CN115896172A - 一种快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体及其制备方法和应用，本发明共转染载体由商业化载体pCoBlast为框架、用Puro抗性基因置换掉其Blast抗性基因而得，在与含目的基因的重组表达载体共转染S2果蝇细胞后，采用嘌呤霉素加压筛选，能够快速富集含目的基因的果蝇细胞。采用Puro筛选标记，具有筛选效率高，筛选周期短，获得稳定表达细胞株快的优点，最大限度的缩短了获得稳定表达细胞株的时间，在重组蛋白表达领域具有重要意义。

Description

一种快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术技术领域，具体涉及一种快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体及其制备方法和应用。

背景技术

传统的S2果蝇细胞表达系统用潮霉素(hygromycin-B)或杀稻瘟菌素(Blasticidin S)进行加压筛选。具体地，使用商业化的共转染载体pCoHygro或pCoBlast，与含目的基因的重组载体，用磷酸钙法共转染S2果蝇细胞，转染48h后，采用相应抗生素加压筛选(若使用pCoHygro共转染载体，则选用潮霉素(hygromycin-B)抗生素；若使用pCoBlast共转染载体，则选用杀稻瘟菌素(Blasticidin S)抗生素)，快速富集含目的基因的果蝇细胞。最后，通过有限稀释法或单克隆挑取获得稳定表达细胞株。

由于不同抗生素作用原理不同，导致杀灭无抗细胞的时间长短不同，进而导致加压筛选周期不同。在实际应用中，商业化的共转染载体pCoHygro(赋予细胞潮霉素抗性)和pCoBlast(赋予细胞杀稻瘟菌素抗性)均需较长时间(2-4周)进行筛选。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体及其制备方法和应用，本发明共转染载体在与含目的基因的重组表达载体共转染S2果蝇细胞后，采用嘌呤霉素加压筛选，仅仅通过1周时间就能够快速富集含目的基因的果蝇细胞。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(a)将含嘌呤霉素抗性基因的DNA片段导入PUC57载体中并进行克隆，得到含嘌呤霉素抗性基因的PUC57克隆载体；

(b)采用XbaI和XhoI双酶切消化含嘌呤霉素抗性基因的PUC57克隆载体，再经分离、纯化，得到嘌呤霉素抗性基因插入片段；

(c)采用XbaI及XhoI双酶切消化pCoBlast载体，再经分离、纯化，得到pCo载体骨架；

(d)将嘌呤霉素抗性基因插入片段和pCo载体骨架进行连接，即得快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体。

优选地，所述含嘌呤霉素抗性基因的DNA片段序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述步骤(b)中，采用XbaI和XhoI双酶切消化含嘌呤霉素抗性基因的PUC57克隆载体的酶切反应体系如下：

0.2μg/μL含嘌呤霉素抗性基因的PUC57克隆载体20μL、10×Buffer 5μL、XbaI 2μL、XhoI 2μL和ddH₂O 21μL；

所述酶切反应温度为37℃、时间为15min。

优选地，所述步骤(c)中，采用XbaI及XhoI双酶切消化pCoBlast载体的酶切反应体系如下：

0.2μg/μL pCoBlast载体20μL、10×Buffer 5μL、XbaI 2μL、XhoI 2μL和ddH₂O 21μL；

所述酶切反应温度为37℃、时间为15min。

优选地，所述步骤(d)中，采用XbaI及XhoI双酶切消化pCoBlast载体的连接反应体系如下：

0.2μg/μL pCo载体骨架3μL、50ng/μL嘌呤霉素抗性基因插入片段13μL、10×Buffer 2μL和T4 DNA连接酶2μL；

所述连接反应条件为在16℃放置过夜。

本发明第二方面提供一种上述制备方法制备得到的快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体。

本发明第三方面提供一种上述制备方法制备得到的快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体在快速筛选含目的基因的果蝇细胞中的应用。

本发明第四方面提供一种快速筛选含目的基因的果蝇细胞的方法，包括如下步骤：

将上述制备方法制备得到的快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体和含有目的基因的重组载体混合；

再使用磷酸钙法共转染S2果蝇细胞，待转染结束后，更换为含1mM嘌呤霉素的培养基，加压筛选培养5～7天，大量阴性空白细胞死亡，有少量阳性克隆堆形成，重悬细胞扩大培养，建立稳定表达原始细胞库。

优选地，所述含目的基因的重组载体包括pMT-E3。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明制备得到的共转染载体由商业化载体pCoBlast为框架、用嘌呤霉素抗性基因置换掉其Blast抗性基因而得，将其与含目的基因的重组表达载体共转染S2果蝇细胞，转染48h后，采用嘌呤霉素加压筛选，能够快速富集含目的基因的果蝇细胞。此外，通过有限稀释法获得高产稳定表达细胞株。该方法采用嘌呤霉素筛选标记，具有筛选效率高，筛选周期短，获得稳定表达细胞株快的优点，最大限度的缩短了获得稳定表达细胞株的时间，在重组蛋白表达领域具有重要意义。

本发明制备得到的共转染载体筛选周期1周，明显优于商业化共转染载体pCoHygro(筛选周期3-4周)和pCoBlast(筛选周期2周)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

以下各实施例采用原料如下：

含嘌呤霉素抗性基因的DNA片段，序列如SEQ ID NO:1所示，具体为TCTAGAGGATCCGGTGCGTGGTGGTTTCATGCTTCTGGGAACGGCAAATGGGTTTAGGATTGGGAACCCCTCATCATCTGTTGGAATATACTATTCAACCTACAAAAATAACGTTAAACAACACTACTTTATATTTGATATGAATGGCCACACCTTTTATGCCATAAAACATATTGTAAGAGAATACCACTCTTTTTATTCCTTCTTTCCTTCTTGTACGTTTTTTGCTGTGAGTAGGTCGTGGTGCTGGTGTTGCAGTTGAAATAACTTAAAATATAAATCATAAAACTCAAACATAAACTTGACTATTTATTTATTTATTAAGAAAGGAAATATAAATTATAAATTACAACAGGTTATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTAGAGTAGATGCCGACCGAACAAGAGCTGATTTCGAGAACGCCTCAGCCAGCAACTCGCGCGAGCCTAGCAAGGCAAATGCGAGAGAACGGCCTTACGCTTGGTGGCACAGTTCTCGTCCACAGTTCGCTAAGCTCGCTCGGCTGGGTCGCGGGAGGGCCGGTCGCAGTGATTCAGGCCCTTCTGGATTGTGTTGGTCCCCAGGGCACGATTGTCATGCCCACGCACTCGGGTGATCTGACTGATCCCGCAGATTGGAGATCGCCGCCCGTGCCTGCCGATTGGGTGCAGATCAGCCTCGAG；由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

上述含嘌呤霉素抗性基因的DNA片段设计思路如下：

本发明中嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因(简称Puro，SEQ ID NO:2)，其编码199个氨基酸，在编码嘌呤霉素抗性基因的DNA序列5’端加上XbaI酶切位点及与pCoBlast载体XbaI后，Blast抗性基因起始密码子前，相同的侧翼序列，并在其3’端加上与pCoBlast载体Blast抗性基因终止密码子后，XhoI前，相同的侧翼序列及XhoI酶切位点，并根据表达系统选择果蝇细胞偏爱密码子设计本发明嘌呤霉素抗性基因DNA序列(SEQ ID NO:2)。

SEQ ID NO:2序列具体为：ATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTAG。

实施例1

本实施例为一种快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(a)将含嘌呤霉素抗性基因的DNA片段导入PUC57载体中并进行克隆，得到含嘌呤霉素抗性基因的PUC57克隆载体；

(b)采用XbaI和XhoI双酶切消化含嘌呤霉素抗性基因的PUC57克隆载体，酶切反应体系如下：

酶切反应条件为37℃水浴15min，然后将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收后，用DNA回收试剂盒纯化，得到嘌呤霉素抗性基因插入片段(记为插入片段Puro)；

(c)采用XbaI及XhoI双酶切消化pCoBlast载体，酶切反应体系如下：

酶切反应条件为37℃水浴15min，然后将酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收后，用DNA回收试剂盒纯化，得到pCo载体骨架；

(d)将嘌呤霉素抗性基因插入片段和pCo载体骨架进行连接，连接反应体系如下：

连接反应条件为16℃放置过夜，即得快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体(记为pCoPuro)；

(e)将pCoPuro转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，铺氨苄抗性平板，挑单菌斑，接种扩大培养，质粒提取，获得大量重组载体，即共转染载体pCoPuro。

实施例2

本实施例为一种快速筛选含目的基因的果蝇细胞的方法，该方法包括如下步骤：

将上述实施例1制备方法制备得到的pCoPuro和pMT-E3混合；

再使用磷酸钙法共转染S2果蝇细胞，待转染结束后，更换为含1mM嘌呤霉素的培养基，加压筛选培养6天，大量阴性空白细胞死亡，有少量阳性克隆堆形成，重悬细胞扩大培养，建立稳定表达原始细胞库。

实验例：

本发明实施例1制备得到的pCoPuro以及现有商业化的共转染载体pCoHygro和pCoBlast性能分析：

方法如下：

a.本发明实施例1制备的共转染载体pCoPuro：

共转染S2细胞：将先前构建好的重组表达载体pMT-E3与共转染载体pCoPuro混合，使用磷酸钙法共转染S2果蝇细胞，在6孔板中进行，转染48h后，更换为含1μg/mL嘌呤霉素的培养基，加压筛选，培养5～7天，大量阴性空白细胞死亡，有少量阳性克隆堆形成，重悬细胞扩大培养，建立稳定表达原始细胞库；

亚克隆：使用有限稀释法，通过S2空白细胞辅助生存策略，经2～3轮嘌呤霉素加压筛选，结合活性分析，得到高产稳定表达细胞株，细胞扩大培养，建立稳定表达亚克隆细胞库。

诱导表达：将果蝇细胞稳定表达株，用无抗培养基扩大培养，在初始细胞密度为1×10⁶cells/mL，补硫酸铜至终浓度为0.5μmol/L，28℃培养72h以上，通常在诱导后8天，收集培养上清。

b.商业化共转染载体pCoHygro：

共转染S2细胞：将先前构建好的重组表达载体pMT-E3与共转染载体pCoHygro混合，使用磷酸钙法共转染S2果蝇细胞，在6孔板中进行，转染48h后，更换为含300μg/mL潮霉素的培养基，加压筛选，培养3～4周，建立稳定表达原始细胞库；

亚克隆：使用有限稀释法，通过S2空白细胞辅助生存策略，经2～3轮潮霉素加压筛选，结合活性分析，得到高产稳定表达细胞株，细胞扩大培养，建立稳定表达亚克隆细胞库。

诱导表达：将果蝇细胞稳定表达株，用无抗培养基扩大培养，在初始细胞密度为1×10⁶cells/mL，补硫酸铜至终浓度为0.5μmol/L，28℃培养72h以上，通常在诱导后8天，收集培养上清。

c.商业化共转染载体pCoBlast：

共转染S2细胞：将先前构建好的重组表达载体pMT-E3与共转染载体pCoBlast混合，使用磷酸钙法共转染S2果蝇细胞，在6孔板中进行，转染48h后，更换为含25μg/mL杀稻瘟菌素的培养基，加压筛选，培养2周，建立稳定表达原始细胞库；

亚克隆：使用有限稀释法，通过S2空白细胞辅助生存策略，经2～3轮杀稻瘟菌素加压筛选，结合活性分析，得到高产稳定表达细胞株，细胞扩大培养，建立稳定表达亚克隆细胞库。

诱导表达：将果蝇细胞稳定表达株，用无抗培养基扩大培养，在初始细胞密度为1×10⁶cells/mL，补硫酸铜至终浓度为0.5μmol/L，28℃培养72h以上，通常在诱导后8天，收集培养上清。

利用本实施方式获得果蝇细胞稳定表达株E3蛋白表达水平的ELISA检测：

将本实施方式获得的果蝇细胞稳定表达株在初始细胞密度为1×10⁶cells/mL，补硫酸铜至终浓度为0.5μmol/L，培养72h的上清液用ELISA法测定蛋白含量，按竞争法加样测活，不同果蝇细胞稳定表达株E3蛋白表达量如表1所示：不同果蝇细胞稳定表达株筛选周期如表2所示：

表1

表2

由表1、表2可知，本申请pCoPuro转染细胞稳定表达株E3蛋白表达量与两个商业化共转染载体相当，本发明共转染载体pCoPuro筛选周期1周，明显优于商业化共转染载体pCoHygro(筛选周期3-4周)和pCoBlast(筛选周期2周)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (9)

1.一种快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将含嘌呤霉素抗性基因的DNA片段导入PUC57载体中并进行克隆，得到含嘌呤霉素抗性基因的PUC57克隆载体；

(b)采用XbaI和XhoI双酶切消化含嘌呤霉素抗性基因的PUC57克隆载体，再经分离、纯化，得到嘌呤霉素抗性基因插入片段；

(c)采用XbaI及XhoI双酶切消化pCoBlast载体，再经分离、纯化，得到pCo载体骨架；

(d)将嘌呤霉素抗性基因插入片段和pCo载体骨架进行连接，即得快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含嘌呤霉素抗性基因的DNA片段序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的，其特征在于，所述步骤(b)中，采用XbaI和XhoI双酶切消化含嘌呤霉素抗性基因的PUC57克隆载体的酶切反应体系如下：

0.2μg/μL含嘌呤霉素抗性基因的PUC57克隆载体20μL、10×Buffer 5μL、XbaI 2μL、XhoI 2μL和ddH₂O 21μL；

所述酶切反应温度为37℃、时间为15min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中，采用XbaI及XhoI双酶切消化pCoBlast载体的酶切反应体系如下：

0.2μg/μL pCoBlast载体20μL、10×Buffer 5μL、XbaI 2μL、XhoI 2μL和ddH₂O 21μL；

所述酶切反应温度为37℃、时间为15min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中，采用XbaI及XhoI双酶切消化pCoBlast载体的连接反应体系如下：

0.2μg/μL pCo载体骨架3μL、50ng/μL嘌呤霉素抗性基因插入片段

13μL、10×Buffer 2μL和T4 DNA连接酶2μL；

所述连接反应条件为在16℃放置过夜。

6.权利要求1～5任一所述的制备方法制备得到的快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体。

7.权利要求1～5任一所述的制备方法制备得到的快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体在快速筛选含目的基因的果蝇细胞中的应用。

8.一种快速筛选含目的基因的果蝇细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1～5任一所述的制备方法制备得到的快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体和含有目的基因的重组载体混合；

再使用磷酸钙法共转染S2果蝇细胞，待转染结束后，更换为含1mM嘌呤霉素的培养基，加压筛选培养5～7天，大量阴性空白细胞死亡，有少量阳性克隆堆形成，重悬细胞扩大培养，建立稳定表达原始细胞库。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述含目的基因的重组载体包括pMT-E3。