KR20110044769A

KR20110044769A - 발현 벡터 및 그의 방법

Info

Publication number: KR20110044769A
Application number: KR1020117005118A
Authority: KR
Inventors: 빌루 모라왈라 파텔; 수니트 마이트야; 아슈토쉬 비야스; 고팔라크리슈난 첼라파
Original assignee: 아베스타겐 리미티드
Priority date: 2008-08-12
Filing date: 2009-08-12
Publication date: 2011-04-29
Also published as: WO2010018444A3; BRPI0918008A2; AU2009280913A1; ZA201101882B; WO2010018444A2; CN102177240A; EP2331693A2; MX2011001644A; CA2736580A1; JP2012506694A

Abstract

본 발명은 재조합 가용성 단백질의 발현을 위한 벡터 및 화합물에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 재조합 가용성 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질의 발현을 위한 핵산 분자, 발현 벡터, 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 사용하여 재조합 가용성 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

발현 벡터 및 그의 방법{AN EXPRESSION VECTOR AND A METHOD THEREOF}

1986년 미국 FDA는 포유동물 세포로부터 유래된 인간 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA; 미국 캘리포니아주 소재의 제넨테크(Genentech)) 단백질이 치료 목적으로 사용될 수 있음을 승인하였다. 세포 배양 및 재조합 DNA 기술이 진보함에 따라 유전공학처리된 세포를 사용함으로써 치료학적으로 가치가 있거나 기타 다른 경제적 가치가 있는 각종의 유사 단백질을 용이하게 발현시킬 수 있게 되었다. 현재 치료용으로 사용될 수 있다는 규제 당국의 승인을 받은 모노클로날 항체가 수개 존재하며, 수백여개가 각종의 개발 및 승인 단계에 있다. tPA와 같이, 이들 단백질들 대부분이 무한증식 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현되지만, 기타 다른 세포주, 예를 들면, 마우스 골수종 (NS0), 새끼 햄스터 신장 (BHK), 인간 배아 신장 (HEK-293)들도 역시 재조합 단백질 생산을 위한 것으로 승인을 받았다.

고등 진핵생물 공급원으로부터 유래된 다수의 생물학적으로 활성인 치료제를 발현시키기 위해서는 대개, 하등 진핵 세포 또는 원핵 세포에서는 천연적으로 일어나지 않는 번역 후 변형이 필요하며, 이에, 고등 진핵생물 공급원으로부터 유래된 세포를 사용하여야 한다. 따라서, 필요시 되는 번역 후 변형은 포유동물 세포주에서도 역시 수행될 수 있기 때문에 일반적으로는 대부분의 치료학적 단백질 생산을 위해서 포유동물 발현 시스템이 바람직하다. 현재, 단백질 발현에 다양한 포유동물 세포 발현 시스템이 이용가능하다. 일반적으로, 발현 벡터는 강한 바이러스 또는 세포 프로모터/인핸서를 사용함으로써 재조합 유전자의 발현을 유도한다. 그러나, 포유동물 세포에서 상기 발현 벡터/시스템으로부터 달성된 재조합 단백질의 발현 수준은 상업적으로 실행 가능하지는 않다. 치료제를 생산하는 동안 처리되어져야 하는 2가지 중요한 문제는 (a) 상기 물질을 제공하는 데 소용되는 시간, (b) 특히, 개발 도상국 또는 후진국에서는 일반 대중이 상기와 같은 물질을 입수하는 데 드는 비용을 감소시키는 것이다. 그러므로, 생명공학 산업에서는 소요되는 시간을 단축시키고 비용을 절감시킬 수 있는 새로운 기술과 공정 개발 전략법에 대한 조사가 계속하여 이루어지고 있다.

TNFR:Fc 융합 단백질로서도 알려져 있는 엔브렐(ENBREL) (이타너셉트(Etanercept))은 인간 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 1B (p75)의 세포외 도메인과 인간 IgG1의 Fc 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질이다. 이는 다수의 환자에서 류마티스 관절염, 다관절 진행형의 연소성 류마티스 관절염, 강직 척추염, 건선성 관절염, 및 건선의 징후와 증상을 감소시켰다는 점에서 류마티스 관절염 치료에 대해 중요한 과학적 진보가 된다. 종양 괴사 인자 (TNF)는 보통 염증 및 면역 반응에 관여하는, 천연적으로 발생된 사이토카인이다. 이는 류마티스 관절염 (RA), 다관절 진행형의 연소성 류마티스 관절염 (JRA) 및 그로 인해 유발된 관절의 병적 이상에서의 염증 진행 과정에서 중요한 역할을 한다. RA 환자의 윤활액 중에서는 TNF의 수준이 증가된 것으로 관찰된다.

TNFR:Fc와 같은 재조합 단백질을 포유동물 세포에서 생산한다는 것은 어려울 수 있는데, 그 이유는 재조합 유전자의 유전적 안정성이 낮고/거나, 재조합 유전자가 침묵화될 수 있기 때문이다. 몇가지 예를 들면, DNA 메틸화, 음성 위치 효과, 통합-의존성 억제 등을 비롯한 수개의 분자 기전이 유전자를 침묵화시킬 수 있다고 보고되었다.

따라서, 당업계에서는 상기 단백질을 대량으로 생산하는 동안 유전적 안정성이 더욱더 높은 발현 시스템을 제공함으로써 공지된 재조합 융합 단백질 생산 방법의 약점을 극복하고자 하는 것이 요구되고 있다. 세포 배양물로부터 대량의 TNFR:Fc를 용이하게 생산할 수 있도록 하기 위해 신규한 발현 벡터가 개발되었다. 이러한 발현 벡터를 사용하면 치료학적 단백질의 발현은 증가하는 것으로 나타났다. 본 출원에서는 TNFR:Fc의 클로닝, 발현, 및 정제를 기술하였다.

요약

본 개시 내용은 첨부되는 특허청구범위에서 언급된 특성들 및/또는 단독 또는 임의의 조합으로 특허받을 수 있는 대상물을 포함할 수 있는 하기의 특성들 하나 이상을 포함한다.

본 발명은 포유동물 및 기타 다른 진핵 세포에서 재조합 단백질의 발현 효율을 증가시키고 안정화시키는 데 사용될 수 있는, 신규의 스캐폴드/기질 부착 부위 (S/MAR) 서열의 발견에 기초한다. S/MAR 서열은 근처 전사 카세트의 유전적 안정성을 증가시키고, 예를 들면, DNA 메틸화와 같은 기전을 사용하여 간섭함으로써 유전자 침묵화를 저해한다. 추가로, S/MAR 서열이 존재하면 위치 효과를 감소시킴으로써 클론-대-클론의 가변성을 감소시킨다고 간주된다.

따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 및 서열 6, 및 그의 변이체 및 기능성 단편, 및 그에 대해 적어도 70％의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산, 또는 엄격한 조건하에서 상기 단리된 핵산에 혼성화하는 서열에 관한 것이다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 스캐폴드/기질 부착 부위 (S/MAR) 서열(들)을 보유하는 발현 벡터 및 그의 임의의 조합(들)에 관한 것이다. S/MAR 서열은 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 및 서열 6, 그의 상보체, 변이체 및 기능성 단편, 및 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool: 기본적인 부분 정렬 탐색 도구) 알고리즘과 같은 매칭 방법을 사용하여 한쌍씩 쌍을 형성하여 이루어지는 DNA 서열 정렬에 의해 측정된 바, 그에 대해 적어도 70％의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 스캐폴드/기질 부착 부위 (S/MAR) 서열(들) 또는 그의 임의의 조합(들), 및 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결되어 있는, 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR) - IgG Fc 융합 단백질을 코딩하는 서열을 수반하는 발현 벡터에 관한 것이다.

S/MAR 서열(들)은 발현 벡터 내 전사 프로모터의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 추가로, S/MAR 서열(들)은 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질을 코딩하는 서열로부터 0 내지 10 kb 거리만큼 떨어진 위치에 위치할 수 있다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 스캐폴드/기질 부착 부위 (S/MAR) 서열(들) 또는 그의 임의의 조합(들)을 수반하는 발현 벡터의 작제 방법에 관한 것이다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 스캐폴드/기질 부착 부위 (S/MAR) 서열(들) 또는 그의 임의의 조합(들)을 수반하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

추가의 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 스캐폴드/기질 부착 부위 (S/MAR) 서열(들) 또는 그의 임의의 조합(들)을 수반하는 발현 벡터를 사용하여 재조합 발현을 통해 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR) - IgG Fc 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

추가의 다른 실시태양에서, 본 발명은 스캐폴드/기질 부착 부위 (S/MAR) 서열(들) 또는 그의 임의의 조합(들)을 수반하는 발현 벡터에 의해 발현되는 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR) - IgG Fc 융합 단백질에 관한 것이다.

추가의 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR) - IgG Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 수반하는 발현 작제물로 포유동물 세포를 형질감염시키고, 스캐폴드/기질 부착 부위 (S/MAR) 서열(들) 또는 그의 임의의 조합(들)을 수반하는 플라스미드를 사용하여 상기 포유동물 세포를 공-형질감염시킴으로써 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR) - IgG Fc 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

추가의 다른 실시태양에서, 본 발명은 스캐폴드/기질 부착 부위 (S/MAR) 서열(들)의 생물학적 활성에 영향을 주는 후성적 및 유전적 인자에 관한 것이다.

본 발명은 하기 도면을 참고로 하여 추가 설명될 것이다:
도 1은 플라스미드 벡터 pCDNA3.1/TNFR:Fc의 작제물을 도시한 것이고;
도 2는 플라스미드 벡터 pCDNA3.1/MAR1/TNFR:Fc의 작제물을 도시한 것이며;
도 3은 플라스미드 벡터 pCDNA3.1/MAR2/TNFR:Fc의 작제물을 도시한 것이고;
도 4는 플라스미드 벡터 pCDNA3.1/MAR3/TNFR:Fc의 작제물을 도시한 것이며;
도 5는 플라스미드 벡터 pCDNA3.1/MAR4/TNFR:Fc의 작제물을 도시한 것이고;
도 6은 플라스미드 벡터 pCDNA3.1/MAR5/TNFR:Fc의 작제물을 도시한 것이며;
도 7은 플라스미드 벡터 pCDNA3.1/MAR6/TNFR:Fc의 작제물을 도시한 것이다.

본원에서 사용되는 바, "스캐폴드/기질 부착 부위 (S/MAR)"라는 용어는 단백질 스캐폴드 또는 세포 핵 기질에의 주기적인 부착에 의해 진핵생물 게놈의 핵 DNA를 몇몇 60,000개의 크로마틴 도메인으로 조직화시켜 주는 것으로서, 길이가 수백개의 염기쌍 (bp)인 것인 비-공통-유사의 AT가 풍부한 DNA 요소를 의미하는 것이다. 이는 전형적으로 예를 들면, 측면 부위, 크로마틴 경계 부위, 및 인트론과 같이, 비-코딩 부위에서 발견된다.

"적어도 70％의 상동성"이란, BLAST (기본적인 부분 정렬 탐색 도구) 알고리즘과 같은 매칭 방법을 사용하여 한쌍씩 쌍을 형성하여 이루어지는 DNA 서열 정렬에 의해 측정된 바, 뉴클레오티드 서열이 정의된 서열에 대해 적어도 70％의 상동성을 갖는 것인 DNA를 의미하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 기능성 단편"이라는 용어는 발현 효율에 대하여 바람직한 효과를 발휘할 수 있을 정도로 충분히 큰 크기를 갖는 상기 서열의 단편을 의미하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "~의 측면에 위치하는"이라는 용어는, 해당 서열이 발현 벡터에 직접 연결되어 있거나, 연결 DNA 서열이 서열의 바람직한 효과를 방해하지 않는 한, 그 길이가 10 kb 이상까지 일 수 있는 연결 DNA 서열에 의해서 연결되어 있는 것을 의미하는 것이다. 발현 벡터는 최소한 관심의 대상이 되는 유전자와, 그에 작동적으로 연결된 발현 제어 요소를 포함한다.

발현 제어 요소는 일반 조절인자 요소, 예를 들면, 전사 프로모터, 인핸서, 리프레서, RNA 폴리머라제 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 번역 개시 신호, 및 번역 종결 신호를 포함하며, 이는 당업계의 통상의 숙련인에 의해 쉽게 달성될 수 있다.

"상보체"라는 용어는 상보성인 뉴클레오티드 서열을 갖고, 기준 뉴클레오티드 서열과 비교하였을 때 그 배향이 역방향인 핵산 서열을 의미한다. 예를 들면, 서열 5' ATGCACGGG 3'은 5' CCCGTGCAT 3'과 상보성이다.

본원에서 사용되는 바, "변이체"라는 용어는, 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 결실, 치환, 또는 첨가되어 있는, 구체적으로 동정된 서열과는 상이한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 변이체는 천연적으로 발생된 대립유전자 변이체, 또는 비천연적으로 발생된 변이체일 수 있다. 변이체는 동일 종으로부터 또는 기타 다른 종으로부터 유래된 것일 수 있고, 호몰로그, 파라로그 및 오솔로그를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 변이체는 해당 서열의 생물학적 활성과 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 가진다.

변이체 폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명의 서열과 바람직하게 적어도 50％, 더욱 바람직하게, 적어도 51％, 더욱 바람직하게, 적어도 52％, 더욱 바람직하게, 적어도 53％, 더욱 바람직하게, 적어도 54％, 더욱 바람직하게, 적어도 55％, 더욱 바람직하게, 적어도 56％, 더욱 바람직하게, 적어도 57％, 더욱 바람직하게, 적어도 58％, 더욱 바람직하게, 적어도 59％, 더욱 바람직하게, 적어도 60％, 더욱 바람직하게, 적어도 61％, 더욱 바람직하게, 적어도 62％, 더욱 바람직하게, 적어도 63％, 더욱 바람직하게, 적어도 64％, 더욱 바람직하게, 적어도 65％, 더욱 바람직하게, 적어도 66％, 더욱 바람직하게, 적어도 67％, 더욱 바람직하게, 적어도 68％, 더욱 바람직하게, 적어도 69％, 더욱 바람직하게, 적어도 70％, 더욱 바람직하게, 적어도 71％, 더욱 바람직하게, 적어도 72％, 더욱 바람직하게, 적어도 73％, 더욱 바람직하게, 적어도 74％, 더욱 바람직하게, 적어도 75％, 더욱 바람직하게, 적어도 76％, 더욱 바람직하게, 적어도 77％, 더욱 바람직하게, 적어도 78％, 더욱 바람직하게, 적어도 79％, 더욱 바람직하게, 적어도 80％, 더욱 바람직하게, 적어도 81％, 더욱 바람직하게, 적어도 82％, 더욱 바람직하게, 적어도 83％, 더욱 바람직하게, 적어도 84％, 더욱 바람직하게, 적어도 85％, 더욱 바람직하게, 적어도 86％, 더욱 바람직하게, 적어도 87％, 더욱 바람직하게, 적어도 88％, 더욱 바람직하게, 적어도 89％, 더욱 바람직하게, 적어도 90％, 더욱 바람직하게, 적어도 91％, 더욱 바람직하게, 적어도 92％, 더욱 바람직하게, 적어도 93％, 더욱 바람직하게, 적어도 94％, 더욱 바람직하게, 적어도 95％, 더욱 바람직하게, 적어도 96％, 더욱 바람직하게, 적어도 97％, 더욱 바람직하게, 적어도 98％, 및 가장 바람직하게 적어도 99％의 동일성을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, "서열 모티프"라는 용어는 보다 큰 올리고뉴클레오티드 서열 중에 포함되어 있는 적어도 2개의 뉴클레오티드로 구성된 특정의 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것이다. 서열 모티프는 올리고뉴클레오티드 서열 중에 1번 존재할 수 있거나, 수회에 걸쳐 존재할 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 5'-AUCAUCAUG-3'에는 서열 모티프 5'-AU-3'이 3회에 걸쳐 존재하고, 서열 모티프 5'-UC-3' 및 5'-CA-3'이 2회에 걸쳐 존재하며, 서열 모티프 5'-UG-3'이 1회에 걸쳐 존재하는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "후성적 인자"라는 용어는 실시 중에는 유전자 또는 유전자 세트의 발현을 효력을 발휘하고, 내부 인자, 예로서, 단백질, 핵산 등을 포함하는 것으로서, 임의의 내부 과정 또는 인자를 의미하는 "유전적 인자"와는 대조적인 의미를 지니는, 임의의 외부 과정 또는 인자를 의미하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "TNFR:Fc 수용체 단백질" 또는 "TNFR:Fc"라는 용어는, 인간 TNFRII (p75) 단백질의 세포외 도메인과 유사한 아미노산 서열을 갖고, 그의 천연 리간드 TNF-알파에 결합함으로써 결과적으로는 TNF-알파가, 세포막에 결합되어 있는 TNFRI 또는 TNFRII에 결합하지 못하도록 그를 저해시킬 수 있는 단백질을 의미하는 것이다. 알려진 바와 같이, 존재하는 2가지 상이한 형태의 TNFR 중 본 발명에서 바람직한 TNFR은 TNFRII (p75)이다. 가용성 TNFR 작제물에는 세포가 밖으로 분비하는 것을 촉진시켜 주는 트랜스막 부위가 존재하지 않는다. 세포외 도메인인 TNFRII의 가용성 부분은 프레임 내에서 인간 IgG1의 Fc 부위에 융합된다. 본 발명의 융합 단백질은 생물학적으로 활성이며, 즉, 본 융합 단백질은 용액 중 TNF에 결합할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "생체분자"라는 용어는 당, 아미노산, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 유기 분자, 합텐, 에피토프, 생물학적 세포, 생물학적 세포의 일부분, 비타민, 호르몬 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로서, 생물학적 환경과 관련된 물질, 화합물 또는 성분을 의미하는 것이다.

"발현 시스템"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질을 생산하는 데 사용되는 임의의 생체내 또는 시험관내 생물학적 시스템을 의미하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "재조합"이라는 용어는 단백질이 재조합 발현 시스템으로부터 유도된 것을 의미하는 데, 여기 본 명세서에서 재조합 발현 시스템은 포유동물 세포 기반의 발현 시스템이다.

본원에서 사용되는 바, "단리된 DNA 서열"이라는 용어는 분리된 단편 형태의, 또는 보다 큰 DNA 작제물의 일부로서의 DNA 중합체를 의미하는 것이다. 그러한 서열은 발현 벡터 중에서 클로닝될 것이며, DNA 단편의 동정, 조작 및 회수를 위해 더 많은 양으로 서열 분리가 이루어질 것이다. 그러한 서열은 비번역 DNA 부위 또는 인트론에 의한 어떤 간섭없이 오픈 리딩 형태로 제공될 것이다.

본원에서 사용되는 바, "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드의 이종중합체를 의미하는 것이다. 본 발명에 의해 제공되는 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 cDNA 단편 및 단쇄의 올리고뉴클레오티드 링커로부터, 또는 일련의 올리고뉴클레오티드로부터 조립됨으로써 재조합 전사 유니트로 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공할 수 있다.

"염색체"는 세포 내부에서 발견되는 조직화된 구조를 갖는 DNA 및 단백질이다.

"크로마틴"은 진핵 세포의 핵 내부에서 발견되는 것으로서, 염색체를 구성하는 것인, DNA 및 단백질의 복합체이다.

"DNA" 또는 "데옥시리보핵산"은 유전적 정보를 포함한다. 이는 상이한 뉴클레오티드 A, G, T 또는 C로 구성된다.

본원에서 사용되는 바, "유전자"란 주어진 성숙 단백질을 코딩하는 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 서열을 의미하는 것이다. 이는 예를 들면, RNA 전사 개시 신호, 폴리아데닐화 부가 부위, 프로모터 또는 인핸서와 같이, 번역되지 않는 것으로서 측면에 위치하는 부위는 포함하지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "전사 프로모터"라는 용어는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어하는 핵산 서열을 의미하는 것이다. 프로모터는 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 또는 자연 상태에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있다. 프로모터는 숙주 세포에서 전사 활성을 보이는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포와 동종성이거나 이종성인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 적합한 프로모터의 예로는 SV40 프로모터, MT-1 (메탈로티오네인 유전자) 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 최조기 프로모터 등이 있다.

"전사 인핸서"란 유전자의 위치 또는 배향과는 상관없이 유전자의 전사를 개시키는 작용을 하는 유전자 서열을 의미하는 것이다.

"전사 리프레서"는 유전자의 위치 또는 배향과는 상관없이 유전자의 전사를 억제시키는 작용을 하는 유전자 서열을 의미하는 것이다.

"신호 펩티드"라는 용어는 분비되는 성숙 단백질보다 선행하는 아미노 말단 폴리펩티드를 의미하는 것이다. 절단되기 때문에 성숙 단백질에는 신호 펩티드가 존재하지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "단백질"이라는 용어는, 하나의 아미노산 (또는 아미노산 잔기)의 알파-탄소에 결합된 카르복실산기의 카르복실 탄소 원자가 인접한 아미노산의 알파-탄소에 결합된 아미노기의 아미노 질소 원자에 공유 결합하였을 때 발생하는 바와 같이, 펩티드 결합을 통해 연결된, 2개 이상의 개별 아미노산 (천연적으로 발생되었는지 여부와는 상관없이)으로 구성된 임의의 중합체를 의미하는 것이다. 이러한 펩티드 결합 연결, 및 그를 포함하는 원자 (즉, 알파-탄소 원자, 카르복실 탄소 원자 (및 그의 치환체 산소 원자), 및 아미노 질소 원자 (및 그의 치환체 소수 원자))가 단백질의 "폴리펩티드 골격"을 형성한다. 추가로, 본원에서 사용되는 바, "단백질"이라는 용어는 "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어를 포함하는 것으로 이해하여야 한다 (여기서, 이들 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다).

본원에서 사용되는 바, "벡터"라는 용어는 그와 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것이다. 보통 플라스미드로부터 유도되는 벡터는 "분자 운반체"와 같은 기능을 하는 데, 이는 DNA 단편을 숙주 세포 내로 운반하게 될 것이다.

벡터는 편리하게 재조합 DNA 방법에 사용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있고, 최상의 벡터는 대개 그가 그 내부로 도입되는 숙주 세포에 따라 달라지게 될 것이다. 따라서, 벡터는 자율 복제 벡터, 즉, 염색체외 실체로서 존재하는 벡터로서 그의 복제는 염색체 복제와는 무관한 것, 예로서, 플라스미드일 수 있다. 별법으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입되었을 때에 숙주 세포 게놈 내로 통합되어, 그가 그 내부로 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 벡터는 코딩 DNA 서열이 DNA 전사에 필요한 추가의 세그먼트에 작동가능하게 연결된 발현 벡터인 것이 바람직하다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 또는 그 둘 모두의 요소를 함유할 수 있다. "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 세그먼트가 그들의 의도된 목적을 위해 함께 공동으로 기능을 발휘할 수 있도록, 예를 들면, 전사는 프로모터에서 개시되어 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 거쳐 진행되도록 상기 세그먼트들이 배열되어 있는 것을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, "플라스미드"라는 용어는 세균 및 기타 다른 몇몇 유기체에서 발견되는 DNA의 작은 환형 더블 스트랜드 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것이다. 플라스미드는 숙주 세포 염색체와는 독립적으로 복제될 수 있다.

"복제"라는 용어는 그의 주형 DNA 스트랜드로부터 DNA가 합성되는 것을 의미하는 것이다.

"전사"라는 용어는 DNA 주형으로부터 RNA가 합성되는 것을 의미하는 것이다.

"번역"이라는 용어는 메신저 RNA로부터 폴리펩티드가 합성되는 것을 의미하는 것이다.

"시스"라는 용어는 동일 플라스미드 상에 연결되어 있는 2개 이상의 DNA 요소의 배치에 대해 언급하는 것이다.

"트랜스"라는 용어는 2개 이상의 상이한 플라스미드 상에 존재하는 2개 이상의 요소의 배치에 대해 언급하는 것이다.

"배향"이라는 용어는 DNA 서열 중 뉴클레오티드의 순서를 의미하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "단리된 핵산 단편"이라는 용어는 싱글 또는 더블 스트랜드인 DNA 또는 RNA의 중합체를 의미하는 것이다. DNA 중합체 형태인 단리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 세그먼트로 구성될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "유전자 증폭"이라는 용어는 기타 다른 유전자의 카피수의 비례적인 증가없이 특정 유전자 또는 유전자들의 선택적이고 반복적인 복제를 의미하는 것이다. 이는 다수의 유기체에서 중요하고 일반적인 발생적이고 진화적인 과정이다. 유전자 증폭은 (i) 제노푸스(Xenopus) 난모세포에서 관찰할 수 있는, 발생적으로 조절되는 유전자 발현과 (ii) 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)에서 보고된 lac 부위의 증폭으로서 자발적으로 발생되는 유전자 발현, 이 2가지 카테고리로 분류될 수 있다. 포유동물 세포에서 가장 잘 알려진 유전자 증폭은 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)이다.

"형질전환"이라는 용어는 핵산 단편을 숙주 유기체의 게놈 내로 전달함으로써 유전적으로 안정성을 띠는 유전이 이루어지는 것을 의미하는 것이다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "형질전환된" 유기체로서 지칭된다.

"진핵 세포"라는 용어는, 그의 세포가 내부 막과 세포골격에 의해서 복합 구조로 조직화되어 있는, 진핵생물 유기체로부터 유래된 임의의 세포를 의미하는 것이다. 유전자/단백질 조작에 사용될 수 있는 임의의 진핵 세포, 및 세포 배양 조건하에서 유지된 후, 이어서 형질감염될 수 있는 임의의 진핵 세포가 본 발명에 포함될 것이다. 특히 바람직한 세포 유형으로는 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), COS, BHK21, NIH3T3, HeLa, C2C12, HEK, MDCK, 암세포, 및 1차 분화 또는 미분화 세포를 포함한다. 포유동물 세포는 CHO 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, COS 세포, HEK 293 세포 또는 기타 다른 무한증식 세포주를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "형질감염"이라는 용어는 임의의 전달 수단에 의해서 DNA와 같은 외래 물질을 진핵 세포 내로 도입하는 것을 의미하는 것이다. 각종의 형질감염 방법으로는 인산칼슘 형질감염, 전기천공, 리포펙타민 형질감염 및 DEAE-덱스트란 형질감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"형질감염된 세포"라는 용어는 외래 DNA가 진핵 세포 내로 도입되어져 있는 진핵 세포를 의미하는 것이다. 이러한 DNA는 숙주 염색체의 일부가 될 수 있거나, 염색체외 요소로서 복제될 수 있다.

"공-형질감염"이라는 용어는 세포에 대해 외래의 것인 1 초과의 외인성 유전자를 사용하여 진핵 세포를 동시에 형질감염시키는 방법을 의미하는 것이다.

"일과성 유전자 발현"이라는 용어는 소량의 단백질을 신속하게 생산할 수 있는 편리한 방법을 나타낸다. COS 세포는 일반적으로 일과성 발현의 특징을 규명하는 데 사용된다.

"안정적인 유전자 발현"이라는 용어는 숙주 염색체 내로 플라스미드가 안정적으로 통합되었는지에 따라 관심의 대상이 되는 유전자를 영구적으로 발현하는 안정적인 세포주를 제조하는 것을 의미한다.

종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질 활성-코딩 DNA를 포함하는 신규의 진핵성 발현 벡터를 작제하고, 적절한 세포주 내로 형질감염되었을 때 TNFR:Fc 활성이 발현될 수 있도록 유도하였다. 신규의 발현 벡터를 사용하여 가용성 TNFR:Fc를 생산할 수 있다. 재조합적으로 생산된 TNFR:Fc의 활성은 류마티스 관절염, 다관절 진행형의 연소성 류마티스 관절염, 강직 척추염, 건선성 관절염, 및 건선을 비롯한, 각종의 질병을 치료 및 예방하는 데 유용하다.

본 발명은 가용성 TNFR:Fc를 증가된 양으로 생산하는 데 사용되는 신규의 진핵성 발현 벡터에 관한 것이다.

분자 생물학에서 검색 도구의 조기 레파토리의 일부가 된 것은 원핵성 발현 시스템이었다. 원핵생물 시스템에서 재조합 진핵성 단백질을 새로 합성하는 것은 진핵성 유전자 생성물에 많은 문제를 부과하였다. 그중 가장 중요한 2가지 문제는 부적절한 단백질 폴딩 및 조립, 및 번역 후 변형, 주로 당화 및 인산화의 부족이었다. 원핵생물 시스템은 구조성이고/거나 촉매적으로 기능성인 진핵성 단백질을 생산하는 데 적절한 단백질 합성 기구들 모두를 소지하는 것은 아니다. 따라서, 필요한 번역 후 변형이 세포 시스템(들)에 의해 계내에서 처리될 수 있다는 단순한 이유에서 포유동물 발현 시스템은 일반적으로 치료학적 단백질을 제조하는 데 바람직하다. 현재는 재조합 유전자의 일과성 또는 안정적인 발현을 위해 다양한 포유동물 발현 시스템이 이용될 수 있다. 일반적으로, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 안정 발현 시스템 (CHO SES)이 사용된다. 또한, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포, 마우스 L-세포, 및 골수종 세포주, 예로서, J558L 및 Sp2/0 등도 또한 안정적인 형질감염체의 확립을 위해 숙주로서 사용될 수 있다.

그러나, 외래 DNA를 숙주 세포의 게놈 내로 통합시키는 것은 예측할 수 없는 공정이다. 트랜스진 발현은 세포주 사이에서 고도로 가변적이며, 통합을 통해 예상치 못했던 표현형 상의 변화가 일어날 수 있다고 문서상으로 잘 보고된 바 있다. 클론 발현 수준에 있어서 가변성이 크다는 점에 기초가 되는 이유로는 상이한 플라스미드 카피수 및 위치 효과로서 알려져 있는 현상을 포함하는 데, 상기 위치 효과는 최초로는 위치-효과 다양성으로서 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster)에서 기술된 바 있다. 통합 위치는 부분 조절 요소의 활성, 부분 크로마틴 구조 및 DNA 메틸화의 부분적인 상태라는 적어도 3가지 기전을 통해 트랜스진 발현에 영향을 줄 수 있다. 2가지의 공통된 접근법을 사용함으로써 DNA를 음성 위치 효과로부터, 또는 통합-의존성 억제로부터 보호할 수 있다. 한가지 접근법은 부위-특이성 재조합 방법을 사용하여 전사 활성을 띠는 소정의 부위 내로 트랜스진을 직접 통합시키는 것을 포함한다. 또 다른 방법은 크로마틴 경계 부위에서 발견되는 DNA 서열 요소를 발현 벡터 내로 혼입시켜, 통합 부위와는 상관없이 유전자가 그 주변의 크로마틴 영향권으로부터 보호될 수 있도록 하는 것이다. 재조합 단백질 발현의 경우, 크로마틴 경계로서 작용하고, 형질감염된 유전자를 그 주변의 크로마틴 영향권으로부터 보호하는 서열은 절연인자 서열 및 스캐폴드/기질-부착 부위 (S/MAR)를 포함한다.

S/MAR은 시험관내에서 단리된 핵 스캐폴드 또는 핵 기질에 고친화도로 결합하는 DNA 서열이다. 절연인자를 포함하는 트랜스진의 측면에 위치하게 되면 양성 효과는 감소할 수 있고, 이로써, 클론 발현의 가변성이 억제된다고 발현 연구를 통해서 제안되었다. S/MAR은 크로마틴 루프를 핵 기질에 고착시키는, 상대적으로 단쇄인 (길이 100-1000 bp) 서열이다. S/MAR은 다양한 전사 유니트를 포함하는 도메인의 말단 측면에 위치하는 것으로 관찰되었다. 또한, S/MAR은 크로마틴의 전사적으로 활성인 부위에 접합하여 전사는 핵 기질의 표면과 부합하는 염색체 부위에서 개시되는 것으로 나타났다.

그 자체로서, 이들은 독립적인 크로마틴 도메인의 경계를 한정할 수 있고, 이로써 오직 모든 것을 포함하는 시스-조절 요소만이 도메인 내에 있는 유전자의 발현을 제어하게 된다. S/MAR에 대한 다수의 가능성 있는 기능이 조기에 논의된 바 있는데, 그러한 기능으로는 크로마틴 도메인 경계 형성, 크로마틴 입체형태 변형, DNA 복제 개시에 참여, 및 염색체의 크로마틴 구조의 조직화를 포함한다. S/MAR은 중심체 결합 DNA 및 말단 소립체 어레이에서 보편적이며, 중기 동안 염색체 모양의 유지와 유사분열 염색체 조립에 중요한 것으로 보인다. 따라서, S/MAR은 세포 주기 중 상이한 단계 동안 다중의 독립적인 과정에 관여한다.

실험을 통해 동정된 S/MAR의 분석을 통해 전형적인 요소는 그 길이가 300개의 염기쌍 (bp)으로 이루어진 것만큼 단쇄인 것에서부터 수 킬로베이스 (kb)인 것까지인 것으로 밝혀졌다. 이러한 S/MAR은 AT가 풍부한 뉴클레오티드 모티프 (> 70％ A-T)를 비롯한, 수개의 서열 모티프를 포함할 수 있다. 대부분의 MAR은 "MAR 인식 시그네처"로 불리는 MAR-특이 서열을 포함하는 것으로 보이는데, 상기 서열은 200 bp 이내에 2개의 개별 서열, AATAAYAA 및 AWWRTAANNWWGNNNC로 구성된 것인 2부분으로 된 서열이다. MAR 서열임을 나타내는 것으로 제안된 기타 다른 서열은 DNA-이중나선을 풀는(unwinding) 모티프 (AATATATTAATATT), 복제 개시인사 단백질 부위 (ATTA 및 ATTTA), 호모-올리고뉴클레오티드 반복부 (예로서, A-박스 AATAAAYAAA 및 T-박스 TTWTWTTWTT), DNase I-과민성 부위, 잠재적으로 뉴클레오좀이 형성되지 않은(nucleosome-free) 스트레치, 폴리퓨린-폴리피리미딘 트랙, 및 음성 초나선 꼬임의 조건하에서 비-B-DNA 또는 삼중-나선 입체형태를 취할 수 있는 서열이다.

각각, 유크로마틴 및 이종크로마틴 도메인으로 지칭되는, 유전자 발현을 위해 허용되거나, 또는 허용되지 않는 구조로 독립적으로 조직화하는 염색체 도메인들 간의 유전적 경계를 S/MAR이 형성할 수 있다고 추측되었다. S/MAR 요소에 의해 말단절단된 트랜스진은 따라서 그의 발현이 인접한 염색체 환경과 무관하게 유지되는 자가 크로마틴 도메인을 구성할 수 있다. 최근에는 S/MAR이 염색체 환경 내로 함께 삽입된 경우, 인접한 트랜스진의 발현이 증가한 것으로 나타났다. 별법으로, S/MAR은 그의 염색체 통합 부위 주변의 크로마틴의 형태를 활발하게 재조정하여 예를 들면, 아핵의 위치화에서의 히스톤 변형 또는 변화를 매개함으로써 트랜스진 침묵화를 막을 수 있다.

특징이 잘 규명되어 있는, 닭 리소자임 (cLys) 유전자좌의 5'-말단에 접하고 있는 3-kb MAR 요소, 초파리 Scs 경계 요소, hspSAP MAR, 마우스 T-세포 수용체 TCRa, 및 래트 LAP 유전자 제어 부위, 이들 모두 다양한 시스템에서 허용 크로마틴 구조를 매개하는 것으로 보고되었다. 이들 요소를 발현 벡터에 도입하였고, CHO 세포의 안정적인 형질감염에 의해 생성된 트랜스진 발현을 분석하였다. 이들 요소들 대부분은 CHO 세포 풀 중 트랜스진의 발현 수준에 대하여 별로 크지 않은 적당한 효과를 나타내었다. 대조적으로, cLysMAR은 이들 요소 중 두번째로 큰 것보다 6배 더 큰 효과를 나타났다. 또한, 2개의 cLysMAR 요소가 발현 카세트 측면에 위치한 경우에는 발현 수준이 추가적으로 4배 증가한 것으로 나타났다.

cLysMAR의 다중 카피는 크며 (6 kb), 이로 인해 발현 벡터의 크기를 고려할 때 상기와 같은 크로마틴 요소의 일반적인 사용은 제한이 된다. MAR의 다용성을 개선시킬 수 있는 한가지 접근법은 별개의 플라스미드에 트랜스로 트랜스진 발현 카세트, 및 cLysMAR을 다양한 양으로 공-형질감염시키는 것으로 구성된다. 이러한 접근법은 단지 cLysMAR 요소만을 보유하는 플라스미드를 사용하였을 때 얻은 수준보다 더 높은 수준으로 발현을 증진시킨 것으로 나타났다. 따라서, MAR을 보유하는 플라스미드는 간단하게 공-형질감염시에 현 발현 벡터에 첨가됨으로써 발현 수준을 현저히 증가시킬 수 있다. 또다른 접근법에서, cLysMAR의 단쇄의 기능적 요소는 결실 돌연변이유발에 의해 한정되었다. MAR 중 상기 부분은 다량체화되었을 때, 비록 훨씬 더 작은 크기이기는 하지만, 전장의 요소와 동등한 활성을 띠는 것으로 나타났다 (문헌 [P.-A. Girod and N. Mermod, 비공개 데이터]).

다량체 단백질을 생산하는 것은, 효율적인 생산을 위해서는 모든 서브유니트가 화학량적인 수준으로 동등하게 합성되어야 한다는 한가지 중요한 문제에 직면하고 있다. 그러므로, 동일한 발현 신호, 예로서, 프로모터 및 3/-부위를 다른 발현 카세트에서 사용하였다. 중쇄 및 경쇄 발현 카세트를 코딩하고, 다양한 종류의 인접 크로마틴 요소를 포함하는, 2개의 선형 플라스미드를 MAR 요소의 존재하에 또는 부재하에서 CRO 세포 내로 동시에 형질감염시켰다. 이번에도 역시, cLysMAR 요소의 첨가를 통해 단리된 CRO 세포 클론의 평균 및 최대 생산성은 5배 내지 10배 만큼 증가하였다.

최적의 설정 환경 중 하나는 형질감염 믹스에 추가의 MAR 함유 플라스미드를 추가로 첨가함으로써 중쇄 및 경쇄 발현 벡터 각각에 시스로, 및 트랜스로, 이 두가지로 MAR 요소를 첨가하는 것으로 구성되었다. 시스 및 트랜스로 이루어진 cLysMAR의 공-형질감염은 안정적으로 공-형질감염된 세포의 풀에서 평균 발현 수준을 증가시켰다. 또한, 상이한 클론에서의 발현 가변성을 감소시켰고, 이로써, 더 높은 빈도로 높은 분비 수준을 보이는 클론을 단리시킬 수 있게 되었다.

각종의 크로마틴 구조 조절 요소가 트랜스진 발현에 미치는 효과를 비교하는 연구에서 닭 리소자임 5' MAR이 가장 활성을 띠는 서열들 중 하나인 것으로 확인되었다. 이는 또한 각종의 포유동물 세포주에서 조절형 또는 구성적 트랜스진 발현의 수준을 증가시키는 것으로 나타났다. cLysMAR 서열을 포함할 경우, CHO 세포주 내로 형질감염되었을 때에 트랜스진의 전반적인 발현은 증가하였다.

앞서 언급한 바와 같이, 포유동물 발현 시스템에서는 번역 후 변형이 필요하기 때문에 치료학적 단백질을 제조하는 데에는 일반적으로 포유동물 발현 시스템이 바람직하다. 현재 단백질 발현을 위해 다양한 포유동물 세포 발현 시스템이 사용될 수 있다. 그러나, 포유동물 세포에서 상기 발현 벡터/시스템으로부터 달성된 재조합 단백질의 발현 수준은 상업적으로 실행 가능하지는 않다.

엔브렐은 인간-75 kDa (p75) 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 세포외 리간드-결합부가 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결되어 있는 것으로 구성된 이량체 융합 단백질이다. 엔브렐의 Fc 성분은 CH2 도메인, CH3 도메인 및 힌지 부위를 포함하지만, IgG1의 CH1 도메인은 포함하지 않는다. 엔브렐은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 포유동물 세포 발현 시스템에서 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 이는 934개의 아미노산으로 구성되어 있고 그의 겉보기 분자량은 대략 150 kDa이다.

엔브렐은 류마티스 관절염, 다관절 진행형의 연소성 류마티스 관절염, 강직 척추염, 건선성 관절염, 및 건선의 징후와 증상을 감소시켰다는 점에서 중요한 과학적 진보가 된다.

TNF는 보통 염증 및 면역 반응에 관여하는, 천연적으로 발생된 사이토카인이다. 이는 류마티스 관절염 (RA), 다관절 진행형의 연소성 류마티스 관절염 (JRA) 및 그로 인해 유발된 관절의 병적 이상에서의 염증 진행 과정에서 중요한 역할을 한다. RA 환자의 윤활액 중에서는 TNF의 수준이 증가된 것으로 관찰된다. 55 kDa 단백질 (p55) 및 75 kDa 단백질 (p75)인, TNF에 대한 2개의 상이한 수용체 (TNFR)은 천연적으로 단량체 분자로서 세포 표면상에 가용성 형태로 존재한다.

TNF의 생물학적 활성은 어느 세포 표면 TNF 수용체든 간에 그에의 결합에 따라 달라진다. 엔브렐과 같은 단백질은 경쟁적 저해에 의해 TNF의 작용을 저해함으로써 TNF가 그의 세포 수용체에 결합하는 것을 방해하여 TNF가 생물학적으로 불활성이 되도록 만들 것이다.

TNFR의 세포외 도메인이 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합되면 분자는 이량체화됨으로써 혈청 잔류 시간이 증가하여 단백질은 최적의 약동학적 성질을 갖게 된다. 융합 단백질의 두 도메인 모두 인간으로부터 기원한 것이기 때문에 키메라 단백질은 면역 반응을 이상적으로 유도하지 못할 것이며, 이로써 상기 단백질은 인간용으로써 적합한 분자가 된다.

본 발명은 엔브렐을 대량으로 생산할 수 있는 상기 언급한 S/MAR을 사용하는 신규의 발현 벡터에 관한 것이다. DNA 서열의 발현 생성물을 배양 배지로부터 단리시켰을 때, 상기 생성물은 TNFR:Fc의 생물학적 활성을 나타낸다. 벡터 개발, 클로닝 및 서브클로닝, 형질감염, 발효 및 정제에 관한 전략법은 개시되어 있다.

방법론

발현 벡터의 클로닝 및 작제

pCDNA3.1 벡터에서 관심의 대상이 되는 유전자는 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 최조기 프로모터/인핸서에 의해 조절된다. 이를 통해 재조합 단백질은 효과적이고 고도한 수준으로 발현될 수 있다. TOPO 발현 키트의 설명서를 사용하여 관심의 대상이 되는 유전자인 TNFR:Fc를 pCDNA3.1 벡터 내로 클로닝하였다. 먼저 콜로니 PCR에 의해서, 이후 적절한 제한 효소를 사용하여 양성 형질전환체를 확인하였다. BamHI 및 XhoI을 사용하여 이중으로 분해시킴으로써 예상되는 패턴을 수득하였다. 또한, 제한 효소 ApaI 및 SacII를 사용함으로써 확인을 하고, 이를 통해 예상된 패턴임을 입증하였다. 이어서, 삽입체의 서열을 확인하였다.

먼저, PCR에 의해 본원에서는 S/MAR 서열로서 마킹되는 단리된 스캐폴드/기질-부착 부위 (S/MAR)를 pGEMTeasy 벡터 내로 클로닝하고, 적절한 제한 효소 분석과 서열 분석에 의해 확인하였다. 이어서, 제한 부위를 사용하여 클로닝된 S/MAR을 pCDNA3.1 벡터 중 CMV 프로모터 상류에 삽입하였다. 상기 삽입은 제한 분석에 의해 확인하였다.

재조합 TNFR 의 발현

본 경우에서는 재조합 발현 벡터로서 pCDNA3.1을 사용하여 TNFR:Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시켰다. 재조합 발현 벡터는, 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 DNA가 그의 발현을 유도하는 특정 유전자 요소에 연결되어 있는 것인 복제가능한 DNA 작제물이다. 상기와 같은 전사 유니트 조립체는 일반적으로 - 전사 프로모터 또는 인핸서, 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 부위, 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 코딩 서열, 및 형질감염된 포유동물 세포주 클론과 비-형질감염된 포유동물 세포주 클론 사이의 식별에 도움을 줄 수 있는 선별 마커로 구성된다.

포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시키는 것은 본 발명의 일부로서 특히 바람직한데, 그 이유는 상기 단백질이 정확하게 폴딩을 하고, 이로써 전체적으로 기능성을 띤 입체형태를 형성하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 재조합 유전자 발현에 사용될 세포주는 CHO-K1 세포주이며, 이는 동종의 세포 군집이 될 것이다. 재조합 단백질을 코딩하는 안정적으로 통합된 전사 유니트를 포함하는 CHO-K1의 형질감염된 콜로니는 단일 배양물이 될 것이며, 즉, 세포는 단일 선조형 형질전환체의 자손이 될 것이다.

형질전환된 숙주 세포는 완전한 전사 유니트를 포함하는 발현 벡터로 형질전환될 것이다. 발현된 TNFR:Fc 융합 단백질이 배양물 상등액으로 분비될 것이다. 항생제 (네오마이신) 내성을 코딩하는 유전자와 같은 선별 마커를 사용하여 세포주를 선별함으로써 발현 생성물의 수준을 증가시킨다.

상기 기술한 설명과 관련하여 본 발명의 많은 변형들이 당업자에게 제안될 것이다. 그러한 명백한 변형은 첨부되는 특허청구범위에서 의도되는 완전한 범주 내에 포함된다.

서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> Avesthagen Limited PATELL, VILLOO MORAWALA DR <120> An Expression Vector and a method thereof for TNF Alpha <130> <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2960 <212> DNA <213> pCDNA3.1 <400> 1 gatccgtaat acaattgtac caggttttgg tttattacat gtgactgacg gcttcctgtg 60 cgtgctcagg aaacggcagt tgggcactgc actgcccggt gatggtgcca cggtggctcc 120 tgccgccttc tttgatattc actctgttgt atttcatctc ttcttgccga tgaaaggata 180 taacagtctg tgaggaaata cttggtattt cttctgatca gcgtttttat aagtaatgtt 240 gaatattgga taaggctgtg tgtcctttgt cttgggagac aaagcccaca gcaggtggtg 300 gttggggtgg tggcagctca gtgacaggag aggttttttt gcctgttttt tttgttgttt 360 ttttttttta agtaaggtgt tcttttttct tagtaaaatt tctactggac tgtatgtttt 420 gacaggtcag aaacatttct tcaaaagaag aaccttttgg aaactgtaca gcccttttct 480 ttcattccct ttttgctttc tgtgccaatg cctttggttc tgatttgcat tatggaaaac 540 gttgatcgga acttgaggtt tttatttata gtgtggcttg aaagcttgga tagctgttgt 600 tacatgagat accttattaa gtttaggcca gcttgatgct ttattttttt ccctttgaag 660 tagtgagcgt tctctggttt ttttcctttg aaactggcga ggcttagatt tttctaatgg 720 gattttttac ctgatgatct agttgcatac ccaaatgctt gtaaatgttt tcctagttaa 780 catgttgata acttcggatt tacatgttgt atatacttgt catctgtgtt tctagtaaaa 840 atatatggca tttatagaaa tacgtaattc ctgatttcct ttttttttta tctctatgct 900 ctgtgtgtac aggtcaaaca gacttcactc ctatttttat ttatagaatt ttatatgcag 960 tctgtcgttg gttcttgtgt tgtaaggata cagccttaaa tttcctagag cgatgctcag 1020 taaggcgggt tgtcacatgg gttcaaatgt aaaacgggca cgtttggctg ctgccttccc 1080 gagatccagg acactaaact gcttctgcac tgaggtataa atcgcttcag atcccaggga 1140 agtgtagatc cacgtgcata ttcttaaaga agaatgaata ctttctaaaa tattttggca 1200 taggaagcaa gctgcatgga tttgtttggg acttaaatta ttttggtaac ggagtgcata 1260 ggttttaaac acagttgcag catgctaacg agtcacagca tttatgcaga agtgatgcct 1320 gttgcagctg tttacggcac tgccttgcag tgagcgattt gcagataggg gtggggtgct 1380 ttgtgtcgtg ttcccacacg ctgccacaca gccacctccc ggaacacatc tcacctgctg 1440 ggtacttttc aaaccatctt agcagtagta gatgagttac tatgaaacag agaagttcct 1500 cagttggata 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Claims

서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6, 그의 상보체, 변이체, 및 기능성 단편, 및 그에 대해 적어도 70％의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 단리된 핵산.
제1항에 있어서, 하나 이상의 서열이 S/MAR 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
제2항에 있어서, 하나 이상의 S/MAR 서열이 발현 시스템에서 사용될 때, 상기 서열이 생체분자의 발현을 증가시키는 것인 단리된 핵산.
제3항에 있어서, 하나 이상의 S/MAR 서열이 발현 시스템에서 상기 서열의 배향과는 독립적으로 생체분자의 발현을 증가시키는 것인 단리된 핵산.
제3항에 있어서, 생체분자가 단백질인 단리된 핵산.
제3항에 있어서, 생체분자가 융합 단백질인 단리된 핵산.
제6항에 있어서, 융합 단백질이 재조합 가용성 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질인 단리된 핵산.
제2항에 있어서, 하나 이상의 S/MAR 서열이 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 모티프를 포함하는 것인 단리된 핵산.
제8항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 모티프가 적어도 하나의 AT가 풍부한 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 것인 단리된 핵산.
제1항의 단리된 핵산을 발현 벡터 내로 삽입하는 것을 포함하는, 발현 효율이 증가된 발현 벡터를 작제하는 방법.
제10항에 있어서, 발현 벡터가 포유동물 발현 벡터인 방법.
제1항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
제12항에 있어서, 세균 플라스미드, 박테리오파지 벡터, 효모 에피솜 벡터, 인공 염색체 벡터, 또는 바이러스 벡터인 벡터.
제12항에 있어서, 포유동물 발현 벡터인 벡터.
제1항의 단리된 핵산 또는 제12항의 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 재조합 숙주 세포를 생산하는 방법.
제15항에 있어서, 단리된 핵산 또는 발현 벡터가 형질감염에 의해 도입되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 단리된 핵산이 형질감염시에 재조합 숙주 세포의 게놈과 통합되는 것인 방법.
제15항의 방법에 따라 생산된 숙주 세포.
제12항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제18항 또는 제19항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
제18항 또는 제19항에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
(a) 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결되어 있는, 단백질을 코딩하는 서열, 및 (b) 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 및 서열 6, 그의 상보체, 변이체, 및 기능성 단편, 및 그에 대해 적어도 70％의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 S/MAR 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제22항에 있어서, 단백질이 융합 단백질인 발현 벡터.
제22항에 있어서, 단백질이 재조합 가용성 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질인 발현 벡터.
제22항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제25항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
제25항에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
(a) 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결되어 있는, 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질을 코딩하는 서열, 및 (b) 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 및 서열 6, 그의 상보체, 변이체, 및 기능성 단편, 및 그에 대해 적어도 70％의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 S/MAR 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제28항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제29항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
제29항에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
제28항에 있어서, 하나 이상의 발현 제어 요소가 전사 프로모터, 전사 인핸서, 전사 리프레서, 폴리아데닐화 부위, 복제 기점 부위, 번역 개시 신호 및 번역 종결 신호 중 적어도 하나를 포함하는 것인 발현 벡터.
제32항에 있어서, 하나 이상의 S/MAR 서열이 전사 프로모터의 상류에 위치하는 것인 발현 벡터.
제32항에 있어서, 하나 이상의 S/MAR 서열이 전사 프로모터의 하류에 위치하는 것인 발현 벡터.
제32항에 있어서, 하나 이상의 S/MAR 서열이 번역 종결 신호의 하류에 위치하는 것인 발현 벡터.
제32항에 있어서, 하나 이상의 S/MAR 서열이 전사 프로모터의 상류 및 번역 종결 신호의 하류에 위치하는 것인 발현 벡터.
제32항에 있어서, 하나 이상의 S/MAR 서열이 전사 프로모터 및 번역 종결 신호의 하류에 위치하는 것인 발현 벡터.
제28항에 있어서, 하나 이상의 S/MAR 서열이 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질을 코딩하는 서열로부터 0 내지 10 KB 거리만큼 떨어진 위치에 위치하는 것인 발현 벡터.
제28항에 있어서, 하나 이상의 S/MAR 서열이 복제 기점 부위로부터 0 내지 10 KB 거리만큼 떨어진 위치에 위치하는 것인 발현 벡터.
제28항에 있어서, 상기 발현 벡터가 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질의 재조합 발현을 위해 사용되는 것인 발현 벡터.
(a) (I) 단백질을 코딩하는 서열 및 (II) 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6, 그의 상보체, 변이체, 및 기능성 단편, 및 그에 대해 적어도 70％의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 S/MAR 서열을 포함하는 발현 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; (b) 단백질 발현에 적합한 조건하에서 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 발현된 단백질을 단리시키는 단계를 포함하는, 단백질을 생산하는 방법.
제41항에 있어서, 단백질이 융합 단백질인 방법.
제41항에 있어서, 단백질이 재조합 가용성 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질인 방법.
(a) (I) 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질을 코딩하는 서열 및 (II) 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6, 그의 상보체, 변이체, 및 기능성 단편, 및 그에 대해 적어도 70％의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 S/MAR 서열을 포함하는 발현 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; (b) 융합 단백질 발현에 적합한 조건하에서 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 발현된 융합 단백질을 단리시키는 단계를 포함하는, 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질을 생산하는 방법.
제44항에 있어서, 상기 단리된 융합 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
제44항의 방법에 따라 생산된 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질.
(a) 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; (b) 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6, 그의 상보체, 변이체, 및 기능성 단편, 및 그에 대해 적어도 70％의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 S/MAR 서열을 포함하는 플라스미드로 상기 포유동물 세포를 공-형질감염시키는 단계; (c) 융합 단백질 발현에 적합한 조건하에서 형질감염된 포유동물 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 발현된 융합 단백질을 단리시키는 단계를 포함하는, 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질을 생산하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 단리된 융합 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
제47항의 방법에 따라 생산된 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFR)-인간 IgG Fc 융합 단백질.
서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6, 그의 상보체, 변이체, 및 기능성 단편, 및 그에 대해 적어도 70％의 상동성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 하나 이상의 S/MAR 서열의 활성에 영향을 주는 인자.
제48항에 있어서, 유전적 인자, 또는 후성적 인자 중 적어도 하나인 인자.