの安定したエピソーム複製を含み、それが、好ましくは、平均して50回の細胞分裂後に宿主細胞集団においてそのポリヌクレオチドが依然として検出可能であるようなエピソーム複製である、請求項15に記載の方法。
- 宿主細胞を安定に遺伝子改変するための、請求項1〜8のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドの使用。
- 前記の宿主細胞の安定な遺伝子改変が、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの安定したエピソーム複製を含み、それが、好ましくは、平均して50回の細胞分裂後に宿主細胞集団においてそのポリヌクレオチドが依然として検出可能であるようなエピソーム複製である、請求項17に記載の使用。
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