KR20200054278A - 세포의 유전적 변형을 위한 비-통합 dna 벡터 - Google Patents

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KR20200054278A
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리하르트 하르보틀레
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도이체스 크렙스포르슝스첸트룸
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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 여기서 상기 S/MAR 요소는 상기 프로모터의 다운스트림에 위치하고 상기 S/MAR 요소의 핵산 서열 (S/MAR 서열) 은 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 3 개 서열 모티프 ATTA (SEQ ID NO:1) 를 포함하며; 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 숙주 세포, 및 의약에서 사용하기 위한 및 유전적 질환을 치료하기 위해 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트 및 장치, 및 폴리뉴클레오티드와 관련된 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

세포의 유전적 변형을 위한 비-통합 DNA 벡터
본 발명은 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 여기서 상기 S/MAR 요소는 상기 프로모터의 다운스트림에 위치하고 상기 S/MAR 요소의 핵산 서열 (S/MAR 서열) 은 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 3 개 서열 모티프 ATTA (SEQ ID NO:1) 를 포함하며; 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 숙주 세포, 및 의약에서 사용하기 위한 및 유전적 질환을 치료하기 위해 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트 및 장치, 및 폴리뉴클레오티드와 관련된 방법 및 용도에 관한 것이다.
세포의 유전적 변형은 과학적 목적으로 현대 세포 배양에서 일상적으로 사용된다. 그러나, 유전자의 돌연변이에 의해 초래된 유전 질환의 치료에 있어서 상응하는 기법의 사용이 매우 바람직하지만, 통상 이용가능한 방법이 일시적 형질감염 프로토콜과 같은 일시적 변형만을 제공하는 반면, 세포의 안정한 변형을 제공하는 방법이 통상 전이유전자의 숙주 세포 게놈으로의 통합에 의존한다는 문제점에 의해 여전히 문제가 있다. 그러나 전이유전자의 통합은, 특정 유전자좌 (specific locus) 를 표적으로 한다 하더라도, 예를 들어 치료의 부작용으로서 암으로 이어질 수 있는 유해한 돌연변이를 유도하는 위험성을 갖는다.
스캐폴드-부착 부위 (SAR) 또는 매트릭스-연관 부위 (MAR) 로도 공지되는 스캐폴드/매트릭스 부착 부위 (S/MAR) 는 핵 매트릭스의 부착을 매개하는 진행생물 유기체의 개놈에서의 서열로서 공지되어 있다. S/MAR 은 AT-풍부 서열이며, 일부 AT-풍부 모티프는 추가로 풍부해지는 것으로 발견되었다 (Liebeich et al. (2002), NAR 30(15): 3433). 예를 들어 US 6,410,314 B1 및 Haase et al. (2010), BMC Biotechnology 10:20 에서, S/MAR 모티프를 기반으로 하는 세포에서의 안정한 유지를 위해 다양한 벡터가 제안되었으며; 더욱이, 이러한 벡터의 복제에 영향을 갖는 후생적 효과가 확인되었다 (Haase et al.(2013), PLOS One 8(11):e79262). 그럼에도 불구하고, 유전자 요법에 사용하기에 충분히 안정한 S/MAR-기반 벡터는 여전히 이용가능하지 않다.
그럼에도 불구하고 당업예에서는, 특히 S/MAR 요소를 사용하고 전이유전자의 숙주 세포 게놈으로의 통합과 관련된 위험성을 방지하면서 세포의 안정한 형질감염을 위한 개선된 수단 및 방법에 대한 필요성이 존재한다. 이 문제점은 본원에 개시된 수단 및 방법에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 여기서 상기 S/MAR 요소는 상기 프로모터의 다운스트림에 위치하고 상기 S/MAR 요소의 핵산 서열 (S/MAR 서열) 은 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 3 개 서열 모티프 ATTA 를 포함한다.
하기에서 사용되는 바와 같이, 용어 "갖는다", "포함한다" 또는 "포함된다" 또는 이의 임의의 문법적 변형은 비배타적인 방식으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 이들 용어들에 의해 도입된 특징 외에, 추가 특징이 그 문맥에서 기재된 개체에 존재하지 않는 상황, 및 하나 이상의 추가 특징이 존재하는 상황 모두를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 표현 "A 가 B 를 갖는다", "A 가 B 를 포함한다" 및 "A 에는 B 가 포함된다" 는 B 외에 A 에는 다른 요소가 존재하지 않는 상황 (즉, A 가 단독으로 및 배타적으로 B 로 이루어지는 상황), 및 B 외에 하나 이상의 추가 요소가, 예컨대 요소 C, 요소 C 와 D, 또는 심지어 추가 요소가 개체 A 에 존재하는 상황 모두를 지칭할 수 있다.
나아가, 하기에 사용되는 바와 같이, 용어 "바람직하게는", "보다 바람직하게는", "가장 바람직하게는", "특히", "보다 특히", "구체적으로", "보다 구체적으로" 또는 유사 용어가 임의의 특징과 함께, 추가 가능성을 제외시키지 않으면서 사용된다. 따라서, 이들 용어에 의해 도입된 특징은 선택적 특징이며 어떠한 방식으로도 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 당업자가 인지할 수 있는 바와 같이 대안적 특징을 사용함으로써 수행될 수 있다. 유사하게, "본 발명의 구현예에서" 또는 유사 표현에 의해 도입된 특징은 본 발명의 추가 구현예에 대해 어떠한 제한도 없이, 본 발명의 범주에 대해 어떠한 제한도 없이, 그리고 기타 선택적이거나 선택적이지 않은 본 발명의 특징과 이러한 방식으로 도입된 특징을 조합하는 가능성에 대해 어떠한 제한도 없이, 선택적인 특징인 것으로 의도된다.
또한, 달리 나타내지 않는 경우, 용어 "약" 은 관련 분야에서 통상적으로 허용되는 기술적인 정밀도를 갖는 표시된 값에 관한 것이며, 바람직하게는 표시된 값 ± 20%, 보다 바람직하게는 ± 10%, 가장 바람직하게는 ± 5% 에 관한 것이다. 또한, 용어 "본질적으로"는 표시된 결과 또는 용도에 대해 영향력을 갖는 편차가 부재하는 것을 의미하고, 다시 말해서, 잠재적인 편차는 표시된 결과가 ± 20%, 보다 바람직하게는 ± 10%, 가장 바람직하게 ± 5% 초과로 벗어나게 하지 않는다. 따라서, "~로 본질적으로 이루어지는" 은 명시된 성분들을 포함하지만, 불순물로서 존재하는 물질, 성분을 제공하기 위해 사용된 과정의 결과로서 존재하는 불가피한 물질, 및 본 발명의 기술적 효과를 달성하기 위한 것 이외의 목적으로 첨가되는 성분을 제외한 다른 성분들의 배제를 의미한다. 예를 들어, 어구 "~로 본질적으로 이루어지는" 을 사용해 정의된 조성물은 임의의 공지된 허용가능한 첨가제, 부형제, 희석제, 담체 등을 포괄한다. 바람직하게는, 성분 세트로 본질적으로 이루어진 조성물은 5 중량% 미만, 보다 바람직하게는 3 중량% 미만, 보다 더 바람직하게는 1% 미만, 가장 바람직하게는 0.1 중량% 미만의 비명시된 성분(들) 을 포함하게 될 것이다. 핵산 서열의 문맥에서, 용어 "본질적으로 동일한" 은 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 의 동일성% 값을 나타낸다. 이해하게 되는 바와 같이, 용어 '본질적으로 동일한' 은 100% 동일성을 포함한다. 상기는 용어 "본질적으로 상보적인" 에 준용하여 적용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 는 선형 또는 원형 핵산 분자를 의미한다. 이 용어는 단일 뿐만 아니라 부분 또는 완전 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 RNA 이거나 또는 cDNA 를 포함하는 DNA 이다. 게다가, 천연 발생 변형 폴리뉴클레오티드 예컨대 당화 또는 메틸화 폴리뉴클레오티드 또는 인공적으로 변형된 유도체 예컨대 바이오틴화 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드 (즉, 이의 천연 환경에서 단리) 또는 유전자 변형된 형태로서 제공될 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 활성인 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소를 포함하고; 게다가 폴리뉴클레오티드는 모두 하기 본 명세서에서 명시되는 바와 같이, 숙주 세포에서 에피솜 복제되는 생물학적 활성을 갖는다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 최대 1 Mb, 보다 바람직하게는 최대 500 kb, 보다 더 바람직하게는 최대 200 kb, 가장 바람직하게는 최대 100 kb 의 길이를 갖는다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 비천연 발생 폴리뉴클레오티드이고; 따라서, 바람직하게는, 뉴클레오티드는 인공 폴리뉴클레오티드이다. 또한 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 키메라 폴리뉴클레오티드이고; 보다 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 포함하는 나머지 핵산 서열과 이종성인 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, 특별히 표시된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 용어 폴리뉴클레오티드는 표시된 특별한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 는 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해서 상기 언급된 특별한 핵산 서열로부터 유래될 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산 서열을 포함하는 본 명세서에 관련된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이고, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 특별한 폴리뉴클레오티드에 대해 명시된 바와 같은 생물학적 활성 또는 활성들을 가질 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 변이체는 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 첨가로 인해 상이한 핵산 서열을 갖게 된다는 것을 이해해야 한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드 변이체는 특별한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 기능적 하위서열, 예를 들어 S/MAR 요소의 오르쏘로그, 파라로그 또는 다른 상동체를 포함한다. 또한 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드 변이체는 특별한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 기능적 하위서열의 천연 발생 대립유전자를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 또한 상기 언급된 특별한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 기능적 하위서열과, 바람직하게는 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 이들 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있고, 표준 참고서에서 확인할 수 있다. 엄격한 하이브리드화 조건에 대한 바람직한 예는 6x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트 (= SSC) 중에 대략 45℃ 에서 하이브리드화 조건, 이후에 0.2x SSC, 0.1% SDS 중에 50 내지 65℃ 에서 1 회 이상의 세척 단계이다. 당업자는 이들 하이브리드화 조건이 핵산 유형, 및 예를 들어 유기 용매가 존재할 때에 따라서, 온도 및 완충액의 농도에 대해 상이하다는 것을 알고 있다. 예를 들어, "표준 하이브리드화 조건" 하에서, 온도는 핵산의 유형에 따라서 0.1x 내지 5x SSC (pH 7.2) 의 농도인 수성 완충액 중에서 42℃ 내지 58℃ 로 상이하다. 유기 용매, 예를 들어 50% 포름아미드가 상기 언급된 완충액에 존재하면, 표준 조건 하에서 온도는 대략 42℃ 이다. DNA:DNA 하이브리드를 위한 하이브리드화 조건은 바람직하게는 예를 들어 0.1x SSC 및 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 30℃ 내지 45℃ 이다. DNA:RNA 하이브리드를 위한 하이브리드화 조건은 바람직하게는, 예를 들어 0.1x SSC 및 30℃ 내지 55℃, 바람직하게는 45℃ 내지 55℃ 이다. 상기 언급된 하이브리드화 온도는 예를 들어 대략 100 bp (= 염기쌍) 길이 및 50% G+C 함량의 핵산에 대해서 포름아미드 부재 하에서 결정되며; 따라서, 당업자에게 공지된 원칙으로, 저-G+C DNA에 보다 적합한 다른 조건은 당업자가 보다 적절하다고 확인할 수 있다. 당업자는 표준 참고서를 참조하여 필요한 하이브리드화 조건을 결정하는 방법을 알고 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는 PCR-기반 기법 예컨대 본 발명의 폴리펩티드의 보존된 도메인에 대한 축퇴성 프라이머를 사용하는, DNA 의 혼합 올리고뉴클레오티드 프라이머-기반 증폭법을 통해 수득가능하다. 폴리펩티드의 보존된 도메인은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열의 다른 유기체의 서열과의 서열 비교를 통해 확인할 수 있다. 주형으로서, 박테리아, 진균, 식물, 또는 바람직하게는 동물 유래의 DNA 또는 cDNA 를 사용할 수 있다. 또한, 변이체는 특별히 표시된 핵산 서열 또는 이의 기능적 하위서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 가 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 게다가, 또한 특별히 표시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 가 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 동일성 % 값은 바람직하게는, 전체 아미노산 또는 핵산 서열 부위 상에서 계산된다. 다양한 알고리즘을 기반으로 하는 일련의 프로그램이 상이한 서열을 비교하기 위해 당업자에게 이용가능하다. 이러한 문맥에서, 니들만 (Needleman) 및 분치 (Wunsch) 또는 스미스 (Smith) 및 워터맨 (Waterman)의 알고리즘은 특히 신뢰할만한 결과를 제공한다. 서열 정렬을 수행하기 위해, 바람직하게는 프로그램 PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) 또는 프로그램 Gap 및 BestFit (Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) 및 Smith 및 Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))) 이 사용된다. 바람직하게는, 상기 프로그램은 그들의 표준 매개변수와 함께 사용된다. 퍼센트 (%) 로서 상기에 언급된 서열 동일성 값은 바람직하게는, 달리 명시하지 않으면 서열 정렬을 위한 표준 설정으로서 항상 사용되는, 하기의 설정으로 전체 서열 부위 상에서 프로그램 GAP 를 사용해 결정될 것이다: 갭 가중치: 50, 길이 가중치: 3, 평균 일치도: 10.000 및 평균 불일치도: 0.000.
임의의 특별히 표시된 핵산 서열의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 표시된 활성 또는 활성들을 보유하는 것인 상기 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오티드로서 포괄된다. 본 명세서에서 의미하는 단편은, 바람직하게는 특별한 핵산 서열의 어느 하나의 적어도 200 개, 바람직하게는 적어도 300 개, 보다 바람직하게는 적어도 400 개의 연이은 뉴클레오티드를 포함하거나; 특별한 아미노산 서열의 어느 하나의 적어도 100 개, 바람직하게는 적어도 200 개, 보다 바람직하게는 적어도 300 개의 연이은 아미노산을 포함하고 표시된 활성을 여전히 보유하는 아미노산 서열을 인코딩한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 언급된 핵산 서열로 이루어지거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이를 포함한다. 따라서, 이들은 또한 추가의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 특히, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 융합 단백질 또는 선별 마커를 인코딩할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 추가 부분으로서 발현을 모니터링하기 위한 폴리펩티드 (예를 들어, 녹색, 황색, 청색 또는 적색 형광성 단백질, 알칼리 포스파타아제 등) 로서 또는 검출가능한 마커로서 또는 정제 목적을 위한 보조 척도로서 제공될 수 있는 이른바 "태그" 를 포함할 수 있다. 상이한 목적을 위한 태그는 당분야에 충분히 공지되어 있으며 본 명세서의 다른 곳에 기술되어 있다.
또한 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 카고 (cargo) 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "카고 서열" 은 숙주 세포로 전달되어 안정하게 유지되는 관심 핵산 서열에 관한 것이다. 바람직하게는, 카고 서열은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 RNA, 및/또는 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이다. 바람직하게는, 관심 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 T 세포 수용체 (TCR), 보다 바람직하게는 인간 또는 키메라 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체 (CAR), 바람직하게는 MART1 TCR, 또는 본 명세서의 다른 곳에 명시된 바와 같이 유전적 질환에 영향을 미치는 세포에서 결여된 폴리펩티드이다. 따라서 예를 들어, 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 페닐케톤뇨증의 치료를 위해 페닐알라닌-히드록실라아제 활성 (EC 1.14.16.1) 을 제공하는 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 카고 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 카고 서열은 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소를 개재한다. 추가 바람직한 구현예에서, 카고 서열은 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소를 개재하며, 여기서 상기 S/MAR 요소에 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체가 측접되고; 따라서 바람직하게는, S/MAR 요소는 카고 서열을 인코딩하는 전사체로부터 스플라이스 아웃 (spliced out) 된다. 따라서 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열은 상기 프로모터 및 상기 S/MAR 요소를 개재한다. 추가 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소를 개재하며, 여기서 상기 S/MAR 요소에 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체가 측접되고; 따라서 바람직하게는, S/MAR 요소는 폴리펩티드를 인코딩하는 전사체로부터 스플라이스 아웃된다.
바람직하게는, 선별 마커 및 카고 서열을 인코딩하는 서열은 하나의 mRNA 로부터 진핵세포 내에서 2종 (또는 그 이상) 의 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 서열, 예를 들어 내부 리보솜 진입 서열 (IRES) 또는, 보다 바람직하게는, 자가-절단 펩티드 서열 예컨대, 가장 바람직하게는, 돼지 테스코바이러스-1 유래 펩티드 2A (P2A) 서열이 개재된다. 적절한 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, [Kim et al. (2011) PLoS ONE 6(4): e18556] 을 참조한다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 DNA 이다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 원핵생물 및/또는 진핵생물, 바람직하게는 진핵생물 숙주 세포에서 유전자의 발현을 허용하는 발현 제어 서열 또는 이의 단리된 분획을 추가로 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 발현은 바람직하게는, 번역가능한 mRNA 로의 폴리뉴클레오티드의 전사를 포함한다. 진핵세포, 바람직하게는 포유류 세포에서의 발현을 보장하는 조절 요소는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 바람직하게는 이들은 전사의 개시를 보장하는 조절 서열, 및 임의로는 전사의 종결 및 전사체의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가의 조절 요소는 전사를 비롯하여 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 진핵생물 숙주 세포에서 발현을 허용하는 조절 요소의 예는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터 또는 SMVP-프로모터, U6-프로모터, H1-프로모터, 7SK-프로모터, CMV-프로모터, EFS-프로모터, SV40-프로모터, 또는 RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 포유류 및 다른 동물 세포에서의 글로빈 인트론이다. 게다가, 유도성 또는 세포 유형-특이적 발현 제어 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 유도성 발현 제어 서열은 tet 또는 lac 오퍼레이터 서열 또는 열충격 또는 다른 환경 인자에 의해 유도가능한 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 제어 서열은 당업계에 충분히 공지되어 있다. 전사의 개시를 담당하는 요소 이외에도, 이러한 조절 요소는 또한 폴리뉴클레오티드의 다운스트림에 또한 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 위치 또는 tk-폴리-A 위치를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포" 는 폴리뉴클레오티드를 수용하여 안정하게 복제할 수 있는 임의의 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 진핵세포, 바람직하게는 식물 또는 효모 세포, 예를 들어 빵 효모 균주의 세포이거나, 동물 세포이다. 보다 바람직하게는, 숙주 세포는 곤충 세포 또는 포유류 세포, 특히 마우스 또는 래트 세포이다. 보다 더 바람직하게는, 숙주 세포는 포유류 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 CD34+ 전구 세포; CD61+ 혈소판 (Thrombocyte); CD19+ B-림프구; CD14+ 단핵구; CD15+ 과립구; 바람직하게는 또한 CD8 및 CD45 에 대해 양성인 CD3+ 세포독성 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD4 및 CD45 에 대해 양성인 CD3+ 헬퍼 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD25 및 CD45 에 대해 양성인 CD3+ 활성화 T-림프구, 종양 침윤성 림프구, 또는 자연 살해 (NK) 세포이다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 또한 박테리아 세포에서 복제를 허용하는 서열, 특히 박테리아 복제 기원을 가질 수 있다. 바람직하게는, 박테리아 세포는 실험실 박테리아 균주의 세포, 보다 바람직하게는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 세포이다.
용어 "프로모터" 는 원칙적으로, 임의로는 추가의 조절 요소와 협력하여, 소정 유전자의 전사 수준을 지정하는 유전적 요소로서 당업자에게 공지되어 있다. 프로모터는 항시성 (constitutive) 일 수 있는데, 즉 숙주 세포의 상태와 본질적으로 관계없이 일정한 전사 수준을 제공하거나, 조절될 수 있는데, 다시 말해서 숙주 세포의 상태를 신뢰하여 전사 수준을 제공할 수 있다. 게다가, 프로모터는 세포 유형 및/또는 조직 특이적일 수 있는데, 즉 오직 소수 또는 오직 한 세포 유형에서만 검출가능한 전사 수준을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로모터는 상기 본 명세서에 명시된 바와 같이 숙주 세포에서 활성이다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 프로모터의 선택은 표적화를 의도하는 숙주 세포의 유형에 따라 좌우될 수 있으며; 특별한 세포 유형에 적합한 프로모터 뿐만 아니라 항시성 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 프로모터는 진핵생물 프로모터, 보다 바람직하게는 항시성 진핵생물 프로모터, 보다 더 바람직하게는 강력한 진핵생물 프로모터이다. 바람직하게는, 프로모터는 EF1알파 (연장 인자 1 알파) 프로모터, UbiC (유비퀴틴 C) 프로모터, ROSA 26 프로모터, PGK (포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, 및/또는 CAG (닭 알파-액틴) 프로모터이고, 보다 바람직하게는 EF1알파 프로모터이다. 또한 바람직하게는, 프로모터는 세포-특이적 및/또는 조직-특이적 진핵생물 프로모터이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터" 는 상기 명시된 바와 같은 프로모터에 대해 사용되는 반면, 폴리뉴클레오티드에 잠재적으로 존재하는 임의의 다른 프로모터는 또한 "2차 프로모터"라고 한다. 따라서 바람직하게는, 프로모터는 숙주 세포에서 S/MAR 서열로의 전사를 지정하는 프로모터이고; 또한 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드의 S/MAR 로의 전사를 지정하지 않는 프로모터, 예를 들어 원핵생물 프로모터, S/MAR 서열로부터 전사적으로 절연 (insulated) 된 것, 및/또는 S/MAR 서열로부터 떨어져서 전사를 지정하는 것인 프로모터는 2차 프로모터이다. 바람직하게는, 프로모터는 아포리포단백질 B 프로모터에 상응하는 1000 개 미만, 보다 바람직하게는 250 개 미만, 보다 더 바람직하게는 100 개 미만, 가장 바람직하게는 20 개 미만의 인접한 염기쌍을 포함하며; 따라서 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 인간 아포리포단백질 B 프로모터를 포함하지 않고, 보다 바람직하게는 아포리포단백질 B 프로모터를 포함하지 않는다.
바람직하게는, S/MAR 서열은 프로모터, 및 존재한다면, 하기 본 명세서에 명시된 바와 같은 선별 마커 유전자의 바로 다운스트림에 위치된다. 바람직하게는, "바로 다운스트림" 에 위치되다라는 것은 개재 전사 종결 신호가 결여된 것이고, 보다 바람직하게는 개재 유전자가 결여된 것이다. 따라서 바람직하게는, 프로모터에서 개시되고, 인코딩된 경우, 검출가능한 마커 서열을 포함하는 전사체는 바람직하게는 전사된 S/MAR 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오티드에 포함된 완전한 S/MAR 서열을 포함하며; 본 명세서의 다른 부분의 설명을 고려하여 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 1차 전사체로부터 S/MAR 서열의 삭제를 매개하는 스플라이싱 위치를 추가로 포함할 수 있고; 따라서 보다 바람직하게는, 바람직하게는, 적어도 프로모터에서 개시되고, 인코딩된 경우, 검출가능한 마커 서열을 포함하는 적어도 1차 전사체는 바람직하게는 전사된 S/MAR 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오티드에 포함된 완전한 S/MAR 서열을 포함한다. 또한 바람직하게는, 용어 "바로 다운스트림" 은 전사 종결 신호가 프로모터 및 S/MAR 를 개재하지 않는다면, 프로모터 및 S/MAR 서열이 연장된 핵산 서열에 의해 이격되는 것인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 프로모터 또는 존재한다면, 선별 마커 유전자의 중지 코돈 및 S/MAR 서열을 개재하는 서열은 최대 2 kb, 보다 바람직하게는 최대 0.5 kb, 보다 더 바람직하게는 최대 0.2 kb, 보다 더욱 바람직하게는 최대 0.1 kb, 가장 바람직하게는 최대 50 bp 의 길이를 갖는다.
"스캐폴드/매트릭스 부착 영역" 이라는 명칭으로도 알려진, 용어 "S/MAR 요소" 는 원칙적으로, 상기 DNA 에 진핵세포의 핵 매트릭스의 부착을 매개하는 DNA 서열과 관련된 것으로 당업자에게 공지되어 있다. S/MAR 서열은 전형적으로 진핵생물 염색체의 DNA 내 서열로부터 유래된다. 다양한 S/MAR 서열이 이용가능하고, 서열은 예를 들어 [Liebich et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 312-374] 에 기술된 바와 같이 공공 데이타베이스로부터 입수가능하다. 본 발명에 따르면, 상기 S/MAR 요소의 핵산 서열 (여기서는 S/MAR 서열이라고 함) 은 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 3 개 서열 모티프 ATTA 를 포함한다. 따라서, S/MAR 서열에 포함된 모티프는 다수의 4-뉴클레오티드 모티프 5'-ATTA-3' 를 포함한다. 바람직하게는, S/MAR 서열은 적어도 200 개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 300 개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 적어도 400 개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 500 개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 바람직하게는, S/MAR 서열은 최대 3 kb, 보다 바람직하게는 최대 2 kb, 보다 더 바람직하게는 최대 1.5 kb, 보다 더욱 바람직하게는 최대 1 kb, 가장 바람직하게는 최대 0.9 kb 의 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, S/MAR 서열은 최대 0.7 kb, 보다 바람직하게는 최대 500 bp, 가장 바람직하게는 최대 250 bp 의 길이를 갖는다. 따라서 바람직하게는, S/MAR 서열은 0.2 kb 내지 3 kb, 보다 바람직하게는 0.3 kb 내지 2 kb, 보다 더 바람직하게는 0.4 kb 내지 1.5 kb, 가장 바람직하게는 0.5 kb 내지 1 kb 의 길이를 갖는다. 이해하게 되는 바와 같이, "100 개 뉴클레오티드 당 n 개 서열 모티프를 포함한다" 라는 표시는 100 염기쌍의 서열 당 계산된 상기 서열 모티프의 평균 수에 관한 것이며, 따라서, 분수일 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:6 중 100 염기쌍 당 ATTA 서열 모티프의 수는 34 / 525 염기쌍 * 100 염기쌍 = 6.5 이다. 바람직하게는, 100 염기쌍 당 서열 모티프의 수는 S/MAR 서열의 전체 길이 상에서 결정되며; 의심스러운 경우에, 예를 들어 S/MAR 서열의 경계를 결정할 수 없으면, 폴리뉴클레오티드의 100 염기쌍 당 서열 모티프의 수는 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 내에 200 bp 의 임의 창에 대해 결정가능한 최고 값이고, 보다 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 내 500 bp 의 임의 창에 대해 결정가능한 최고 값이다. 바람직하게는, S/MAR 서열은 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 4 개 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게는 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 5 개 서열 모티프 ATTA, 보다 더욱 바람직하게는 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 6 개 서열 모티프 ATTA 를 포함한다. 또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 최대 400 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 3 개 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게는 최대 400 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 4 개 서열 모티프 ATTA, 보다 더 바람직하게는 최대 400 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 5개 서열 모티프 ATTA, 가장 바람직하게는 최대 400 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 6 개 서열 모티프를 포함한다. 또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 최대 500 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 3 개 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게는 최대 500 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 4 개 서열 모티프 ATTA, 보다 더 바람직하게는 최대 500 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 5 개 서열 모티프 ATTA, 가장 바람직하게는 최대 500 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 6 개 서열 모티프 ATTA 를 포함한다. 따라서 바람직하게는, S/MAR 서열은 500 개 뉴클레오티드의 서열 상에 적어도 10 개 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게는 500 개 뉴클레오티드의 서열 상에 적어도 20 개 서열 모티프 ATTA, 보다 더 바람직하게는 500 개 뉴클레오티드의 서열 상에 적어도 30 개 서열 모티프 ATTA 를 포함한다. 바람직하게는, S/MAR 서열 내 ATTA 모티프의 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 는 각각 9 내지 13, 바람직하게는 10 내지 12, 가장 바람직하게는 11 염기쌍만큼 이격된다.
바람직하게는, S/MAR 요소는 바람직하게는 상기 본 명세서에 기술된 ATTA 모티프를 포함하는 서열 내에 추가의 서열 모티프를 포함한다. 바람직하게는, 상기 ATTA 서열 모티프를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 스트래치는 적어도 1 개 서열 모티프 ATTTA (SEQ ID NO:2), 바람직하게는 적어도 2 개 서열 모티프 ATTTA, 보다 바람직하게는 적어도 4 개 서열 모티프 ATTTA, 가장 바람직하게는 적어도 8 개 서열 모티프 ATTTA 를 추가로 포함한다. 또한 바람직하게는, 상기 ATTA 서열 모티프 및 임의로는 상기 ATTTA 모티프(들) 를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 스트래치는 적어도 1 개, 바람직하게는 적어도 2 개, 보다 바람직하게는 적어도 4 개, 가장 바람직하게는 적어도 6 개의 팔린드롬 모티프, 바람직하게는 모티프 TAAATATTTTA (SEQ ID NO:3) 를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 모티프 TAAATATTTTA 는 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 적어도 1 개 모티프 ATTA 가 인접한다. 또한 바람직하게는, 상기 ATTA 서열 모티프를 포함하는 S/MAR 요소의 서열 스트래치는 적어도 1 개, 바람직하게는 적어도 2 개, 보다 바람직하게는 적어도 3 개, 보다 더 바람직하게는 적어도 4 개, 가장 바람직하게는 적어도 5 개 서열 모티프 ATTATAAATATTTTAATTA (SEQ ID NO:4), 보다 바람직하게는 서열 모티프 ATTTAATTATAAATATTTTAATTA (SEQ ID NO:5) 를 포함한다.
또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 낮은 G+C 함량을 갖는다. 당업자는 서열 내 모든 구아닌 및 시티닌 염기를 세고 누적 결과를 서열 내 뉴클레오티드의 수로 나누어 공지된 서열의 C+G 함량을 계산하는 방법을 알고 있다. 바람직하게는, 상기 서열 모티프 ATTA 를 포함하는 S/MAR 요소의 서열 스트래치는 최대 30%, 보다 바람직하게는 최대 20%, 보다 더 바람직하게는 최대 15%, 보다 더욱 바람직하게는 최대 10%, 가장 바람직하게는 최대 5% 의 G+C 함량을 갖는다. 바람직하게는, S/MAR 요소의 경계를 결정할 수 없는 경우에, G+C 함량의 계산에 사용되는 서열은 상기 본 명세서에 명시된 바와 같이 100 염기쌍 당 ATTA 모티프의 수를 계산하기 위해 사용된 것과 동일하다. 또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 적은 수의 CG 디뉴클레오티드를 갖는다. 바람직하게는, 상기 서열 모티프를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 스트래치는 최대 6 개 서열 모티프 CG, 보다 바람직하게는 최대 4 개, 보다 더 바람직하게는 최대 2 개 서열 모티프 CG 를 포함하고, 가장 바람직하게는 서열 모티프 CG 를 포함하지 않는다.
바람직하게는, S/MAR 서열은 아포리포단백질 B 유전자, 바람직하게는 인간 아포리포단백질 B 유전자의 S/MAR 서열, 보다 바람직하게는 인간 아포리포단백질 B 유전자의 3' S/MAR 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, S/MAR 서열은 인간 아포리포단백질 B 유전자, 보다 바람직하게는 인간 아포리포단백질 B 유전자의 3' S/MAR 서열의 변이체를 포함한다. 따라서 바람직하게는, S/MAR 서열은 SEQ ID NO:6, 바람직하게는 SEQ ID NO:7 또는 8 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, S/MAR 서열은 SEQ ID NO:6, 바람직하게는 SEQ ID NO:7, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:8 의 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, S/MAR 서열은 SEQ ID NO:15 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 S/MAR 서열은 SEQ ID NO:15 의 서열을 포함한다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 S/MAR 요소의 다운스트림에 폴리-A 신호를 포함하고; 보다 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 S/MAR 요소의 다운스트림에 폴리-A 신호 및 전사 종결 신호를 포함한다. 또한 바람직하게는, S/MAR 요소에 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체가 측접되고; 따라서 바람직한 구현예에서, 프로모터로부터, S/MAR 요소의 서열이 스플라이스 아웃되는 전사체가 전사된다. 또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 바람직하게는 전사 후 선별 마커를 인코딩하는 전사체로부터 스플라이스 아웃된다. 또한 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 상기 본 명세서에 명시된 바와 같은 (2차) 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 박테리아 복제 기원 및 박테리아 선별 마커 유전자의 발현을 구동하는 프로모터는 원핵생물-특이적이고, 즉 보다 바람직하게는, 숙주 세포에서 비기능적이다. 또한 바람직하게는, 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드에 포함된 원핵세포에서 활성인 모든 요소는 적어도 하나의 절연 요소의 존재에 의해, 보다 바람직하게는 절연 요소에 의한 측접에 의해 폴리뉴클레오티드에 포함된 잔류 서열로부터 절연된다. 바람직하게는, 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자, 바람직하게는 원핵세포에서 활성인 모든 요소는 5' 말단에 적어도 하나의 절연 요소의 존재 및 3' 말단에 적어도 하나의 절연 요소의 존재에 의해 폴리뉴클레오티드에 포함된 잔류 서열로부터 절연된다. 보다 바람직하게는, 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드에 포함된 원핵세포에서 활성인 모든 요소는 적어도 하나의 절연 요소의 존재에 의해, 보다 바람직하게는 절연 요소에 의한 측접에 의해 프로모터로부터 절연된다. 바람직하게는, 상기 절연 요소(들) 는 억제방지성 요소40 요소 (SEQ ID NO:11) 또는 이의 변이체 및/또는 S/MAR 요소이다.
따라서 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:7 또는 8 의 서열 또는 SEQ ID NO:7 또는 8 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열; 바람직하게는 SEQ ID NO:12 의 서열 또는 SEQ ID NO:12 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열, 보다 바람직하게는 SEQ ID SEQ ID NO:13 의 서열 또는 SEQ ID NO:13 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:14 의 서열 또는 SEQ ID NO:14 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 GFP 를 인코딩하는 핵산 서열이 상이한 폴리펩티드, 바람직하게는 치료적 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 인간 T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR), 바람직하게는 MART1 TCR 을 인코딩하는 핵산 서열에 의해 대체된 SEQ ID NO:14 의 서열을 포함한다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 선별 마커 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하고, 상기 선별 마커 서열은 폴리뉴클레오티드의 프로모터 및 폴리뉴클레오티드의 S/MAR 요소를 개재하고, 바람직하게는 상기 프로모터 및 상기 선별 마커 서열은 함께 선별 마커 유전자를 구성한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "선별 마커 서열" 은 표현 "선별 마커 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열" 의 약칭으로서 사용된다. 용어 "선별 마커" 는 원칙적으로 당업자가 이해하며, 숙주 세포에서 발현될 때, 그에 적용시 숙주 세포에 대한 선택압을 매개하는 적어도 하나의 조건에 대한 저항성을 부여하는 핵산 서열에 관한 것이다. 선별 마커는 원핵세포 및 진핵세포에 대해 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 선별 마커는 진핵세포의 선별 마커이다. 바람직하게는, 선별 마커는 선별 마커 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 숙주 세포로부터 선택적 화합물을 제거하거나 상기 선택적 화합물을 불활성으로 만들도록 변형시키는 수송체 및/또는 효소 활성을 갖는 선별 마커 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 선별 마커 유전자는 바람직하게는 선별 마커 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 업스트림에, 적어도 하나의 인트론을 추가로 인코딩한다. 바람직하게는, 선별 마커는 퓨로마이신, 블라스티시딘, 네오마이신, 및/또는 제오신, 보다 바람직하게는 퓨로마이신에 대한 저항성을 매개하는 마커이다. 따라서 바람직하게는, 프로모터 및 선별 마커는 함께 퓨로마이신 저항성 유전자, 블라스티시딘 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자, 또는 제오신 저항성 유전자, 보다 바람직하게는 퓨로마이신 저항성 유전자를 구성한다. 바람직한 구현예에서, 선별 마커는 특정한 성장 신호의 집합, 바람직하게는 증식 신호의 존재 및/또는 부재에 저항성을 제공하는 폴리펩티드이다. 따라서 바람직한 구현예에서, 선별 마커는 원칙적으로 당업계에 모두 알려져 있는 T-세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR) 이다. 바람직하게는, TCR 및/또 는CAR 은 공지된 특이성을 가져, 바람직하게는, T 세포 신호화가 상기 TCR 및/또는 CAR 을 포함하는 숙주 세포에서 유도될 수 있다. 바람직하게는 이러한 경우, 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 바람직하게는, 선별 마커 유전자는 폴리-A 신호 및 전사 종결 신호(들) 가 없다. 따라서 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 선별 마커를 인코딩하는 코딩 서열 (선별 마커 서열) 을 추가로 포함하며, 상기 선별 마커 서열은 상기 프로모터 및 상기 S/MAR 요소를 개재하고, 상기 프로모터 및 상기 선별 마커 서열은 함께 선별 마커 유전자를 구성하고, 상기 선별 마커는 진핵세포의 선별 마커이다.
바람직하게는 선별 마커는 Genbank Acc No. KX548903.1 (SEQ ID NO:10) 의 뉴클레오티드 535 내지 1134 에 의해 인코딩되는 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라아제 (Genbank Acc No. KX548903.1) (SEQ ID NO:9) 이다. 따라서, 선별 마커 유전자는 바람직하게는, a) SEQ ID NO:9 의 서열을 포함하는 퓨로마이신 저항성 폴리펩티드의 발현을 야기시키고; b) SEQ ID NO:9 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 퓨로마이신 저항성 폴리펩티드의 발현을 야기시키고; c) SEQ ID NO:10 의 서열을 포함하고; d) SEQ ID NO:10 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하고; e) SEQ ID NO:9 의 서열을 포함하고, 바람직하게는 이것으로 이루어지는 퓨로마이신 저항성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고/하거나, f) SEQ ID NO:9 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하고, 바람직하게는 이것으로 이루어지는 퓨로마이신 저항성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "복제하는" 은 세포의 복제 주기 동안 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 적어도 2 개의 복제물의 생성을 유도하는 폴리뉴클레오티드의 활성에 관한 것이다. 따라서 바람직하게는, 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 복제는 일련의 세포 분열 후 폴리뉴클레오티드의 존재를 측정하여 결정되며, 여기서 비-복제 폴리뉴클레오티드는 희석되어 버릴 것으로 예상된다. 바람직하게는, 복제는 안정한 복제이며, 즉 평균 50 회 세포 분열 후, 보다 바람직하게는 평균 100 회 세포 분열 후, 가장 바람직하게는 평균 250 회 세포 분열 후 숙주 세포 집단에서 폴리뉴클레오티드가 여전히 검출가능한 정도로의 복제이다. 바람직하게는, 숙주 세포 집단에서 폴리뉴클레오티드의 검출은 표준 조건 하에서 PCR 을 통해 수행된다.
용어 "에피솜" 복제는 원칙적으로 세포 게놈으로의 통합 없이, 즉 세포 게놈에 공유적으로 부착되지 않고, 폴리뉴클레오티드의 복제에 관한 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 따라서 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드의 에피솜 복제는 자율 복제 유닛으로서 상기 폴리뉴클레오티드의 복제이다. 바람직하게는, 에피솜 복제는 원형으로 폐쇄된 이중 가닥 DNA 분자의 형태로의 숙주 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 유지이다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 상기 폴리뉴클레오티드의 실제 복제는 다른 형태, 예를 들어 롤링 써클 복제 (rolling circle replication) 를 포함할 수 있다. 원형 DNA 의 에피솜 유지는 바람직하게는 당업자에게 공지된 플라스미드 회수 (plasmid rescue) 절차; 즉 바람직하게는 숙주 세포의 용해물을 준비하는 단계 및 이에 포함된 DNA 로 적절한 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포를 형질전환시키는 단계에 의해 검증되며; 상기 방법으로 수득가능한 적합한 수의 박테리아 콜로니가 원래의 원형 DNA 와 동일한 제한 효소 패턴 및/또는 서열을 갖는 플라스미드로서 원형 DNA 를 포함한다면, 바람직하게는 그 원형 DNA 가 에피솜으로 유지되었다고 추정된다. 또한 당업자에게 공지된, 에피솜 유지를 검증하는 추가 방법은 DNA/DNA 블롯팅 ("서던 블롯" 방법) 이고; 따라서 바람직하게는, 숙주 세포의 전체 DNA 를 준비하여 하나 이상의 제한 효소(들) 로 분해시키고; 프로브로서 원래 플라스미드를 사용하는 서던 블롯에서, 원래의 원형 DNA 에 상응하는 밴드만이 가시적인 경우, 바람직하게는, 플라스미드가 에피솜으로 유지된다고 결론내린다. 보다 바람직하게는, 에피솜 유지는 본 명세서의 실시예에 기술된 대로 검증한다.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "에피솜 복제되는" 은 세포 복제 주기 동안 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 적어도 2 개의 복제물의 생성을 유도하는 상기 폴리뉴클레오티드의 활성에 관한 것으로서, 그 동안에 상기 폴리뉴클레오티드는 자율적인 복제 독립체로서 상기 세포에 존재하며; 안정한 에피솜 복제는 폴리뉴클레오티드가 적어도 50 회 세포 분열 후, 바람직하게는 적어도 100 회 세포 분열 후, 보다 바람직하게는 적어도 250 회 세포 분열 후, 가장 바람직하게는 적어도 500 회 세포 분열 후 숙주 세포에서 여전히 검출가능한 정도로의 에피솜 복제이다. 바람직하게는, 상기 세포 분열 횟수는 세포 집단에 대한 평균 세포 분열 횟수이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 시미안 바이러스 40 (SV40) 복제 기원, 소 유두종 바이러스 (BPV) 복제 기원, 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 복제 기원이 없고; 바람직하게는 폴리오마바이러스 복제 기원, 유두종 바이러스 복제 기원, 및 헤르페스바이러스 복제 기원이 없고; 보다 바람직하게는 진핵생물-감염 바이러스의 복제 기원이 없다. 보다 바람직하게는, 벡터는 임의의 공지된 진핵생물 복제 기원이 없다. 그러나 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 원핵생물, 바람직하게는 박테리아 복제 기원, 특히 이. 콜라이 복제 기원을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 원핵생물 복제 기원은 폴리뉴클레오티드에 포함되는 유일한 복제 기원이다.
유리하게는, 이는 명시된 바와 같은 S/MAR 요소를 상기 S/MAR 요소로 입력되는 프로모터와 조합함으로써, 폴리뉴클레오티드가 전용 복제 기원 부재 하에서도 숙주 세포에서 에피솜 형태로 매우 안정하게 수득된다는 것이 본 발명의 기초가 되는 작업에서 확인되었다. 게다가, 폴리뉴클레오티드의 확립 효율이 퓨로마이신 저항성 유전자의 사용, 저항성 유전자를 통한 S/MAR 요소로의 전사 보장, 및 폴리뉴클레오티드에 잠재적으로 존재하는 다른 프로모터로부터 전사적으로 프로모터 - S/MAR 조합의 절연을 통해서 더욱 개선될 수 있다는 것을 확인하였다.
상기에서 이루어진 정의는 하기에서 준용하여 적용된다. 하기에서 추가로 이루어지는 추가적인 정의 및 설명도 또한 본 명세서에 기재된 모든 구현예에 준용하여 적용된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조성물" 은 명시된 바와 같은 화합물 및 임의로는 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 조성물은 약학적으로 허용가능한 조성물이며; 따라서, 바람직하게는, 담체는 약학적으로 허용가능한 담체이다. 본 발명의 화합물은 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염으로서 제형화될 수 있다. 바람직한 염은 아세테이트, 메틸에스테르, HCl, 술페이트, 클로라이드 등을 포함한다.
담체(들) 는 제형의 다른 성분과 상용성이고 이의 수령체에게 유해하지 않다는 의미에서 허용가능해야만 한다. 적용되는 담체는 예를 들어 고형, 겔 또는 액상일 수 있다. 고형 약학 담체의 예는 락토오스, 백토, 수크로오스, 탈크, 젤라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등이다. 액상 담체의 예는 인산완충생리식염수, 시럽, 오일 예컨대 땅콩유 및 올리브유, 물, 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등이다. 유사하게, 담체 또는 희석제는 당업계에 충분히 공지된 시간 지연 재료, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 상기 적합한 담체는 상기에 언급된 것들 및 당업계에 충분히 공지된 다른 것들을 포함하며, 예를 들어 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania] 를 참조한다. 희석제(들) 는 조성물 중 화합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 생리적 염수, 링거액, 덱스트로오스액 및 행크액이다. 또한, 약학 조성물 또는 제형은 다른 담체, 보강제 또는 무독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제 등을 포함할 수도 있다.
바람직하게는, 조성물은 숙주 세포로의 폴리뉴클레오티드의 진입을 매개한다. 따라서, 바람직하게는 조성물은 적어도 하나의 형질감염제를 포함한다. 적절한 형질감염제의 선택은 표적 숙주 세포 뿐만 아니라 고려되는 특별한 적용에 따라 좌우될 수 있다. 형질감염제, 적절한 형질감염 조건 뿐만 아니라 이에 대한 선택 기준은 당업계에 충분히 공지되어 있다. 또한 바람직하게는, 조성물은 바이러스-유사 입자를 포함한다. 따라서 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 바이러스-유사 입자에 패키징되며, 즉 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 바이러스-유사 입자에 포함된다.
약학 조성물은 바람직하게는 국소로 또는 전신으로 투여된다. 약물 투여에 통상적으로 사용되는 적합한 투여 경로는 경구, 정맥내 또는 비경구 투여 뿐만 아니라 흡입이다. 그러나, 화합물의 작용 방식 및 성질에 따라서, 약학 조성물은 또한 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 화합물은 상기 본 명세서에 명시된 바와 같이, 바이러스 벡터 또는 바이러스 또는 리포솜을 사용하여 유전자 요법 접근방식으로 투여될 수 있다. 게다가, 화합물은 통상의 약학 조성물에서 또는 개별 약학 조성물로서 다른 약물과 조합으로 투여될 수 있고, 상기 개별 약학 조성물은 부분품 키트의 형태로 제공될 수 있다. 화합물은 바람직하게는 통상의 절차에 따라서 표준 약학 담체와 약물을 조합하여 제조된 통상의 투약 형태로 투여된다. 이들 절차는 바람직한 조제물로 적절하게 성분을 혼합, 과립화 및 압착 또는 용해시키는 것을 포함시킬 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징은 조합하려는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 충분히 공지된 변수들에 의해 영향받는다는 것을 이해하게 될 것이다.
약학 조성물의 치료적 유효 용량은 본 명세서에서 언급되는 질환 또는 병태를 동반하는 증상을 예방, 경감 또는 치료하는 본 발명의 약학 조성물에서 사용하려는 화합물의 양을 의미한다. 이러한 화합물의 치료적 효능 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차, 예를 들어 ED50 (집단의 50% 에서 치료적으로 유효한 용량) 및 LD50 (집단의 50% 에 대해 치명적인 용량) 을 통해 결정될 수 있다. 치료적 효과와 독성 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 이는 LD50/ED50 의 비로서 표시될 수 있다.
투약량 용법은 바람직하게는 상기 기술된 방법 중 어느 하나에 따라서, 임상의 및 다른 임상 인자에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 충분히 공지된 바와 같이, 어느 한 환자에 대한 투약량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여하려는 특정 화합물, 성별, 투여 시기 및 경로, 일반 건강 및, 동시 투여되는 다른 약물을 포함하는 많은 인자에 의존적이다. 진행은 주기적인 평가를 통해 모니터링할 수 있다. 전형적인 용량은 예를 들어, 1 내지 1000 ㎍ 범위일 수 있지만; 특히 상기 언급된 인자를 고려하여 이러한 예시적인 범위 이하 또는 이상의 용량이 계획된다. 일반적으로, 약학 조성물의 정기적인 투여로서의 용법은 1 일 당 1 ㎍ 내지 10 mg 유닛의 범위여야 한다. 용법이 연속 주입인 경우, 또한 각각 분 당 체중 킬로그램 당 1 ㎍ 내지 10 mg 유닛의 범위여야 한다. 진행은 주기적인 평가를 통해 모니터링할 수 있다. 그러나, 대상체 및 투여 방식에 따라서, 투여 물질의 분량은 체질량 kg 당 약 0.01 mg 내지 체질량 kg 당 약 10 mg 을 제공하는 광범위한 범위에서 가변적일 수 있다. 바이러스 벡터, 특히 아데노-연합 바이러스 벡터가 투여되는 경우, 바람직한 용량은 5 x 1011, 내지 2 x 1013 바이러스 입자 또는 바이러스 게놈/kg 체중이고; 이해하게 되는 바와 같이, 이러한 예시적인 용량은 상기에 기술된 인자에 추가로, 바이러스의 유형, 표적 기관 등과 같은 추가의 인자에 따라서 변형될 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 약학 조성물 및 제형은 본 명세서에서 열거되는 질환 또는 병태를 치료 또는 경감 또는 예방하기 위해 적어도 1 회 투여된다. 그러나, 상기 약학 조성물은 1 회 초과, 예를 들어 비제한적인 일수까지 1 일 1 회 내지 4 회 투여될 수 있다.
특별한 약학 조성물은 약학 분야에 충분히 공지된 방식으로 제조되며 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와의 혼합물로 또는 다르게는 회합되어 상기 본 명세서에 언급된 적어도 하나의 활성 화합물을 포함한다. 이들 특별한 약학 조성물을 제조하기 위해, 활성 화합물(들) 은 통상 담체 또는 희석제와 혼합될 것이거나, 캡슐, 샤세, 카세, 종이 또는 다른 적합한 용기 또는 비히클에 밀봉 또는 캡슐화될 것이다. 생성된 제형은 투여 방식에 맞춰 채택될 것이며, 즉, 정제, 캡슐, 좌제, 용액, 현탁액 등의 형태로 채택될 것이다. 투약량 권고는 고려되는 수령체에 따라서 용량 조정을 예측하기 위해 처방자 또는 사용자 지시사항에 표시될 것이다.
본 발명은 또한 의약에서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전적 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전적 질환" 은 개체의 게놈 내 하나 이상의 변형, 바람직하게는 돌연변이와 인과적으로 연관된 질환에 관한 것이다. 따라서 바람직하게는, 유전적 질환은 하나 이상의 후생적 변화와 인과적으로 연관되며, 보다 바람직하게는 하나 이상의 유전적 돌연변이와 인과적으로 연관된다. 이해하게 되는 바와 같이, 유전적 질환의 증상은 종종 하나 이상의 특별한 조직(들) 및/또는 세포 유형(들) 에서 유전자 생성물의 정상 기능을 제공하는 유전자의 발현 결여 및/또는 돌연변이된 유전자의 발현에 의해 야기된다. 따라서, 돌연변이가 질환의 원인이 되는 세포에서만 유전적 질환을 치료하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 유전적 질환은 단일유전성 질환이며, 즉 한 유전자 내 유전자 변형에 의해 야기된다. 보다 바람직하게는, 유전적 질환은 단일유전성 열성 질환이고, 즉 유전자의 양쪽 대립유전자 내 유전자 변형에 의해 야기되며; 따라서 바람직하게는, 증상의 경감은 영향받은 유전자의 적어도 하나의 비변경된 카피의 제공을 통해서 기대된다. 가장 바람직하게는, 유전적 질환은 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레버 선천성 흑암시, 범맥락막위축, 또는 스타가르트병이다. 바람직한 구현예에서, 유전적 질환은 암이다.
본 발명은 또한 세포 진입을 매개하는 화합물 및 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "키트" 는 함께 포장될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 본 발명의 상기 언급된 화합물, 수단 또는 시약의 컬렉션을 의미한다. 키트의 성분은 개별 바이알 (즉, 개별 부분품의 키트로서) 에 포함될 수 있거나 단일 바이알에 제공될 수 있다. 게다가, 본 발명의 키트는 바람직하게는 상기 본 명세서에 언급된 방법을 실시하는데 사용하려는 것임을 이해해야 한다. 바람직하게는, 모든 성분은 상기 언급된 방법을 실시하기 위해 즉시 사용 (ready-to-use) 방식으로 제공되는 것이 계획된다. 또한, 키트는 바람직하게는 상기 방법을 실행하기 위한 지시사항을 포함한다. 지시사항은 종이 또는 전자 형태로 사용자 매뉴얼에 의해 제공될 수 있다. 또한, 매뉴얼은 본 발명의 키트를 사용하여 상기 언급된 방법을 실행할 때 수득된 결과를 해석하기 위한 지시사항을 포함할 수 있다. 상기로부터 이해하게 되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트의 설명은 바람직하게는 준용하여 상응하는 벡터를 포함하는 키트에 관한 것이다.
바람직하게는, 키트는 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 세포 진입을 매개하는 적어도 하나의 화합물을 추가로 포함하고, 용어 "세포 진입을 매개하는 화합물" 은 키트의 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 내부, 바람직하게는 숙주 세포에 들어가게 하는데 적합한 임의의 수단에 관한 것이다. 세포 진입을 매개하는 적합한 화합물 (전달 수단) 은 당업계에 공지되어 있으며 특히 형질감염 수단, 패키징 조성물 등을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전달 수단, 예를 들어 바이러스 입자, 보다 바람직하게는 복제-결함성 바이러스 입자, 가장 바람직하게는 바이러스-유사 입자 (VLP) 에 사전 패키징된다. 당업자는 세포 수용체에 상이한 특이성을 제공하는 전달 수단을 알고 있어, 소정의 표적 숙주 세포에 적절한 전달 수단을 선택할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 장치에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "장치" 는 본 발명의 화합물 또는 조성물의 투여가 허용되도록 적어도 서로 작동적으로 연결된 수단을 포함하는 수단의 시스템에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드, 조성물, 숙주 세포를 투여하기 위한 바람직한 수단은 당업계에 충분히 공지되어 있다. 작동되는 방식으로 수단을 연결시키는 방법은 장치에 포함되는 수단의 유형, 계획되는 투여의 종류에 의존할 것이다. 바람직하게는, 그러한 경우에 수단은 단일 장치로 포함된다. 따라서 상기 장치는 화합물 또는 조성물의 투여를 위한 전달 유닛 및 투여까지 상기 화합물 또는 조성물을 저장하기 위한 저장 유닛을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 수단은 이러한 구현예에서 개별 장치로서 존재할 수 있고, 바람직하게는 키트로서 함께 패키징될 수 있다는 것을 또한 고려한다. 당업자는 추가의 노고 없이 수단을 연결하는 방법을 인지하게 될 것이다. 바람직한 장치는 전문 기술자의 특정 지식 없이도 적용할 수 있는 것들이다. 바람직한 구현예에서, 장치는 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함하는, 보다 바람직하게는 바늘이 존재하는 시린지이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 장치는 화합물 또는 조성물을 포함하는 정맥내 주입 (IV) 장비이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 장치는 투여 위치를 플러싱하기 위한 화합물 또는 약물을 포함하거나, 예를 들어 종양에 화합물 또는 조성물을 국소 도포하기 위한 바늘을 추가로 포함하는 내시경 장치이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 장치는 본 발명의 화합물을 포함하는 흡입기이고, 여기서 보다 바람직하게는 상기 화합물은 에어로졸로서의 투여를 위해 제형화된다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 숙주 세포를 안정적으로 형질감염시키는 방법에 관한 것이다:
a) 상기 숙주 세포를 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포와 접촉시키는 단계, 및
b) 그에 따라, 숙주 세포를 안정적으로 형질감염시키는 단계.
본 발명의 숙주 세포를 안정적으로 형질감염시키는 방법은 바람직하게는 시험관내 방법이다. 게다가, 상기 명확하게 언급된 것들에 추가로 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 예를 들어 단계 a) 에서 숙주 세포 또는 이를 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 및/또는 접촉된 숙주 세포에 선택압을 적용하는 단계에 관한 것일 수 있다. 또한, 하나 이상의 상기 단계는 자동화 장비를 통해 수행될 수 있다.
용어 숙주 세포를 "안정적으로 형질감염시키는" 은 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 이종성 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입시켜 폴리뉴클레오티드가 상기 본 명세서에 명시된 바와 같은 숙주 세포에 의해 안정적으로 복제되는 것에 대한 것으로 당업자에 의해 이해된다. 바람직하게는, 안정한 형질감염은 폴리뉴클레오티드의 안정한 에피솜 복제를 포함한다. 바람직하게는, 안정한 형질감염은 접촉 후, 선별 마커의 존재에 대해 선택되도록 숙주 세포에 선택압을 적용하는 것을 포함한다. 선택압은 접촉 후, 임의로는 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 확립되도록 허용하는 제 1 시간 기간을 배제하고 적용되며; 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 확립되도록 허용하는 상기 제 1 시간 기간의 지속기간은 대부분 접촉되는 숙주 세포의 유형 및 사용되는 선별 마커의 종류에 의존적일 것이며; 바람직하게는, 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 확립되도록 허용하는 상기 제 1 시간 기간의 지속기간은 1 시간 내지 48 시간, 보다 바람직하게는 2 시간 내지 24 시간, 가장 바람직하게는 3 시간 내지 16 시간이다. 그러나, 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 확립되도록 허용하는 상기 제 1 시간 기간의 지속기간은 또한 0 일 수 있는데, 즉 선택압이 접촉 직후 또는 심지어 접촉 동안에 적용될 수 있다. 선택압은 연속적으로, 즉 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 숙주 세포가 증식되는 것이 방지되도록, 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 확립되도록 허용하는 제 1 시간 기간 후 본질적으로 모든 시점에 적용될 수 있거나; 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오티드를 수용하지 않은 세포를 제거하기 위해 일시적으로 적용될 수 있다. 바람직하게는, 선택압의 일시적 적용은 세포가 상기 접촉 후 유기체에게 다시 전달되는 경우에 사용된다. 그러나, 또한 특히 표적 숙주 세포로의 폴리뉴클레오티드의 전달 효율이 충분히 높다고 알려진 경우 및/또는 트랜스제닉 숙주 세포의 순수 집단이 크게 중요하지 않은 경우에는 선택압이 적용되지 않는 것을 계획한다. 바람직한 구현예에서, 안정적으로 형질감염된 세포 집단은 또한 상기 본 명세서에서 명시된 바와 같은 검출가능한 폴리펩티드를 인코딩하는 카고 서열이 발현되는 것을 허용하고, 예를 들어 세포 분류, 바람직하게는 FACS 에 의해 카고 서열을 발현하는 세포를 선택함으로써 수득될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 안정적으로 형질감염시키는 것은, 폴리뉴클레오티드의 안정한 에피솜 복제, 바람직하게는 평균 50 회 세포 분열 후에도 숙주 세포 집단에서 폴리뉴클레오티드가 여전히 검출가능한 정도로의 에피솜 복제를 포함한다.
본 발명의 방법의 문맥에서 사용되는 용어 "접촉하는" 은 당업자가 이해하고 있다. 바람직하게는, 이 용어는 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 숙주 세포와 물리적으로 접촉되게 하는 것, 예를 들어 숙주 세포 및 화합물(들) 이 상호작용하도록 허용하는 것에 관한 것이다. 바람직하게는, 접촉은 바람직하게는 상기에 명시된 전달 수단을 통해, 숙주 세포의 내부에 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 유전적 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다:
a) 상기 대상체를 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포와 접촉시키는 단계, 및
b) 그에 따라, 상기 대상체에서 유전적 질환을 치료하는 단계.
본 발명의 유전적 질환을 치료하는 방법은 바람직하게는 생체내 방법이다. 게다가, 상기 명확하게 언급된 것들에 추가로 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 단계 a) 에서 숙주 샘플 또는 이를 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 및/또는 대상체에게 상기 샘플 또는 숙주 세포를 재투여하는 단계에 관한 것일 수 있다. 따라서, 유전적 질환을 치료하기 위한 방법은 상기 명시된 바와 같이 숙주 세포를 안정적으로 형질감염시키는 방법의 단계를 포함한다. 또한, 하나 이상의 상기 단계는 자동화 장비를 통해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 숙주 세포를 안정적으로 유전적 변형시키기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 그리고 유전적 질환, 바람직하게는 단일유전성 질환, 보다 바람직하게는 단일유전성 열성 질환, 가장 바람직하게는 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레버 선천적 흑암시, 범맥락막위축, 또는 스타가르트병의 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 유전적 질환은 상기 본 명세서에서 명시한 바와 같이, 암이다.
또한, 본 발명은 유도 만능 줄기 세포 (IPSC) 의 생성을 위한, 일차 세포, 바람직하게는 일차 피부 섬유아세포의 유전적 변형을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 일차 세포는 마우스 또는 인간 일차 세포이다.
용어 "일차 세포" 는 배양된 세포주의 세포에 반대되는 것으로 당업자는 이해하고; 따라서 바람직하게는, 일차 세포는 살아있는 유기체로부터 유래되며 최대 20 계대, 보다 바람직하게는 최대 15 계대, 보다 더 바람직하게는 최대 10 계대, 보다 더욱 바람직하게는 최대 5 계대로 배양된 세포이다. 가장 바람직하게는, 일차 세포는 살아있는, 바람직하게는 마우스 또는 인간의 조직으로부터 직접적으로 유래된 세포이다.
용어 "줄기 세포" 는 또한 적어도 2종의 세포 유형, 바람직하게는 적어도 5종의 세포 유형, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 완전한 세포 계통으로 분화되는 잠재성을 갖는 미분화 또는 저분화 세포에 관한 것으로 당업자는 이해한다. 바람직하게는, 줄기 세포는 전능 줄기 세포, 보다 바람직하게는 만능 줄기 세포이다. 용어 "유도 만능 줄기 세포" 또는 "IPSC" 는 분화된 세포, 바람직하게는 분화된 일차 세포로부터 유래된 만능 줄기 세포에 관한 것이다. IPSC 를 생성시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 바람직하게는 세포에서 4종의 전사 인자의 발현을 포함한다 (예를 들어, [Takahashi et al. (2006), Cell. 126 (4):663] 참조).
본 발명은 또한 배아 줄기 세포의 유전적 변형을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전적 질환, 바람직하게는 단일유전성 질환, 보다 바람직하게는 단일유전성 열성 질환, 가장 바람직하게는 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레버 선천성 흑암시, 범맥락막위축, 또는 스타가르트병의 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 약제는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 트랜스제닉 동물을 생성시키기 위한 줄기 세포의 유전적 변형을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 트랜스제닉 동물의 생성을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "트랜스제닉 동물" 은 바람직하게는 유전자 조작 방법에 의해 상기 동물에게 도입된, 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동물에 관한 것이다. 바람직하게는, 트랜스제닉 동물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 1 개, 보다 바람직하게는 적어도 10 개, 보다 더 바람직하게는 적어도 1000 개, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 10000 개 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 전핵 주입에 의한 단일 세포 배아의 유전적 변형을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 용어 "전핵 주입" 은 바람직하게는 트랜스제닉 동물을 생성시키기 위해, 유전적 물질, 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 수정된 난모세포의 핵에 주입하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 또한 숙주 세포에서의 유전자 발현을 변형하는데 있어서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다. 이를 위해서, 간섭, 비-코딩 핵산을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 발현가능한 형태로 포함될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드으로부터 발현되는 비-코딩 간섭 핵산은 전형적으로 안티센스 RNA, siRNA, microRNA 또는 리보자임일 수 있다. 그로써, 유전자 발현은 변형될 수 있으며, 즉, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 조성물을 사용하여 하향조절될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 간섭, 비-코딩 핵산에 대한 발현 벡터는 개선된 안정성 및 발현 성능을 갖지만 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 기능적 비-코딩, 간섭 핵산을 동시에 발현할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 상기 명시된 바와 같은 비-코딩, 간섭 핵산을 인코딩하는 발현가능한 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구축물은 또한 임상적 맥락에서 유전자 침묵 (gene silencing) 에, 즉, 본 명세서의 다른 곳에서 언급된 것들을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 개선된 안정성 및 발현 특징으로 인해, 유전자 침묵 접근방식이 또한 개선될 수 있다.
상기를 고려하여, 하기 구현예가 바람직하다:
1. 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 S/MAR 요소가 상기 프로모터의 다운스트림에 위치하고 상기 S/MAR 요소의 핵산 서열 (S/MAR 서열) 이 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 3 개 서열 모티프 ATTA (SEQ ID NO:1) 를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
2. 구현예 1 에 있어서, 상기 S/MAR 서열이 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 4 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하고, 바람직하게는 상기 S/MAR 서열이 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 5 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 S/MAR 서열이 최대 200 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 6 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
3. 구현예 1 또는 2 에 있어서, 상기 S/MAR 서열이 최대 400 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 3 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하고, 바람직하게는 상기 S/MAR 서열이 최대 400 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 4 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 S/MAR 서열이 최대 400 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 5 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하고, 가장 바람직하게는 상기 S/MAR 서열이 최대 400 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 6 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 S/MAR 서열이 최대 500 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 3 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하고, 바람직하게는 상기 S/MAR 서열이 최대 500 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 4 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 S/MAR 서열이 최대 500 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 5 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하고, 가장 바람직하게는 상기 S/MAR 서열이 최대 500 개 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 6 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 S/MAR 서열이 500 개 뉴클레오티드의 서열 상에서 적어도 10 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하고, 바람직하게는 상기 S/MAR 서열이 500 개 뉴클레오티드의 서열 상에서 적어도 20 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하고, 보다 바람직하게는 500 개 뉴클레오티드의 서열 상에서 적어도 30 개 서열 모티프 ATTA 를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 ATTA 서열 모티프를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 스트래치가 적어도 1 개 서열 모티프 ATTTA (SEQ ID NO:2), 바람직하게는 적어도 2 개 서열 모티프 ATTTA, 보다 바람직하게는 적어도 4 개 서열 모티프 ATTTA, 가장 바람직하게는 적어도 8 개 서열 모티프 ATTTA 를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 ATTA 서열 모티프, 및 임의로는 상기 ATTTA 모티프(들) 를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 스트래치가, 적어도 1 개, 바람직하게는 적어도 2 개, 보다 바람직하게는 적어도 4 개, 가장 바람직하게는 적어도 6 개 모티프 TAAATATTTTA (SEQ ID NO:3) 를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
8. 구현예 7 에 있어서, 상기 모티프 TAAATATTTTA 가 5' 말단 및/또는 3' 말단 상에서 적어도 1 개 모티프 ATTA 와 인접한, 폴리뉴클레오티드.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 ATTA 서열 모티프를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 스트래치가 적어도 1 개, 바람직하게는 적어도 2 개, 보다 바람직하게는 적어도 3 개, 더 바람직하게는 적어도 4 개, 가장 바람직하게는 적어도 5 개 서열 모티프 ATTATAAATATTTTAATTA (SEQ ID NO:4), 보다 바람직하게는 서열 모티프 ATTTAATTATAAATATTTTAATTA (SEQ ID NO:5) 를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 모티프를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 스트래치가 최대 30%, 바람직하게는 최대 20%, 보다 바람직하게는 최대 15%, 보다 더 바람직하게는 최대 10%, 가장 바람직하게는 최대 5% 의 G+C 함량을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 모티프를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 스트래치가 최대 6 개 서열 모티프 CG, 보다 바람직하게는 최대 4 개 서열 모티프 CG, 보다 더 바람직하게는 최대 2 개 서열 모티프 GC 를 포함하고, 가장 바람직하게는 서열 모티프 CG 를 포함하지 않는, 폴리뉴클레오티드.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 S/MAR 서열이 아포리포단백질 B 유전자, 바람직하게는 인간 아포리포단백질 B 유전자의 S/MAR 서열, 보다 바람직하게는 인간 아포리포단백질 B 유전자의 3' S/MAR 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 S/MAR 서열이 SEQ ID NO:6, 바람직하게는 SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:7, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:8 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 S/MAR 서열이 SEQ ID NO:6, 바람직하게는 SEQ ID NO:7 의 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드, 바람직하게는 선별 마커를 인코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하고, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열이 상기 프로모터 및 상기 S/MAR 요소를 개재하고; 바람직하게는 선별 마커를 인코딩하는 코딩 서열 (선별 마커 서열), 바람직하게는 선별 마커 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열을 포함하고, 상기 선별 마커 서열은 상기 프로모터 및 상기 S/MAR 요소를 개재하고, 바람직하게는 상기 프로모터 및 상기 선별 마커 서열은 함께 선별 마커 유전자를 구성하고, 바람직하게는 상기 선별 마커가 진핵세포의 선별 마커인, 폴리뉴클레오티드.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에서 에피솜 복제하고, 바람직하게는 에피솜 복제가 바람직하게는 적어도 50 회, 바람직하게는 적어도 100 회, 보다 바람직하게는 적어도 250 회 세포 분열 동안 안정한 에피솜 복제인, 폴리뉴클레오티드.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 S/MAR 서열이 상기 프로모터, 임의로는 상기 선별 마커 유전자의 바로 다운스트림에 위치하는, 폴리뉴클레오티드.
18. 구현예 17 에 있어서, 바로 다운스트림에 위치하는 것이 전사 종료 신호 개재가 결핍되어 있고, 보다 바람직하게는 개재 유전자가 결핍되어 있는 것인, 폴리뉴클레오티드.
19. 구현예 17 또는 18 에 있어서, 바로 다운스트림에 위치하는 것이 선별 마커 서열의 전사체가 전사된 S/MAR 서열을 포함하도록 가깝게 위치하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
20. 구현예 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 바로 다운스트림이 선별 마커 유전자의 중지 코돈의 마지막 뉴클레오티드의 최대 250 bp, 바람직하게는 최대 100 bp, 보다 바람직하게는 최대 50 bp 다운스트림인, 폴리뉴클레오티드.
21. 구현예 16 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터가 숙주 세포에서 활성이고, 바람직하게는 항시성 진핵생물 프로모터, 바람직하게는 EF1알파 (연장 인자 1 알파) 프로모터, UbiC (유비퀴틴 C) 프로모터, ROSA 26 프로모터, PGK (포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, 및/또는 CAG (닭 알파-액틴) 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터가 세포 특이적 및/또는 조직 특이적 진핵생물 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
23. 구현예 15 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 선별 마커 유전자가, 바람직하게는 선별 마커 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 업스트림인, 적어도 하나의 인트론을 추가로 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
24. 구현예 15 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 선별 마커 유전자가 퓨로마이신 저항성 유전자, 블라스티시딘 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자, 또는 제오신 저항성 유전자이고, 바람직하게는 퓨로마이신 저항성 유전자인, 폴리뉴클레오티드.
25. 구현예 24 에 있어서, 퓨로마이신 저항성 유전자가:
a) SEQ ID NO:9 의 서열을 포함하는 퓨로마이신 저항성 폴리펩티드의 발현을 초래하고;
b) SEQ ID NO:9 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 퓨로마이신 저항성 폴리펩티드의 발현을 초래하고;
c) SEQ ID NO:10 의 서열을 포함하고;
d) SEQ ID NO:10 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하고;
e) SEQ ID NO:9 의 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어지는 퓨로마이신 저항성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고/하거나
f) SEQ ID NO:9 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어지는 퓨로마이신 저항성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는,
폴리뉴클레오티드.
26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 시미안 바이러스 40 (SV40) 복제 기원, 소 유두종 바이러스 (BPV) 복제 기원 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 복제 기원이 없고, 바람직하게는 폴리오마바이러스 복제 기원, 유두종 바이러스 복제 기원 및 헤르페스바이러스 복제 기원이 없고; 보다 바람직하게는 진핵생물-감염 바이러스의 복제 기원이 없는, 폴리뉴클레오티드.
27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터가 유일한 복제 기원으로서 박테리아 복제 기원을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 S/MAR 요소의 다운스트림에 폴리-A 신호를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 S/MAR 요소에 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체가 측접하는, 폴리뉴클레오티드.
30. 구현예 15 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 선별 마커 유전자가 폴리-A 신호가 없는, 폴리뉴클레오티드.
31. 구현예 15 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 선별 마커 유전자로부터, S/MAR 요소의 서열이 스플라이스 아웃되는 전사체가 전사되는, 폴리뉴클레오티드.
32. 구현예 31 에 있어서, S/MAR 요소의 다운스트림에서의 폴리-A 신호가 상기 스플라이싱에서 보유되는, 폴리뉴클레오티드.
33. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포인, 폴리뉴클레오티드.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자 및/또는 카고 서열을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
35. 구현예 34 에 있어서, 상기 박테리아 선별 마커 유전자가 원핵생물-특이적 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
36. 구현예 34 또는 35 에 있어서, 상기 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자, 바람직하게는 원핵세포에서 활성인 모든 요소가 적어도 하나의 절연 요소에 존재에 의해, 보다 바람직하게는 절연 요소에 의한 측접에 의해, 폴리뉴클레오티드에 포함된 잔류 서열로부터 절연되는, 폴리뉴클레오티드.
37. 구현예 36 에 있어서, 상기 절연 요소가 요소-40 및/또는 S/MAR 요소인, 폴리뉴클레오티드.
38. 구현예 36 또는 37 에 있어서, 상기 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자, 바람직하게는 원핵세포에서 활성인 모든 요소가 5' 말단에서의 적어도 하나의 절연 요소 및 3' 말단에서의 적어도 하나의 절연 요소의 존재에 의해 폴리뉴클레오티드에 포함된 잔류 서열로부터 절연되는, 폴리뉴클레오티드.
39. 구현예 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:12 의 서열 또는 SEQ ID NO:12 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열; 바람직하게는 SEQ ID NO:13 의 서열 또는 SEQ ID NO:13 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:14 의 서열 또는 SEQ ID NO:14 의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 상이한 폴리펩티드, 바람직하게는 치료적 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 인간 T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR), 바람직하게는 MART1 TCR 을 인코딩하는 핵산 서열에 의해 대체된 GFP 를 인코딩하는 핵산 서열을 갖는 SEQ ID NO:14 의 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
41. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:12; 바람직하게는 SEQ ID NO:13; 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:14 의 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
43. 구현예 42 에 있어서, 상기 조성물이 상기 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포로의 진입을 매개하는, 조성물.
44. 구현예 31 또는 32 에 있어서, 상기 조성물이 적어도 하나의 형질감염제를 포함하는, 조성물.
45. 구현예 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 바이러스-유사 입자를 포함하고, 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 바이러스-유사 입자에 포함되는, 조성물.
46. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로서, 바람직하게는 상기 숙주 세포가 CD34+ 전구 세포; CD61+ 혈소판; CD19+ B-림프구; CD14+ 단핵구; CD15+ 과립구; CD3+ 세포독성 T-림프구, 바람직하게는 또한 CD8 및 CD45 에 대해 양성인 CD3+ 세포독성 T-림프구; CD3+ 헬퍼 T-림프구, 바람직하게는 또한 CD4 및 CD45 에 대해 양성인 CD3+ 헬퍼 T-림프구; CD3+ 활성화 T-림프구, 바람직하게는 또한 CD25 및 CD45 에 대해 양성인 CD3+ 활성화 T-림프구, 종양 침윤 림프구, 또는 자연 살해 (NK) 세포인, 숙주 세포.
47. 의약에서 사용하기 위한, 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 구현예 42 내지 45 중 어느 하나에 따른 조성물, 및/또는 구현예 46 에 따른 숙주 세포.
48. 유전적 질환, 바람직하게는 단일유전성 질환, 보다 바람직하게는 단일유전성 열성 질환, 가장 바람직하게는 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레버 선천성 흑암시, 범맥락막위축, 또는 스타가르트병을 치료하는데 사용하기 위한, 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 구현예 42 내지 45 중 어느 하나에 따른 조성물, 및/또는 구현예 46 에 따른 숙주 세포.
49. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 및 세포 진입을 매개하는 화합물을 포함하는 키트.
50. 구현예 49 에 있어서, 상기 세포 진입을 매개하는 화합물이 형질감염 수단인, 키트.
51. 구현예 49 또는 50 에 있어서, 상기 세포 진입을 매개하는 화합물이 상기 폴리뉴클레오티드를 바이러스-유사 입자 내에 패키징하기 위한 패키징 조성물인, 키트.
52. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 구현예 42 내지 45 중 어느 하나에 따른 조성물, 및/또는 구현예 46 에 따른 숙주 세포를 포함하는 장치.
53. 하기 단계를 포함하는, 숙주 세포를 안정적으로 형질감염시키는 방법:
a) 상기 숙주 세포를 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 구현예 42 내지 45 중 어느 하나에 따른 조성물, 및/또는 구현예 46 에 따른 숙주 세포와 접촉시키는 단계, 및
b) 그에 따라, 숙주 세포를 안정적으로 형질감염시키는 단계.
54. 구현예 53 에 있어서, 상기 숙주 세포에 상기 선별 마커 유전자의 존재를 선별하는 선택압을 적용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
55. 구현예 53 또는 54 에 있어서, 상기 선택압이 연속적으로, 또는 바람직하게는 일시적으로 적용되는 방법.
56. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서의 유전적 질환을 치료하는 방법:
a) 상기 대상체를 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 구현예 42 내지 45 중 어느 하나에 따른 조성물, 및/또는 구현예 46 에 따른 숙주 세포와 접촉시키는 단계, 및
b) 그에 따라, 상기 대상체에서의 유전적 질환을 치료하는 단계.
57. 숙주 세포를 안정적으로 유전적 변형시키기 위한, 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도.
58. 약제의 제조를 위한, 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 구현예 42 내지 45 중 어느 하나에 따른 조성물, 및/또는 구현예 46 에 따른 숙주 세포의 용도.
59. 유전적 질환, 바람직하게는 단일유전성 질환, 보다 바람직하게는 단일유전성 열성 질환, 가장 바람직하게는 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레버 선천성 흑암시, 범맥락막위축, 또는 스타가르트병의 치료용 약제의 제조를 위한, 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 구현예 42 내지 45 중 어느 하나에 따른 조성물, 및/또는 구현예 46 에 따른 숙주 세포의 용도.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 전체 개시물 내용 및 본 명세서에 구체적으로 언급된 개시물 내용에 관하여 참조로 본원에 포함된다.
도 1: 유전적으로 변형된 세포 집단의 분석 및 확립 효율: A) 퓨로마이신으로의 4 주 선별 후 형성되는 크리스탈 바이올렛 염색된 콜로니를 갖는 세포 배양 플레이트; 벡터 확립의 효율은 대략 40% 이었음; B) 퓨로마이신 선별된 세포에서의 GFP 형광의 FACS 검출; 형광은 매우 균질하며 비-형광 세포의 수는 매우 낮음; 1= pEPI, 2= pSMARt.
도 2: 확립된 세포 집단으로부터의 pS/MARt 벡터의 플라스미드 회수 결과. pS/MARt 및 pEPI 플라스미드 DNA 로 확립된 Hek293T 세포에서 유래하는 총 DNA 의 박테리아 형질전환에 따른 플라스미드 회수 및 제한 분석.
도 3: 선별된 세포에서 유지된 pSMARt 벡터의 서던 블롯: pS/MART 의 GFP 유전자에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드를 숙주 세포로부터의 추출물 중 BamHI 제한된 벡터 DNA 를 검출하기 위한 프로브로서 사용하였음 (pS/MARt1 ~ 3); 비-형질감염된 벡터를 대조군으로서 사용하였음 ("pS/MARt(+)").
도 4: pS/MART 의 벡터 맵; ori: 박테리아 복제 기원, P2A: 돼지 테스코바이러스-1 로부터의 자가-절단 펩티드 2A 를 인코딩하는 서열, 아포리포B MAR: 아포리포단백질 B 유전자로부터의 S/MAR 서열.
도 5: Hek293T 및 HeLa 세포에서의 pSMARt 의 상이한 형태를 사용한 콜로니 형성 어세이
도 6: pSMARt 는 연속 선별의 부재 하 분열하는 세포에서도 효율적으로 보유됨.
도 7: pSMARt 의 확립 효율은 선별 마커 (A) 와는 관계가 없으나, 프로모터 이전의 절연체 요소의 존재는 이의 확립 효율 (B) 를 증가시킴; 도 7A: 1=pEPI, 2 pSMARt-Ele40-GFP-2A-Puro, 3=pSMARt-Ele40-GFP-2A-G418; B: 1=pSMARt-UCOE, 2=pSMARt-Ele40, 3=pSMARt, 4=pEPI
도 8: pSMARt 벡터는 개월에 걸쳐 일차 인간 CD3+ 세포에서 효율적으로 보유됨.
도 9: SMAR 에 측접하는 스플라이스 접합부의 도입은 분열하는 세포에서 벡터의 확립을 개선시킴. (1) pEPI, (2) pS/MARt, (3) NP, (4) NP-스플라이스 (1,2,3,4 모두 β-inf MAR 를 가짐) (5) pS/MARt, (6) NP스플라이스 (5,6 은 ApoLMAR 을 가짐)
도 10: pSMARt 는 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 에서 유지되며 벡터의 존재는 세포 거동에 영향을 주지 않음.
도 11: pSMARt 벡터는 배발생 및 분화 동안 활성이며, 이들은 후생학적 침묵화에 대해 저항성임.
도 12: pSMARt 는 줄기 세포 분화 동안 전이유전자 GFP 의 발현을 지속시킴.
도 13: pSMARt 벡터로 변형된 CAR-T 세포 및 렌티바이러스의 비교; 실시간 종양 사멸, 인터페론 생성 및 세포독성 분석.
도 14: 생체내 종양 사멸의 분석
도 15: pSMARt 로 변형된 CAR T 세포 및 렌티바이러스의 생체내 유지 및 종양 샘플의 분석; 1= 동형 대조군, 2= 미처리, 3= 모의 T 세포로 처리, 4= CAR 항 인간 CEA 를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입된 T 세포, 5= CAR 항 인간 CEA 를 인코딩하는 pSMARt 로 형질감염된 T 세포.
도 16: 스플라이싱 서열을 함유하는 pS/MARt 및 Nano 벡터로부터의 발현 데이터. pS/MARt 의 상이한 형태로 확립된 Hek293T 세포 집단을, DNA 전달 35 일 후 전이유전자 발현 및 유세포 분석에 의한 퓨로마이신 (0.5 ug/ml) 에서의 선별에 대해 분석하였다 (A). 전이유전자 GFP 의 상대 발현을 평가하고 하우스키핑 유전자 GAPDH 의 발현에 대해 정규화하였다 (B). 도면은 스플라이싱 서열의 도입이 세포에서의 RNA 양을 개선시킴으로써 전이유전자 발현을 개선시킨다는 것을 보여준다. 도(A): (1) pS/MARt, (2) Nano-S/MARt, (3) Nano-S/MARt-스플라이스; 도 (B): (1) pS/MARt, (2) Nano-S/MARt, (3) Nano-S/MARt-스플라이스.
하기 실시예는 단지 본 발명을 설명할 것이다. 이는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 전혀 해석되지 않을 것이다.
실시예 1: 유전적으로 변형된 세포 집단의 분석 및 확립 효율 (도 1)
안정적으로 발현하는 세포를 생성하는데 있어서의 효능을 pEPI 와 비교하여 pS/MARt 를 사용하여 콜로니 형성 어세이에서 평가하였다 (도 4, SEQ ID NO:14). DNA 전달시, GFP 전이유전자 발현에 양성인 세포를 FACS 분류 (FACS Aria II) 를 통해 단리하고, 100 개 세포를 6 cm 세포 배양 접시에 플레이팅하였다. 그런 다음, 0.5 μg/ml 퓨로마이신의 존재 하에 4 주 동안 배양하였다. 4 주 후 세포를 PFA 로 고정시키고 콜로니를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 콜로니 수는 벡터 확립의 효율, 즉 FACS 분류된 플레이팅 세포의 수 당 형성되는 콜로니의 수로서 간주된다. 안정한 세포주의 생성은 40% 초과의 형질감염된 세포가 확립되는데 매우 효과적이다 (도 1A)). 전이유전자 (GFP) 발현 세포의 수를 유세포 분석에 의해 추정하였다. 도 1b) 에서 나타낸 바와 같이, pS/MARt 는 전이유전자의 발현이 음성 세포의 유의한 수 없이 균질한, 변형된 집단을 생성한다.
안정적으로 발현하는 세포를 생성하는 효율을 유세포 분석에 의해 평가하였다. Hek293T 세포를 pEPI 또는 pS/MARt 로 형질감염시켰다. 세포를 35 일 동안 배양한 후, FACS 분석하여 전이유전자 (GFP) 를 지속적으로 발현하는 세포의 비율 및 이의 중간 형광 강도를 측정하였다. 도 1B) 의 상부 패널은, pS/MARt 가 전이유전자의 발현이 강건하고 균질한 유전적으로 변형된 세포의 집단을 생성시킨다는 것을 보여준다. 이는 이종성 및 낮은 수준의 전이유전자 발현을 나타내는 pEPI 로 형질감염된 세포와 대조적이다. 막대 차트는 이들 세포 풀 (pool) 에서 pS/MARt 에 유의한 음성 세포 집단이 없으며 pEPI 주가 전이유전자 발현을 주로 침묵화시키거나 손실한 것을 보여준다. 추가적으로, pS/MARt 주에서 전이유전자의 중간 발현은 실질적으로 더 높다. 실험 세부사항: JetPEI 로의 세포 형질감염, pEPI 에 대해 0.5 ug/ml Puro 및 1 mg/ml G418 로의 선별.
실시예 2: 확립된 세포 집단으로부터의 pS/MARt 벡터의 플라스미드 회수 (도 2)
포유류 세포에서 벡터의 분자적 무결성 및 에피솜 상태를 측정하기 위해 DNA 회수 실험을 수행하였다.
플라스미드 pS/MARt 또는 pEPI 로 확립된 세포로부터 벡터 DNA 를 단리하였다. 이들 세포를 1 주 동안 항생제 퓨로마이신 (0.5 ug/ml) 의 존재 하에 확장시키고, 적어도 30 일 동안 항생제 없이 추가 확장시켰다. 플라스미드 회수를 위해, 확립된 세포로부터의 gDNA 를 Blood&Tissue DNAeasy 키트 (Qiagen) 로 추출하고 DH10B 이. 콜라이로 형질전환하였다. 박테리아를 카나마이신 (50 ug/ml) 을 포함하는 LB-아가 플레이트 상에서 성장시켰다. 12 개 콜로니를 밤새 카나마이신 (50 ug/ml) 을 포함하는 액체 LB 배지에서 성장시키고, 플라스미드 DNA 를 MiniprepKit (Qiagen) 로 추출하였다. 분석을 위해 DNA 소량 추출물 (mini preparations) 을 10 분 동안 37℃ 에서 제한 효소 BamHI (Thermo Fisher) 로 소화시키고, 제한 패턴을 1% 아가로오스 겔에서 처리하였다. 대조군으로서 확립 절차의 시작시 세포를 형질감염시키는데 사용한 DNA 를 동일한 효소로 소화시키고 참조물로서 수행하였다. (A) pS/MART 로부터 단리한 12 개 대표 샘플을 분석하였으며 본래 DNA 벡터와 분자적으로 동등한 것으로 판명되었고, pEPI 로 확립된 세포로부터 회수된 DNA (B) 는 본래 DNA 의 재배열을 명백하게 보여주는 번진 (smeared) 밴드를 갖는 본래 벡터와 분자적으로 다른 것으로 나타났다.
실시예 3: pS/MARt 벡터는 변형된 세포에서 에피솜 유지됨 (도 3)
pS/MARt 벡터가 에피솜으로서 포유류 세포를 변형시키고 있음을 추가로 입증하기 위해, 구조를 서던 블롯 분석에 의해 물리적으로 측정하였다. DNA 형질감염 후 적어도 30 일 동안 배양한 Hek293T 세포 집단을 분석하였다. 게놈 DNA 를 Blood&Tissue DNAeasy 키트 (Qiagen) 로 추출하고, 밤새 37℃ 에서 제한 효소 BamHI (NEB) 로 소화시켰다. 그런 다음, 총 세포 DNA 를 1% 아가로오스 겔 상에서 분리하고, 나일론 멤브레인에 옮겼다. 벡터의 GFP 유전자에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 세포 DNA 내 pS/MARt DNA 를 검출하는데 사용된 방사성 프로브를 생성시켰다. 동일한 크기의 대조군 벡터를 갖는 단일 밴드의 샘플 중 존재는, 확립된 포유류 세포 집단에서의 pS/MARt 의 에피솜 상태를 입증한다. 번짐 및/또는 대체 밴드의 부재는 벡터가 재배열되지도, 세포 게놈에 통합되지도 않았음을 입증한다.
실시예 3: 안정적으로 발현하는 세포를 생성하는데 있어서의 효율 (도 5)
ApoL-MAR 및 베타-IFN-MAR 의 성분을 보유하는 다양한 pS/MARt DNA 벡터에 의해 안정적으로 발현하는 세포를 생성하는데 있어서의 효율을 콜로니 형성 어세이에서 평가하였다. DNA 전달시, 리포터 유전자 GFP 의 발현에 양성인 세포를 FACS 분류 (FACS Aria II) 를 통해 단리하고, 100 개 세포를 6 cm 세포 배양 접시에 플레이팅하였다. 그런 다음, 세포를 4 주 동안 0.5 g/ml 퓨로마이신의 존재 하에 배양하였다. 4 주 후 세포를 PFA 로 고정시키고 콜로니를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 정량하였다. 콜로니의 수는 벡터 확립 효율로서 간주된다. 어세이는 ApoL MAR, 코어 (Core) 서열 또는 단편 (Fragment) 2 로 조작된 벡터가 유전적으로 변형된 세포의 생성에 있어서 가장 효율적임을 보여준다.
실시예 4: 선별의 부재 하의 안정성 (도 6)
절연체 (insulator) 서열이 DNA 벡터의 손실 또는 침묵화를 방지할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 항생제 선별의 부재 하에 (A) pSMARt-절연체-GFP-2a-Puro 베타 인터페론 MAR 또는 (B) pSMARt-절연체-GFP-2a-Puro ApoL MAR 로 형질감염된 세포에서 GFP 의 전이유전자 발현을 측정하였다. 세포를 DNA 벡터로 형질감염시키고, 1 ug/ml 퓨로마이신 중 배양하였다. 1 주 후 세포를 분할시키고, 약물을 각각의 형질감염으로부터의 세포의 대표군으로부터 제거하였다.
(1) pSMARt-절연체-GFP-2a-Puro 베타 인터페론 MAR - 연속 선별로 배양
(2) pSMARt-절연체 GFP-2A-Puro 베타 인터페론 MAR - 선별 제거
(3) pSMARt-절연체-GFP-2a-Puro ApoL MAR - 연속 선별로 배양
(4) pSMARt-절연체 GFP-2A-Puro ApoL MAR - 선별 제거
실시예 5: 확립 효율 (도 7)
확립 효율에 대한 선별 마커의 영향을 평가하기 위해, 도 5 에서 기재된 바와 같은 콜로니 형성 어세이를 수행하였다. 도 7 (A) 는 DNA 벡터 pS/MARt 로의 확립 효율이 항생제 선별 마커와 관계가 없음을 보여준다. 선별 마커는 S/MAR 모티프에 전사적으로 연결되는 경우 확립 효율을 개선시킨다. 도 7 (B) 는 박테리아 백본과 진핵생물 프로모터 사이에 절연 요소가 추가적으로 통합된 확립의 개선된 효율을 설명한다.
실시예 6: 일차 세포에서의 안정성 (도 8)
일차 인간 CD3+ 세포를 형질감염시키는 본 DNA 벡터 시스템의 효능을 평가하고 그의 발현 프로파일을 측정하기 위해, pS/MARt 벡터 시스템 및 GFP 인코딩 pEPI 의 3 개 변이체를 형질감염시키고, 인간 T 세포에서 리포터 유전자 GFP 의 지속 발현을 제공하는 능력을 시험하였다. DNA 벡터를 전기 이동 (electro-transfer) (Nucleofector Device Y, Lonza) 을 통해 신선하게 단리된 PBMC 에 전달하고, 세포를 IL-2 (5 μg/ml, Biolegend) 의 존재 하에 35 일 동안 배양하였다. 7 일마다 세포를 전이유전자 발현에 대해 확인하고, 항체 항-CD28 (Bioegend) 및 항-CD3 (Biolegend) 의 배지 중 첨가를 통해 그의 성장을 자극하였다. ApoLMAR 의 코어 형태를 가지는 pS/MARt 는, 전장 ApoL-MAR 서열, βIFN MAR 보유 pS/MARt 및 pEPI 에 대해 비교시, 더 높은 수의 전이유전자 발현 세포를 생성시킬 수 있다.
실시예 7: MAR 스플라이싱 (도 9)
확립 효율이 스플라이싱 서열의 도입에 의해 개선될 수 있음을 입증하기 위해, MAR 요소에 측접하는 스플라이스 공여체 및 수용체 위치가 존재하거나 부재하는 일련의 DNA 벡터를 생성하였다. 확립 효율에 대한 스플라이싱 요소의 영향을 평가하기 위해, 도 5 에서 기재된 바와 같은 콜로니 형성 어세이를 수행하였다.
DNA 벡터의 확립 효율은 박테리아 백본의 개선 및 최소화시에 상당히 개선된다. 이전에 열거된 개선으로, 즉 선별 마커 및 절연체 서열 및 이의 보다 현대적이고 개선된 백본 pS/MARt 는 pEPI 보다 효율적으로 확립된다. 그 결과 백본의 최소화는 이를 더 개선시킨다 (도 9 (3)). mRNA 로부터 S/MAR 요소를 제거하기 위한 스플라이싱 서열의 도입은 이러한 부류의 벡터의 효율을 거의 2 개 증가시킨다. 이러한 효과는 상이한 S/MAR 요소 (5-6) 를 포함하는 벡터의 유사한 조성물로 재현될 수 있다.
실시예 8: 줄기 세포에서의 pS/MARt (도 10)
pS/MARt 가 분자적 손상 없이 줄기 세포를 효과적으로 변형시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 안정한 줄기 세포주를 생성하였다. E14 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 주를 pS/MARt-GFP 벡터로 확립하였다. 리포터 유전자 GFP 의 발현을, 형광 현미경 (A) 을 통해 DNA 전달 1 개월 후 측정하였다. pS/MARt-GFP 로 변형된 mESC 를, 에피솜 벡터의 존재가 다능성 특징을 변경시키지 않는다는 것을 보여주는 가장 보편적인 다능성 마커로 염색하였다.
실시예 9: 배발생에서의 pS/MARt (도 11 및 12)
pSMARt-GFP 표지된 mESC 를 C57BL/6 마우스의 배반포에 주사하여, 키메라의 형성을 초래하였다. 이들 키메라로부터의 조혈 기관, 예컨대 비장 및 골수를 pan 혈액 표면 마커 (CD45) 로 염색하고 이의 형광을 유세포 분석에 의해 분석하였다. C57BL/6 마우스 및 항시성 발현 UBC::GFP 마우스를 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 사용하였다 (도 11).
pS/MARt 는 조혈 분화 동안 전이유전자의 지속적인 발현을 매개한다. mESC 를 HSC 로 분화시키고, 이를 분화 과정 이전 (제 0 일) 및 이후 (제 6 일) 에 유세포 분석에 의해 분석하였다. 모세포 및 표지된 세포 둘 모두는 HSC 로 성공적으로 분화되었고, pS/MARt-GFP 로 태깅된 세포는 절차 전체에 걸쳐 리포터 유전자의 발현을 유지하였다 (도 12).
실시예 10: 렌티바이러스와의 비교 (도 13)
(A) 둘의 상이한 건강한 공여체로부터 분류된 CD3+ 세포를, 인간 CEA 에피토프에 대한 표적화를 제공하는 CAR272 를 발현하는 S/MARt DNA 벡터로 변형시키고, 그의 세포용해 활성을 세포독성 및 인터페론-γ 방출 어세이를 사용하여 MCF-7 세포 (유방암 세포주) 에서 확인하였다.
(B) CAR272 를 발현하는 S/MARt 벡터 시스템으로 조작된 T-세포는, 동일한 발현 카세트를 가지는 렌티바이러스로 변형된 CD3+ 세포와 비교시 개선된 사멸 활성을 나타낸다.
실시예 11: 종양 사멸 (도 14 및 15)
S/MARt DNA 벡터 시스템, 렌티바이러스 및 차세대 NanoS/MARt DNA 벡터로 생성된 CAR-T 세포의 생체내 분석 (도 14).
NOD/SCID 마우스 (n=6) 에 2x106 HT29 종양 세포를 피하 접종하였다. S/MARt DNA 벡터, 렌티바이러스 및 차세대 NanoS/MARt DNA 벡터로 생성된 3x105 CAR+ T-세포를 종양 세포 주사 후 7 일에 사전 화학요법 또는 방사선요법 없이 각각의 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 변형된 세포의 종양 표적화 효능을 모의 전기천공된 CD3+ 과 비교하고 종양 성장 (A) 및 마우스 생존 (B) 으로서 기록하였다.
과성장 종양 (상기 기재한 종양으로부터 단리됨) 을 외식하고, 분리하고, CAR 표적의 존재에 대해 분석하였다 (도 15). 종양 덩어리 내의 CAR+ CD3 의 빈도 뿐만 아니라 비장에서 CD3 을 발현하는 CAR 의 존재를 분석하였다.
남아 있는 종양은 표적화된 에피토프가 결여된 종양 세포만을 포함하는데, 이는 S/MARt 처리된 T-세포가 렌티바이러스 대조군과 적어도 유사한 수준으로 종양 세포를 사멸시키고 제거하는데 효과적이었음을 설명한다. 추가적으로, CAR-T 양성 세포는 여전히 종양 내에서 검출가능하게 침윤성이며 비장을 채우는데, 이는 DNA 벡터가 트랜스제닉 T-세포 내에서 여전히 활발하게 발현되고 있음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Deutsches Krebsforschungszentrum <120> Non-Integrating DNA Vectors for the genetic modification of Cells <130> DK14791PC <150> EP17191829.5 <151> 2017-09-19 <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atta 4 <210> 2 <211> 5 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 attta 5 <210> 3 <211> 11 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 taaatatttt a 11 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 attataaata ttttaatta 19 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atttaattat aaatatttta atta 24 <210> 6 <211> 525 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atttataaaa tattgaatta taaaatatgt aattataaat actttaatta taaaatatgt 60 aattataaat actttaatta taaaatatgt aattataaat actttataaa atatgtaatt 120 ataaaatatg taattataaa cattttaatt ataaaatatg taattataaa cattttaatt 180 ataaaatatg taattataaa cattttaatt ataaaatatg taattataaa cattttaatt 240 ataaaatatg taattataaa cattttaatt ataaaatatt taattataaa cattttaatt 300 ataaaatatt taattataaa 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Trp Phe Leu Ala Thr Val 115 120 125 Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val 130 135 140 Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu 145 150 155 160 Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe 165 170 175 Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys 180 185 190 Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala 195 <210> 10 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> puromycin acetyltransferase encoding sequence, synthetic construct <400> 10 atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc ccgggccgta 60 cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgacccggac 120 cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180 atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240 agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300 tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360 cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420 agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480 gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540 gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 600 <210> 11 <211> 1031 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> anti-repressive element40 <400> 11 gatcaagaaa gcactccggg ctccagaagg agccttccag gccagctttg agcataagct 60 gctgatgagc agtgagtgtc ttgagtagtg ttcagggcag catgttacca ttcatgcttg 120 acttctagcc agtgtgacga gaggctggag tcaggtctct agagagttga gcagctccag 180 ccttagatct cccagtctta tgcggtgtgc ccattcgctt tgtgtctgca gtcccctggc 240 cacacccagt aacagttctg ggatctatgg gagtagcttc cttagtgagc tttcccttca 300 aatactttgc aaccaggtag agaagtttgg agtgaaggtt ttgttcttcg tttcttcaca 360 atatggatat gcatcttctt ttgaaaatgt taaagtaaat tacctctctt ttcagatact 420 gtcttcatgc gaacttggta tcctgtttcc atcccagcct tctataaccc agtaacatct 480 tttttgaaac cagtgggtga gaaagacacc tggtcaggaa cgcggaccac aggacaactc 540 aggctcaccc acggcatcag actaaaggca aacaaggact ctgtataaag taccggtggc 600 atgtgtatta gtggagatgc agcctgtgct ctgcagacag ggagtcacac agacactttt 660 ctataatttc ttaagtgctt tgaatgttca agtagaaagt ctaacattaa atttgattga 720 acaattgtat attcatggaa tattttggaa cggaatacca aaaaatggca atagtggttc 780 tttctggatg gaagacaaac ttttcttctt taaaataaat tttattttat atatttgagg 840 ttgaccacat gaccttaagg atacatatag acagtaaact ggttactaca gtgaagcaaa 900 ttaacatatc taccatcgta catagttaca tttttttgtg tgacaggaac agctaaaatc 960 tacgtattta acaaaactcc taaagacaat acatttttat taactatagc cctcatgatg 1020 tacattagat c 1031 <210> 12 <211> 1438 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CMV Promoter - S/MAR sequence <400> 12 ggcattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300 ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa 540 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag aggtcttctc cactcctggc 600 aggctgagtg aaataaagga cttgttattt catctcgagg cctaccggag agccttgcct 660 tgcaaaggca gacagtcagt gaggaagact atgtggcaca tgaagacacc agaggtgttc 720 ctcaggatca aagtatgtac aagcctttgt gaatattttt tccttctcac ttggcaaata 780 caattcctga gatcaataac ctcgtctttt taattttttc ctcgtctttt taactattta 840 taaaatattg aattataaaa tatgtaatta taaatacttt aattataaaa tatgtaatta 900 taaatacttt aattataaaa tatgtaatta taaatacttt ataaaatatg taattataaa 960 atatgtaatt ataaacattt taattataaa atatgtaatt ataaacattt taattataaa 1020 atatgtaatt ataaacattt taattataaa atatgtaatt ataaacattt taattataaa 1080 atatgtaatt ataaacattt taattataaa atatttaatt ataaacattt taattataaa 1140 atatttaatt ataaatattt taattataaa atatttaatt ataaatattt taattataaa 1200 atatttaatt ataaatattt taattataaa atatttaatt ataaatactt taattataaa 1260 atatttaatt ataaatattt taattataaa atatttaatt ataaatattt taattataaa 1320 tattttaatt ataaaatatt taattataaa aacacaatta cctcatcttt ttaaatattt 1380 ttgcaaaata tttccctcca taatttctcc gtttccattt ttattctgtt acttaaat 1438 <210> 13 <211> 2038 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CMV Promoter - Puromycin - S/MAR sequence <400> 13 ggcattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300 ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa 540 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag aggtatgacc gagtacaagc 600 ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tcccccgggc cgtacgcacc ctcgccgccg 660 cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgaccc ggaccgccac atcgagcggg 720 tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg 780 tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg 840 cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc 900 agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg 960 ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc 1020 ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc 1080 gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg 1140 aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc ctgacttctc cactcctggc 1200 aggctgagtg aaataaagga cttgttattt catctcgagg cctaccggag agccttgcct 1260 tgcaaaggca gacagtcagt gaggaagact atgtggcaca tgaagacacc agaggtgttc 1320 ctcaggatca aagtatgtac aagcctttgt 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catcggcaag gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg 1800 gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg 1860 cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg 1920 gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac 1980 caccagggca agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc 2040 gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg 2100 ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg 2160 acccgcaagc ccggtgcctg aagatctatg catgcagaag ttggtcgtga ggcactgggc 2220 aggtaagtat caaggttaca agacaggtcg acttctccac tcctggcagg ctgagtgaaa 2280 taaaggactt gttatttcat ctcgaggcct accggagagc cttgccttgc aaaggcagac 2340 agtcagtgag gaagactatg tggcacatga agacaccaga ggtgttcctc aggatcaaag 2400 tatgtacaag cctttgtgaa tattttttcc ttctcacttg gcaaatacaa ttcctgagat 2460 caataacctc gtctttttaa ttttttcctc gtctttttaa ctatttataa aatattgaat 2520 tataaaatat gtaattataa atactttaat tataaaatat gtaattataa atactttaat 2580 tataaaatat gtaattataa atactttata aaatatgtaa ttataaaata tgtaattata 2640 aacattttaa ttataaaata tgtaattata aacattttaa ttataaaata tgtaattata 2700 aacattttaa ttataaaata tgtaattata aacattttaa ttataaaata tgtaattata 2760 aacattttaa ttataaaata tttaattata aacattttaa ttataaaata tttaattata 2820 aatattttaa ttataaaata tttaattata aatattttaa ttataaaata tttaattata 2880 aatattttaa ttataaaata tttaattata aatactttaa ttataaaata tttaattata 2940 aatattttaa ttataaaata tttaattata aatattttaa ttataaatat tttaattata 3000 aaatatttaa ttataaaaac acaattacct catcttttta aatatttttg caaaatattt 3060 ccctccataa tttctccgtt tccattttta ttctgttact taaataattc tgcagtcgac 3120 ggttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactctaccg cgggcccggg 3180 atccaccgga tctagataac tgatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 3240 tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 3300 tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 3360 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 3420 tgtatcttac atgtgagcaa 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Claims (18)

  1. 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 S/MAR 요소가 상기 프로모터의 다운스트림에 위치하고 상기 S/MAR 요소의 핵산 서열 (S/MAR 서열) 이 최대 200 뉴클레오티드의 스트래치 상에서 100 개 뉴클레오티드 당 적어도 3 개 서열 모티프 ATTA (SEQ ID NO:1) 를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 S/MAR 요소에 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체가 측접하는, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드, 바람직하게는 선별 마커를 인코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하고, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열이 상기 프로모터 및 상기 S/MAR 요소를 개재하는, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 선별 마커를 인코딩하는 코딩 서열 (선별 마커 서열) 을 추가로 포함하고, 상기 선별 마커 서열이 상기 프로모터 및 상기 S/MAR 요소를 개재하고, 상기 프로모터 및 상기 선별 마커 서열이 함께 선별 마커 유전자를 구성하며, 상기 선별 마커가 진핵세포의 선별 마커인, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 선별 마커 유전자가 퓨로마이신 저항성 유전자, 블라스티시딘 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자, 또는 제오신 저항성 유전자이고, 바람직하게는 퓨로마이신 저항성 유전자인, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터로부터, S/MAR 요소의 서열이 스플라이스 아웃 (spliced out) 되는 전사체가 전사되는, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자를 추가로 포함하고, 상기 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자가 적어도 하나의 절연 요소 (insulation element) 의 존재에 의해 폴리뉴클레오티드에 포함된 잔류 서열로부터 절연되는, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 시미안 바이러스 40 (SV40) 복제 기원, 소 유두종 바이러스 (BPV) 복제 기원 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 복제 기원이 없는, 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에서 에피솜 복제하고, 바람직하게는 에피솜 복제가, 바람직하게는 포유류 세포에서 안정한 에피솜 복제인, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서, 바람직하게는 상기 조성물이 약학 조성물인, 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로서, 바람직하게는 상기 숙주 세포가 CD34+ 전구 세포; CD61+ 혈소판; CD19+ B-림프구; CD14+ 단핵구; CD15+ 과립구; 바람직하게는 또한 CD8 및 CD45 에 대해 양성인 CD3+ 세포독성 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD4 및 CD45 에 대해 양성인 CD3+ 헬퍼 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD25 및 CD45 에 대해 양성인 CD3+ 활성화 T-림프구, 종양 침윤 림프구, 또는 자연 살해 (NK) 세포인, 숙주 세포.
  12. 의약에서 사용하기 위한, 바람직하게는 유전적 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제 10 항에 따른 조성물, 및/또는 제 11 항에 따른 숙주 세포.
  13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 및 세포 진입을 매개하는 화합물을 포함하는 키트.
  14. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제 10 항에 따른 조성물, 및/또는 제 11 항에 따른 숙주 세포를 포함하는 장치.
  15. 숙주 세포를 안정적으로 형질감염시키는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 형질감염 방법:
    a) 상기 숙주 세포를 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 및/또는 제 10 항에 따른 조성물, 및/또는 제 11 항에 따른 숙주 세포와 접촉시키는 단계, 및
    b) 그에 따라, 숙주 세포를 안정적으로 형질감염시키는 단계.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 안정적으로 형질감염시키는 것이 폴리뉴클레오티드의 안정한 에피솜 복제, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 평균 50 회 세포 분열 후에도 숙주 세포 집단에서 여전히 검출가능한 정도로의 에피솜 복제를 포함하는, 형질감염 방법.
  17. 숙주 세포를 안정적으로 유전적 변형시키기 위한, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 숙주 세포를 안정적으로 유전적 변형시키는 것이 상기 숙주 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 안정한 에피솜 복제, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 평균 50 회 세포 분열 후에도 숙주 세포 집단에서 여전히 검출가능한 정도로의 에피솜 복제를 포함하는, 용도.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
WO2015105955A1 (en) 2014-01-08 2015-07-16 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
CA3085784A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic transducer driver and controller
EP3942035A1 (en) * 2019-03-18 2022-01-26 Deutsches Krebsforschungszentrum Expression constructs for the genetic modification of cells
CN115066255A (zh) 2019-09-18 2022-09-16 星际治疗有限公司 合成的dna载体和使用方法
WO2022018143A1 (en) 2020-07-22 2022-01-27 Deutsches Krebsforschungszentrum 5' s/mar applications
CN113025651B (zh) * 2021-03-31 2023-03-24 重庆医科大学 靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结构类似物新应用
AU2022299552A1 (en) 2021-06-25 2024-01-04 Oxford Biomedica (Us) Llc Adeno-associated virus packaging systems
WO2023083985A1 (en) 2021-11-11 2023-05-19 Patrick Schmidt Immunoreactive molecules and uses thereof
WO2023083982A1 (en) 2021-11-11 2023-05-19 Universitaet Heidelberg Immunoreactive molecules and uses thereof
WO2023114901A2 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Oxford Biomedica Solutions Llc Methods and compositions for the production of adeno-associated virus
CN115896172A (zh) * 2022-09-29 2023-04-04 深圳盛源生物技术有限公司 一种快速建立果蝇细胞稳定表达株的共转染载体及其制备方法和应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5888774A (en) 1994-12-19 1999-03-30 Cangene Corporation Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin
FR2738842B1 (fr) 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
US5922583A (en) 1995-10-17 1999-07-13 Biostar Inc. Methods for production of recombinant plasmids
DE19848017A1 (de) 1998-10-17 2000-04-20 Multigene Biotech Gmbh Episomal replizierender Vektor zur Expression eines Transgens in Säugerzellen
FR2821855B1 (fr) 2001-03-09 2004-04-02 Cayla Genes synthetiques et plasmides bacteriens depourvus de cpg
GB0327056D0 (en) 2003-11-20 2003-12-24 Cobra Biolog Ltd Plasmid maintenance
TWI311152B (en) 2004-09-17 2009-06-21 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co K Host-vector system for antibiotic-free cole1 plasmid propagation
CA2586201A1 (en) * 2004-11-03 2006-05-11 Almac Diagnostics Limited Transcriptome microarray technology and methods of using the same
ATE504655T1 (de) * 2005-10-05 2011-04-15 Univ Milano Bicocca Verfahren zur übertragung episomaler vektoren in tierzellen
EP2152889B1 (en) 2007-05-29 2017-03-15 Nature Technology Corporation Vectors and methods for genetic immunization
CA2726862A1 (en) 2008-06-30 2010-01-21 Atgcell Inc. Mammalian cell expression vectors and utilization
EP3093351B1 (en) * 2008-07-09 2018-04-18 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
KR20110044769A (ko) 2008-08-12 2011-04-29 아베스타겐 리미티드 발현 벡터 및 그의 방법
US9045759B2 (en) 2009-01-21 2015-06-02 James Arthur Williams DNA plasmids with improved copy number
EP2476755A1 (en) 2011-01-17 2012-07-18 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH S/MAR containing expression vectors, cell and cell lines as well as methods using the same
GB201213117D0 (en) 2012-07-24 2012-09-05 Ucl Business Plc Transgene expression
US9550998B2 (en) * 2012-08-29 2017-01-24 Nature Technology Corporation DNA plasmids with improved expression
WO2014077863A1 (en) * 2012-11-19 2014-05-22 Nature Technology Corporation Replicative minicircle vectors with improved expression
EP2878674A1 (en) 2013-11-28 2015-06-03 Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) Stable episomes based on non-integrative lentiviral vectors
JP6544565B2 (ja) 2015-04-28 2019-07-17 国立大学法人広島大学 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用
EP3942035A1 (en) * 2019-03-18 2022-01-26 Deutsches Krebsforschungszentrum Expression constructs for the genetic modification of cells

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