CN111492056A

CN111492056A - 用于细胞的遗传修饰的非整合型dna载体

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Publication number: CN111492056A
Application number: CN201880061037.1A
Authority: CN
Inventors: 理查德·哈伯特; 马蒂亚斯·博扎; 詹姆斯·A·威廉姆斯
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Nature Technology Corp
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Nature Technology Corp
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2020-08-04
Also published as: DK3684924T3; SG11202001941SA; CA3017658A1; EP3684924B1; EP3456821A1; EP3684924A1; SG11202002367WA; EP3456821B1; JP2020535805A; ES2821655T3; AU2018337672A1; JP2023089132A; ES2942210T3; US20200277624A1; KR20200079244A; JP7189943B2; MX2020003092A; FI3456821T4; AU2018337673A1; JP7263327B2

Abstract

本发明涉及用于基因疗法、离体细胞疗法、干细胞疗法，更特别是用于改善载体编码的抗原或治疗基因表达的自复制非整合型附加体型脊椎动物表达载体的领域。这样的重组DNA分子可用于生物技术、转基因生物、基因疗法、干细胞疗法、治疗性疫苗接种、农业和DNA疫苗。更具体地，涉及包含至少一种启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段上每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA(SEQ ID NO：1)；本发明还涉及包含所述多核苷酸的组合物和宿主细胞，以及涉及用于医学和用于治疗遗传疾病的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的试剂盒和装置，以及涉及多核苷酸的方法和用途。

Description

用于细胞的遗传修饰的非整合型DNA载体

本发明涉及用于基因疗法、离体细胞疗法、干细胞疗法，更特别是用于改善载体编码的抗原或治疗基因的表达的自复制非整合型附加体型脊椎动物表达载体的领域。这样的重组DNA分子可用于生物技术、转基因生物、基因疗法、干细胞疗法、治疗性疫苗接种、农业和DNA疫苗。更具体地，涉及包含至少一种启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段上每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA(SEQ ID NO：1)；本发明还涉及包含所述多核苷酸的组合物和宿主细胞，以及涉及用于医学和用于治疗遗传疾病的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的试剂盒和装置，以及涉及多核苷酸的方法和用途。

出于科学目的，现代细胞培养中通常使用细胞的遗传修饰。然而，尽管非常需要使用相应技术来治疗由基因突变引起的遗传疾病，但是其仍然受到阻碍，存在的问题是可用的方法通常仅提供瞬时修饰，例如瞬时转染方案，而提供细胞稳定修饰的方法例如病毒性慢病毒载体或非病毒性转座子载体通常依赖于转基因整合到宿主细胞的基因组中。然而，即使靶向于特定基因座，转基因的整合也具有引起有害突变的风险，这可能导致例如癌症作为治疗的副作用。

支架/基质附着区(S/MAR)，也称为支架附着区(SAR)或与基质相关的区域(MAR)，被称为真核生物基因组中介导核基质附着的序列。S/MARS是富含AT的序列，并且发现一些富含AT的基序被进一步富集(Liebeich等人，(2002)，NAR 30(15)：3433)。已经提出了用于在细胞中稳定维持的基于S/MAR基序的多种载体，例如在US 6410314 B1中以及在Haase等人，(2010)，BMC Biotechnology 10：20中；此外，已经鉴定出对这种载体的复制有影响的表观遗传效应(Haase等人，(013)，PLOS One 8(11)：e79262)。尽管如此，仍需要基于S/MAR的载体足够稳定以用于基因疗法。

次优的表达水平、基因沉默和低建立率是本领域描述的基于S/MAR的载体的主要限制。

因此，需要用于稳定转染细胞的改进的手段和方法，特别是使用S/MAR元件并避免与将转基因整合到宿主细胞的基因组中有关的风险。该问题通过本文公开的手段和方法解决。

本发明涉及可用于非整合型附加体型基因疗法和干细胞疗法的载体，更具体地说，涉及用于改善自复制非整合型附加体型的S/MAR表达载体的转基因表达和载体建立效率，以及用于消除通过非病毒载体转移抗生素抗性标记基因的载体。

公开了改进的载体方法和组合物，其改善了靶脊椎动物细胞中自复制非整合型附加体型S/MAR表达载体的表达和建立效率。

本发明的一个目的是提高自复制非整合型附加体型S/MAR表达载体在靶脊椎动物细胞中的表达。

本发明的另一个目的是提高在靶脊椎动物细胞中自复制非整合型附加体型S/MAR表达载体的建立效率。

在一个实施方案中，本技术提供了一种用于在靶脊椎动物细胞中提高自复制非整合型附加体型S/MAR表达载体的表达和建立效率的方法，其包括以下步骤：a)提供附加体型S/MAR表达载体，其包含：i)细菌复制选择区域，其包含细菌复制起点和选择标记；ii)用于在脊椎动物细胞中表达转基因的转录单元，包括启动子、5′UTR、转基因和3′UTR；iii)位于所述3’UTR内的S/MAR插入片段；和b)修饰附加体型S/MAR表达载体，使得S/MAR在所述3′UTR内侧面为5′剪接供体位点和3′剪接受体位点，由此得到的自复制非整合型附加体型S/MAR表达载体提高了脊椎动物细胞转染后的表达和建立效率。在其他实施方案中，所述S/MAR包含内部AATAAA转录终止基序。在其他实施方案中，将所述S/MAR中的所述AATAAA转录终止基序替换为AATATT基序。在其他实施方案中，所述S/MAR选自人干扰素βS/MAR、M18 S/MAR、ApoL1 S/MAR。在其他实施方案中，侧面为5′剪接供体位点和3′剪接受体位点的所述SMAR与选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的序列具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述细菌复制起点是R6Kγ复制起点。在其他实施方案中，所述细菌复制起点是与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQID NO：4的序列具有至少95％序列同一性的R6Kγ复制起点。在其他实施方案中，所述选择标记是与选自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的序列具有至少95％序列同一性的RNA-IN调节RNA-OUT功能变体。在其他实施方案中，所述选择标记是RNA-OUT RNA选择标记，其编码与SEQ ID NO：6具有至少95％序列同一性的RNA-IN调节RNA-OUT RNA。在其他实施方案中，包含细菌复制起点和选择标记的所述细菌复制选择区域是R6K起点-RNA-OUT RNA选择标记细菌复制选择区域，其与选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的序列具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述5′UTR还编码内含子。在其他实施方案中，所述转录单位还编码位于启动子上游的表达增强子。在其他实施方案中，所述表达增强子与选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的序列具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述剪接供体位点与SEQ ID NO：25具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述剪接受体位点与SEQ ID NO：26具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述自复制非整合型附加体型S/MAR表达载体选自质粒载体、纳米质粒载体、整合缺陷型慢病毒载体和非整合型慢病毒载体。

在另一个实施方案中，本技术提供了无抗生素标记的共价封闭的环状重组DNA分子，其包含：a)用于在脊椎动物细胞中表达转基因的无抗生素标记的转录单位，其包括启动子、5′UTR、转基因和3′UTR；b)位于所述3′UTR内的S/MAR，其中所述S/MAR的侧面为5′剪接供体位点和3′剪接受体位点；c)与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4的序列具有至少95％序列同一性的R6Kγ复制起点；和d)RNA-OUT RNA选择标记，其包含与选自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的序列具有至少95％序列同一性的RNA-IN调节RNA-OUT功能变体。在其他实施方案中，所述R6Kγ复制起点和所述RNA-OUT RNA选择标记包含R6K起点-RNA-OUT RNA选择标记细菌复制选择区域，其与选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的序列具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述S/MAR选自人干扰素βS/MAR、M18 S/MAR、ApoL1 S/MAR。在其他实施方案中，所述S/MAR包含内部AATAAA转录终止基序。在其他实施方案中，将所述S/MAR中的所述AATAAA转录终止基序替换为AATATT基序。在其他实施方案中，所述S/MAR选自人干扰素βS/MAR、M18 S/MAR、ApoL1 S/MAR。在其他实施方案中，侧面为5′剪接供体位点和3′剪接受体位点的所述SMAR与选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的序列具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述5′UTR还编码内含子。在其他实施方案中，所述转录单位还编码位于启动子上游的表达增强子。在其他实施方案中，所述表达增强子与选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的序列具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述剪接供体位点与SEQ ID NO：25具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述剪接受体位点与SEQ ID NO：26具有至少95％的序列同一性。

在另一个实施方案中，本技术提供了共价封闭的环状重组DNA分子，其包含：a)用于在脊椎动物细胞中表达转基因的转录单位，其包括启动子、5′UTR、转基因和3′UTR；b)位于所述3′UTR内的S/MAR，其中所述S/MAR的侧面为5′剪接供体位点和3′剪接受体位点；c)与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少95％序列同一性的R6Kγ复制起点；和d)RNA-OUT RNA选择标记，其包含与选自SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：7的序列具有至少95％序列同一性的RNA-IN调节RNA-OUT功能变体。在其他实施方案中，所述R6Kγ复制起点和所述RNA-OUT RNA选择标记包含R6K起点-RNA-OUT RNA选择标记细菌复制选择区域，其与选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的序列具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述S/MAR选自人干扰素βS/MAR、M18 S/MAR、ApoL1 S/MAR。在其他实施方案中，所述S/MAR包含内部AATAAA转录终止基序。在其他实施方案中，将所述S/MAR中的所述AATAAA转录终止基序替换为AATATT基序。在其他实施方案中，所述S/MAR选自人干扰素βS/MAR、M18 S/MAR、ApoL1 S/MAR。在其他实施方案中，侧面为5′剪接供体位点和3′剪接受体位点的所述SMAR与选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQID NO：21、SEQ ID NO：22、和SEQ ID NO：23的序列具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述5′UTR还编码内含子。在其他实施方案中，所述转录单位还编码位于启动子上游的表达增强子。在其他实施方案中，所述表达增强子与选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的序列具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述剪接供体位点与SEQ IDNO：25具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述剪接受体位点与SEQ ID NO：26具有至少95％的序列同一性。

与具有在3′UTR中两侧不为接剪接供体和受体位点的S/MAR的质粒相比，产生的具有在3′UTR内侧面为5′剪接供体位点和3′剪接受体位点的S/MAR的质粒具有出人意料的改善的建立和转基因表达。

附图的简要说明

图1描绘了pCI内含子，其具有剪接供体(SD)分支点和剪接受体(SA)区域。图2描绘了干扰素βS/MAR(上图)和SD干扰素βS/MAR SA衍生物(中图)以及其中内部AATAAA多腺苷酸化信号发生了突变的SD干扰素βS/MAR SA衍生物(下图)。

图3描绘了侧面为SD和SA位点的干扰素βS/MAR衍生物M18。

图4描绘了侧面为SD和SA位点的805bp(上图)或525bp(下图)的apoB S/MAR。

图5描绘了pMAX-UCOE-coGFP P2A-PuroR-NP(pSMARt UCOE)载体。

图6描绘了NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SMAR-SV40 pA(NP-UCOE)和NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SD SMAR-SA SV40 pA(NP-UCOE-SP)载体。

图7描绘了NTC9385R-SP-UCOE-CMV-GFP SMARter(NP-SMARter-SP)和NTC9385R-SP-UCOE-CMV-GFP CMARter(NP-CMARter-SP)载体。

图8描绘了NTC9385R-UCOE EF1-coGFP SD-SMAR SA SV40 pA(NP-UCOE-EF1-SP)和NTC9385R-UCOE EF1-coGFP-SD SMAR R6K-R-OUT-SA pA(UCOE-EF1-SP-NP)载体。

图9描绘了NTC9385R-SP-ELE40-CMV-GFP CMARter(NP-Ele40-CMARter-SP)载体。

图10描绘了建立的侧面为SD和SA位点和两侧不为SD和SA位点的S/MAR载体的提高的表达。左图：用具有/不具有剪接连接的S/MAR载体建立的HEK293T细胞的MFI。载体在侧面为(纳米-S/MAR-剪接＝NP-UCOE-SP；NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SD SMAR-SASV40 pA图6)或两侧不为(NP-UCOE；NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SMAR-SV40 pA，图6侧面为SD和SA位点的S/MAR)的3′UTR中含有NP细菌区域、基因组绝缘子UCOE、由CMV启动子驱动的表达盒GFP-2A-PuroR和干扰素βS/MAR。右图：通过实时PCR分析证实了转录表达的改善。将转基因GFP的表达相对于管家基因GAPDH归一化。

图11描绘了建立的侧面为SD和SA位点和两侧不为SD和SA位点的S/MAR载体的提高的表达。已建立的细胞(HEK293T和原代小鼠胚胎成纤维细胞)的MFI，其中的载体带有侧面为剪接连接的不同S/MAR。载体名称如图5、图6和图7所示。

图12描绘了侧面为SD和SA位点和两侧不为SD和SA位点的S/MAR载体的改进的建立。在HEK293T中进行的集落形成测定，使用带有侧面为SD和SA位点或两侧不为SD和SA位点的两个不同S/MAR的载体。pEPI是带有3′UTR干扰素βS/MAR的CMV启动子质粒载体。

图13：遗传修饰细胞群的建立效率和分析：A)用嘌呤霉素选择4周后形成的具有结晶紫染色集落的细胞培养板；载体建立的效率约为40％；b)通过FACS检测嘌呤霉素选择的细胞中的GFP荧光；荧光非常均匀，非荧光细胞的数量非常少。

图14：从建立的细胞群中质粒拯救pS/MARt载体的结果：用BamHI消化质粒拯救实验中获得的来自细菌集落的DNA(1至12号)，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；标有“p/SMART”的泳道含有来自细菌集落的DNA，该集落带有用上述相同方法处理的原始质粒。

图15：保留在选择的细胞中的pSMARt载体的DNA印迹：与pS/MART的GFP基因杂交的寡核苷酸用作探针，以检测宿主细胞提取物中BamHI限制性内切的载体DNA(pS/MARt1至3)；将未转染的载体用作对照(“pS/MARt(+)”)。

图16：pS/MART的载体图；ori：细菌复制起点，P2A：编码来自猪捷申病毒-1的自切割2A肽的序列，apolipoB MAR：来自载脂蛋白B基因的S/MAR序列。

表1：侧面为R6K起点-RNA-OUT选择标记载体的pNTC多克隆位点。

表2：转染到A549和HEK293细胞系后S/MAR载体的瞬时表达。

表3：转染到A549和HEK293细胞系后S/MAR载体的瞬时表达。

表4：转染到A549和HEK293细胞系后S/MAR载体的瞬时表达。

SEQ ID NO：1：R6Kγ起点

SEQ ID NO：2：1CpG R6Kγ起点

SEQ ID NO：3：无CpG的R6Kγ起点

SEQ ID NO：4：延长的R6Kγ起点

SEQ ID NO：5：RNA-OUT选择标记

SEQ ID NO：6：RNA-OUT反义阻遏RNA

SEQ ID NO：7：2CpG RNA-OUT选择标记SEQ ID NO：8：侧面为NheI和KpnI限制性内切位点的R6Kγ起点-RNA-OUT细菌区域

SEQ ID NO：9：侧面为NheI和KpnI限制性内切位点的1CpG R6Kγ起点-2CpG RNA-OUT细菌区域

SEQ ID NO：10：pNTC-NP1多接头trpA R6K-RNA-OUT多接头克隆盒：EcoRI/HindIII

SEQ ID NO：11：pNTC-NP2多接头trpA R6K-RNA-OUT多接头克隆盒：EcoRI/HindIII

SEQ ID NO：12：pNTC-NP3多接头trpA R6K-RNA-OUT多接头克隆盒：EcoRI/HindIII

SEQ ID NO：13：pNTC-NP4多接头trpA R6K-RNA-OUT多接头克隆盒：EcoRI/HindIII

SEQ ID NO：14：pNTC-NP5多接头trpA R6K-RNA-OUT多接头克隆盒：KasI/HindIII

SEQ ID NO：15：pNTC-NP6多接头trpA R6K-RNA-OUT多接头克隆盒：EcoRI/SacI

SEQ ID NO：16：pNTC-NP7多接头trpA R6K-RNA-OUT多接头克隆盒：BssHII/BssHII

SEQ ID NO：17：pNTC-3xCpG NP1多接头R6K-RNA-OUT多接头克隆盒：HindIII/EcoRI

SEQ ID NO：18：侧面为5′BglII-XhoI位点和3′EcoRI限制性内切位点的人干扰素βS/MAR

SEQ ID NO：19：侧面为5′BglII位点和3′BamHI限制性内切位点的剪接供体-人干扰素βS/MAR-剪接受体

SEQ ID NO：20：侧面为5′BglII位点和3′BamHI限制性内切位点的剪接供体-人干扰素βS/MAR(-AATAAA)-剪接受体

SEQ ID NO：21：侧面为5′BglII位点和3′BamHI限制性内切位点的剪接供体-人干扰素βM18 S/MAR-剪接受体

SEQ ID NO：22：侧面为5′BglII位点和3′BamHI限制性内切位点的剪接供体-805bp人载脂蛋白B S/MAR-剪接受体

SEQ ID NO：23：侧面为5′NsiI位点和3′BamHI限制性内切位点的剪接供体-525bp人载脂蛋白B S/MAR-剪接受体

SEQ ID NO：24：pCI内含子

SEQ ID NO：25：pCI剪接供体

SEQ ID NO：26：pCI剪接受体(鼠IgG)

SEQ ID NO：27：Ele40表达增强子

SEQ ID NO：28：A2UCOE表达增强子

SEQ ID NO：29：剪接受体共有序列

SEQ ID NO：30：序列基序

SEQ ID NO：31：序列基序

SEQ ID NO：32：序列基序

SEQ ID NO：33：序列基序

SEQ ID NO：34：序列基序

SEQ ID NO：35：序列基序

SEQ ID NO：36：嘌呤霉素乙酰转移酶，合成构建体

SEQ ID NO：37：合成的嘌呤霉素乙酰转移酶编码序列

SEQ ID NO：38：抗抑制元件40

SEQ ID NO：39：CMV启动子-S/MAR序列

SEQ ID NO：40：CMV启动子-嘌呤霉素-S/MAR序列

SEQ ID NO：41：元件40-GPF-P2A-嘌呤霉素-S/MAR

如下所使用的，术语“具有”、“包含”或“包括”以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指除了由这些术语引入的特征之外，在上下文中描述的实体中不存在其他特征的情况，也可以指存在一个或多于一个其他特征的情况。例如，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”都可以指其中除了B之外，A中不存在其他任何要素的情况(即，A由且仅由B组成的情况)，还指其中除B之外，实体A中还存在一个或多于一个其他要素，例如要素C、要素C和要素D或甚至其他要素的情况。

此外，如下所使用的，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似的术语与任选的特征结合使用时，不限制其他可能性。因此，由这些术语引入的特征是任选特征，并且不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代特征来进行。类似地，由“在本发明的实施方案中”或类似表达引入的特征指任选特征，而对本发明的其他实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对以这种方式引入的特征与本发明的其他任选或非任选特征相组合的可能性也没有任何限制。

此外，如果没有另外指出，则术语“约”涉及具有相关领域中公认的技术精度的指示值，优选地涉及指示值±20％，更优选±10％，最优选±5％。此外，术语“基本上”表示不存在对所指示的结果或用途有影响的偏差，即，潜在的偏差不会使所指示的结果偏差超过±20％，更优选±10％，最优选±5％。因此，“基本上由......组成”是指包括特定的组分，但不包括其他组分，所述其他组分不包括作为杂质存在的材料、由于用于提供组分的工艺而存在的不可避免的材料以及为实现本发明的技术效果以外的目的而添加的组分。例如，使用短语“基本上由......组成”定义的组合物涵盖任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。优选地，基本上由一组组分组成的组合物包含小于5重量％，更优选小于3重量％，甚至更优选小于1重量％，最优选小于0.1重量％的非特定的组分。在核酸序列的上下文中，术语“基本相同”表示同一性值％为至少80％，优选至少90％，更优选至少98％，最优选至少99％。可以理解，术语基本相同包括100％同一性。如适当修改，前述也适用于术语“基本上互补的”。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”是指线性或环状核酸分子。该术语涵盖单链以及部分或完全双链的多核苷酸。优选地，多核苷酸是RNA或是DNA，包括cDNA。此外，还包括化学修饰的多核苷酸，包括天然存在的修饰的多核苷酸，例如糖基化或甲基化的多核苷酸，或人工修饰的衍生物，例如生物素化的多核苷酸。本发明的多核苷酸应优选以分离的多核苷酸(即从其天然环境分离)或遗传修饰的形式提供。本发明的多核苷酸包含在宿主细胞中有活性的至少一种启动子和S/MAR元件；此外，多核苷酸具有在宿主细胞中以附加体型复制的生物学活性，全部如本文下文所述。优选地，多核苷酸的长度为至多1Mb，更优选至多500kb，甚至更优选至多200kb，最优选至多100kb。优选地，多核苷酸是非天然存在的多核苷酸；因此，优选地，核苷酸是人工多核苷酸。还优选地，多核苷酸是嵌合多核苷酸；更优选地，多核苷酸包含与其所包含的其余核酸序列异源的至少一种核酸序列。

如本文所使用的，术语多核苷酸优选包括具体指出的多核苷酸的变体。更优选地，术语多核苷酸涉及所示的特定多核苷酸。如本文所使用的，术语“多核苷酸变体”涉及与本文相关的多核苷酸的变体，其包含的核酸序列的特征在于该序列可通过至少一种核苷酸取代、添加和/或缺失衍生自上述特定核酸序列，其中多核苷酸变体应具有针对特定多核苷酸指定的一种或多于一种生物学活性。因此，应理解，根据本发明的多核苷酸变体应具有由于至少一种核苷酸取代、缺失和/或添加而不同的核酸序列。优选地，所述多核苷酸变体包含特定多核苷酸或其功能性亚序列，例如S/MAR元件的直系同源物、旁系同源物或另一种同源物。还优选地，所述多核苷酸变体包含特定多核苷酸或其功能性亚序列的天然存在的等位基因。多核苷酸变体还涵盖包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列优选在严格的杂交条件下能够与上述特定多核苷酸或其功能性亚序列杂交。这些严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在标准教科书中找到。严格的杂交条件的优选实例是在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中，随后在50℃至65℃下在0.2x SSC，0.1％SDS中的一个或多于一个洗涤步骤的杂交条件。技术人员知道，根据核酸的类型以及例如当存在有机溶剂时，这些杂交条件在缓冲液的温度和浓度方面有所不同。例如，在“标准杂交条件”下，在浓度为0.1x至5xSSC(pH 7.2)的含水缓冲液中，根据核酸的类型，温度为42℃至58℃。如果上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度约为42℃。DNA：DNA杂交体的杂交条件优选为例如0.1xSSC和20℃至45℃，优选30℃至45℃。DNA：RNA杂交体的杂交条件优选为例如0.1xSSC和30℃至55℃，优选45℃至55℃。例如在不存在甲酰胺的情况下，对于长度约为100bp(＝碱基对)且G+C含量为50％的核酸，确定上述杂交温度；因此，本领域技术人员原则上已知，技术人员能够发现更适合于低G+C DNA的其他条件。技术人员知道如何通过参考标准教科书来确定所需的杂交条件。或者，可通过基于PCR的技术，例如基于混合寡核苷酸引物的DNA扩增，即使用针对本发明多肽的保守结构域的简并引物来获得多核苷酸变体。可以通过将本发明的多核苷酸的核酸序列或本发明的多肽的氨基酸序列与其他生物的序列进行序列比较来鉴定多肽的保守结构域。作为模板，可以使用来自细菌、真菌、植物或优选来自动物的DNA或cDNA。此外，变体包括的多核苷酸包含与明确指出的核酸序列或其功能性亚序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％同一性的核酸序列。此外，还涵盖了多核苷酸，其包含的核酸序列编码与具体指出的氨基酸序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。同一性百分比值优选地在整个氨基酸或核酸序列区域上计算。技术人员可以使用基于各种算法的一系列程序来比较不同的序列。在这种情况下，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出了特别可靠的结果。为了进行序列比对，优选使用程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS，51989：151-153)或程序Gap和BestFit(Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970)和Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))。优选地，所述程序与它们的标准参数一起使用。上面列出的以百分比(％)表示的序列同一性值优选通过以下设置在整个序列区域中使用程序GAP确定：间隔权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均错配：0.000，除非另有说明，否则应始终将此用作序列比对的标准设置。

还涵盖了包含任何明确指出的核酸序列的片段的多核苷酸为本发明的变体多核苷酸，所述多核苷酸保留了指出的活性。本文所指的片段优选包含任一个特定核酸序列的至少200个，优选至少300个，更优选至少400个连续核苷酸；或编码一种氨基酸序列，该氨基酸序列包含任一个特定氨基酸序列的至少100个，优选至少200个，更优选至少300个连续氨基酸，并且仍然具有指出的活性。

本发明的多核苷酸由上述核酸序列组成、基本上由上述核酸序列组成或包含上述核酸序列。因此，它们也可以包含其他核酸序列。具体而言，本发明的多核苷酸可以编码例如融合蛋白或选择标记。此类融合蛋白可包含用于监测表达作为附加部分的多肽(例如，绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白，碱性磷酸酶等)，或可作为可检测的标记或作为辅助方法用于纯化目的的所谓的“标签”。用于不同目的的标签是本领域众所周知的，并在本文其他地方进行了描述。

还优选地，多核苷酸包含至少一种货物序列。如本文所使用的，术语“货物序列”涉及转移到宿主细胞中并稳定地维持在宿主细胞中的目的核酸序列。优选地，货物序列是编码多核苷酸，例如RNA和/或目的多肽的核酸序列。优选地，目的多肽是治疗性多肽，更优选T细胞受体(TCR)，更优选人或嵌合T细胞受体，嵌合抗原受体(CAR)，优选MART1 TCR，或在受本文其他地方所述的遗传性疾病影响的细胞中缺乏的多肽。因此，例如优选地，多核苷酸包含至少一种货物序列，该货物序列编码提供用于治疗苯丙酮尿症的苯丙氨酸羟化酶活性(EC 1.14.16.1)的多肽。

优选地，编码选择标记的序列和货物序列被能够由一种mRNA在真核细胞中表达两种(或多于两种)多肽的序列，例如内部核糖体进入序列(IRES)，或更优选自切割肽序列，例如最优选来自猪捷申病毒1的肽2A(P2A)序列插入。适当的序列是本领域已知的，例如，来自Kim等人，(2011)PLoS ONE 6(4)：e18556。

优选地，多核苷酸是DNA。优选地，多核苷酸包含其他的表达控制序列，其允许基因在原核宿主细胞和/或真核宿主细胞中，优选在真核宿主细胞，或其分离的部分中表达。所述多核苷酸的表达包括多核苷酸的转录，优选转录成可翻译的mRNA。在真核细胞，优选哺乳动物细胞中确保表达的调节元件是本领域众所周知的。它们优选包含确保转录起始的调节序列，以及任选地确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。其他调节元件可包括转录增强子和翻译增强子。允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1启动子或GAL1启动子或在哺乳动物和其他动物细胞中的SMVP-启动子、U6-启动子、H1-启动子、7SK-启动子、CMV-启动子、EFS-启动子、SV40-启动子或RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。此外，诱导型或细胞类型特异性表达控制序列可以包含在本发明的多核苷酸中。诱导型表达控制序列可以包含tet或lac操纵基因序列或可由热激或其他环境因素诱导的序列。合适的表达控制序列是本领域众所周知的。除了负责转录起始的元件外，此类调节元件还可在多核苷酸下游包含转录终止信号，例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”涉及能够接收和稳定复制多核苷酸的任何细胞。优选地，宿主细胞是真核细胞，优选植物细胞或酵母细胞，例如面包酵母菌株的细胞，或者是动物细胞。更优选地，宿主细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞，特别是小鼠细胞或大鼠细胞。甚至更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，最优选地是人细胞。优选地，宿主细胞是CD34+祖细胞；CD61+凝血细胞；CD19+B淋巴细胞；CD14+单核细胞；CD15+粒细胞；CD3+细胞毒性T淋巴细胞，优选还对CD8和CD45呈阳性；CD3+辅助性T淋巴细胞，优选还对CD4和CD45呈阳性；CD3+活化的T淋巴细胞，优选还对CD25和CD45呈阳性，肿瘤浸润淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞。如本领域技术人员将理解的，多核苷酸可另外具有允许在细菌细胞中复制的序列，特别是细菌复制起点优选地，细菌细胞是实验室细菌菌株的细胞，更优选是大肠杆菌细胞。

原则上，术语“启动子”是技术人员已知的遗传元件，其任选地与其他调节元件协同指导给定基因的转录水平。启动子可以是组成型的，即提供基本上不依赖于宿主细胞状态的恒定转录水平，或者可以被调节，即根据宿主细胞的状态而提供转录水平。此外，启动子可以是细胞类型特异性和/或组织特异性的，即仅在少数或仅一种细胞类型中提供可检测的转录水平。优选地，根据本发明的启动子在如上所述的宿主细胞中具有活性。如本领域技术人员将理解的，启动子的选择可以取决于旨在靶向的宿主细胞的类型；用于特定细胞类型的合适的启动子以及组成型启动子是本领域已知的。优选地，启动子是真核启动子，更优选地是组成型真核启动子，甚至更优选是强真核启动子。优选地，启动子是EF1α(延伸因子1α)启动子、UbiC(泛素C)启动子、ROSA 26启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)启动子和/或CAG(鸡α-肌动蛋白)启动子，更优选地是EF1α启动子。还优选地，启动子是细胞特异性和/或组织特异性的真核启动子。如本文所使用的，术语“启动子”用于如上所述的启动子，而另外可能存在于多核苷酸上的任何其他启动子称为“次级启动子”。因此，优选地，启动子是指导转录到宿主细胞的S/MAR序列中的启动子；还优选地，不指导转录到多核苷酸的S/MAR序列中的启动子，例如，原核启动子、与S/MAR序列转录绝缘，和/或指导远离S/MAR序列的转录的启动子是次级启动子。优选地，启动子包含对应于载脂蛋白B启动子的少于1000个，更优选少于250个，甚至更优选少于100个，最优选少于20个连续碱基对；因此，优选地，多核苷酸不包含人载脂蛋白B启动子，更优选地不包含载脂蛋白B启动子。

优选地，S/MAR序列位于启动子的下游，并且如果存在的话，位于紧邻下文指定的选择标记基因的下游。优选地，位于“紧邻下游”是缺少插入转录终止信号，更优选地，缺少插入基因。因此，优选地，在启动子处起始，并且如果编码，则包含可检测的标记序列的转录物，在多核苷酸中优选包含转录的S/MAR序列，更优选包含完整的S/MAR序列；如本领域技术人员根据本文其他地方的描述将理解的，多核苷酸还可以包括介导从原始转录物中切除S/MAR序列的剪接位点；因此，更优选地，优选至少在启动子处起始，并且如果编码，则包括可检测的标记序列的初级转录物，在多核苷酸中优选地包含转录的S/MAR序列，更优选地，包含完整的S/MAR序列。还优选地，术语“紧邻下游”包括其中启动子和S/MAR序列被延长的核酸序列分开的多核苷酸，条件是转录终止信号不介于启动子和S/MAR之间。优选地，介于启动子或选择标记基因的终止密码子(如果存在的话)和S/MAR序列之间的序列的长度至多为2kb，更优选为至多0.5kb，甚至更优选为至多0.2kb，还更优选至多0.1kb，最优选至多50bp。

术语“S/MAR元件”，也称为“支架/基质附着区”，原则上是技术人员已知的，其涉及介导真核细胞核基质与所述DNA的附着的DNA序列。S/MAR序列通常衍生自真核染色体DNA中的序列。可获得各种S/MAR序列，并且序列可从公共数据库中获得，例如描述于Liebich等人，(2002)，Nucleic Acids Res.30，312-374中。根据本发明，所述S/MAR元件的核酸序列(迄今称为S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段上每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA。因此，S/MAR序列中包含的基序包含多个四核苷酸基序5′-ATTA-3′。优选地，S/MAR序列的长度为至少200个核苷酸，更优选为至少300个核苷酸，甚至更优选为至少400个核苷酸，最优选为至少500个核苷酸。优选地，S/MAR序列的长度为至多3kb，更优选至多2kb，甚至更优选至多1.5kb，还更优选至多1kb，最优选至多0.9kb。因此，优选地，S/MAR序列的长度为0.2kb至3kb，更优选为0.3kb至2kb，甚至更优选为0.4kb至1.5kb，最优选为0.5kb至1kb。应当理解，指示“每100个核苷酸包含n个序列基序”涉及每100个序列的碱基对计算的所述序列基序的平均数，因此其可以是分数。例如SEQ ID NO：6中每100个碱基对的ATTA序列基序的数目是34/525个碱基对*100个碱基对＝6.5。优选地，在S/MAR序列的整个长度上确定每100个碱基对的序列基序的数目；如有疑问，例如在无法确定S/MAR序列的边界的情况下，每100个多核苷酸的碱基对的序列基序数目优选为可在所述多核苷酸内对于200bp的任何窗口确定的最高数目，更优选为可在所述多核苷酸内500bp的任何窗口确定的最高数目。优选地，S/MAR序列在至多200个核苷酸的片段中每100个核苷酸包含至少4个序列基序ATTA，更优选在至多200个核苷酸的片段中每100个核苷酸包含至少5个序列基序ATTA，还更优选在至多200个核苷酸的片段中每100个核苷酸包含至少6个序列基序ATTA。还优选地，S/MAR序列在至多400个核苷酸的片段中每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA，更优选在至多400个核苷酸的片段中每100个核苷酸包含至少4个序列基序ATTA，甚至更优选在至多400个核苷酸的片段中每100个核苷酸包含至少5个序列基序ATTA，最优选在至多400个核苷酸片段中每100个核苷酸包含至少6个序列基序ATTA。还优选地，S/MAR序列在至多500个核苷酸的片段中每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA，更优选在至多500个核苷酸的片段中每100个核苷酸包含至少4个序列基序ATTA，甚至更优选在至多500个核苷酸的片段中每100个核苷酸包含至少5个序列基序ATTA，最优选在至多500个核苷酸的片段中每100个核苷酸包含至少6个序列基序。因此，优选地，S/MAR序列在500个核苷酸的序列中包含至少10个序列基序ATTA，更优选在500个核苷酸的序列中包含至少20个序列基序ATTA，还更优选在500个核苷酸的序列中包含至少30个序列基序ATTA。优选地，S/MAR序列中的至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的ATTA基序被9个至13个碱基对，优选10个至12个碱基对，最优选11个碱基对间隔开。

优选地，S/MAR元件包括另外的序列基序，优选地在包含上文描述的ATTA基序的序列内。优选地，包含所述ATTA序列基序的所述S/MAR元件的序列片段还包含至少一个序列基序ATTTA，优选至少2个序列基序ATTTA，更优选至少4个序列基序ATTTA，最优选至少8个序列基序ATTTA。还优选地，包含所述ATTA序列基序和任选的所述ATTTA基序的所述S/MAR元件的序列片段还包含至少一个，优选至少两个，更优选至少四个，最优选至少六个回文基序，优选基序TAAATATTTTA(SEQ ID NO：30)。优选地，所述基序TAAATATTTTA在5′端和/或3′端与至少一个基序ATTA相邻。还优选地，包含所述ATTA序列基序的S/MAR元件的序列片段包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选至少四个，最优选至少五个序列基序ATTATAAATATTTTAATTA(SEQ ID NO：31)，更优选序列基序ATTTAATTATAAATATTTTAATTA(SEQID NO：32)。

还优选地，S/MAR序列具有低的G+C含量。本领域技术人员知道如何通过计数序列中的所有鸟嘌呤和胞苷碱基并将累计结果除以序列中的核苷酸数来计算已知序列的C+G含量。优选地，包含所述序列基序ATTA的S/MAR元件的序列片段的G+C含量为至多30％，更优选至多20％，还更优选至多15％，甚至更优选至多10％，最优选至多5％。优选地，在无法确定S/MAR元件的边界的情况下，如上所述，用于计算G+C含量的序列与用于计算每100个碱基对的ATTA基序数目的序列相同。还优选地，S/MAR序列具有低数目的CG二核苷酸。优选地，包含所述序列基序的所述S/MAR元件的序列片段包含至多6个序列基序CG，更优选至多4个序列基序CG，甚至更优选至多2个序列基序CG，最优选不包含序列基序CG。

优选地，S/MAR序列包含载脂蛋白B基因的S/MAR序列，优选人载脂蛋白B基因，更优选人载脂蛋白B基因的3′S/MAR序列。更优选地，S/MAR序列包含人载脂蛋白B基因的变体，更优选人载脂蛋白B基因的3′S/MAR序列。因此，优选地，S/MAR序列包含与SEQ ID NO：33，优选SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35的序列具有至少70％同一性的序列。更优选地，S/MAR序列包含SEQ ID NO：33，优选SEQ ID NO：34，更优选SEQ ID NO：35的核酸序列。

优选地，多核苷酸在S/MAR元件的下游包含poly-A信号：更优选地，多核苷酸在S/MAR元件的下游包含poly-A信号和转录终止信号。同样优选地，S/MAR元件的侧面为剪接供体和剪接受体；因此，优选地，S/MAR序列优选在转录后从编码选择标记的转录物中剪接出来。还优选地，多核苷酸还包含如上文所指定的(次级)细菌复制起点和/或细菌选择标记基因。优选地，细菌复制起点和驱动细菌选择标记基因表达的启动子是原核生物特异性的，即，更优选地，在宿主细胞中是无功能的。还优选地，通过至少一种绝缘元件的存在，更优选地，通过侧面为绝缘元件，多核苷酸中包含的细菌复制起点和/或细菌选择标记基因，优选原核细胞中所有活性的元件与多核苷酸中包含的其余序列绝缘。优选地，通过在5′端存在至少一个绝缘元件和在3′端存在至少一个绝缘元件，将细菌复制起点和/或细菌选择标记基因，优选在原核细胞中所有活性元件与多核苷酸中包含的其余序列绝缘。更优选地，通过至少一种绝缘元件的存在，更优选地，通过侧面为绝缘元件，多核苷酸中包含的细菌复制起点和/或细菌选择标记基因，优选原核细胞中所有活性元件与启动子绝缘。优选地，所述绝缘元件是抗抑制元件40元件(SEQ ID NO：38)或其变体和/或S/MAR元件。

因此，优选地，多核苷酸包含SEQ ID NO：34或35的序列或与SEQ ID NO：34或SEQID NO：35的序列具有至少70％同一性的序列；优选为SEQ ID NO：39或与SEQ ID NO：39的序列具有至少70％同一性的序列，更优选为SEQ ID NO：40或与SEQ ID NO：40的序列具有至少70％同一性的序列，最优选为SEQ ID NO：41或与SEQ ID NO：41的序列具有至少70％同一性的序列。优选地，多核苷酸包含SEQ ID NO：41的序列，其中编码GFP的核酸序列被编码不同多肽的核酸序列取代，所述多肽优选地是治疗性多肽，更优选地是人T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)，优选MART1TCR。

优选地，多核苷酸还包含编码选择标记多肽的编码序列，所述选择标记序列介于多核苷酸的启动子和多核苷酸的S/MAR元件之间，优选地，其中所述启动子和所述选择标记序列共同构成选择标记基因。如本文所使用的，术语“选择标记序列”用作表达“编码选择标记多肽的编码序列”的简写。术语“选择标记”原则上是技术人员理解的，并且涉及当在宿主细胞中表达时，当向宿主细胞施加选择性压力时，赋予对介导宿主细胞选择性压力的条件的至少一种抗性的核酸序列。对于原核细胞和真核细胞，选择标记是本领域已知的。优选地，选择标记是真核细胞的选择标记。优选地，选择标记是选择标记多肽，更优选地是具有转运蛋白和/或酶活性的选择标记多肽，其从热细胞中除去选择化合物或修饰所述选择化合物以使其失活。优选地，选择标记基因还编码至少一个内含子，优选地在编码选择标记多肽的序列的上游。优选地，选择标记是介导对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、新霉素和/或吉欧霉素，更优选对嘌呤霉素的抗性的标记。因此，优选地，启动子和选择标记共同构成嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因或吉欧霉素抗性基因，更优选嘌呤霉素抗性基因。优选地，选择标记基因没有poly-A信号和转录终止信号。

优选地，选择标记是嘌呤霉素乙酰转移酶(Genbank登录号KX548903.1(SEQ IDNO：36)，由Genbank登录号KX548903.1(SEQ ID NO：37)的核苷酸535至1134编码)。因此，选择标记基因优选包含的核酸序列a)引起嘌呤霉素抗性多肽的表达，该多肽包含SEQ ID NO：36的序列；b)引起嘌呤霉素抗性多肽的表达，该多肽包含与SEQ ID NO：36的序列具有至少70％同一性的序列；c)包含SEQ ID NO：37的序列；d)包含与SEQ ID NO：37的序列具有至少70％同一性的序列，e)包含编码嘌呤霉素抗性多肽的核酸序列，该多肽包含SEQ ID NO：36的序列，优选由SEQ ID NO：36的序列组成，和/或f)包含编码嘌呤霉素抗性多肽的核酸序列，其包含与SEQ ID NO：36的序列具有至少70％同一性的序列，优选由与SEQ ID NO：36的序列具有至少70％同一性的序列组成。

如本文所使用的，术语“复制”涉及在细胞复制周期期间多核苷酸在宿主细胞中诱导所述多核苷酸的至少两个复制品产生的活性。因此，优选地，通过在一系列细胞分裂后确定多核苷酸的存在来确定宿主细胞中多核苷酸的复制，其中预期非复制多核苷酸被稀释掉。优选地，复制是稳定复制，即复制到在平均50次细胞分裂后，更优选在平均100次细胞分裂后，最优选在平均250次细胞分裂后仍能在宿主细胞群中检测到多核苷酸的程度。优选地，在标准条件下通过PCR进行宿主细胞群中多核苷酸的检测。

原则上，术语“附加体型”复制是技术人员已知的，涉及多核苷酸的复制而不被整合到细胞基因组中，即，不与细胞基因组共价连接。因此，优选地，多核苷酸的附加体型复制是作为自主复制单位的所述多核苷酸的复制。优选地，附加体型复制是以环状闭合双链DNA分子的形式维持宿主细胞中的多核苷酸。如本领域技术人员将理解的，所述多核苷酸的实际复制可以涉及其他形式，例如，以滚环复制。环状DNA的附加体型维持优选通过技术人员已知的质粒拯救程序来验证；即，优选地，通过制备宿主细胞的裂解物并将其中包含的DNA转化至合适的细菌细胞中，例如，大肠杆菌细胞；如果通过所述方法可获得的合适数目的细菌集落包含环状DNA作为具有与原始环状DNA相同的限制性内切模式和/或序列的质粒，则优选假定环状DNA是以附加体型维持的。本领域技术人员还已知的另一种验证附加体型维持的方法是DNA/DNA印迹法(“DNA印迹”法)；因此，优选地，制备宿主细胞的总DNA并用一种或多于一种限制性内切酶消化；如果在使用原始质粒作为探针的DNA印迹中，仅可见对应于原始环状DNA的条带，则优选推断质粒是以附加体型维持的。更优选地，如本文实施例中所述验证附加体型维持。

因此，如本文所使用的，术语“以附加体型复制”涉及多核苷酸在细胞复制周期期间诱导宿主细胞中所述多核苷酸的至少两个复制品产生的活性，而所述多核苷酸以自复制实体存在于所述细胞中；稳定的附加体型复制是在至少50次细胞分裂后，优选在至少100次细胞分裂后，更优选在至少250次细胞分裂后，最优选在至少500次细胞分裂后，在宿主细胞中仍能检测到多核苷酸的程度的附加体型复制。优选地，上述细胞分裂数是细胞群的平均细胞分裂数。

本发明的多核苷酸优选不含猿猴病毒40(SV40)复制起点、牛乳头状瘤病毒(BPV)复制起点和EB病毒(EBV)复制起点，优选不含多瘤病毒复制起点、乳头状瘤病毒复制起点和疱疹病毒复制起点；更优选地，不含感染真核生物的病毒的复制起点。更优选地，载体没有任何已知的真核复制起点。然而，优选地，多核苷酸还包含原核复制起点，优选细菌复制起点，特别是大肠杆菌复制起点。优选地，原核复制起点是多核苷酸中包含的唯一复制起点。

有利地，在本发明的基础工作中发现，通过将指定的S/MAR元件与读入所述S/MAR元件中的启动子结合，甚至在没有专用的复制起点的情况下，获得了在宿主细胞中以附加体形式高度稳定的多核苷酸。此外，发现通过使用嘌呤霉素抗性基因，通过确保通过抗性基因向S/MAR元件中转录以及通过使启动子-S/MAR组合与多核苷酸中潜在存在的其他启动子转录隔离而可以进一步提高建立多核苷酸的效率。

以上作出的定义经适当修改后适用于以下内容。下面作进一步说明的附加定义和解释经适当修改后也适用于本说明书中所述的所有实施方案。

本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸的组合物。

如本文所使用的，术语“组合物”涉及包含指定化合物的物质和任选的一种或多于一种可接受的载体的组合物。优选地，组合物是药学上可接受的组合物；因此，优选地，载体是药学上可接受的载体。本发明的化合物可以配制成优选为药学上可接受的盐。优选的盐包括乙酸盐、甲酯、HCl盐、硫酸盐、氯化物等。

在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是可接受的。所使用的载体可以是例如固体、凝胶或液体。固体药物载体的实例是乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液体载体的实例是磷酸盐缓冲盐溶液、糖浆、例如花生油和橄榄油的油、水、乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。类似地，载体或稀释剂可包含本领域众所周知的延时材料，例如单独或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。所述合适的载体包括上面提到的那些和本领域众所周知的其他载体，参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。选择稀释剂以不影响组合物中化合物的生物活性。这样的稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和汉克溶液。另外，药物组合物或制剂还可包含其他载体、佐剂或无毒、无治疗、无免疫原性的稳定剂等。

优选地，组合物介导多核苷酸进入宿主细胞。因此，优选地，组合物包含至少一种转染剂。合适的转染剂的选择可以取决于靶宿主细胞以及所设想的具体应用。转染剂、合适的转染条件以及其选择标准是本领域众所周知的。还优选地，组合物包含病毒样颗粒。因此，优选地，将多核苷酸包装到病毒样颗粒中，即，优选地将多核苷酸包含在病毒样颗粒中。

药物组合物优选局部施用或全身施用。通常用于药物施用的合适的施用途径是口服施用、静脉内施用或肠胃外施用以及吸入。然而，取决于化合物的性质和作用方式，药物组合物也可以通过其他途径施用。例如，如上文所指定，可以通过使用病毒载体或病毒或脂质体以基因疗法的方式施用多核苷酸化合物。此外，化合物可以与其他药物组合在普通药物组合物中或作为分离的药物组合物施用，其中所述分离的药物组合物可以以成套试剂盒的形式提供。化合物优选以常规剂型施用，所述常规剂型是根据常规方法通过将药物与标准药物载体结合而制备的。这些程序可以包括将成分适当地混合、制粒、压制或溶解，以适合所需的制剂。应当理解，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特性由与其结合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量决定。

药物组合物的治疗有效剂量是指用于本发明的药物组合物中的化合物预防、改善或治疗伴随本说明书所述的疾病或病症的症状的量。这类化合物的治疗功效和毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准药学方法来确定，例如ED50(对50％的群体有效的治疗剂量)和LD50(对50％的群体致死的剂量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为比例LD50/ED50。

剂量方案将由主治医生和其他临床因素决定；优选根据上述方法中的任何一种。如医学领域众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、总体健康状况以及同时施用的其他药物。可以通过定期评估来监控进度。典型的剂量可以为例如1μg至1000μg；然而，可以设想低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到上述因素。通常，作为药物组合物的常规施用方案应为每天1μg至10mg单位。如果方案是连续输注，则每分钟每千克体重也应分别为1μg至10mg单位。可以通过定期评估来监控进度。然而，取决于对象和施用方式，物质的施用量可以在很宽的范围内变化，以提供每kg体重约0.01mg至每kg体重约10mg。在施用病毒载体，特别是腺相关病毒载体的情况下，优选剂量为5×10¹¹个至2×10¹³个病毒颗粒或病毒基因组/kg体重；如将理解的，除了上述因素之外，可以根据例如病毒类型、靶器官等其他因素来修改这些示例性剂量。

为了治疗或改善或预防本说明书中所述的疾病或病症，本文所指的药物组合物和制剂至少施用一次。但是，所述药物组合物可以施用多次，例如每天一次至四次，至不限天数一次至四次。

特定的药物组合物是以药学领域众所周知的方式制备的，并且包含至少一种本文上面提到的活性化合物，其与药学上可接受的载体或稀释剂混合或以其他方式结合。为了制备那些特定的药物组合物，通常将活性化合物与载体或稀释剂混合，或封闭或封装在胶囊、密封小袋、扁囊剂、纸或其他合适的容器或载剂中。所得制剂应采用施用方式，即以片剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、混悬剂等形式。剂量建议应在开处方者或使用者说明中指出，以便根据所考虑的接受者预期进行剂量调整。

本发明还涉及用于医学的根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞。本发明还涉及用于治疗遗传疾病的根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞。

如本文所使用的，术语“遗传疾病”涉及与个体的基因组中的一种或多于一种修饰，优选突变有因果关系的疾病。因此，优选地，遗传疾病与一种或多于一种表观遗传变化有因果关系，更优选地与一种或多于一种基因突变有因果关系。可以理解，遗传疾病的症状通常是由突变基因的表达和/或缺乏提供一种或多于一种特定组织和/或细胞类型的基因产物的正常功能的基因的表达引起的。因此，可能优选仅在突变导致疾病的那些细胞中治疗遗传疾病。优选地，遗传疾病是单基因疾病，即由一个基因的基因改变引起。更优选地，遗传疾病是单基因隐性疾病，即由基因的两个等位基因中的遗传改变引起；因此，优选预期通过提供至少一个未改变的受影响基因的拷贝来改善症状。最优选地，遗传疾病是苯丙酮尿症、尿黑酸症、莱伯先天性黑矇、无脉络膜或Stargardt病。

本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸和介导进入细胞的化合物的试剂盒。

如本文所使用的，术语“试剂盒”是指可以包装在一起或可以不包装在一起的本发明的上述化合物、手段或试剂的集合。试剂盒的组分可以包含在分开的小瓶中(即，作为具有分开的部分的试剂盒)或提供在单个小瓶中。此外，应当理解，优选地，本发明的试剂盒将用于实施本文上面提到的方法。优选地，设想以现成的方式提供所有组分以实施上述方法。此外，试剂盒优选包含用于实施所述方法的说明。这些说明可以通过用户手册以纸或电子形式提供。另外，手册可以包括用于解释当使用本发明的试剂盒进行前述方法时获得的结果的说明。从上面可以理解，包含多核苷酸的试剂盒的描述优选地涉及包含相应经适当修改后的载体的试剂盒。

优选地，试剂盒还包含至少一种介导其所包含的多核苷酸进入细胞的化合物，术语“介导进入细胞的化合物”涉及适合于使试剂盒的多核苷酸进入宿主细胞内部，优选宿主细胞的任何手段。合适的介导进入细胞的化合物(递送手段)是本领域已知的，并且特别包括转染手段、包装组合物等。优选地，本发明的多核苷酸被预先包装在递送手段中，例如在病毒颗粒中，更优选在复制缺陷型病毒颗粒中，最优选在病毒样颗粒(VLP)中。技术人员知道为细胞受体提供不同特异性的递送手段，使得可以选择适合于给定靶宿主细胞的递送手段。

本发明还涉及一种装置，其包含根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞。

如本文所使用的，术语“装置”涉及一种手段系统，其至少包括彼此可操作地连接以施用本发明的化合物或组合物的手段。用于施用多核苷酸、组合物、宿主细胞的优选手段是本领域众所周知的。如何以操作方式连接这些手段取决于装置中所包括的手段的类型以及所设想的施用方式。优选地，在这种情况下，所述手段包括在单个装置中。因此，所述装置可以包括用于施用化合物或组合物的递送单元和用于储存所述化合物或组合物直至施用的储存单元。然而，还可以预期的是，在这样的实施方案中，本发明的手段可以表现为单独的装置，并且优选地被包装在一起作为试剂盒。本领域技术人员将容易地认识到如何连接这些工具。优选的装置是无需专业技术人员的特殊知识便可以应用的装置。在一个优选的实施方案中，装置是包含本发明的化合物或组合物的注射器，更优选地具有针头。在另一个优选的实施方案中，装置是包含化合物或组合物的静脉输注(IV)装置。在另一个优选的实施方案中，装置是内窥镜装置，其包括用于冲洗施用部位的化合物或药物，或者还包括用于例如向肿瘤局部施用化合物或组合物的针。在另一个优选的实施方案中，装置是包含本发明化合物的吸入器，其中，更优选地，所述化合物被配制成以气雾剂形式施用。

本申请还涉及稳定转染宿主细胞的方法，其包括

a)使所述宿主细胞与根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞接触，和

b)从而稳定地转染宿主细胞。

稳定转染本发明宿主细胞的方法优选是体外方法。而且，除了上面明确提到的那些步骤之外，它还可以包括其他步骤。例如，其他步骤可以涉及，例如，为步骤a)提供宿主细胞或包含其的样品，和/或对接触的宿主细胞施加选择性压力。此外，所述步骤中的一个或多于一个可以由自动化设备执行。

技术人员将术语“稳定转染宿主细胞”理解为涉及将多核苷酸，优选异源多核苷酸引入细胞中，使得多核苷酸被宿主细胞稳定地复制，如上文所述。优选地，稳定的转染包括多核苷酸的稳定附加体型复制。优选地，稳定的转染包括在接触后向宿主细胞施加选择性压力以根据是否存在选择标记进行选择。在接触之后施加选择性压力，任选地排除允许在宿主细胞内建立多核苷酸的第一时间范围；允许在宿主细胞内建立多核苷酸的所述第一时间范围的持续时间主要取决于所接触的宿主细胞的类型以及所使用的选择标记的种类；优选地，允许在宿主细胞内建立多核苷酸的所述第一时间范围的持续时间为1h至48h，更优选为2h至24h，最优选为3h至16h。然而，允许在宿主细胞内建立多核苷酸的所述第一时间范围的持续时间也可以为零，即可以在接触后立即或甚至在接触期间施加选择性压力。可以连续地施加选择性压力，即在允许在宿主细胞内建立多核苷酸的第一时间范围之后的基本所有时间点上，更优选地是防止不包含多核苷酸的宿主细胞增殖；或者可以短暂地应用，更优选地是除去未接受多核苷酸的细胞。优选地，在所述接触之后细胞被转移回生物体的情况下，使用短暂地施加选择性压力。然而，还设想不施加选择性压力，特别是在已知多核苷酸转移至靶宿主细胞的效率足够高和/或纯转基因宿主细胞群不是非常重要的情况下。

在本发明的方法的上下文中使用的术语“接触”是本领域技术人员理解的。优选地，该术语涉及使至少一种本发明的多核苷酸、载体和/或宿主细胞与宿主细胞物理接触，例如使宿主细胞和化合物相互作用。优选地，接触包括将本发明的至少一种多核苷酸递送至宿主细胞内部，优选地经由如上所述的递送方式。

本发明还涉及治疗对象遗传疾病的方法，其包括

a)使所述对象与根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞接触，和

b)从而治疗所述对象的遗传疾病。

本发明的治疗遗传疾病的方法优选是体内方法。而且，除了上面明确提到的那些步骤之外，它还可以包括其他步骤。例如，其他步骤可以涉及，例如，为步骤a)提供宿主细胞或包含其的样品，和/或将所述样品或宿主细胞重新施用至对象。因此，用于治疗遗传疾病的方法包括如上所述的用于稳定转染宿主细胞的方法的步骤。此外，所述步骤中的一个或多于一个可以由自动化设备执行。

此外，本发明涉及本发明的多核苷酸在稳定遗传修饰宿主细胞中的用途。

此外，本发明涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在制备药物中的用途。以及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在制备用于治疗遗传疾病，优选单基因疾病，更优选单基因隐性疾病，最优选苯丙酮尿症、尿黑酸症、莱伯先天性黑矇、无脉络膜或Stargardt病的药物中的用途。

此外，本发明涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞用于遗传修饰原代细胞，优选原代真皮成纤维细胞以用于诱导多能干细胞(IPSC)的生成中的用途。优选地，所述原代细胞是小鼠原代细胞或人原代细胞。

本领域技术人员将术语“原代细胞”理解为与培养的细胞系的细胞相反；因此，优选地，原代细胞是衍生自活生物体并且已被培养至多20代，更优选至多15代，甚至更优选至多10代，还更优选至多5代的细胞。最优选地，原代细胞是直接衍生自生物，优选小鼠或人的组织的细胞。

术语“干细胞”也被技术人员理解为涉及具有分化成至少两种细胞类型，优选至少五种细胞类型，更优选至少一种完整细胞谱系的潜力的未分化或低分化的细胞。优选地，干细胞是全能干细胞，更优选地是多能干细胞。术语“诱导多能干细胞”或“IPSC”涉及衍生自分化的细胞，优选分化的原代细胞的多能干细胞。生成IPSC的方法是本领域已知的，并且优选包括在细胞中表达四种转录因子(例如，来自Takahashi等人，(2006)，Cell.126(4)：663)。

本发明还涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在胚胎干细胞的遗传修饰中的用途。本发明还涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在制备用于治疗遗传疾病，优选单基因病，更优选单基因隐性疾病，最优选苯丙酮尿症、尿黑酸症、莱伯先天性黑矇、无脉络膜或Stargardt病的药物中的用途，其中所述药物包含宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的多核苷酸。

本发明还涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在干细胞的遗传修饰以生成转基因动物中的用途。本发明还涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在生产转基因动物中的用途。

本文所使用的术语“转基因动物”涉及包含至少一种异源多核苷酸的动物，优选通过基因工程方法引入所述动物。优选地，转基因动物包含至少一个，更优选至少10个，还更优选至少1000个，甚至更优选至少10000个包含根据本发明的多核苷酸的细胞。

此外，本发明涉及根据本发明的多核苷酸、根据本发明的组合物和/或根据本发明的宿主细胞在通过原核注射对单细胞胚胎进行遗传修饰中的用途。

如本领域技术人员所理解的，术语“原核注射”涉及将遗传物质，优选本发明的多核苷酸注射到受精卵母细胞的核中，优选产生转基因动物。

其他定义：

AF：无抗生素。

amp：氨苄青霉素。

ampR：氨苄青霉素抗性基因。

抗生素选择标记：赋予对抗生素抗性的基因，例如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、四环素抗性基因。

ApoB：载脂蛋白B

大约：如本文所使用的，术语“大约”或“约”，应用于一个或多于一个目标值，是指与所述参考值相同或相似的值。

细菌区域：在细菌宿主中扩增和选择所需的质粒载体区域。

bp：碱基对

ccc：共价封闭环。

cI：λ阻遏物。

cITs857：进一步掺入了赋予温度敏感性的C到T(Ala到Thr)突变的λ阻遏物。cITs857是28℃至30℃时的功能阻遏物，但在37℃至42℃时无活性。也称为cI857。

CatR：氯霉素抗性基因。

cmv：巨细胞病毒。

E.coli：大肠杆菌，革兰氏阴性细菌。

EGFP：增强的绿色荧光蛋白。

ELE40：抗阻遏元件元件40，STAR40，公开于Kwaks等人，2003，Nat Biotechnol.21：553

EP：电穿孔。

建立效率：转染后其中自复制非整合型附加体型S/MAR表达载体稳定地保留为附加体的细胞百分比。

真核表达载体：使用RNA聚合酶I、II或III启动子在靶真核细胞或生物中表达mRNA、蛋白质抗原、蛋白质治疗剂、shRNA、RNA或微RNA基因的载体。

真核区域：在目标生物中编码真核序列和/或质粒功能所需序列的质粒区域。这包括在包含RNA Pol II增强子、启动子、转基因和poly-A序列的目标生物中表达一种或多于一种转基因所需的质粒载体区域。这也包括使用RNA Pol I或RNA Pol III启动子、RNA PolI或RNA Pol III表达的转基因或RNA在目标生物中表达一种或多于一种转基因所需的质粒载体区域。真核区域可任选地包括其他功能序列，例如真核转录终止子、超螺旋诱导的DNA双链不稳定(SIDD)结构、S/MAR、边界元件等。

外显子：RNA剪接除去内含子后，完成转录并存在于成熟mRNA产物中的基因编码的核苷酸序列。

表达增强子：改善相邻启动子表达的DNA序列。例如，如Saunders等人，2015 PloSOne 10：e0120096中所述，Ele40、UCOE、抗阻遏元件或稳定抗阻遏(STAR)元件

表达载体：用于在目标生物中表达mRNA、蛋白质抗原、蛋白质治疗剂、shRNA、RNA或微RNA基因的载体。

g：克，kg表示千克

目的基因：在目标生物中表达的基因。包括编码蛋白质或肽抗原、蛋白质或肽治疗剂的mRNA基因，以及编码RNA治疗剂的mRNA、shRNA、RNA或微RNA，以及编码RNA疫苗的mRNA、shRNA、RNA或微RNA等。

GFP：绿色荧光蛋白。

Hr：小时。

ID：皮内。

IM：肌内。

免疫应答：抗原反应性细胞(例如抗原反应性T细胞)或抗体(例如抗原反应性IgG)应答。

内含子：转录并随后通过RNA剪接从成熟的mRNA产物中除去的基因编码的核苷酸序列。

ITR：反向终端重复。

kan：卡那霉素。

kanR：卡那霉素抗性基因。

Kd：千道尔顿。

科扎克序列：优化的共有DNA序列gccRccATG(R＝G或A)位于ATG起始密码子的上游，其确保有效的翻译起始。

MFI：中等荧光强度。

小环：共价封闭的环状质粒衍生物，其中通过体内或体外位点特异性重组或体外限制性内切酶消化/连接从亲本质粒中除去了细菌区域。小环载体在细菌细胞中不能复制。

mRNA：信使RNA。

mSEAP：鼠分泌的碱性磷酸酶。

NA：不适用。

NanoplasmidTM载体：具有细菌区域的载体，所述细菌区域将RNA选择标记与R6K、ColE2或ColE2相关的复制起点结合在一起。例如，NTC9385C、NTC9685C、NTC9385R、NTC9685R载体和修饰描述于Williams，2014.DNA plasmids with improved expression，世界专利申请WO2014035457中，其通过引用并入本文。

非整合型慢病毒载体：具有突变的整合酶和S/MAR的慢病毒载体，用于维持附加体型LTR环，如Verghese等人，2014 Nucleic Acids Research 42：e53中所述的那些。

NP：纳米质粒。

NTC8385：NTC8385、NTC8485和NTC8685质粒是无抗生素的pUC起点载体，其包含短RNA(RNA-OUT)选择标记，而不是例如kanR的抗生素抗性标记。这些基于RNA-OUT的无抗生素载体的产生和应用描述在Williams，JA 2008世界专利申请WO2008153733中，并通过引用并入本文。

NTC8485：NTC8485是无抗生素的pUC起点载体，其包含短RNA(RNA-OUT)选择标记，而不是例如kanR的抗生素抗性标记。NTC8485的创建和应用描述在Williams，JA 2010美国专利申请20100184158中，其通过引用并入本文。

NTC8685：NTC8685是无抗生素的pUC起点载体，其包含短RNA(RNA-OUT)选择标记，而不是例如kanR的抗生素抗性标记。NTC8685的创建和应用描述在Williams，同上，2010中，其通过引用并入本文。

NTC9385R：在通过引用并入本文的Williams，同上，2014中描述的NTC9385R纳米质粒TM载体具有间隔区，其编码NheI-trpA终止子-R6K起点RNA-OUT-KpnI细菌区域(SEQ IDNO：8)，其通过侧面为NheI和KpnI位点连接至真核区域。

OD600：600nm处的光密度。

PBS：磷酸盐缓冲溶液。

PCR：聚合酶链反应。

pDNA：质粒DNA。

pINT pR pL载体：pINT pR pL attHK022整合表达载体描述在Luke等人，2011 MolBiotechnol 47：43中，其通过引用并入本文。待表达的目标基因被克隆到pL启动子的下游。该载体编码温度诱导型cI857阻遏物，允许热诱导目标基因表达。

PL启动子：λ左侧启动子。PL是被结合至OL1、OL2和OL3阻遏物结合位点的cI阻遏物所抑制的强启动子。温度敏感的cI857阻遏物允许通过热诱导来控制基因表达，因为cI857阻遏物在30℃时是有功能的，并且可以抑制基因表达，但在37℃至42℃时，阻遏物是无活性的，因此继续表达基因。

PL(OL1 G至T)启动子：λ左侧启动子。PL是被结合至OL1、OL2和OL3阻遏物结合位点的cI阻遏物所抑制的强启动子。温度敏感的cI857阻遏物允许通过热诱导来控制基因表达，因为cI857阻遏物在30℃时是有功能的，并且可以抑制基因表达，但在37℃至42℃时，阻遏物是无活性的，因此继续表达基因。cI阻遏物与OL1的结合因OL1的G到T突变而降低，导致启动子活性在30℃和37℃至42℃下增加，如Williams，同上，2014年所述。

质粒：与染色体DNA分离的额外染色体DNA分子，能够独立于染色体DNA复制

质粒拷贝数：每个细胞中质粒的拷贝数。质粒拷贝数的增加增加了质粒的产量。

Pol：聚合酶。

poly-A：多腺苷酸化信号或位点。多腺苷酸化是将poly(A)尾巴添加到RNA分子。聚腺苷酸化信号包含被RNA切割复合物识别的序列基序。大多数人的多腺苷酸化信号包含AAUAAA基序，并带有其5′和3′的保守序列。常用的poly-A信号衍生自兔β球蛋白(RBG)、牛生长激素(BGH)、SV40早期或SV40晚期poly-A信号。

pUC起点：pBR322衍生的复制起点，具有从G到A的转变，在高温下增加拷贝数，并缺失ROP负调控子。

无pUC：不包含pUC起点的质粒。可以包括pUC起点的非复制性片段，例如RNAI选择标记。

pUC质粒：含有pUC起点的质粒。

PuroR：嘌呤霉素抗性基因。

R6K质粒：NTC9385R、NTC9685R、NTC9385R2-O1、NTC9385R2-O2、NTC9385R2a-O1、NTC9385R2a-O2、NTC9385R2b-O1、NTC9385R2b-O2、NTC9385Ra-O1、NTC9385Ra-O2、NTC9385RaF和NTC9385RbF载体以及修饰和可选的含R6K复制起点的载体描述于Williams，同上，2014中，其通过引用并入本文。本领域已知的可选的R6K载体包括但不限于pCOR载体(Gencell)、无pCpG载体(Invivogen)和包含pGM169的牛津大学无CpG载体。

R6K复制起点：被R6K Rep蛋白特异性识别以启动DNA复制的区域。包括但不限于公开为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的R6Kγ复制起点序列和无CpG版本(例如SEQ ID NO：3)，描述于Drocourt等人，美国专利7244609中，其通过引用并入本文。R6K复制起点-RNA-OUT细菌区域：包含用于增殖的R6K复制起点和RNA-OUT选择标记(例如SEQ IDNO：8；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ IDNO：14；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17)。

Rep：复制

复制中间体：质粒复制早终止产生的线性DNA片段

Rep蛋白依赖性质粒：复制依赖于Trans中提供的复制(Rep)蛋白的质粒。例如，R6K复制起点、ColE2-P9复制起点和ColE2相关的复制起点质粒，其中Rep蛋白从宿主菌株基因组表达。许多另外的Rep蛋白依赖性质粒是本领域已知的，其中许多总结于del Solar等人，同上，1998中，其通过引用并入本文。

逆转录病毒载体：可以感染分裂细胞的整合型病毒载体。也称为转移质粒。质粒编码侧面为表达单位的逆转录病毒LTR。转移质粒与制备病毒颗粒所需的包膜和包装质粒一起转染到生产细胞中。

RNA-IN：插入序列10(IS10)编码的RNA-IN，其是与RNA RNA-OUT的一部分互补和反义的RNA。当将RNA-IN克隆到mRNA的非翻译前导序列中时，将RNA-IN退火为RNA-OUT会减少RNA-IN下游编码基因的翻译。

RNA-IN调节的选择标记：染色体表达的RNA-IN调节的选择标记。在质粒携带的RNA-OUT反义阻遏物RNA(SEQ ID NO：6)的存在下，RNA-IN下游编码的蛋白质的表达被抑制。构造RNA-IN调节的选择标记，使得RNA-IN调节1)对所述细胞本身，或者通过产生有毒物质(例如SacB)具有致死性或毒性的蛋白质，或2)通过抑制对所述细胞的生长必不可少的基因(例如，由RNA-IN tetR阻遏物基因调控的murA必需基因)的转录具有致死性或毒性的阻遏蛋白。例如，Williams，同上，2008中描述了用于RNA-OUT质粒选择/增殖的染色体表达的RNA-IN-SacB细胞系，其通过引用并入本文。本领域中描述的替代选择标记可以代替SacB。

RNA-OUT：插入序列10(IS10)编码的RNA-OUT，其是与RNA-IN下游表达的转座子基因杂交并减少其翻译的反义RNA。可以修饰RNA-OUT RNA(SEQ ID NO：6)和染色体表达的互补RNA-IN SacB的RNA-IN-SacB细胞系的序列，以掺入替代的功能性RNA-IN/RNA-OUT结合对，例如描述于Mutalik等人，2012 Nat Chem Biol 8：447中的那些，包括但不限于RNA-OUTA08/RNA-IN S49对、RNA-OUT A08/RNA-IN S08对以及将RNA-OUT 5′TTCGC序列中的CG修改为非CpG序列的无CpG的修饰RNA-OUT A08。无CpG的RNA-OUT选择标记的实例，其中除去了RNA-OUT RNA中的两个CpG基序(其中一个存在于RNA-IN互补区域中)描述于Williams2015.Replicative minicircle vectors with improved expression.美国专利申请US2015/0275221中，其通过引用并入本文。可以使用多种替代取代来除去两个CpG基序(将每个CpG突变为CpA、CpC、CpT、ApG、GpG或TpG)以制备无CpG的RNA-OUT。

RNA-OUT选择标记：RNA-OUT选择标记DNA片段，其包含侧面为RNA-OUT RNA的大肠杆菌转录启动子和终止序列。RNA-OUT选择标记使用侧面为DraIII和KpnI限制性内切酶位点的RNA-OUT启动子和终止序列，并设计为染色体表达用于RNA-OUT质粒扩增的RNA-IN-SacB细胞系描述于Williams，同上，2008中，并通过引用并入本文。可以将RNA-OUT RNA(SEQID NO：6)两侧的SEQ ID NO：5中的RNA-OUT启动子和终止子序列替换为异源启动子和终止子序列。例如，RNA-OUT启动子可以被本领域已知的无CpG的启动子取代，例如I-EC2K启动子或P5/6 5/6或P5/6 6/6启动子，其描述于Williams，同上，2008中，并通过引用并入本文。SEQ ID NO：7给出了其中除去了RNA-OUT启动子中的两个CpG基序的2个CpG RNA-OUT选择标记。无CpG的RNA-OUT转录单位的实例，其中除去RNA-OUT RNA中的两个CpG基序(其中一个存在于RNA-IN互补区域)和RNA-OUT启动子中的两个CpG基序，描述于Williams，同上，2015中，并通过引用并入本文。可以使用Williams，同上，2008中描述的用于RNA-OUT质粒增殖的RNA-IN-SacB细胞系，选择掺有无CpG的RNA-OUT选择标记的载体用于蔗糖抗性。或者，可以修饰这些细胞系中的RNA-IN序列，使其包含1bp的变化，以完全匹配与RNA-IN互补的无CpG的RNA-OUT区域。

RNA聚合酶II启动子：启动子募集RNA聚合酶II来合成mRNA，大多数小核RNA和微RNA。例如，组成型启动子，例如人或鼠CMV启动子、延伸因子1(EF1)启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、其他物种的β-肌动蛋白启动子、延伸因子-1α(EF1α)启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人血清白蛋白(SA)启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、α-1抗胰蛋白酶(AAT)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、细胞色素P4502E1(CYP2E1)启动子等。载体还可以利用组合启动子，例如鸡β-肌动蛋白/CMV增强子(CAG)启动子、人或鼠CMV衍生的增强子元件结合延伸因子1α(EF1α)启动子、无CpG版本的人或鼠CMV衍生的增强子元件结合延伸因子1α(EF1α)启动子、白蛋白结合α-甲胎蛋白MERII增强子等，或本领域已知的多种组织特异性或诱导型启动子，例如肌肉特异性启动子肌肉肌酸激酶(MCK)和C5-12或肝脏特异性启动子ApoE-hAAT、载脂蛋白AI(ApoAI)等。

RNA聚合酶III启动子：募集RNA聚合酶III以合成tRNA、5S核糖体RNA和其他小RNA的启动子。例如I类启动子，如5s rRNA启动子，II类启动子，如tRNA启动子，III类启动子，如U6小核RNA启动子或H1核RNA酶P启动子等。

RNA选择标记：RNA选择标记是通过质粒表达的非翻译RNA，其调节染色体表达的靶基因以进行选择。这可能是通过质粒携带的无义抑制性tRNA，其调节无义可抑制的可选择的染色体靶标，如Crouzet J和Soubrier F 2005美国专利6977174所述，其通过引用并入本文。这也可以是质粒携带的反义阻遏RNA，通过引用包括在本文的非限制性列表包括抑制RNA-IN调节的靶标的RNA-OUT(Williams，同上，2008)、抑制RNAII调节的靶标的pMB1质粒起点编码的RNAI(Grabherr R，Pfaffenzeller I.2006美国专利申请US20060063232；Cranenburgh RM.2009；美国专利7611883)、抑制RNA II调节的靶标的IncB质粒pMU720起点编码的RNAI(Wilson IW，Siemering KR，Praszkier J，Pittard AJ.1997.J Bacteriol179：742-53)、抑制Hok调节的靶标的质粒R1的ParB基因座Sok、抑制flmA调节的靶标的F质粒的Flm基因座FlmB(Morsey MA，1999美国专利US5922583)。RNA选择标记可以是本领域已知的另一种天然反义阻遏RNA，例如在Wagner EGH，Altuvia S，Romby P.2002.Adv Genet46：361-98和Franch T和Gerdes K.2000.Current Opin Microbiol 3：159-64中描述的那些。RNA选择标记还可以是工程改造的阻遏RNA，例如表达为SgrS、MicC或MicF支架的合成小RNA，如Na D，Yoo SM，Chung H，Park H，Park JH，Lee SY.2013.Nat Biotechnol 31：170-4中所述。RNA选择标记还可以是工程改造的阻遏RNA，作为选择标记的一部分，其可抑制与待调控靶基因例如SacB融合的靶RNA，如Williams，同上，2015中所述。

ROP：启动子阻遏物。

RSM：RNA选择标记。

SA：剪接受体，共有序列YYYYYYYYYYYAGRW显示为SEQ ID NO：29。为创建有效剪接的SA位点，在剪接受体位点的上游包含一个剪接分支点(共有序列YTNAY)(见图1)。

SacB：编码枯草芽孢杆菌的结构基因。在蔗糖存在下，SacB在革兰氏阴性细菌中的表达是有毒性的。

SD：剪接供体，共有序列AGGTRAGT。

SEAP：分泌的碱性磷酸酶。

可选择标记：选择标记，例如卡那霉素抗性基因或RNA选择标记。

选择标记：选择标记，例如卡那霉素抗性基因或RNA选择标记。

SIDD：超螺旋诱导的DNA双链失稳(SIDD)结构。当这些位点被整合到载体中时，可以改变载体中其他失稳序列的敏感性，从而使其失稳。例如，在表达载体上添加SIDD位点可能会减少启动子的螺旋失稳，这可能会增加或降低启动子的活性，取决于启动子，因为一些启动子的表达随启动子的螺旋失稳而增加，而其他启动子的表达则随启动子螺旋失稳而下降。

shRNA：短发夹RNA。

S/MAR：支架/基质附着区，如本文其他地方所述。介导DNA附着于核基质的真核序列。

间隔区：如本文所使用的，间隔区是连接真核区域序列5′和3′端的区域。真核区域5′和3′端通常由质粒载体中细菌复制起点和细菌选择标记间隔开。

SR：间隔区。

SV40起点：包含复制起点的猿猴病毒40基因组DNA。

SV40增强子：猿猴病毒40基因组DNA，其包含72bp和任选的21bp增强子重复序列。

靶抗原：免疫原性蛋白质或肽表位，或蛋白质和表位的组合，可以针对其进行免疫应答。靶抗原可能来自传染病或过敏应用的病原体，也可能来自宿主生物体以用于癌症、过敏或自身免疫性疾病等应用。靶抗原在本领域中已被明确定义。一些实例描述于Williams，同上，2008中，其通过引用并入本文。

TE缓冲液：含有约10mM Tris pH 8和1mM EDTA的溶液。

TetR：四环素抗性基因。

转录终止子：细菌转录终止子：标记基因或操纵子转录末端的DNA序列，可能是内在的转录终止子或Rho依赖性转录终止子。对于内在终止子，例如trpA终止子，在转录物中形成发夹结构，破坏了mRNA-DNA-RNA聚合酶三元复合物。或者，Rho依赖性转录终止子需要RNA解旋酶蛋白复合物Rho因子来破坏新生的mRNA-DNA-RNA聚合酶三元复合物。真核转录终止子：poly-A信号不是“终止子”，而是在poly-A位点的内部切割，在3′UTR RNA上留下未封端的5′端用于核酸酶消化。核酸酶赶上了RNA Pol II并导致终止。通过引入RNA Pol II暂停位点可以在poly-A的短区域内促进终止(真核转录终止子)。暂停RNA Pol II可以使poly-A切割后引入3′UTR mRNA的核酸酶在暂停位点赶上RNA Pol II。本领域已知的非限制性真核转录终止子包括C2x4和胃泌素终止子。真核转录终止子可以通过增强mRNA的适当3′端加工来提高mRNA水平。

转染：将核酸递送到细胞中的方法[例如聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)、ISCOM、脂质体(liposomes)、类脂质体(niosomes)、病毒体、壳聚糖和其他可生物降解的聚合物、微粒、微球、纳米颗粒、纳米胶囊、电穿孔、核转染、压电渗透、声致穿孔、离子电渗疗法、超声、SQZ高速细胞变形介导的膜破裂、电晕等离子体、血浆促进递送、组织可耐受的血浆、激光微穿孔、冲击波能量、磁场、非接触磁渗透、基因枪、微针、微晶磨皮、流体动力递送、高压尾静脉注射等]如本领域已知的并且通过引用并入本文。

转基因：克隆到载体中以在靶生物中表达的目的基因。

ts：温度敏感的

μg：微克

μl：微升

UCOE：普遍存在的染色质开放元件，例如A2UCOE或最小衍生物，如Muller-Kuller等人，2015，Nucleic Acids Research 43：1577中所公开的。

UTR：mRNA的非翻译区(编码区的5′或3′)。

载体：基因传递载体，包括病毒(例如，α病毒、痘病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、与腺病毒有关的病毒、整合缺陷型慢病毒载体等)和非病毒(例如质粒、纳米质粒、MIDGE、转录活性PCR片段、微环、噬菌体等)载体。这些在本领域中是众所周知的，并通过引用包含在本文中。

载体主链：载体的真核区域和细菌区域，无转基因或靶抗原编码区域。

脊椎动物表达载体：使用RNA聚合酶I、II或III启动子在靶脊椎动物细胞或生物中表达mRNA、蛋白质抗原、蛋白质治疗剂、shRNA、RNA或微RNA基因的载体。

具体实施方式

当前技术一般涉及自复制非整合型附加体型脊椎动物表达载体方法和组合物，其改善附加体型复制和转基因表达。可以实践当前技术来改善载体例如非病毒载体和病毒载体(例如，附加体型整合缺陷型慢病毒载体、非整合型慢病毒载体、附加体型逆转录病毒载体等)的表达和附加体型复制。

改善的附加体型复制在本文中定义为与未掺入本技术的质粒相比，在体外或体内改善的非整合型附加体型载体的建立和/或维持。本文中将提高的质粒表达定义为提高的转基因表达水平和/或与不结合本技术的转基因编码质粒相比，表达在体外或体内的持续时间更长。应当理解，本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。

出人意料地发现，当前技术的质粒修饰方法提供了提供有效建立自复制非整合型附加体型载体的解决方案。

本文公开的载体方法和组合物是与非SD-SA版本相比具有改善的表达和/或附加体型建立(改善的性能)的3′UTR SD-SMAR-SA组合物。改善的性能不是S/MAR特异性的，因为在各种S/MAR上都可以观察到性能的提高。改进的性能也不是载体转录单位特异性的，因为可以观察到SD-SMAR-SA与各种启动子、5′UTR、转基因和poly-A信号连接的性能改善。在有或没有上游内含子的情况下观察到改善的性能。因此，本公开的3′UTR SD-SMAR-SA载体广泛适用于改善自复制非整合型附加体型脊椎动物表达载体的性能。

鉴于现有技术，与非SD-SA版本相比，所公开的3′UTR SD-SMAR-SA的改善的性能是出人意料的。例如，Le Hir等人，2003 Trends in Biochemical Sciences 28：215教导了‘Matsumoto等人[51]发现这些翻译作用高度依赖于内含子位置。在他们的研究中，放置在5′UTR中的内含子具有很高的刺激性，而放置在3′UTR中的相同内含子则将翻译抑制到相应无内含子mRNA的水平以下。’......‘尽管如此，对于对优化转基因表达感兴趣的研究人员而言，重要的是要注意内含子位置是重要的变量。除了可能抑制翻译外，3′UTR中的内含子还可以触发如下所述的mRNA的无义介导的衰变(NMD)，从而导致更低的蛋白质表达。’Barrett等人，2012 Cell.Mol.Life Sci.69：3613教导‘与5′UTR相比，3′UTR的内含子相对较少(5％)[21]。关于后移的哺乳动物基因中获得内含子的罕见情况的研究发现，这些基因的3′UTR中存在内含子会通过无义介导的衰变导致基因表达的下调[52]。这种对表达的负面影响为3′UTR内含子的低存在率提供了一种解释。尽管不限制本发明的应用，但在所公开的发明中添加侧面为剪接供体和剪接受体剪接位点可能具有预料不到的益处，其中3’UTR编码S/MAR序列。

如本文中所使用的，术语“序列同一性”是指任何给定查询序列例如SEQ ID NO：2和对象序列之间的同一性程度。对象序列可以例如与给定查询序列具有至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。为了确定百分比序列同一性，使用本领域中众所周知的任何合适的序列比对程序将查询序列(例如核酸序列)与一个或多于一个对象序列比对，例如计算机程序ClustalW(版本1.83，默认参数)，其允许在核酸序列的整个长度上进行核酸序列的比对(全局比对)。Chema等人，2003 Nucleic Acids Res.，31：3497-500。在一种优选的方法中，序列比对程序(例如，ClustalW)计算查询序列和一个或多于一个对象序列之间的最佳匹配，并将它们比对，以便可以确定同一性、相似性和差异。可以将一个或多于一个核苷酸的空位插入查询序列、对象序列或两者中，以最大化序列比对。对于核酸序列的快速成对比对，可以选择适合于特定比对程序的合适的默认参数。输出是反映序列之间关系的序列比对。为了进一步确定对象核酸序列与查询序列的百分比同一性，使用比对程序对序列进行比对，将比对中相同匹配的数目除以查询序列的长度，然后将结果乘以100。注意，百分比同一性值可以舍入为最接近的零点一。例如，将78.11、78.12、78.13和78.14舍入为78.1，而将78.15、78.16、78.17、78.18和78.19舍入为78.2。

现在转到附图，图1示出了pCI内含子(上)，剪接供体(SD)区域(中)以及分支点和剪接受体(SA)区域(下)的注释图。图2示出了干扰素βS/MAR(上图)和SD干扰素βS/MAR SA衍生物(中)以及其中内部AATAAA多腺苷酸化信号发生了突变的SD干扰素βS/MAR SA衍生物(下)的注释图。图3示出了侧面为SD和SA位点的干扰素βS/MAR衍生物M18的注释图。图4示出了侧面为SD和SA位点的805bp(上)或525bp(下)的apoB S/MAR的注释图。图5示出了pMAX-UCOE-coGFP P2A-PuroR-NP(pSMARt UCOE)载体的注释图。图6示出了NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SMAR-SV40 pA(NP-UCOE)和NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SDSMAR-SA SV40 pA(NP-UCOE-SP)载体的注释图。图7示出了NTC9385R-SP-UCOE-CMV-GFPSMARter(NP-SMARter-SP)和NTC9385R-SP-UCOE-CMV-GFP CMARter(NP-CMARter-SP)载体的注释图。图8示出了NTC9385R-UCOE EF1-coGFP SD-SMAR SA SV40 pA(NP-UCOE-EF1-SP)和NTC9385R-UCOE EF1-coGFP-SD SMAR R6K-R-OUT-SA pA(UCOE-EF1-SP-NP)载体的注释图。图9示出了NTC9385R-SP-ELE40-CMV-GFP CMARter(NP-Ele40-CMARter-SP)载体的注释图。图10出了建立的具有和不具有侧面为SD和SA位点的S/MAR载体的提高的表达。左图：用具有/不具有剪接连接的S/MAR载体建立的HEK293T细胞的MFI。载体在具有(纳米-S/MAR-剪接＝NP-UCOE-SP；NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SD SMAR-SA SV40 pA图6)或不具有(NP-UCOE；NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SMAR-SV40 pA，图6)两侧为SD和SA位点的S/MAR的3′UTR中含有NP细菌区域、基因组绝缘子UCOE、由CMV启动子驱动的表达盒GFP-2A-PuroR和干扰素βS/MAR。右图：通过实时PCR分析证实了转录表达的改善。将转基因GFP的表达相对于管家基因GAPDH归一化。图11示出了建立的具有和不具有两侧为SD和SA位点的S/MAR载体的提高的表达。已建立的细胞(HEK293T和原代小鼠胚胎成纤维细胞)的MFI，其中的载体带有通过剪接连接侧接的不同S/MAR。载体名称如图5、图6和图7所示。图12示出了具有和不具有两侧为SD和SA位点的S/MAR载体的改进的建立。在HEK293T中进行的集落形成测定，其中的载体带有两个不同的S/MAR(干扰素βS/MAR；ApoB S/MAR，805bp)，两侧为或两侧不为SD和SA位点。pEPI是带有3′UTR干扰素βS/MAR的CMV启动子质粒载体。

实施例

下面的实施例进一步说明了本申请技术的方法。这些仅作为示例提供，而不旨在限制本公开的范围。

实施例1：pUC和R6K复制起点质粒的产生

RNA-OUT无抗生素选择标记背景：如Williams，同上，2008中所述，在含有噬菌体λ附着位点染色体整合了pCAH63-CAT RNA-IN-SacB(P5/6 6/6)的大肠杆菌菌株中进行无抗生素选择。SacB(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶)是一种反向选择标记，在蔗糖存在下对大肠杆菌细胞具有致死性。质粒编码的RNA-OUT抑制了RNA-IN-SacB转录物中SacB的翻译。通过抑制SacB介导的致死性，这有助于在蔗糖存在下进行质粒选择。

R6K起点载体的复制和生产背景：R6Kγ质粒复制起点需要质粒复制蛋白

它作为复制起始单体与多个重复的“重复子(iteron)”结合。使用条件复制起点例如R6Kγ需要专门的细胞系进行扩增，这增加了安全边际，因为如果将载体转移到患者的内源菌群中，该载体将不会复制。

高度最小化的R6Kγ衍生的复制起点(SEQ ID NO：1)，其包含复制所需的核心序列，描述于Williams，同上，2014中，其通过引用并入本文。在Williams，同上，2014中描述了NTC9385R纳米质粒TM骨架，该骨架包括该最小化的R6K起点和间隔区中的RNA-OUT AF选择标记，在此通过引用并入本文。Williams，同上，2014中描述了表达噬菌体HK022附着位点的宿主菌株，其整合了pL启动子可热诱导的

P42L、P106L和F107S高拷贝突变复制(Rep)蛋白，用于选择和扩增R6K起点纳米质粒TM载体。这是附加的纳米质粒TM安全因子，因为R6K起点载体只能在表达Rep蛋白的工程改造的大肠杆菌宿主菌株中复制。

摇瓶生产：在大肠杆菌菌株DH5α[F-Ф80lacZAM15Δ(lacZYA-argF)U169 recA1endA1 hsdR17(rK-，mK+)phoA supE44λ-thi-1 gyrA96 relA1](Invitrogen，Carlsbad CA)中进行pUC起点质粒生产。在宿主菌株NTC940211 DH5αattλ：：P5/6 6/6-RNA-IN-SacB，catR；attHK022：：pL(OL1-G to T)P42L-P106I-F107S或NTC1050811 DH5αattλ：：P5/6 6/6-RNA-IN-SacB，catR；attHK022：：pL(OL1-G to T)P42L-P106I-F107S P113S(P3-)，SpecRStrepR；

tetR中进行R6K起点-RNA-OUT蔗糖选择纳米质粒TM载体的生产。使用专有的质粒+摇瓶培养基进行摇瓶生产。从甘油储存或集落开始接种培养，并划线到含有50μg/mL抗生素(用于ampR或kanR选择质粒)或6％蔗糖(用于RNA-OUT选择质粒)的LB培养基琼脂平板上。平板在30℃至32℃下生长；将细胞重悬于培养基中，并用于为500mL的质粒+摇瓶提供OD600约2.5的接种量，对于ampR或kanR选择质粒摇瓶中含有50μg/mL的抗生素或摇瓶中含有0.5％的蔗糖以选择RNA-OUT质粒。摇动培养瓶至生长饱和。

实施例2：S/MAR载体构建

pNTC-NP1、pNTC-NP2、pNTC-NP3、pNTC-NP4、pNTC-NP5、pNTC-NP6、pNTC-NP7载体编码克隆到基于pUC57的载体的多接头区域中的R6Kγ起点-RNA-OUT细菌复制-选择区域(SEQID NO：8)。pNTC-3xCpG NP1载体编码克隆到基于pUC57的载体的多接头区域的1CpG R6Kγ起点-2 CpG RNA-OUT细菌复制-选择区域(SEQ ID NO：9)。每个载体具有不同的侧接的限制性内切位点，可用于将目标载体改造为R6K复制-RNA-OUT选择。表1显示了pNTC-NP 1-7载体和pNTC-3xCpG NP1的侧接R6K-RNA-OUT插入片段的5′和3′多接头序列。

表1：两侧为R6K起点-RNA-OUT选择标记载体的pNTC多克隆位点

a分离R6K和RNA-OUT的序列CACGTTGTG的非回文独特的3bp的NNN黏性末端DraIII位点(CACNNNGTG)可用于在定向多片段连接反应中从分开的bpNTC载体组装R6K和RNA-OUT。S/MAR载体pUC起点-抗生素选择细菌骨架改造为R6K-RNA-OUT(即，纳米质粒、NP、载体)是通过：

1)选择两侧为目标S/MAR载体中pUC起点和抗生素选择标记区域的限制性内切位点；

2)鉴定pNTC-NP相配的多接头-R6K-RNA-OUT多接头盒(pNTC-NP1、2、3、4、5、6或7；表1)；

3)排除pUC起点的抗生素选择标记区域，并使用选择的限制性内切消化方法和标准连接酶介导的克隆替换选择的R6K起点RNA-OUT区。

在某些情况下，使用非回文的DraIII接头位点，将R6K起点和RNA-OUT单位从独立的限制性内切片段以多片段连接的形式进行组装(参见表1)。

显示了原始pUC起点-抗生素选择标记载体(例如pSMARt UCOE；图5)和改造后的R6K起点-RNA-OUT无抗生素的选择标记载体(例如NP-UCOE：图6)的示例载体图和载体特性。

SD-S/MAR-SA 3′UTR如下合成基因制成。将具有5′BglII和NsiI克隆位点的剪接供体位点(SEQ ID NO：25)和3′XhoI克隆位点(图1)掺入S/MAR的5′端中，而具有5′EcoRI和3′BamHI克隆位点的剪接受体位点(SEQ ID NO：26)掺入S/MAR的3′端中(图1)。这些基因在Genscript(Piscataway，NJ)合成，并使用标准限制性内切片段连接介导的克隆在现有SMAR-NP载体中进行克隆代替S/MAR。例如，将干扰素βS/MAR(SEQ ID NO：18)(例如NP-UCOE载体，图6)替换为剪接供体-干扰素βS/MAR-剪接受体(SEQ ID NO：19)(例如NP-UCOE-SP载体，图6；NP-UCOE-EF1-SP，图8)或剪接供体-干扰素βS/MAR(-AATAAA)-剪接受体(SEQ IDNO：20)或剪接供体-干扰素βM18 S/MAR-剪接受体(SEQ ID NO：21)。剪接供体干扰素βS/MAR(-AATAAA)用于除去具有AATATT(T)MAR基序的S/MAR编码的AATAAA(N)转录终止信号(图2)。将805bp的ApoB S/MAR替换为剪接供体-805bp ApoB S/MAR-剪接受体版本(SEQ ID NO：22)(例如，NP-SMARter-SP，图7)，而525bp ApoB S/MAR替换为剪接供体-525bp ApoB S/MAR-剪接受体版本(SEQ ID NO：23)(例如，NP-CMARter-SP，图7；NP-Ele40-CMARter-SP，图9)。通过标准限制性内切片段连接介导的克隆，制备了具有其他转基因、启动子、5′UTR内含子或ELE40或UCOE元件的其他NP构建体。所有构建体均通过限制性内切酶消化和测序验证正确。

实施例3：瞬时转染后S/MAR载体表达

黏附的HEK293(人类胚胎肾脏)和A549(人肺癌)细胞系得自美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞系在Dulbecco改良的Eagle培养基/F12中扩增，该培养基含有10％胎牛血清并使用Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)试剂和常规方法分裂(0.25％胰蛋白酶-EDTA)。对于转染，将细胞接种在24孔组织培养皿中。按照制造商的说明(Invitrogen)，使用Lipofectamine 2000将质粒转染到细胞系中。

通过将细胞重悬于细胞裂解缓冲液(CelLytic M，Sigma，St Louis，MO，USA)中来制备用于EGFP测定的总细胞裂解物，通过在37℃下孵育30分钟裂解细胞，然后在-80℃下进行冻融循环。通过离心澄清裂解的细胞，并通过FLX800微板荧光读取器(Bio-Tek，Winooski，VT，USA)测定上清液的EGFP。结果总结于表2-4中。

表2：转染至A549和HEK293细胞系后S/MAR载体的瞬时表达

a呈现的结果是转染后2天的平均荧光单位±标准偏差

表3：转染至A549和HEK293细胞系后S/MAR载体的瞬时表达

a呈现的结果是转染后2天的平均荧光单位±标准偏差

表2和3中显示的结果证明，与没有SD/SA位点的人IFNB SMAR相比，两侧为SD/SA的具有UCOE-EF1启动子的无内含子coGFP转基因转录单位的人IFNB SMAR在HEK293和A549细胞系中均提高了表达。在2种SD/SA配置(两侧为SMAR，或两侧为SMAR+R6K-RNA-OUT NP细菌区域)中观察到了改善的表达。侧面为SD/SA的M18 SMAR(源自人IFNB SMAR)比侧面为SD/SA的等效人IFNB SMAR具有更高的表达。

此外，表3中的结果显示了UCOE-CMV启动子pCI内含子coGFP转基因转录单位中表达的提高(即，使用两个不同的启动子，带有或不带有5′UTR编码的内含子的表达得到改善)。在(SV40或RBG衍生的)不同的多腺苷酸化信号中也观察到表达的改善。

表4：转染至A549和HEK293细胞系后S/MAR载体的瞬时表达

a呈现的结果是转染后2天的平均荧光单位±标准偏差

表4所示结果进一步证明，使用UCOE-EF1启动子无内含子coGFP转基因转录单位，和UCOE-CMV启动子pCI内含子coGFP转基因转录单位，与没有SD/SA位点的人IFNB SMAR相比，侧面为SD/SA的人IFNB SMAR在HEK293和A549细胞系中的表达均有改善(即，使用两个不同的启动子，具有或不具有5′UTR编码的内含子改善表达)。另外，侧面为SD/SA的CMARterSMAR比侧面为SD/SA的人IFNB SMAR具有更高的表达。此外，用AATATT(T)MAR基序替换S/MARAATAAA(N)转录终止信号产生功能性S/MAR，这表明该方法可用于从本领域中描述的S/MAR元件中除去转录终止子信号。可以用替代基序代替AATATT(T)，例如，如Liebeich等人，同上，2002所述，S/MAR中富集了富含AT的基序。该AATAAA基序替换方法允许在本发明的3’UTR中利用本领域的改变的S/MAR，而不会通过AATAAA基序介导的过早转录终止而降低表达。

总体而言，结果表明，本发明的载体解决了本领域描述的基于S/MAR的载体的次优表达水平限制。

实施例4：附加体建立后S/MAR载体表达

在细胞系HEK293中附加体型建立后，确定NP-UCOE(图6)和NP-UCOE-SP(图6)的表达。使用标准方案建立细胞，该方案需要应用嘌呤霉素(0.5μg/ml)持续一周，之后扩增至少30天(Wong和Harbottle，2013Mol Ther Nucleic Acids 2：e115)。通过FACS分析已建立的群的报告基因GFP的表达，并通过qPCR评估GFP RNA水平。结果(图10)表明，与HEK293细胞系中以附加体型建立后的无SD/SA位点的人IFNB SMAR相比，侧面为SD/SA的人IFNB SMAR改善了mRNA转录和GFP转基因表达。在HEK293细胞系和原代小鼠胚胎成纤维细胞中附加体型建立后，第二个实验表明，与非SD-SA载体NP-UCOE(图6)相比，SD-S/MAR-SA载体NP-UCOE-SP(图6)，NP-SMARter-SP(图7)和NP-CMARter-SP(图7)的GFP转基因表达有所改善。

建立的细胞系的这些结果表明，本发明的载体解决了本领域描述的基于S/MAR的载体的基因沉默限制。

实施例5：附加体建立后S/MAR载体表达

还通过集落形成测定法(Wong和Harbottle，同上，2013)，测试了使用具有和不具有侧面为SD和SA位点的带有两个不同S/MAR(干扰素βS/MAR；ApoB S/MAR，805bp)的载体在HEK293T中建立细胞的效果。结果表明(图12)，使用侧面为SD和SA位点的干扰素βS/MAR和ApoB S/MAR，大大提高了产生建立的细胞的效果(即产生最高数目集落)。这些结果表明，本发明的载体解决了本领域描述的基于S/MAR的载体的低建立率限制。

实施例6：

建立和分析转基因细胞群的效率(图1)

使用pS/MARt在集落形成试验中评估了稳定表达细胞生成的效率(图4，SEQ IDNO：41)。DNA递送后，通过FACS分选(FACS Aria II)分离出GFP转基因表达阳性的细胞，将100个细胞接种到6cm的细胞培养皿中。然后将它们在0.5μg/ml嘌呤霉素存在下培养4周。4周后，将细胞用PFA固定，并将集落用结晶紫染色。集落的数量被认为是建立载体的效率，即形成的集落数量相比于接种的FACS分选的细胞数量。稳定的细胞系的产生非常有效，超过40％的转染细胞得以建立(图1A)。通过流式细胞术估计表达转基因(GFP)的细胞数量。如图1b)所示，pS/MARt产生修饰的群，其中转基因的表达是均质的，而没有大量的阴性细胞。

实施例7：

从已建立的细胞群中质粒拯救pS/MARt载体(图2)

确定在修饰的细胞中DNA载体是否在附加体型状态下并且具有完整性的一种有效方法是验证它们是否可以被完整保存到未处理的细菌中。为此，在抗生素嘌呤霉素(0.5μg/ml)存在下，将经质粒pS/MARt修饰的持续建立的细胞系培养1周，并在不使用抗生素的情况下扩增至少30天，以评估载体的完整性。使用Blood&Tissue DNAeasy试剂盒(Qiagen)从细胞中制备总DNA，并将其转化进入DH10B大肠杆菌细胞。将细菌在含卡那霉素(50μg/ml)的LB-琼脂平板上生长。取12个集落在含卡那霉素的液体LB培养基中生长，然后用MiniprepKit(Qiagen)提取质粒DNA。为了进行分析，将DNA mini制备物在37℃下用限制性内切酶BamHI(Thermo Fisher)消化10分钟，并在1％琼脂糖凝胶上处理获得限制性内切图谱。作为对照，将在构建过程开始时用于转染细胞的DNA用相同的酶消化并作为参考。这些凝胶说明完整的pS/MARt DNA可以从稳定的经修饰的细胞系中分离出来，并且在每种情况下，该DNA与最初转染的载体相同。

实施例8：将pS/MARt载体以附加体型维持在修饰的细胞中(图3)

为了进一步证明pS/MARt载体作为附加体修饰哺乳动物细胞，通过DNA印迹分析确定了结构。分析DNA转染后培养至少30天的Hek293T细胞群。用Blood&Tissue DNAeasy试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA，并在37℃下用限制酶BamHI(NEB)消化过夜。然后在1％的琼脂糖凝胶上分离出总细胞DNA，并转移到尼龙膜上。与该载体的GFP基因相对应的寡核苷酸被用于生成放射性探针，用于检测细胞DNA中的pS/MARt DNA。样品中存在与对照载体大小相同的单个条带，证明了已建立的哺乳动物细胞群中pS/MARt的附加体型的状态。涂片和/或替代条带的缺失表明载体没有重排或整合到细胞基因组中。

本文公开的载体方法和组合物以及以上给出的评估证明，与非SD-SA版本相比，3′UTR SD-SMAR-SA组合物改善了表达和/或附加体型建立。改善的性能不是S/MAR特异性的，因为在各种S/MAR上都可以观察到性能的提高。改进的性能也不是载体转录单位特异性的，因为可以观察到SD-SMAR-SA与各种启动子、5′UTR、转基因和poly-A信号连接的性能改善。在有或没有上游内含子的情况下观察到改善的性能。因此，本公开的3′UTR SD-SMAR-SA载体广泛适用于改善自复制非整合型附加体型脊椎动物表达载体的性能。

本技术的载体的本领域中描述的任何内含子剪接供体位点都可以替代为pCI内含子衍生的剪接供体。同样，本领域描述的任何内含子剪接受体位点都可以替代为pCI内含子衍生的剪接受体。例如，剪接供体和受体可以衍生自Williams，同上，2014中公开的HTLV-IR-兔β球蛋白杂交内含子、HTLV-IR CMV杂交内含子、CMV内含子、无CpG内含子I 140、人β球蛋白鼠IgG嵌合内含子、腺病毒前导序列-鼠IgG嵌合内含子、兔β球蛋白内含子、截短的CMV内含子、CAG(鸡β肌动蛋白-兔β球蛋白)内含子、CMV-兔β球蛋白杂交内含子或本领域中描述的其他内含子。

本领域中描述的各种替代S/MAR也可以用于本技术的载体中。如果需要，可以通过本文所述的基序替换来除去内部poly-A位点。

载体可编码不同于本文提供的实例的多种转基因，例如，多种病原体的抗原基因，或治疗性基因，例如缺氧诱导因子、角质形成细胞生长因子、因子IX、因子VIII、范可尼贫血补充组A蛋白质、尿黑酸双加氧酶等，或多蛋白，例如重编因子多蛋白。

同样，载体可以利用不同于本文提供的CMV和延伸因子1(EF1)启动子实例的多种RNA Pol II启动子，例如组成型启动子，例如鸡β-肌动蛋白启动子、其他物种的β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人血清白蛋白(SA)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、细胞色素P4502E1(CYP2E1)启动子等。载体还可以利用组合启动子，例如鸡β-肌动蛋白/CMV增强子(CAG)启动子、人或鼠CMV衍生的增强子元件结合延伸因子1α(EF1α)的启动子、无CpG版本的人或鼠CMV衍生的增强子元件结合延伸因子1α(EF1α)的启动子、白蛋白启动子结合α-胎蛋白MERII增强子等，或本领域已知的组织特异性或诱导型启动子的多样性，例如肌肉特异性启动子肌肉肌酸激酶(MCK)和C5-12或肝特异性启动子载脂蛋白AI(ApoAI)、α-1抗胰蛋白酶(AAT)启动子、AAT-TTR启动子、SERP-TTR启动子和ApoE-hAAT或T细胞启动子，例如hTCR8.1、CD4和WASp。

另外，在纳米质粒主链中，可以利用R6K复制起点的各种方向和RNA选择标记。例如，可以使用R6K复制起点的八个起点中的任何一个，以及本技术载体中的RNA选择标记(即←Pol III复制起点RSM→；←Pol III复制起点←RSM；Pol III复制起点→RSM→；Pol III复制起点→←RSM；←RSM Pol III复制起点→；←RSM←Pol III复制起点；RSM→Pol III复制起点→；RSM→←Pol III复制起点)。此外，本领域已知的多种RNA选择标记可以代替RNA-OUT。因此，读者将发现，本技术的改善的自复制非整合型附加体型脊椎动物表达载体提供改善非整合型附加体型复制质粒编码的转基因表达的方法。

因此，本公开的范围不应由所示出的实施例确定，而应由所附权利要求书确定。

Claims

1.一种用于在靶脊椎动物细胞中提高自复制非整合型附加体型S/MAR表达载体的表达和建立效率的方法，其包括以下步骤：

a.提供附加体型S/MAR表达载体，其包含：

i.细菌复制选择区域，其包含细菌复制起点和选择标记；

ii.用于在脊椎动物细胞中表达转基因的转录单位，其包含启动子、5’UTR、转基因和3’UTR；

iii.位于所述3’UTR内的S/MAR插入物；和

b.修饰附加体型S/MAR表达载体，使得S/MAR在所述3’UTR内侧面为5’剪接供体位点和3’剪接受体位点，从而得到的自复制非整合型附加体型S/MAR表达载体提高了脊椎动物细胞转染后的表达和建立效率。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述S/MAR插入物包含内部AATAAA转录终止基序。

3.根据权利要求2所述的方法，其中将所述S/MAR中的所述AATAAA转录终止基序替换为AATATT基序。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述S/MAR选自人干扰素βS/MAR、M18 S/MAR、载脂蛋白B S/MAR。

5.根据权利要求1所述的方法，其中侧面为5’剪接供体位点和3’剪接受体位点的所述SMAR与选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的序列具有至少95％的序列同一性。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌复制起点是R6Kγ复制起点。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌复制起点是与选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少95％序列同一性的R6Kγ复制起点。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择标记是与选自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的序列具有至少95％序列同一性的RNA-IN调节RNA-OUT功能变体。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择标记是RNA-OUT RNA选择标记，其编码与SEQ ID NO：6具有至少95％序列同一性的RNA-IN调节RNA-OUT RNA。

10.根据权利要求1所述的方法，其中包含细菌复制起点和选择标记的所述细菌复制选择区域是R6K起点-RNA-OUT RNA选择标记细菌复制选择区域，其与选自SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的序列具有至少95％的序列同一性。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述5’UTR还编码内含子。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述转录单位还编码位于启动子上游的表达增强子。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述表达增强子与选自SEQ ID NO：27和SEQ IDNO：28的序列具有至少95％的序列同一性。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述剪接供体位点与SEQ ID NO：25具有至少95％的序列同一性。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述剪接受体位点与SEQ ID NO：26具有至少95％的序列同一性。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述自复制非整合型附加体型S/MAR表达载体选自质粒载体、纳米质粒载体、整合缺陷型慢病毒载体和非整合型慢病毒载体。

17.一种包含至少一种启动子和S/MAR元件的多核苷酸，其中所述S/MAR元件位于所述启动子的下游，并且其中所述S/MAR元件的核酸序列(S/MAR序列)在至多200个核苷酸的片段上每100个核苷酸包含至少3个序列基序ATTA，其中所述S/MAR元件的侧面为剪接供体和剪接受体，并且其中所述多核苷酸还包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少95％序列同一性的R6Kγ复制起点。

18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述启动子包含在用于在宿主细胞中表达货物多肽和/或选择标记的转录单位中。

19.根据权利要求18所述的多核苷酸，其中所述转录单位包含启动子、5’UTR、转基因和3’UTR。

20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中所述S/MAR位于所述3’UTR内。

21.根据权利要求17至21中任一项所述的多核苷酸，其中所述S/MAR的侧面为5’剪接供体位点和3’剪接受体位点。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含RNA-OUTRNA选择标记，所述RNA-OUT RNA选择标记包含与选自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的序列具有至少95％序列同一性的RNA-IN调节RNA-OUT功能变体。

23.一种共价封闭的环状重组DNA分子，其包含：

a.用于在脊椎动物细胞中表达转基因的转录单位，其包含启动子、5’UTR、转基因和3’UTR；

b.位于所述3’UTR内的S/MAR，其中所述S/MAR的侧面为5’剪接供体位点和3’剪接受体位点；

c.与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少95％序列同一性的R6Kγ复制起点；和

d.RNA-OUT RNA选择标记，其包含与选自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的序列具有至少95％序列同一性的RNA-IN调节RNA-OUT功能变体。

24.根据权利要求17至22中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求23所述的重组DNA分子，其中所述R6Kγ复制起点和所述RNA-OUT RNA选择标记包含R6K起点-RNA-OUT RNA选择标记细菌复制选择区域，其与选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQID NO：17的序列具有至少95％的序列同一性。

25.根据权利要求17至22和24中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求23所述的重组DNA分子，其中所述S/MAR包含内部AATAAA转录终止基序。

26.根据权利要求17至22和24至25中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求25所述的重组DNA分子，其中所述S/MAR中的所述AATAAA转录终止基序被AATATT基序替代。

27.根据权利要求17至22和24至26中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求23所述的重组DNA分子，其中所述S/MAR选自人干扰素βS/MAR、M18 S/MAR、载脂蛋白B S/MAR。

28.根据权利要求17至22和24至27中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求23所述的重组DNA分子，其中侧面为5’剪接供体位点和3’剪接受体位点的所述SMAR与选自SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的序列具有至少95％的序列同一性。

29.根据权利要求17至22和24至28中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求23所述的重组DNA分子，其中所述5’UTR还编码内含子。

30.根据权利要求17至22和24至29中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求17所述的重组DNA分子，其中所述转录单位还编码位于启动子上游的表达增强子。

31.根据权利要求17至22和24至30中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求17所述的重组DNA分子，其中所述表达增强子与选自SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的序列具有至少95％的序列同一性。

32.根据权利要求17至22和24至31中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求17所述的重组DNA分子，其中所述剪接供体位点与SEQ ID NO：25具有至少95％的序列同一性。

33.根据权利要求17至22和24至33中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求17所述的重组DNA分子，其中所述剪接受体位点与SEQ ID NO：26具有至少95％的序列同一性。