CN111278972A - 用于细胞遗传修饰的非整合型dna载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含至少一个启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段中，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA(SEQ ID NO：1)；本发明还涉及包含所述多核苷酸的组合物和宿主细胞，以及涉及用于医药用途和用于治疗遗传疾病的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的试剂盒和装置，以及涉及多核苷酸的方法和用途。

Description

用于细胞遗传修饰的非整合型DNA载体
本发明涉及包含至少一个启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段中，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA(SEQ ID NO：1)；本发明还涉及包含所述多核苷酸的组合物和宿主细胞，以及涉及用于医学和用于治疗遗传疾病的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的试剂盒和装置，以及涉及多核苷酸的方法和用途。
出于科学目的，现代细胞培养中通常使用细胞的遗传修饰。然而，尽管非常需要，但是使用相应技术来治疗由基因突变引起的遗传疾病仍然受到以下问题的阻碍：可用的方法通常仅提供瞬时修饰，例如瞬时转染方案，而提供细胞稳定修饰的方法通常依赖转基因整合到宿主细胞的基因组中。然而，即使靶向至特定基因座，转基因的整合也具有引起有害突变的风险，这可能导致例如作为治疗副作用的癌症。
核骨架/基质附着区(S/MAR)(也称为核骨架附着区(SAR))或与基质相关的区(MAR)被称为真核生物基因组中介导核基质附着的序列。S/MARS是富AT的序列，并且发现一些富AT的基序被进一步富集(Liebeich等人(2002)，NAR 30(15)：3433)。已经提出了多种在细胞中稳定维持的基于S/MAR基序的载体，例如在US 6410314 B1和Haase等人(2010)，BMCBiotechnology 10：20中；此外，鉴定了对这种载体的复制有影响的表观遗传效应(Haase等人(2013)，PLOS One 8(11)：e79262)。然而，仍然没有足够稳定的用于基因治疗的基于S/MAR的载体。
然而，在本领域中需要用于稳定转染细胞的改进的手段和方法，特别是使用S/MAR元件并避免与将转基因整合到宿主细胞的基因组中有关的风险。该问题通过本文公开的手段和方法解决。
因此，本发明涉及包含至少一个启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA。
如下所使用的，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任意语法变体以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指除了由这些术语引入的特征之外，在该上下文中描述的实体中不存在其他特征的情况，也可以指具有一个或多于一个其他特征的情况。例如，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”可以指除了B之外，A中不存在其他要素的情况(即，A仅由B组成的情况)，以及除了B之外，实体A中还存在一个或多于一个其他要素，例如要素C、要素C和D或甚至其他元素的情况。
此外，如下文所使用的，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与任选的特征结合使用，而不限制其他可能性。因此，由这些术语引入的特征是任选特征，并且不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代性特征来进行。类似地，由“在本发明的实施方案中”或类似表述引入的特征旨在为任选特征，其对本发明的其他实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对将以这种方式引入的特征和本发明的其他任选或非任选特征组合的可能性也没有任何限制。
此外，如果没有另外指出，则术语“约”涉及具有相关领域中通常可接受的技术精度的指示值，优选地涉及±20％，更优选±10％，最优选±5％的指示值。此外，术语“基本上”表示不存在对所指示的结果或用途有影响的偏差，即潜在的偏差不会使所指示的结果偏差超过±20％，更优选±10％，最优选±5％。因此，“基本上由……组成”指包含指定的组分，但除了作为杂质存在的物质、由于用于提供组分的工艺而存在的不可避免的物质之外不包含的其他组分，以及为实现本发明的技术效果以外的目的而添加的组分。例如，使用短语“基本上由……组成”限定的组合物涵盖任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。优选地，基本上由一组组分组成的组合物将包含小于5重量％，更优选小于3重量％，甚至更优选小于1重量％，最优选小于0.1重量％的非特定组分。在核酸序列的上下文中，术语“基本上相同”表示至少80％，优选至少90％，更优选至少98％，最优选至少99％的同一性值％。如会被理解的，术语基本相同包括100％的同一性。加以必要变通的情况下，前述内容也适用于术语“基本上互补”。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”指线性或环状核酸分子。该术语涵盖单链多核苷酸以及部分或完全双链的多核苷酸。优选地，多核苷酸是RNA或是DNA，包括cDNA。此外，还包括经化学修饰的多核苷酸，包括天然存在的修饰的多核苷酸，例如糖基化或甲基化的多核苷酸，或人工修饰的衍生物，例如生物素化的多核苷酸。本发明的多核苷酸应优选以分离的多核苷酸(即从其天然环境分离的)或以遗传修饰的形式提供。本发明的多核苷酸包含至少一种在宿主细胞中有活性的启动子和S/MAR元件。此外，多核苷酸具有在宿主细胞中附加体型复制的生物学活性，全部如本文下文所述。优选地，多核苷酸的长度为至多1Mb，更优选至多500kb，甚至更优选至多200kb，最优选至多100kb。优选地，多核苷酸是非天然存在的多核苷酸；因此，优选地，核苷酸是人工多核苷酸。还优选地，多核苷酸是嵌合多核苷酸；更优选地，多核苷酸包含与其包含的其余核酸序列异源的至少一个核酸序列。
如本文所使用的，术语多核苷酸优选包含具体所示的多核苷酸的变体。更优选地，术语多核苷酸涉及所示的特定多核苷酸。如本文所使用的，术语“多核苷酸变体”涉及与本文相关的多核苷酸的变体，其包含核酸序列，特征在于该序列可通过至少一个核苷酸置换、添加和/或缺失衍生自上述特定核酸序列，其中多核苷酸变体应具有对特定多核苷酸特异的生物学活性。因此，应理解，根据本发明的多核苷酸变体应具有由于至少一个核苷酸置换、缺失和/或添加而不同的核酸序列。优选地，所述多核苷酸变体包含特定多核苷酸或其功能性子序列(例如，S/MAR元件)的种间同源物、种内同源物或其他同源物。还优选地，所述多核苷酸变体包含特定多核苷酸或其功能性子序列的天然存在的等位基因。多核苷酸变体还涵盖包含核酸序列的多核苷酸，该核酸序列优选在严格的杂交条件下能够与上述特定多核苷酸或其功能性子序列杂交。这些严格的条件是本领域技术人员已知的并且可以在标准教科书中找到。严格的杂交条件的优选实例是在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中的杂交条件，然后在50℃至65℃下在0.2x SSC，0.1％SDS中的一个或多于一个洗涤步骤。技术人员知道这些杂交条件根据核酸的类型以及例如当存在有机溶剂时，在缓冲液的温度和浓度方面有所不同。例如，在“标准杂交条件”下，根据核酸类型，温度为42℃至58℃，含水缓冲液浓度为0.1x至5x SSC(pH 7.2)。如果上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度为约42℃。DNA：DNA杂交体的杂交条件优选为例如0.1x SSC和20℃至45℃，优选30℃至45℃。DNA：RNA杂交体的杂交条件优选为例如0.1x SSC和30℃至55℃，优选45℃至55℃。例如在不存在甲酰胺的情况下，对于长度为约100bp(＝碱基对)且G+C含量为50％的核酸，确定上述杂交温度；因此，技术人员可能发现更适于低G+C DNA的其他条件(原则上对于技术人员是已知的)。技术人员知道如何通过参考标准教科书来确定所需的杂交条件。或者，可通过基于PCR的技术，例如基于混合寡核苷酸引物的DNA扩增，即，使用针对本发明多肽的保守结构域的简并引物来获得多核苷酸变体。多肽的保守结构域可以通过本发明的多核苷酸的核酸序列或本发明的多肽的氨基酸序列与其他生物的序列的序列比较来鉴定。作为模板，可以使用来自细菌、真菌、植物或优选来自动物的DNA或cDNA。此外，变体包括包含核酸序列的多核苷酸，该核酸序列与具体所示的核酸序列或其功能性子序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。此外，还涵盖了多核苷酸，其包含编码与具体所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的核酸序列。同一性百分比值优选地在整个氨基酸或核酸序列区域上计算。技术人员可以使用基于各种算法的一系列程序来比较不同的序列。在这种情况下，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出了特别可靠的结果。为了进行序列比对，优选使用程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS，5 1989：151-153)或程序Gap和BestFit(Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970))和Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981)))。优选地，所述程序与它们的标准参数一起使用。上面列出的以百分比(％)表示的序列同一性值优选以以下设置在整个序列区域中使用程序GAP确定：间隔权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均不匹配：0.000，除非另有说明，否则应始终将其用作序列比对的标准设置。
本发明的多核苷酸变体也涵盖包含任何具体所示的核酸序列的片段的多核苷酸、保留了所示活性的所述多核苷酸。本文所指的片段优选包含任一种特定核酸序列的至少200个，优选至少300个，更优选至少400个连续核苷酸；或编码包含任一种特定氨基酸序列的至少100个，优选至少200个，更优选至少300个连续氨基酸的氨基酸序列，并且仍具有所示活性。
本发明的多核苷酸由上述核酸序列组成、基本上由其组成或包含上述核酸序列。因此，它们也可以包含其他核酸序列。具体地，本发明的多核苷酸可以编码例如融合蛋白或选择性标志物。这些融合蛋白可包含作为附加部分的多肽以用于监测表达(例如，绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白、碱性磷酸酶等)或所谓的“标签”，其可作为可检测的标志物或用于纯化目的的辅助措施。用于不同目的的标签是本领域众所周知的，并在本文其他地方进行了描述。
还优选地，多核苷酸包含至少一种货物序列。如本文所使用的，术语“货物序列”涉及转移到宿主细胞中并稳定地维持在宿主细胞中的目标核酸序列。优选地，货物序列是编码多核苷酸，例如RNA和/或目的多肽的核酸序列。优选地，目的多肽是治疗性多肽，更优选T细胞受体(TCR)，更优选人T细胞受体或嵌合T细胞受体，嵌合抗原受体(CAR)，优选MART1TCR，或在受本文其他地方所述的遗传疾病影响的细胞中缺乏的多肽。因此，例如优选地，多核苷酸包含至少一种货物序列，其编码提供用于治疗苯丙酮尿症的苯丙氨酸-羟化酶活性(EC 1.14.16.1)的多肽。在优选的实施方案中，货物序列介于至少一个启动子和S/MAR元件之间。在另一个优选的实施方案中，货物序列介于至少一个启动子和S/MAR元件之间，其中所述S/MAR元件的侧面是剪接供体和剪接受体；因此，优选地，S/MAR元件是从编码货物序列的转录物中剪接出来的。因此，在优选的实施方案中，多核苷酸还包含编码多肽的编码序列，其中所述编码多肽的编码序列介于所述启动子和所述S/MAR元件之间。在另一个优选的实施方案中，编码多肽的序列介于至少一个启动子和S/MAR元件之间，其中所述S/MAR元件的侧面是剪接供体和剪接受体；因此，优选地，S/MAR元件是从编码多肽的转录物中剪接出来的。
优选地，编码选择性标志物的序列和货物序列被能够使真核细胞中的两种(或多于两种)多肽从一种mRNA中表达的序列插入，所述序列例如为内部核糖体进入序列(IRES)，或更优选自裂解肽序列，例如最优选来自猪捷申病毒属-1的肽2A(P2A)序列。适当的序列是本领域已知的，例如来自Kim等人(2011)PLoS ONE 6(4)：e18556。
优选地，多核苷酸是DNA。优选地，多核苷酸包含其他表达控制序列，其允许基因在原核宿主细胞和/或真核宿主细胞，优选在真核宿主细胞中或其分离的部分中表达。所述多核苷酸的表达包括多核苷酸的转录，优选转录为可翻译的mRNA。确保在真核细胞，优选哺乳动物细胞中表达的调节元件是本领域众所周知的。它们优选包含确保转录起始的调节序列，以及任选地包含确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。其他调节元件可包含转录增强子以及翻译增强子。允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的SMVP启动子、U6启动子、H1启动子、7SK启动子、CMV-EFS-启动子、SV40启动子或RSV启动子(Rous肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。此外，诱导型或细胞类型特异性表达控制序列可以包含在本发明的多核苷酸中。诱导型表达控制序列可以包含tet或lac操纵基因序列或由热激或其他环境因素诱导的序列。合适的表达控制序列是本领域众所周知的。除了负责转录起始的元件外，这种调节元件还可在多核苷酸下游包含转录终止信号，例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”涉及能够接收和稳定复制多核苷酸的任何细胞。优选地，宿主细胞是真核细胞，优选植物细胞或酵母细胞(例如面包酵母菌株的细胞)或动物细胞。更优选地，宿主细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞，特别是小鼠细胞或大鼠细胞。甚至更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，最优选是人细胞。优选地，宿主细胞是CD34+祖细胞；CD61+血小板；CD19+B淋巴细胞；CD14+单核细胞；CD15+粒细胞；CD3+细胞毒性T淋巴细胞，优选对CD8和CD45也呈阳性；CD3+辅助性T淋巴细胞，优选对CD4和CD45也呈阳性；CD3+激活的T淋巴细胞，优选对CD25和CD45也呈阳性，肿瘤浸润淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞。如本领域技术人员将理解的，多核苷酸可另外具有允许在细菌细胞中复制的序列，特别是细菌复制起点。优选地，细菌细胞是细菌实验室菌株的细胞，更优选是大肠杆菌细胞。
原则上，术语“启动子”是技术人员已知的遗传元件，其任选地与其他调节元件协同指导给定基因的转录水平。启动子可以是组成性的，即提供基本上不依赖于宿主细胞状态的恒定转录水平，或者可以被调节，即依赖于宿主细胞的状态而提供转录水平。此外，启动子可以是细胞类型和/或组织特异性的，即仅在少数或仅一种细胞类型中提供可检测的转录水平。优选地，根据本发明的启动子在如上所述的宿主细胞中具有活性。如本领域技术人员将理解的，启动子的选择可以取决于待靶向的宿主细胞的类型；用于特定细胞类型的合适的启动子以及组成性启动子是本领域已知的。优选地，启动子是真核启动子，更优选是组成性真核启动子，甚至更优选是强真核启动子。优选地，启动子是EF1α(延伸因子1α)启动子、UbiC(泛素C)启动子、ROSA 26启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)启动子和/或CAG(鸡α-肌动蛋白)启动子，更优选是EF1α启动子。还优选地，启动子是细胞特异性和/或组织特异性的真核启动子。如本文所使用的，术语“启动子”用于如上所述的启动子，而另外可能存在于多核苷酸上的任何其他启动子被称为“次级启动子”。因此，优选地，启动子是指导转录到宿主细胞的S/MAR序列中的启动子；还优选地，不指导转录到多核苷酸的S/MAR序列中的启动子(例如原核启动子、与S/MAR序列隔绝转录、和/或指导远离S/MAR序列的转录的启动子)是次级启动子。优选地，启动子包含对应于载脂蛋白B启动子的少于1000个，更优选少于250个，甚至更优选少于100个，最优选少于20个连续碱基对；因此，优选地，多核苷酸不包含人载脂蛋白B启动子，更优选不包含载脂蛋白B启动子。
优选地，S/MAR序列位于紧邻启动子的下游，并且如果存在的话，位于下文指定的选择性标志基因的下游。优选地，位于“紧邻下游”缺少插入转录终止信号，更优选地，缺少插入基因。因此，优选地，包含可检测的标志物序列的在启动子处起始的转录物如果被编码，则优选包含转录的S/MAR序列，更优选包含在多核苷酸中包含的完整S/MAR序列：如本领域技术人员根据本文其他地方的描述将理解的，多核苷酸可进一步包含介导从初级转录物中切除S/MAR序列的剪接位点；因此，更优选地，优选包含可检测的标志物序列的至少在启动子处起始的初级转录物如果被编码，则优选包含转录的S/MAR序列，更优选包含在多核苷酸中包含的完整的S/MAR序列。还优选地，术语“紧邻下游”包括其中启动子和S/MAR序列被延长的核酸序列隔开的多核苷酸，条件是转录终止信号不介于启动子和S/MAR之间。优选地，介于启动子或选择性标志物基因的终止密码子(如果存在)和S/MAR序列之间的序列的长度至多为2kb，更优选至多0.5kb，甚至更优选至多0.2kb，还更优选至多0.1kb，最优选至多50bp。
术语“S/MAR元件”也称为“核骨架/基质附着区”，原则上其是技术人员已知的，其涉及介导真核细胞的核基质与DNA的附着的DNA序列。S/MAR序列通常衍生自真核染色体DNA中的序列。可获得各种S/MAR序列，并且序列可由公共数据库获得，例如如Liebich等人(2002)，Nucleic Acids Res.30，312-374所述。根据本发明，所述S/MAR元件的核酸序列(迄今称为S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA。因此，S/MAR序列中包含的基序包含大量四核苷酸基序5′-ATTA-3′。优选地，S/MAR序列的长度为至少200个核苷酸，更优选至少300个核苷酸，甚至更优选至少400个核苷酸，最优选至少500个核苷酸。优选地，S/MAR序列的长度为至多3kb，更优选至多2kb，甚至更优选至多1.5kb，还更优选至多1kb，最优选至多0.9kb。在优选的实施方案中，S/MAR序列的长度为至多0.7kb，更优选至多500bp，最优选至多250bp。因此，优选地，S/MAR序列的长度为0.2kb至3kb，更优选0.3kb至2kb，甚至更优选0.4kb至1.5kb，最优选0.5kb至1kb。应当理解，表述“每100个核苷酸包含n个序列基序”涉及序列的每100个碱基对计算的所述序列基序的平均数，因此可以是分数。例如SEQ ID NO：6中每100个碱基对的ATTA序列基序的数目是34/525个碱基对*100个碱基对＝6.5。优选地，在S/MAR序列的整个长度上确定每100个碱基对的序列基序的数目；在有疑问的情况下，例如无法确定S/MAR序列的边界的情况下，多核苷酸的每100个碱基对的序列基序数优选为可在所述多核苷酸内对于任何200bp的窗口确定的最高数目，更优选为可在所述多核苷酸内对于任何500bp的窗口确定的最高数目。优选地，S/MAR序列在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少4个序列基序ATTA，更优选在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少5个序列基序ATTA；还更优选在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少6个序列基序ATTA。还优选地，S/MAR序列在至多400个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA，更优选在至多400个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少4个序列基序ATTA，甚至更优选在至多400个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少5个序列基序ATTA，最优选在至多400个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少6个序列基序ATTA。还优选地，S/MAR序列在至多500个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA，更优选在至多500个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少4个序列基序ATTA，还更优选在至多500个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少5个序列基序ATTA，最优选在至多500个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少6个序列基序ATTA。因此，优选地，S/MAR序列在500个核苷酸的序列上包含至少10个序列基序ATTA，更优选在500个核苷酸的序列上包含至少20个序列基序ATTA，还更优选在500个核苷酸的序列上包含至少30个序列基序ATTA。优选地，S/MAR序列中的至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的ATTA基序分别被9至13个碱基对，优选10至12个碱基对，最优选11个碱基对隔开。
优选地，S/MAR元件包含额外的序列基序，优选在包含上文所述的ATTA基序的序列内包含额外的序列基序。优选地，包含所述ATTA序列基序的所述S/MAR元件的序列片段还包含至少一个序列基序ATTTA(SEQ ID NO：2)，优选至少2个序列基序ATTTA，更优选至少4个序列基序ATTTA，最优选至少8个序列基序ATTTA。还优选地，包含所述ATTA序列基序和任选的所述ATTTA基序的所述S/MAR元件的序列片段还包含至少一个，优选至少两个，更优选至少四个，最优选至少六个回文基序(palindromic motif)，优选基序TAAATATTTTA(SEQ ID NO：3)。优选地，所述基序TAAATATTTTA在5′端和/或3′端与至少一个基序ATTA相邻。还优选地，包含所述ATTA序列基序的S/MAR元件的序列片段包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选至少四个，最优选至少五个序列基序ATTATAAATATTTTAATTA(SEQ ID NO：4)，更优选序列基序ATTTAATTATAAATATTTTAATTA(SEQ ID NO：5)。
还优选地，S/MAR序列具有低的G+C含量。技术人员知道如何通过计算序列中所有鸟嘌呤和胞苷碱基并将累积结果除以序列中核苷酸的数目来计算已知序列的C+G含量。优选地，包含所述序列基序ATTA的S/MAR元件的序列片段的G+C含量为至多30％，更优选至多20％，还更优选至多15％，甚至更优选至多10％，最优选至多5％。优选地，在无法确定S/MAR元件的边界的情况下，如上文所述，用于计算G+C含量的序列与用于计算每100个碱基对的ATTA基序数目的序列相同。还优选地，S/MAR元件具有低数量的CG二核苷酸。优选地，包含所述序列基序的所述S/MAR元件的序列片段包含至多6个序列基序CG，更优选至多4个序列基序CG，甚至更优选至多2个序列基序CG，最优选不包含序列基序CG。
优选地，S/MAR序列包含载脂蛋白B基因的S/MAR序列，优选人载脂蛋白B基因的S/MAR序列，更优选人载脂蛋白B基因的3′S/MAR序列。更优选地，S/MAR序列包含人载脂蛋白B基因的变体，更优选人载脂蛋白B基因的3′S/MAR序列的变体。因此，优选地，S/MAR序列包含与SEQ ID NO：6，优选SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有至少70％同一性的序列。更优选地，S/MAR序列包含SEQ ID NO：6，优选SEQ ID NO：7，更优选SEQ ID NO：8的核酸序列。在优选的实施方案中，S/MAR序列包含与SEQ ID NO：15的序列具有至少70％同一性的序列，更优选地，S/MAR序列包含SEQ ID NO：15的序列。
优选地，多核苷酸在S/MAR元件的下游包含poly-A信号。更优选地，多核苷酸在S/MAR元件的下游包含poly-A信号和转录终止信号。还优选地，S/MAR元件的侧面是剪接供体和剪接受体；因此，在优选的实施方案中，从启动子转录转录物，从该转录物中剪接出S/MAR元件的序列。还优选地，优选在转录后从编码选择性标志物的转录物中剪接出S/MAR序列。还优选地，多核苷酸还包含如上文所述的(次级)细菌复制起点和/或细菌选择性标志物基因。优选地，细菌复制起点和驱动细菌选择性标志物基因的表达的启动子是原核生物特异性的，即更优选地，在宿主细胞中是无功能的。还优选地，包含在多核苷酸中的细菌复制起点和/或细菌选择性标志基因，优选原核细胞中的所有活性元件通过至少一种隔绝元件的存在与包含在多核苷酸中的其余序列隔绝、更优选其侧面为隔绝元件。优选地，细菌复制起点和/或细菌选择性标志物基因，优选原核细胞中的所有活性元件通过至少一种在5′端的隔绝元件和至少一种在3′端的隔绝元件的存在与包含在多核苷酸中的其余序列隔绝。更优选地，包含在多核苷酸中的细菌复制起点和/或细菌选择性标志物基因，优选原核细胞中的所有活性元件通过至少一种隔绝元件的存在与启动子隔绝、更优选其侧面为隔绝元件。优选地，所述隔绝元件是抗抑制元件40元件(SEQ ID NO：11)或其变体和/或S/MAR元件。
因此，优选地，多核苷酸包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列或与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有至少70％同一性的序列；优选SEQ ID NO：12的序列或与SEQ IDNO：12的序列具有至少70％同一性的序列，更优选SEQ ID NO：13的序列或与SEQ ID NO：13的序列具有至少70％同一性的序列，最优选SEQ ID NO：14的序列或与SEQ ID NO：14的序列具有至少70％同一性的序列。优选地，多核苷酸包含SEQ ID NO：14的序列，其中编码GFP的核酸序列被编码不同多肽，优选治疗性多肽，更优选人T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)，优选MART1 TCR的核酸序列所替换。
优选地，多核苷酸还包含编码选择性标志物多肽的编码序列，所述选择性标志物序列介于多核苷酸的启动子和多核苷酸的S/MAR元件之间，优选地，其中所述启动子和所述选择性标志物序列共同构成选择性标志物基因。如本文所使用的，术语“选择性标志物序列”用作表述“编码选择性标志物多肽的编码序列”的简写。术语“选择性标志物”原则上是技术人员所理解的，并且涉及当在宿主细胞中表达时赋予介导对宿主细胞施用的选择性压力的至少一种条件的抗性的核酸序列。对于原核细胞和真核细胞，选择性标志物是本领域已知的。优选地，选择性标志物是真核细胞的选择性标志物。优选地，选择性标志物是选择性标志物多肽，更优选具有转运蛋白和/或酶活性的选择性标志物多肽，其从宿主细胞中除去选择性化合物或修饰所述选择性化合物以使其失活。优选地，选择性标志物基因还编码至少一个内含子，优选在编码选择性标志物多肽的序列上游。优选地，选择性标志物是介导对嘌呤霉素、杀稻瘟素、新霉素和/或博莱霉素，更优选对嘌呤霉素的抗性的标志物。因此，优选地，启动子和选择性标志共同构成嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟素抗性基因、新霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因，更优选嘌呤霉素抗性基因。在优选的实施方案中，选择性标志物是对特定的一组生长条件(优选存在和/或不存在增殖信号)提供抗性的多肽。因此，在优选的实施方案中，选择性标志物是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)，两者在本领域中原则上是已知的。优选地，TCR和/或CAR具有已知的特异性，使得优选地，可以在包含所述TCR和/或CAR的宿主细胞中诱导T细胞信号传导。优选地，在这种情况下，宿主细胞是T细胞或NK细胞。优选地，选择性标志物基因缺乏poly-A信号和转录终止信号。因此，在优选的实施方案中，多核苷酸还包含编码选择性标志的编码序列(选择性标志序列)，所述选择性标志物序列介于所述启动子和所述S/MAR元件之间，其中所述启动子和所述选择性标志物序列共同构成选择性标志物基因，其中所述选择性标志物是真核细胞的选择性标志物。
优选地，选择性标志物是嘌呤霉素乙酰转移酶(Genbank登录号KX548903.1(SEQID NO：9)，由Genbank登录号KX548903.1(SEQ ID NO：10)的535至1134位核苷酸编码。因此，选择性标志物基因优选包含核酸序列，其a)引起包含SEQ ID NO：9的序列的抗嘌呤霉素多肽的表达；b)引起包含与SEQ ID NO：9的序列具有至少70％同一性的序列的抗嘌呤霉素多肽的表达；c)包含SEQ ID NO：10的序列；d)包含与SEQ ID NO：10的序列具有至少70％同一性的序列，e)包含编码抗嘌呤霉素多肽的核酸序列，所述抗嘌呤霉素多肽包含SEQ ID NO：9的序列，优选由其构成，和/或f)包含编码抗嘌呤霉素多肽的核酸序列，所述抗嘌呤霉素多肽包含与SEQ ID NO：9的序列具有至少70％同一性的序列，优选由其构成。
如本文所使用的，术语“复制”涉及在细胞复制周期期间多核苷酸在宿主细胞中诱导所述多核苷酸的至少两个复制品产生的活性。因此，优选地，通过在一系列细胞分裂后确定多核苷酸的存在来确定宿主细胞中多核苷酸的复制，其中非复制多核苷酸将预期被稀释掉。优选地，复制是稳定复制，即复制的程度为在平均50次细胞分裂后，更优选在平均100次细胞分裂后，最优选在平均250次细胞分裂后仍能在宿主细胞群中检测到多核苷酸。优选地，在标准条件下通过PCR进行在宿主细胞群中多核苷酸的检测。
原则上，术语“游离”复制是技术人员已知的，其涉及复制多核苷酸而不使其整合到细胞基因组中，即不与细胞基因组共价连接。因此，优选地，多核苷酸的附加体型复制是作为自主复制单位的所述多核苷酸的复制。优选地，附加体型复制是以环状闭合双链DNA分子的形式维持宿主细胞中的多核苷酸。如技术人员将理解的，所述多核苷酸的实际复制可以涉及其他形式，例如滚环式复制。环状DNA的游离维持优选通过技术人员已知的质粒拯救过程来验证；即优选地，通过制备宿主细胞的裂解物并将其中包含的DNA转化为合适的细菌细胞，例如大肠杆菌细胞；如果通过所述方法可获得的合适数目的细菌菌落包含环状DNA作为具有与原始环状DNA相同的限制图谱和/或序列的质粒，则优选假定环状DNA被游离维持。本领域技术人员还已知的另一种验证游离维持的方法是DNA/DNA印迹法(“Southern Blot”法)；因此，优选地，制备宿主细胞的总DNA并用一种或多于一种限制酶消化；如果在使用原始质粒作为探针的Southern Blot中，仅可见对应于原始环状DNA的条带，则优选推断质粒被游离维持。更优选地，如本文实施例中所述验证游离维持。
因此，如本文所使用的，术语“附加体型复制”涉及多核苷酸在细胞复制周期期间诱导宿主细胞中所述多核苷酸的至少两个复制品产生的活性，而所述多核苷酸以自主复制实体存在于所述细胞中；稳定的附加体型复制是附加体型复制到使得在至少50次细胞分裂后，优选在至少100次细胞分裂后，更优选在至少250次细胞分裂后，最优选在至少500次细胞分裂后，在宿主细胞中仍能检测到多核苷酸的程度。优选地，上述细胞分裂次数是细胞群的平均细胞分裂次数。
本发明的多核苷酸优选缺乏猿猴病毒40(SV40)复制起点、牛乳头瘤病毒(BPV)复制起点和EB病毒(EBV)复制起点，优选缺乏多瘤病毒复制起点、乳头瘤病毒复制起点和疱疹病毒复制起点；更优选缺乏感染真核细胞的病毒的复制起点。更优选地，载体缺乏任何已知的真核复制起点。然而，优选地，多核苷酸还包含原核复制起点，优选细菌复制起点，特别是大肠杆菌复制起点。优选地，原核复制起点是多核苷酸中包含的唯一复制起点。
有利地，在本发明的基础工作中发现，通过将指定的S/MAR元件与读入所述S/MAR元件中的启动子组合，获得了以游离形式在宿主细胞中甚至在不存在专用的复制起点的宿主细胞中高度稳定的多核苷酸。此外，发现通过使用抗嘌呤霉素基因、通过确保通过抗性基因向S/MAR元件中的转录以及通过使启动子-S/MAR组合与其他多核苷酸中潜在存在的启动子转录隔绝而可以进一步提高建立多核苷酸的功效。
加以必要变通的情况下，以上作出的定义也适用于以下内容。加以必要变通的情况下，以下进一步作出的附加定义和解释也适用于本说明书中所述的所有实施方案。
本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸的组合物。
如本文所使用的，术语“组合物”涉及包含指定化合物和任选的一种或多于一种可接受的载体的物质的组合物。优选地，组合物是药学上可接受的组合物；因此，优选地，载体是药学上可接受的载体。优选本发明的化合物可以配制为药学上可接受的盐。优选的盐包括乙酸盐、甲酯盐、HCl盐、硫酸盐、氯化物等。
载体必须在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害方面是可接受的。所使用的载体可以是例如固体、凝胶或液体。固体药物载体的实例是乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液体载体的实例是磷酸盐缓冲盐溶液、糖浆、油(例如，花生油和橄榄油)、水、乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。类似地，载体或稀释剂可包含本领域众所周知的延迟材料，例如单独或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。所述合适的载体包括上述的那些和本领域众所周知的其他载体，参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。稀释剂选择为不影响组合物中化合物的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克溶液。另外，药物组合物或制剂还可包含其他载体、佐剂或无毒稳定剂、无治疗性稳定剂、无免疫原性稳定剂等。
优选地，组合物介导多核苷酸进入宿主细胞。因此，优选地，组合物包含至少一种转染剂。合适的转染剂的选择可以取决于靶宿主细胞以及所设想的具体应用。转染剂、合适的转染条件以及其选择标准是本领域众所周知的。还优选地，组合物包含病毒样颗粒。因此，优选地，将多核苷酸包装到病毒样颗粒中，即优选地，将多核苷酸包含在病毒样颗粒中。
药物组合物优选被局部施用或全身施用。通常用于药物施用的合适的施用途径是口服、静脉内或肠胃外施用以及吸入。然而，取决于化合物的性质和作用方式，药物组合物也可以通过其他途径施用。例如，如上文所述，可以通过使用病毒载体或病毒或脂质体以基因疗法的方式施用多核苷酸化合物。此外，化合物可以与其他药物组合在普通药物组合物中或作为分开的药物组合物施用，其中所述分开的药物组合物可以以试剂盒的形式提供。化合物优选以常规剂型施用，所述常规剂型根据常规方法通过将药物与标准药物载体组合而制备。这些过程可以涉及将成分适当地混合、制粒、压制或溶解为期望的制剂。应当理解，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特性由与其结合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量决定。
药物组合物的治疗有效剂量涉及用于本发明的药物组合物中的化合物的量，其预防、改善或治疗伴随本说明书中所述的疾病或病状的症状。这种化合物的治疗功效和毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准药物方法，例如ED50(对50％的人群有效的治疗剂量)和LD50(对50％的人群致死的剂量)来确定。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。
剂量方案将由主治医生和其他临床因素确定；优选根据上述方法中的任一种确定。如医学领域中众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用的时间和途径、总体健康状况以及其他同时施用的药物。可以通过定期评估来监控进展。典型的剂量可以例如为1μg至1000μg；然而，特别是考虑到上述因素，可以想到低于或高于该示例性范围的剂量。通常，作为药物组合物常规施用的方案应在每天1μg至10mg单位的范围内。如果方案是连续输注，则每分钟每千克体重也应分别在1μg至10mg单位的范围内。可以通过定期评估来监控进展。然而，取决于对象和施用方式，物质的施用量可以在宽的范围内变化，以提供每千克体重约0.01mg至每千克体重约10mg。在施用病毒载体，特别是腺相关病毒载体的情况下，优选剂量为5×1011至2×1013个病毒颗粒或病毒基因组/kg体重；如将理解的，除了上述因素外，可以根据例如病毒类型、靶器官等的其他因素来更改这些示例性剂量。
为了治疗或改善或预防本说明书中所述的疾病或病症，本文所述的药物组合物和制剂被施用至少一次。但是，所述药物组合物可以施用多于一次，例如每天1次至4次，持续天数不限。
特定的药物组合物是以药学领域众所周知的方式制备的，并且包含至少一种上文提到的活性化合物，其与药学上可接受的载体或稀释剂混合或以其他方式结合。为了制备那些特定的药物组合物，通常将活性化合物与载体或稀释剂混合，或将活性化合物封闭或封装在胶囊、香囊、扁囊剂、纸或其他合适的容器或载剂中。所得制剂按施用方式来采用，即为片剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、悬浮剂等形式。剂量建议应在开处方者或使用者说明中指出，以根据所考虑的接受者预期剂量调整。
本发明还涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞，其用于医学用途。本发明还涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞，其用于治疗遗传疾病。
如本文所使用的，术语“遗传疾病”涉及与个体的基因组中的一种或多于一种修饰优选突变具有因果关系的疾病。因此，优选地，遗传疾病与一种或多于一种表观遗传变化有因果关系，更优选与一种或多于一种基因突变有因果关系。如将理解的，遗传疾病的症状通常是由突变基因的表达和/或提供一种或多于一种特定组织和/或细胞类型中的正常功能的基因的表达缺乏引起的。因此，可能优选仅在突变导致疾病的那些细胞中治疗遗传疾病。优选地，遗传疾病是单基因疾病，即由一个基因中的遗传改变引起。更优选地，遗传疾病是单基因隐性疾病，即由基因的两个等位基因中的遗传改变引起；因此，优选通过提供至少一个受影响基因的未改变拷贝来预期症状的改善。最优选地，遗传疾病是苯丙酮尿症、尿黑酸症、莱伯氏先天性黑矇、无脉络膜或少年型黄斑营养不良。在优选的实施方案中，遗传疾病是癌症。
本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸和介导细胞进入的化合物的试剂盒。
如本文所使用的，术语“试剂盒”涉及可以或可以不包装在一起的本发明的上述化合物、工具或试剂的集合。试剂盒的组分可以包含在分开的小瓶中(即，作为分开的部分的试剂盒)或在单个小瓶中提供。此外，应当理解，优选本发明的试剂盒将用于实施上文所述的方法。优选地，预期以即用的方式提供所有组分以实施上述方法。此外，试剂盒优选包含用于实施所述方法的说明书。说明书可以通过以纸质或电子形式的用户手册提供。另外，手册可以包含用于解释当使用本发明的试剂盒进行上述方法时获得的结果的说明。如由上可理解的，加以必要变通的情况下，包含多核苷酸的试剂盒的描述优选地涉及包含相应载体的试剂盒。
优选地，试剂盒还包含至少一种介导细胞进入其所包含的多核苷酸的化合物，术语“介导细胞进入的化合物”涉及适合于使试剂盒的多核苷酸进入宿主细胞内部，优选宿主细胞的任何手段。合适的介导细胞进入的化合物(递送手段)是本领域已知的，并且特别包括转染手段、包装组合物等。优选地，本发明的多核苷酸被预先包装在递送手段中，例如在包装在病毒颗粒中，更优选包装在复制缺陷型病毒颗粒中，最优选包装在病毒样颗粒(VLP)中。技术人员知道为细胞受体提供不同特异性的递送手段，使得可以选择适合于给定靶宿主细胞的递送手段。
本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞的装置。
如本文所使用的，术语“装置”涉及机构系统，其至少包含彼此可操作连接的机构，以允许施用本发明的化合物或组合物。用于施用多核苷酸、组合物、宿主细胞的优选机构是本领域众所周知的。如何以操作方式连接这些机构将取决于装置中所包含的机构的类型以及所设想的施用方式。优选地，在这种情况下，单个装置包含机构。因此，所述装置可以包含用于施用化合物或组合物的递送单元和用于储存所述化合物或组合物直至施用的储存单元。然而，还可以预期的是，在这样的实施方案中，本发明的机构可以表现为单独的装置，并且优选地被包装在一起作为试剂盒。本领域技术人员会容易地认识到如何连接这些手段。优选的装置是无需专业技术人员的特定知识便可以应用的那些机构。在优选的实施方案中，装置是包含本发明的化合物或组合物的注射器，更优选具有针的注射器。在另一个优选的实施方案中，装置是包含化合物或组合物的静脉输注(IV)设备。在另一个优选的实施方案中，装置是内窥镜装置，其包含用于冲洗施用部位的化合物或药物，或进一步包含用于局部施用化合物或组合物(例如施用至肿瘤)的针。在另一个优选的实施方案中，装置是包含本发明的化合物的吸入器，其中更优选地，所述化合物被配制为以气溶胶施用。
本申请还涉及稳定转染宿主细胞的方法，其包括
a)使所述宿主细胞与根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞接触，和
b)从而稳定地转染宿主细胞。
用于稳定转染本发明的宿主细胞的方法优选是体外方法。而且，除了以上明确提到的那些步骤外，还可以包括其他步骤。例如，其他步骤可以涉及例如，为步骤a)提供宿主细胞或包含其的样品，和/或对接触的宿主细胞施加选择性压力。此外，所述步骤中的一个或多于一个可以通过自动化设备进行。
技术人员理解，术语“稳定转染”宿主细胞涉及将多核苷酸，优选异源多核苷酸引入细胞中，使得多核苷酸被如上文所述的宿主细胞稳定地复制。优选地，稳定的转染包括多核苷酸的稳定附加体型复制。优选地，稳定转染包括在接触后向宿主细胞施加选择性压力以选择是否存在选择性标志物。在接触后施加选择性压力，任选地排除允许多核苷酸在宿主细胞内产生的第一时间范围；允许多核苷酸在宿主细胞内产生的所述第一时间范围的持续时间将主要取决于所接触的宿主细胞的类型以及所使用的选择性标志物的种类；优选地，允许多核苷酸在宿主细胞内产生的所述第一时间范围的持续时间为1小时至48小时，更优选2小时至24小时，最优选3小时至16小时。然而，允许多核苷酸在宿主细胞内产生的所述第一时间范围的持续时间也可以为零，即可以在接触后立即或甚至在接触期间施加选择性压力。可以连续地施加选择性压力，即在允许多核苷酸在宿主细胞内产生，更优选防止不包含多核苷酸的宿主细胞增殖的第一时间范围后的基本上所有时间点施加选择性压力；或者可以瞬时施加，更优选除去未接受多核苷酸的细胞。优选地，在所述接触之后细胞被转移回生物体的情况下，使用选择性压力的瞬时施加。然而，还设想不施加选择性压力，特别是在已知多核苷酸转移至靶宿主细胞的效率足够高和/或在转基因宿主细胞的纯种群不是很重要的情况下。在优选的实施方案中，还可以通过如下方式获得稳定转染的细胞群：使如上文所述的编码可检测的多肽的货物序列表达，并通过例如细胞分选，优选FACS选择表达货物序列的细胞。在优选的实施方案中，稳定转染包括多核苷酸的稳定附加体型复制，优选附加体型复制到使得在平均50次细胞分裂后在宿主细胞群中仍能检测到多核苷酸的程度。
技术人员理解如本发明的方法的上下文中使用的术语“接触”。优选地，术语涉及使至少一种本发明的多核苷酸、载体和/或宿主细胞与宿主细胞物理接触，例如使宿主细胞与化合物相互作用。优选地，接触包括将本发明的至少一种多核苷酸递送，优选通过如上所述的递送方式递送至宿主细胞内部。
本发明还涉及用于治疗对象的遗传疾病的方法，其包括
a)使所述对象与根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞接触，和
b)从而治疗所述对象的遗传疾病。
本发明用于治疗遗传疾病的方法优选是体内方法。而且，除了以上明确提到的那些步骤外，还可以包括其他步骤。例如，其他步骤可以涉及例如，为步骤a)提供宿主细胞或包含其的样品，和/或将所述样品或宿主细胞重新施用到对象中。因此，用于治疗遗传疾病的方法包括如上所述的用于稳定转染宿主细胞的方法的步骤。此外，所述步骤中的一个或多于一个可以通过自动化设备进行。
此外，本发明涉及本发明的多核苷酸用于稳定地遗传修饰宿主细胞的用途。
此外，本发明涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在制备药物中的用途。以及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在用于制备治疗遗传疾病，优选单基因疾病，更优选单基因隐性疾病，最优选苯丙酮尿症、尿黑酸症、莱伯氏先天性黑矇、无脉络膜或少年型黄斑营养不良的药物中的用途。在优选的实施方案中，遗传疾病是癌症，如上所述。
此外，本发明涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞用于遗传修饰原代细胞，优选原代真皮成纤维细胞，以生成诱导的多能干细胞(IPSC)的用途。优选地，所述原代细胞是小鼠原代细胞或人原代细胞。
技术人员所理解的术语“原代细胞”与培养的细胞系的细胞相对；因此，优选地，原代细胞是衍生自活生物体并且已被培养至多20代，更优选至多15代，甚至更优选至多10代，还更优选至多5代的细胞。最优选地，原代细胞是直接来自于生物优选小鼠或人的组织的细胞。
技术人员理解术语“干细胞”涉及具有分化为至少两种细胞类型，优选至少五种细胞类型，更优选至少一种完整细胞谱系的潜力的未分化或低分化的细胞。优选地，干细胞是全能干细胞，更优选多能干细胞。术语“诱导的多能干细胞”或“IPSC”涉及衍生自分化细胞优选分化的原代细胞的多能干细胞。生成IPSC的方法是本领域已知的，并且优选包括在细胞中表达四种转录因子(例如，来自Takahashi等人(2006)，Cell.126(4)：663)。
本发明还涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞用于遗传修饰胚胎干细胞的用途。本发明还涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在用于制备治疗遗传疾病，优选单基因疾病，更优选单基因隐性疾病，最优选苯丙酮尿症、尿黑酸症、莱伯氏先天性黑矇、无脉络膜或少年型黄斑营养不良的药物中的用途，其中所述药物包含含有根据本发明的多核苷酸的宿主细胞。
本发明还涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞用于遗传修饰干细胞以生成转基因动物的用途。本发明还涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在制备转基因动物中的用途。
如本文所使用的术语“转基因动物”涉及包含至少一种异源多核苷酸的动物，优选通过基因工程方法将异源多核苷酸引入所述动物。优选地，转基因动物包含含有至少一种根据本发明的多核苷酸的至少一个，更优选至少10个，还更优选至少1000个，甚至更优选至少10000个细胞。
此外，本发明涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞用于通过原核注射遗传修饰单细胞胚胎的用途。
如技术人员所理解的，术语“原核注射”涉及将遗传物质，优选本发明的多核苷酸注射到受精卵母细胞的核中，优选产生转基因动物。
本发明还涉及根据本发明的多核苷酸或根据本发明的组合物在修饰宿主细胞中的基因表达中的用途。为此，可以以可表达的形式包括编码干扰非编码核酸的多核苷酸序列。因此，由多核苷酸表达的非编码干扰核酸通常可以是反义RNA、siRNA、微RNA或核酶。因此，可以通过使用根据本发明的多核苷酸或组合物来修饰，即下调基因表达。包含本发明的多核苷酸的用于干扰非编码核酸的表达载体具有改善的稳定性和表达性能，但是其可以在宿主细胞或宿主生物中同时表达功能性非编码干扰核酸。因此，包含本发明的多核苷酸和编码上述非编码干扰核酸的可表达形式的多核苷酸的表达构建体也可用于临床背景中的基因沉默，即用于治疗疾病或病症，包括本说明书其他地方所提及的疾病或病症。由于改善的稳定性和表达特性，基因沉默方法也可以被改善。
鉴于上述内容，优选以下实施方案：
1.一种包含至少一个启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA(SEQ ID NO：1)。
2.根据实施方案1的多核苷酸，其中所述S/MAR序列在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少4个序列基序ATTA，优选所述S/MAR序列在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少5个序列基序ATTA；更优选所述S/MAR序列在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少6个序列基序ATTA。
3.根据实施方案1或2的多核苷酸，其中所述S/MAR序列在至多400个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA，优选所述S/MAR序列在至多400个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少4个序列基序ATTA，更优选所述S/MAR序列在至多400个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少5个序列基序ATTA，最优选所述S/MAR序列在至多400个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少6个序列基序ATTA。
4.根据实施方案1至3中任一项的多核苷酸，其中所述S/MAR序列在至多500个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA，优选所述S/MAR序列在至多500个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少4个序列基序ATTA，更优选所述S/MAR序列在至多500个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少5个序列基序ATTA，最优选所述S/MAR序列在至多500个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少6个序列基序ATTA。
5.根据实施方案1至4中任一项的多核苷酸，其中所述S/MAR序列在500个核苷酸的序列上包含至少10个序列基序ATTA，优选所述S/MAR序列在500个核苷酸的序列上包含至少20个序列基序ATTA，更优选在500个核苷酸的序列上包含至少30个序列基序ATTA。
6.根据实施方案1至5中任一项的多核苷酸，其中包含所述ATTA序列基序的所述S/MAR元件的序列片段还包含至少一个序列基序ATTTA(SEQ ID NO：2)，优选至少2个序列基序ATTTA，更优选至少4个序列基序ATTTA，最优选至少8个序列基序ATTTA。
7.根据实施方案1至6中任一项的多核苷酸，其中包含所述ATTA序列基序和任选的所述ATTTA基序的所述S/MAR元件的序列片段还包含至少一个、优选至少两个、更优选至少四个、最优选至少六个基序TAAATATTTTA(SEQ ID NO：3)。
8.根据实施方案7的多核苷酸，其中所述基序TAAATATTTTA在5′端和/或3′端与至少一个基序ATTA相邻。
9.根据实施方案1至8中任一项的多核苷酸，其中包含所述ATTA序列基序的所述S/MAR元件的序列片段包含至少一个、优选至少两个、更优选至少三个、甚至更优选至少四个、最优选至少五个序列基序ATTATAAATATTTTAATTA(SEQ ID NO：4)，更优选序列基序ATTTAATTATAAATATTTTAATTA(SEQ ID NO：5)。
10.根据实施方案1至9中任一项的多核苷酸，其中包含所述序列基序的所述S/MAR元件的序列片段的G+C含量为至多30％，优选至多20％，更优选至多15％，甚至更优选至多10％，最优选至多5％。
11.根据实施方案1至10中任一项的多核苷酸，其中包含所述序列基序的所述S/MAR元件的序列片段包含至多6个序列基序CG，更优选至多4个序列基序CG，甚至更优选至多2个序列基序GC，最优选不包含序列基序CG。
12.根据实施方案1至11中任一项的多核苷酸，其中所述S/MAR序列包含载脂蛋白B基因的S/MAR序列，优选人载脂蛋白B基因的S/MAR序列，更优选人载脂蛋白B基因的3′S/MAR序列。
13.根据实施方案1至12中任一项的多核苷酸，其中所述S/MAR序列包含与SEQ IDNO：6，优选SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：7，更优选SEQ ID NO：8的序列具有至少70％同一性的序列。
14.根据实施方案1至13中任一项的多核苷酸，其中所述S/MAR序列包含SEQ IDNO：6，优选SEQ ID NO：7的核酸序列。
15.根据实施方案1至14中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含编码多肽的编码序列，优选编码选择性标志物的编码序列，其中所述编码多肽的编码序列介于所述启动子和所述S/MAR元件之间；优选地，所述多核苷酸包含编码选择性标志物的编码序列(选择性标志物序列)，优选包含编码选择性标志物多肽的编码序列，所述选择性标志物序列介于所述启动子和所述S/MAR元件之间，优选地，其中所述启动子和所述选择性标志物序列共同构成选择性标志物基因，优选地，其中所述选择性标志物是真核细胞的选择性标志物。
16.根据实施方案1至15中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸在宿主细胞中附加体型复制，优选其中附加体型复制是稳定的附加体型复制，优选对于至少50次细胞分裂，优选至少100次细胞分裂，更优选至少250次细胞分裂是稳定的。
17.根据实施方案1至16中任一项的多核苷酸，其中所述S/MAR序列位于紧邻所述启动子和任选的所述选择性标志物基因的下游。
18.根据实施方案17的多核苷酸，其中位于紧邻下游为缺少插入转录终止信号，更优选地，缺少插入基因。
19.根据实施方案17或18的多核苷酸，其中位于紧接下游的位置接近程度是使得选择性标志物序列的转录物包含转录的S/MAR序列。
20.根据实施方案17至19中任一项的多核苷酸，其中紧邻下游是在选择性标志物基因的终止密码子的最末核苷酸的下游至多250bp，优选至多100bp，更优选至多50bp。
21.根据实施方案16至20中任一项的多核苷酸，其中所述启动子在宿主细胞中是活性的，优选是组成型真核启动子，优选EF1α(延伸因子1α)启动子、UbiC(泛素C)启动子、ROSA 26启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)启动子和/或CAG(鸡α-肌动蛋白)启动子。
22.根据实施方案1至21中任一项的多核苷酸，其中所述启动子是细胞特异性和/或组织特异性的真核启动子。
23.根据实施方案15至22中任一项的多核苷酸，其中所述选择性标志物基因还编码至少一个内含子，优选在编码选择性标志物多肽的序列上游。
24.根据实施方案15至23中任一项的多核苷酸，其中所述选择性标志物基因是抗嘌呤霉素基因、抗杀稻瘟素基因、抗新霉素基因或抗博来霉素基因，优选抗嘌呤霉素基因。
25.根据实施方案24的多核苷酸，其中抗嘌呤霉素基因
a)引起包含SEQ ID NO：9的序列的抗嘌呤霉素多肽的表达；
b)引起包含与SEQ ID NO：9的序列具有至少70％同一性的序列的抗嘌呤霉素多肽的表达；
c)包含SEQ ID NO：10的序列；
d)包含与SEQ ID NO：10的序列具有至少70％同一性的序列，
e)包含编码抗嘌呤霉素多肽的核酸序列，所述抗嘌呤霉素多肽包含SEQ ID NO：9的序列，优选由SEQ ID NO：9的序列构成，和/或
f)包含编码抗嘌呤霉素多肽的核酸序列，所述抗嘌呤霉素多肽包含与SEQ ID NO：9的序列具有至少70％同一性的序列，优选由与SEQ ID NO：9的序列具有至少70％同一性的序列构成。
26.根据实施方案1至25中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸缺乏猿猴病毒40(SV40)复制起点、牛乳头瘤病毒(BPV)复制起点和EB病毒(EBV)复制起点，优选缺乏多瘤病毒复制起点、乳头瘤病毒复制起点和疱疹病毒复制起点；更优选缺乏感染真核细胞的病毒的复制起点。
27.根据实施方案1至26中任一项的多核苷酸，其中所述载体包含细菌复制起点作为唯一的复制起点。
28.根据实施方案1至27中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸在S/MAR元件的下游包含poly-A信号。
29.根据实施方案1至28中任一项的多核苷酸，其中所述S/MAR元件的两侧是剪接供体和剪接受体。
30.根据实施方案15至29中任一项的多核苷酸，其中所述选择性标志物基因缺乏poly-A信号。
31.根据实施方案15至30中任一项的多核苷酸，其中由所述选择性标志物基因转录转录物，从所述转录物中剪接出S/MAR元件的序列。
32.根据实施方案31的多核苷酸，其中在所述剪接中保留了S/MAR元件下游的poly-A信号。
33.根据实施方案1至20中任一项的多核苷酸，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。
34.根据实施方案1至33中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含细菌复制起点和/或细菌选择性标志物基因和/或货物序列。
35.根据实施方案34的多核苷酸，其中所述细菌选择性标志物基因包含原核生物特异性的启动子。
36.根据实施方案34或35的多核苷酸，其中所述细菌复制起点和/或细菌选择性标志物基因，优选原核细胞中的所有活性元件通过至少一种隔绝元件的存在与多核苷酸中包含的其余序列隔绝，更优选其两侧为隔绝元件。
37.根据实施方案36的多核苷酸，其中所述隔绝元件是元件-40和/或S/MAR元件。
38.根据实施方案36或37的多核苷酸，其中所述细菌复制起点和/或细菌选择性标志物基因，优选原核细胞中的所有活性元件通过至少一种在5′端的隔绝元件和至少一种在3′端的隔绝元件的存在与多核苷酸中包含的其余序列隔绝。
39.根据实施方案1至38中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：12的序列或与SEQ ID NO：12的序列具有至少70％同一性的序列；优选SEQ ID NO：13的序列或与SEQ ID NO：13的序列具有至少70％同一性的序列，更优选SEQ ID NO：14的序列或与SEQ ID NO：14的序列具有至少70％同一性的序列。
40.根据实施方案1至39中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：14的序列，其中编码GFP的核酸序列被编码不同多肽的核酸序列所替换，所述不同多肽优选治疗性多肽，更优选人T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)，优选MART1 TCR。
41.根据实施方案1至40中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：12的序列；优选SEQ ID NO：13的序列，更优选SEQ ID NO：14的序列。
42.一种包含根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸的组合物。
43.根据实施方案42的组合物，其中所述组合物介导所述多核苷酸进入宿主细胞。
44.根据实施方案31或32的组合物，其中所述组合物包含至少一种转染剂。
45.根据实施方案31至33中任一项的组合物，其中所述组合物包含病毒样颗粒，优选其中所述多核苷酸被包含在所述病毒样颗粒中。
46.一种包含根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸的宿主细胞，优选地，其中宿主细胞是CD34+祖细胞；CD61+血小板；CD19+B淋巴细胞；CD14+单核细胞；CD15+粒细胞；CD3+细胞毒性T淋巴细胞，优选对CD8和CD45也呈阳性；CD3+辅助性T淋巴细胞，优选对CD4和CD45也呈阳性；CD3+激活的T淋巴细胞，优选对CD25和CD45也呈阳性，肿瘤浸润淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞。
47.根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸、根据实施方案42至45中任一项的组合物和/或根据实施方案46的宿主细胞，其用于医药用途。
48.根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸、根据实施方案42至45中任一项的组合物和/或根据实施方案46中的宿主细胞，其用于治疗遗传疾病，优选单基因疾病，更优选单基因隐性疾病，最优选苯丙酮尿症、尿黑酸症、莱伯氏先天性黑矇、无脉络膜或少年型黄斑营养不良(Stargardt病)。
49.一种包含根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸和介导细胞进入的化合物的试剂盒。
50.根据实施方案49的试剂盒，其中所述介导细胞进入的化合物是转染试剂。
51.根据实施方案49或50的试剂盒，其中所述介导细胞进入的化合物是用于将所述多核苷酸包装到病毒样颗粒中的包装组合物。
52.一种包含根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸、根据实施方案42至45中任一项的组合物和/或根据实施方案46的宿主细胞的装置。
53.一种用于稳定转染宿主细胞的方法，其包括
a)使所述宿主细胞与根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸、根据实施方案42至45中任一项的组合物和/或根据实施方案46的宿主细胞接触，和
b)从而稳定地转染宿主细胞。
54.根据实施方案53的方法，其中所述方法还包括向所述宿主细胞施加选择性压力，以选择是否存在所述选择性标志物基因。
55.根据实施方案53或54的方法，其中连续或优选瞬时施加所述选择性压力。
56.一种用于治疗对象的遗传疾病的方法，其包括
a)使所述对象与根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸、根据实施方案42至45中任一项的组合物和/或根据实施方案46的宿主细胞接触，和
b)从而治疗所述对象的遗传疾病。
57.根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸用于稳定遗传修饰宿主细胞的用途。
58.根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸、根据实施方案42至45中任一项的组合物和/或根据实施方案46的宿主细胞用于制备药物的用途。
59.根据实施方案1至41中任一项的多核苷酸、根据实施方案42至45中任一项的组合物和/或根据实施方案46中的宿主细胞用于制备治疗遗传疾病，优选单基因疾病，更优选单基因隐性疾病，最优选苯丙酮尿症、尿黑酸症、莱伯氏先天性黑矇、无脉络膜或少年型黄斑营养不良的药物的用途。
关于本说明书中引用的所有参考文献，其全部公开内容和本说明书中具体提及的公开内容通过引用并入本文。
附图说明
图1：建立和分析遗传修饰的细胞群的效率：A)用嘌呤霉素选择4周后形成的具有结晶紫染色集落的细胞培养板；载体建立的效率为约40％；B)嘌呤霉素选择的细胞中GFP荧光的FACS检测；荧光非常均匀，且非荧光细胞的数量非常少；1＝pEPI，2＝pSMARt。
图2：从已建立的细胞群中pS/MARt载体的质粒拯救结果。在细菌转化源自用pS/MARt和pEPI质粒DNA建立的Hek293T细胞的总DNA之后，进行质粒拯救和限制性酶切分析。
图3：保留在所选择细胞中的pSMARt载体的Southern印记：与pS/MART的GFP基因杂交的寡核苷酸被用作探针，以检测宿主细胞提取物中BamHI限制的载体DNA(pS/MARt1至3)；将未转染的载体用作对照(“pS/MARt(+)”)。
图4：pS/MART的矢量图；ori：细菌复制起点，P2A：编码来自猪捷申病毒属-1的自裂解2A肽的序列，apolipoB MAR：来自载脂蛋白B基因的S/MAR序列。
图5：Hek293T和HeLa细胞中不同版本的pSMARt的集落形成测定。
图6：在没有连续选择的情况下，pSMARt也有效保留在分裂细胞中。
图7：pSMARt的建立效率与选择标志物无关(A)，但是在启动子之前存在绝缘子会提高其建立效率(B)；图7A：1＝pEPI，2＝pSMARt-Ele40-GFP-2A-Puro，3＝pSMARt-Ele40-GFP-2A-G418；图7B：1＝pSMARt-UCOE，2＝pSMARt-Ele40，3＝pSMARt，4＝pEPI。
图8：pSMARt载体在原代人CD3+细胞中有效保留了超过一个月。
图9：SMAR两侧的剪接连接的引入提高了分裂细胞中载体的建立。(1)pEPI，(2)pS/MARt，(3)NP，(4)NP-剪接(1、2、3、4全部具有β-inf MAR)(5)pS/MARt，(6)NP剪接(5、6具有ApoLMAR)。
图10：pSMARt保留在小鼠胚胎干细胞(mESC)中，载体的存在不影响细胞行为。
图11：pSMARt载体在胚胎发生和分化过程中是活性的，并且对表观遗传沉默具有抗性。
图12：pSMARt在干细胞分化过程中维持转基因GFP的表达。
图13：用pSMARt载体和慢病毒修饰的CAR-T细胞的比较；实时肿瘤杀伤、干扰素产生和细胞毒性分析。
图14：体内肿瘤杀伤分析
图15：肿瘤样品分析和用pSMARt和慢病毒修饰的CAR T细胞的体内维持；1＝同种型对照，2＝未处理，3＝用模拟T细胞处理，4＝用编码CAR抗人CEA的慢病毒转导的T细胞，5＝用编码CAR抗人CEA的pSMARt转染T细胞。
图16：来自包含剪接序列的pS/MARt和Nano载体的表达数据。DNA递送后35天，分析了使用不同版本的pS/MARt建立的Hek293T细胞群的转基因表达，以及通过流式细胞术在嘌呤霉素(0.5ug/ml)中的选择(A)。评价转基因GFP的相对表达，并相对于管家基因GAPDH的表达标准化(B)。该图显示剪接序列的引入通过改善细胞中的RNA量来改善转基因表达。图(A)：(1)pS/MARt，(2)Nano-S/MARt，(3)Nano-S/MARt接头；图(B)：(1)pS/MARt，(2)Nano-S/MARt，(3)Nano-S/MARt接头。
以下实施例将仅说明本发明。无论如何，它们不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：建立和分析转遗传修饰的细胞群的效率(图1)
与pEPI相比，使用pS/MARt在集落形成测定中评价了生成稳定表达细胞的功效(图4，SEQ ID NO：14)。DNA递送后，通过FACS分选(FACS Aria II)分离出对GFP转基因表达呈阳性的细胞，并将100个细胞接种到6cm细胞培养皿中。然后在0.5μg/ml嘌呤霉素的存在下将它们培养4周。4周后，将细胞用PFA固定，并将集落用结晶紫染色。集落的数量被认为是载体建立的效率，即形成的集落数量/接种的FACS分选细胞。稳定的细胞系的生成非常有效，超过40％的转染细胞得以建立(图1A)。通过流式细胞术估计表达转基因(GFP)的细胞的数目。如图1b)所示，pS/MARt生成修饰的群，其中转基因的表达是同质的，没有大量的阴性细胞。
通过流式细胞术评估生成稳定表达的细胞的效率。用pEPI或pS/MARt转染Hek293T细胞。将细胞培养35天，然后进行FACS分析，以确定继续表达转基因(GFP)的细胞比例及其中等荧光强度。图1B)的上图显示了pS/MARt生成了经遗传修饰的细胞群，其中转基因的表达是稳定且同质的。这与用pEPI转染的细胞相反，用pEPI转染的细胞显示异质和低水平的转基因表达。条形图显示，在这些细胞库中，pS/MARt中没有大量的阴性细胞群，同时pEPI系主要沉默或丢失了转基因表达。另外，在pS/MARt系中，转基因的中值表达明显更高。实验细节：用JetPEI转染细胞，对于pEPI用0.5ug/ml Puro和1mg/ml G418选择。
实施例2：从已建立的细胞群中质粒拯救pS/MARt载体(图2)
进行了DNA拯救实验，以确定哺乳动物细胞中载体的游离状态和分子完整性。
从用质粒pS/MARt或pEPI建立的细胞中分离载体DNA。这些细胞在抗生素嘌呤霉素(0.5ug/ml)的存在下扩增1周，在没有抗生素的情况下进一步扩增至少30天。为了进行质粒拯救，用Blood&Tissue DNAeasy试剂盒(Qiagen)从已建立的细胞中提取gDNA，并将其转化为DH10B大肠杆菌。细菌在具有卡那霉素(50ug/ml)的LB-琼脂板上生长。将12个菌落在具有卡那霉素(50ug/ml)的液体LB培养基中培养过夜，并用MiniprepKit(Qiagen)提取质粒DNA。为了进行分析，将DNA微制备物用限制性酶BamHI(Thermo Fisher)在37℃下消化10分钟，并在1％琼脂糖凝胶上处理限制性图谱。作为对照，将在建立过程开始时用于转染细胞的DNA用相同的酶消化并作为参考。分析了由pS/MART分离的12个代表性样品，并证明了(A)其与原始DNA载体在分子上等价，同时用pEPI建立的细胞中拯救了DNA(B)在分子上与原始载体不同，具有明显的显示原始DNA重排的模糊条带。
实施例3：pS/MARt载体游离维持在经修饰的细胞中(图3)
为了进一步证明pS/MARt载体将哺乳动物细胞修饰为附加体，通过Southern印迹法分析物理确定了结构。分析DNA转染后培养至少30天的Hek293T细胞群。用Blood&TissueDNAeasy试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA，并在37℃下用限制酶BamHI(NEB)消化过夜。然后将总细胞DNA在1％琼脂糖凝胶上分离，并转移到尼龙膜上。与载体的GFP基因相对应的寡核苷酸被用于生成放射性探针，其用于检测细胞DNA中的pS/MARt DNA。样品中具有与对照载体大小相同的单一条带的存在证明了已建立的哺乳动物细胞群中pS/MARt的游离基因状态。模糊和/或替代条带的缺失表明载体没有重排或整合到细胞基因组中。
实施例3：生成稳定表达细胞的效率(图5)
在集落形成测定中评估了通过一系列包含ApoL-MAR和β-IFN-MAR组分的pS/MARtDNA载体产生稳定表达细胞的效率。DNA递送后，通过FACS分选(FACS Aria II)分离出对报道基因GFP的表达呈阳性的细胞，并将100个细胞接种到6cm细胞培养皿中。然后在0.5g/ml嘌呤霉素的存在下将细胞培养4周。4周后，将细胞用PFA固定，并将集落用结晶紫染色并定量。集落的数目被认为是载体建立的效率。测定表明用ApoL MAR、核心序列或片段2工程化的载体在产生经遗传修饰的细胞方面是最有效的。
实施例4：在无选择的情况下的稳定性(图6)
为了评估绝缘子序列是否可以防止DNA载体的沉默或丢失，测量了在缺少抗生素选择的情况下，用(A)pSMARt-绝缘子-GFP-2a-Puroβ干扰素MAR或(B)pSMARt-绝缘子-GFP-2a-Puro ApoL MAR转染的细胞中GFP的转基因表达。用DNA载体转染细胞，并在1μg/ml嘌呤霉素中培养。一周后，将细胞分裂，并从每次转染中将药物从代表性的细胞组中除去。
(1)在连续选择中培养的pSMARt-绝缘子-GFP-2a-Puroβ干扰素MAR
(2)选择去除的pSMARt-绝缘子GFP-2A-Puroβ干扰素MAR
(3)在连续选择中培养的pSMARt-绝缘子-GFP-2a-Puro ApoL MAR
(4)选择去除的pSMARt-绝缘子GFP-2A-Puro ApoL MAR
实施例5：建立效率(图7)
为了评估选择标志物对建立效率的影响，进行了集落形成测定，如图5所示。图7(A)显示了DNA载体pS/MARt的建立效率与抗生素选择标志物无关。当选择标志物转录连接至S/MAR基序时，选择标志物提高建立效率。图7(B)显示了通过在细菌主链和真核启动子之间另外引入绝缘元件而提高了建立效率。
实施例6：原代细胞的稳定性(图8)
为了评估DNA载体体系转染原代人CD3+细胞的效率并测量其表达谱，转染了pS/MARt载体体系和编码GFP的pEPI的三个变体，并测试了它们在人T细胞的报道基因GFP中持续表达的能力。将DNA载体通过电转移(Nucleofector Device Y，Lonza)递送至刚刚分离的PBMC，并将细胞在IL-2(5μg/ml，Biolegend)的存在下培养35天。每7天检查一次细胞的转基因表达，并通过加入抗CD28抗体(Bioegend)和抗CD3抗体(Biolegend)来刺激其生长。与全长ApoL-MAR序列、携带βIFN MAR的pS/MARt和pEPI相比，携带ApoLMAR核心版本的pS/MARt能够生成更多的转基因表达细胞基因。
实施例7：MAR剪接(图9)
为了证明可以通过引入剪接序列来提高建立效率，生成了一系列带有和不带有位于MAR元件两侧的剪接供体和受体位点的DNA载体。为了评估剪接元件对建立效率的影响，进行了集落形成测定，如图5所示。
DNA载体的建立效率随细菌主链的改善和最小化而显著提高。通过前面列出的改进，即选择标志物和绝缘子序列及其更现代和改进的骨架，pS/MARt比pEPI更有效地建立。进而，骨架的最小化进一步改善了这一点(图9(3))。引入剪接序列以从mRNA中除去S/MAR元件几乎使这类载体的效率加倍。可以使用包含不同S/MAR元件的相似载体组合物来重现该效果(图9(5-6))。
实施例8：干细胞中的pS/MARt(图10)
为了评估pS/MARt是否可以有效修饰干细胞而不会造成分子损伤，生成了稳定的干细胞系。用pS/MARt-GFP载体建立了E14小鼠胚胎干细胞(mESC)系。在DNA递送后1个月通过荧光显微镜测量了报告物基因GFP的表达(A)。用pS/MARt-GFP修饰的mESC进行了最常见的多能性标志物染色，其表明附加型载体的存在不会改变其多能性特征。
实施例9：胚胎发生中的pS/MARt(图11和图12)
将pSMARt-GFP标记的mESC注射到C57BL/6小鼠的胚泡中，其导致嵌合体的形成。将来自这些嵌合体的造血器官(如脾脏和骨髓)用全血表面标志物(CD45)染色，并通过流式细胞术分析其荧光。将C57BL/6小鼠和组成性表达UBC：：GFP的小鼠分别用作阴性对照和阳性对照。(图11)
pS/MARt在造血分化期间介导转基因的持续表达。使mESC分化为HSC，并在分化过程之前(第0天)和之后(第6天)通过流式细胞术进行分析。亲代细胞和标记细胞均成功分化为HSC，并且在整个过程中，用pS/MARt-GFP标记的细胞保留了报告物基因的表达。(图12)
实施例10：与慢病毒的比较(图13)
(A)用表达CAR272的S/MARt DNA载体修饰由两个不同健康供体分选的CD3+细胞(CAR272提供针对人CEA表位的靶向)，并在具有细胞毒性的MCF-7细胞(乳腺癌细胞系)和干扰素释放试验中证实了它们的细胞溶解活性。
(B)与用携带相同表达盒的慢病毒修饰的CD3+细胞相比，具有表达CAR272的S/MARt载体体系的工程化T细胞显示出提高的杀伤活性。
实施例11：肿瘤杀伤(图14和图15)
使用S/MARt DNA载体体系、慢病毒和下一代NanoS/MARt DNA载体制备的CAR-T细胞的体内分析。(图14)
用2×106个HT29肿瘤细胞皮下接种NOD/SCID小鼠(n＝6)。将用S/MARt DNA载体、慢病毒和下一代产生的3×105个CAR+T细胞注射到每只小鼠的尾静脉中，不在肿瘤细胞注射后第7天进行化疗或放疗。将经修饰细胞的肿瘤靶向效率与模拟电穿孔的CD3+进行比较，并记录为肿瘤生长(A)和小鼠存活率(B)。
将过度生长的肿瘤(从上述肿瘤中分离出来)移植、分离并分析CAR靶的存在(图15)。分析了肿瘤块中CAR+CD3的频率以及脾脏中表达CD3的CAR的存在。
其余的肿瘤仅包含缺乏靶向表位的肿瘤细胞，这表明经S/MARt处理的T细胞可有效杀伤和清除肿瘤细胞，且其水平至少与慢病毒对照的水平相当。另外，仍能检测到CAR-T阳性细胞在肿瘤内浸润并聚集在脾脏中，这表明DNA载体在转基因T细胞内仍积极表达。
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Claims (18)

1.一种包含至少一个启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段上，每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA(SEQ ID NO：1)。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述S/MAR元件两侧是剪接供体和剪接受体。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含编码多肽、优选编码选择性标志物的编码序列，其中所述编码多肽的编码序列介于所述启动子和所述S/MAR元件之间。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含编码选择性标志物的编码序列(选择性标志物序列)，所述选择性标志物序列介于所述启动子和所述S/MAR元件之间，其中所述启动子和所述选择性标志物序列共同构成选择性标志物基因，其中所述选择性标志物是真核细胞的选择性标志物。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述选择性标志物基因是抗嘌呤霉素基因、抗杀稻瘟素基因、抗新霉素基因或抗博来霉素基因，优选抗嘌呤霉素基因。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的多核苷酸，其中由所述启动子转录转录物，从所述转录物中剪接出S/MAR元件的序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含细菌复制起点和/或细菌选择性标志物基因，其中所述细菌复制起点和/或细菌选择性标志物基因通过至少一种隔绝元件的存在与多核苷酸中包含的其余序列隔绝。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸缺乏猿猴病毒40(SV40)复制起点、牛乳头瘤病毒(BPV)复制起点和EB病毒(EBV)复制起点。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在宿主细胞中附加体型复制，优选其中附加体型复制是稳定的附加体型复制，优选在哺乳动物中。
10.一种包含根据权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸的组合物，优选其中所述组合物是药物组合物。
11.一种包含根据权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸的宿主细胞，优选地，其中所述宿主细胞是CD34+祖细胞；CD61+血小板；CD19+B淋巴细胞；CD14+单核细胞；CD15+粒细胞；CD3+细胞毒性T淋巴细胞，优选对CD8和CD45也呈阳性；CD3+辅助性T淋巴细胞，优选对CD4和CD45也呈阳性；CD3+激活的T淋巴细胞，优选对CD25和CD45也呈阳性，肿瘤浸润淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求10所述的组合物和/或根据权利要求11所述的宿主细胞，其用于医药用途，优选用于治疗遗传疾病。
13.一种包含根据权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸和介导细胞进入的化合物的试剂盒。
14.一种包含根据权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求10所述的组合物和/或根据权利要求11所述的宿主细胞的装置。
15.一种用于稳定地转染宿主细胞的方法，其包括
a)使所述宿主细胞与根据权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸和/或根据权利要求10所述的组合物和/或根据权利要求11所述的宿主细胞接触，和
b)从而稳定地转染宿主细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述稳定地转染包括多核苷酸的稳定附加体型复制，优选附加体型复制的程度为使得在平均50次细胞分裂后在宿主细胞群中仍能检测到多核苷酸。
17.根据权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸用于稳定遗传修饰宿主细胞的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述稳定遗传修饰宿主细胞包括多核苷酸在所述宿主细胞中的稳定附加体型复制，优选附加体型复制的程度为使得在平均50次细胞分裂后在宿主细胞群中仍能检测到多核苷酸。
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