MX2011002706A - Tornillo radiolucido con marcador radiopaco. - Google Patents

Abstract

Un tornillo para hueso incluye un eje alargado que se extiende longitudinalmente entre un extremo próximo y un extremo distante opuesto. El eje limita un primer pasaje que se extiende por lo menos parcialmente entre el extremo próximo y el extremo distante. El eje se comprende de un material radiolúcido. Un alma se dispone dentro del primer pasaje del eje. El alma puede comprenderse de un material radiolúcido o radiopaco. Una cabeza se forma integralmente con, o se asegura al, extremo próximo del eje o al extremo próximo del alma. La cabeza también puede limitar un segundo pasaje que se extiende a través de la cabeza y se alinea con el primer pasaje. El alma también puede disponerse dentro del segundo pasaje.

Description

UN VECTOR DE EXPRESIÓN Y UN MÉTODO DEL MISMO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a vectores y compuestos para la expresión de . proteínas solubles recombinantes . Más particularmente, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico, vectores de expresión, y células hospederas para la expresión del receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) soluble recombinánte -proteína de fusión Fe de IgG humana. La invención se refiere adicionalmente a un método para preparar el receptof del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) soluble recombinánte -proteína de fusión Fe de IgG humana usando las células hospederas transíectadas con los vectores de expresión, ANTECEDENTES DE LA INVENCION En 1986, la FDA de EUA aprobó la proteína del activador del plasminogeno de tejido humano (tPA; Genentech, CA, EUA) de células de mamífero gue se usa para propósitos terapéuticos. Los avances en el cultivo celular y las tecnologías de ADN recombinánte han facilitado la expresión de una variedad de proteínas similares de valor terapéutico u otro valor económico usando células genéticamente diseñadas. Actualmente existen varios anticuerpos monoclonales, los cuales tienen la aprobación reguladora para uso terapéutico y, varios cientos están en varias etapas de desarrollo y aprobación. Como la tPA, la mayoría de estas proteínas se expresan en células de ovario de hámster chino (CHO) inmortalizadas, pero otras líneas de células, tal como de mieloma de ratón (NSO) , de riñon de hámster bebe (BHK) , de riñon de embrión humano (HEK-293) también se aprueban| para la producción de proteínas' recombinantes .

La expresión de muchos productos terapéuticos biológicamente activos, los cuales se derivan- de fuentes eucarióticas superiores , requiere frecuentemente modificaciones postraduccionales las cuales ocurren naturalmente en las células eucarióticas o procarióticas inferiores, necesitando de esta . manera el uso de células derivadas de fuentes eucarióticas superiores, j Por consiguiente, un sistema de expresión de mamífero se prefiere, generalmente para la manufactura de la mayoría de proteínas terapéuticas, puesto que las modificaciones postraduccionales requeridas también son llevadas a cabo en las líne.as de células. Una variedad de sistemas de expresión de células de mamífero ahora son disponibles para la expresión . de proteínas. Generalmente los vectores de expresión usan un promotor/potenciador viral o celular fuerte para conducir la expresión del gen recombinante . . Sin embargo, el nivel de expresión de una proteina recombinante lograda a partir de estos vectores/sistemas de expresión en células de mamífero no es comercialmente viable. Existen dos problemas críticos durante la producción de productos terapéuticos que necesitan ser tratados (a) el tiempo tomado para proporcionar el material (b) disminuir el precio del material para el acceso a las masas, especialmente en países en desarrollo o subdesarrollados . Por lo tanto, la industria dé la biotecnología continúa analizando nuevas tecnologías y estrategias de desarrollo de proceso que reducirán las fechas límite y costos. ¦ ENBREL (Etanercept) , también conocido como proteína de fusión TNFR:Fc, es una proteína de fusión recombinante que comprende el dominio extracelular de la superfamiliá del receptor del factor de necrosis tumoral humano, miembro IB t I I (p75) y el dominio Fe de la IgGl humana. Es un avance científico importante para el tratamiento de la artritis reumatoide tal que, en muchos pacientes se ha mostrado que reduce los signos y síntomas de la artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular , espondilitis anquilosante, artritis psoriática y psoriasis. El Factor de Necrosis Tumoral (TNF) es una citocina de origen natural que se implica en las respuestas inflamatorias e inmunes normales. Desempeña una función importante en los procesos inflamatorios de la artritis reumatoide (RA) , artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular (JRA) y la patología articular resultante. Niveles elevados de TNF se encuentran en el fluido sinovial de pacientes con RA.

La producción de las proteínas recombinañtes tal como TNFR:Fc dentro de las células de mamífero puede ser difícil debido a la baja estabilidad genética del gen recombinante y/o el silenciamiento del gen recombinant · Se ha reportador que varios mecanismos moleculares pueden ¦ i conducir al silenciamiento génico que incluye metilacipn del ADN, efecto de posición negativo, represión dependiente de integración etcétera, para nombrar algunos.

De esta manera, existe una necesidad en él campo para superar las deficiencias de los métodos conocidos para producir proteínas de fusión recombinañtes, al proporcionar sistemas de expresión con estabilidad genética superior durante la producción a gran escala de estas proteínas. :A fin de facilitar la producción de grandes cantidades de TNFR:Fc del cultivo celular, se ha desarrollado un vector de expresión novedoso. El uso de este vector de expresión se ha mostrado que incrementa la expresión de la prpteína terapéutica. La clonación, expresión, y purificación .del TNFRrFc se ha mencionado en esta solicitud.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente descripción incluye una o más dé las características citadas en las reivindicaciones anexas y/o las siguientes características las cuales, solas io en cualquier combinación, pueden comprender un contenido patentable La presente invención se basa en el descubrimiento de las secuencias novedosas de Región de Fija-ion al i Andamiaje/a la Matriz (S/MAR), las cuales se pueden usar para incrementar y estabilizar el rendimiento de expresión de las proteínas recombinantes en mamíferos y otras células eucarióticas . Las secuencias S/MAR incrementan la estabilidad genética cerca de . los casetes de transcripción e inhiben la silenciación genética al interferir con los mecanismos tal i como metilación del ADN . Adicionalmente, la presencia de secuencias S/MAR se cree que disminuyen la variabilidad de clon a clon a través de los efectos de posición decreciente. i De esta manera, en una modalidad, la presente 1 invención se refiere a un ácido nucleico aislado que ! tiene una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del ] grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: .5, y SEQ ID NO: 6, variantes y fragmentos funcionales de las mismas y secuencias que son por lo menos 70% homologas a las mismas o secuencias que I hibridan al ácido nucleico aislado bajo condiciones de severidad.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector de expresión que lleva secuencia (s) de Región de Fijación al Andamiaje/a la Matriz (S/MAR) y cualquier combinación (es ) de la misma. Las secuencias S/MAR se pueden I seleccionar del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, S;ÉQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SED. ID NO: 6, complementos, variantes y fragmentos funcionales de las mismas y secuencias que son por lo menos 70% homologas ta las mismas como se determina por la alineación de secuencia de ADN por pares usando métodos de coincidencia similares a algoritmo BLAST (Herramienta de Investigación de Alineación . i Local Básica) .

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector de expresión que lleva secuencia (s) de Región de Fijación al Andamiaj e/a la Matriz (S/MAR) o cualquier combinación (es) de la misma, y una secuencia que codifica el receptor de Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - proteína de fusión Fe de IgG enlazada operablemente a unp ó más elementos de control de expresión.

La(s) secuencia (s) S/MAR se puede (n) localizar cadena arriba o cadena abajo del promotor transcripcional dentro del vector de expresión. Además, la(s) secuencia (s; S/MAR se puede localizar en una distancia de 0 a 10 |kb:de la secuencia (s) de Región de Fijación al Andamiaje/a la Matriz o cualquier combinación (es ) de la misma.

En todavía otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para producir el receptor Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - proteína de fusión de Fe de IgG al transfectar una célula de mamífero con un censtructo de expresión que lleva el gen que codifica el receptor de Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - proteína de fusión de Fe de IgG, y co-transfecta la misma célula de mamífero usando un plásmido que lleva la(s) secuencia (s) de Región de Fijación al Andamiaje/a la Matriz (S/MAR) ualquier combinación (es ) de la misma.

En aún una modalidad adicional, la presente invención se refiere a factores epigenéticos y genéticos que afectan la actividad biológica de la(s) secuencia s ) de Región de Fijación al Andamiaje/a la Matriz (S/MAR) BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención se explica adicionalmeríte con referencia a los dibujos en los cuales: La Figura 1 ilustra el constructo delj vector plásmido pCDNA3.1V TNFR: Fe; La Figura 2 ilustra el constructo del vector plásmido pCDNA3.1 /MARI /T FR : Fe ; La Figura 3 ilustra el constructo del| vector plásmido la pCDNA3.1/MAR2/TNFR: Fe; La Figura 4 ilustra el constructo del| vector plásmido pCDNA3.1/MAR3/TNFR: Fe; La Figura 5 ilustra el constructo del| vector plásmido pCDNA3.1/MAR4/TNFR: Fe; La Figura 6 ilustra el constructo del| Vector plásmido pCDNA3.1/MAR5/TNFR: Fe; y La Figura 7 ilustra el constructo del| vector plásmido pCDNA3.1/MAR6/TNFR: Fe DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIO El término "Región de Fijación al Andamiaje/a la Matriz (S/MAR)" como se usa en este documento se refiere a elementos de ADN ricos eon AT similares a los de no consenso de varios cientos de pares base (bp) en longitud, los cuales organizan el ADN nuclear del genoma eucariótico dentro de algunos 60,000 dominios de cromatina, por la |fijación periódica al andamiaje o. matriz de la proteina del núcleo celular. Se encuentran típicamente en regiones no de codificación tales como las regiones de flanqueo, regiones límites de cromatina e intrones.

Con "por ' lo menos 70% de homología" se propone el ADN en donde la secuencia de nucleótidos es por lo menos 70% homologa a una secuencia definida medida por la alineación de secuencia de ADN por pares usando métodos de coincidencia como el algoritmo BLAST (Herramienta de Investigación de Alineación Local Básica) .

El término "fragmentos funcionales de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 6" como se usa en este documento fragmentos de las secuencias de un tamaño suffiiciehtemente grande para tener el efecto deseado sobre los rendimi!entos de expresión El término "flanqueo" como se usa en este documento propone que las secuencias en cuestión se conecten ya sea directamente al vector de expresión o se conecten por las secuencias de ADN de enlace las cuales pueden ser hasta 10 kb o más en longitud siempre y cuando estas secuencias ce enlace no interfieran con el efecto deseado de las secuencias. El vector de expresión comprende en un mínimo un gen de interés y elementos de control de expresión enlazados opera ivamente al mismo.

Los elementos de control de expresión comprenden los elementos reguladores usuales tales como promotores transcripcionales , potenciadores , represores, sitios de enlace de ARN polimerasa, sitios de poliadenilación, señales de iniciación de traducción, y señales de terminación de traducción y se pueden lograr fácilmente por una persona ordinariamente experta en el campo.

El término "complemento" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que tienen una secuencia de nucleótidos complementaria y una orientación inversa como es comparada a una secuencia de nucleótidos de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es una secuencia complementaria a 5' CCCGTGCAT 3' .

Como se usa en este documento, el término "variante" se refiere a . secuencias de polinucleótidos o polipéptidos diferentes de las secuencias específicamente identificadas, en donde uno o más nucleótidos o residuos de aminoácidos se suprimen, se sustituyen, o se agregan. Las variantes pueden ser variantes alélicas de origen natural, o variantes no de origen natural. Las variantes pueden ser de la misma o de otras especies y pueden abarcar homólogos, parálogos y ortólogos. En ciertas modalidades, las variantes poseen actividades biológicas que son las mismas o similares a aquellas de las secuencias en cuestión.

Las secuencias de polinucleótidos variantes exhiben preferiblemente por lo menos 50%, más preferiblemente por lo menos 51%, más preferiblemente por lo menos 52% más preferiblemente por lo menos 53%, más preferiblemente por lo menos 54%, más. .preferiblemente por lo menos 55%, más preferiblemente por lo menos 56%, más preferiblemente por lo menos 57%, más preferiblemente por lo menos 58%, más preferiblemente por lo menos 59%, más preferiblemente por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 61%,¡ más i preferiblemente por lo menos 62%, más preferiblemente por lo menos 63%, más preferiblemente por lo menos 64%, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 66%, más preferiblemente por lo menos 67%, más preferiblemente por lo menos 68%, más preferiblemente por lo menos 69%, más preferiblemente por lo menos 70% ,j más i preferiblemente por lo menos 71%, más preferiblemente por lo menos 72%, más preferiblemente por lo menos 73%, más preferiblemente por lo menos 74%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 76%,; más preferiblemente por lo menos 77%, más preferiblemente por lo menos 78%, más preferiblemente por lo menos 79% más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 81%, más preferiblemente por lo menos 82%, más preferiblemente por lo menos 83%, más preferiblemente por lo menos 84%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 86%, más preferiblemente por lo menos 87%, más preferiblemente por lo menos 88%; más j preferiblemente por lo menos 89%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 91%, más preferiblemente por lo menos 92%, más preferiblemente por lo menos 93%, más preferiblemente por lo menos 94%,;. más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 96%, más preferiblemente por lo menos 97%, más preferiblemente por lo menos 98%, y mucho más preferiblemente por lo menos 99% de identidad a una secuencia de la presente invención .

El término "porción de secuencia", como se usa en este documento, se refiere a una cierta secuencia de nucleótidos de por lo menos 2 nucleótidos comprendidos en una secuencia de oligonucleótidos más grande. Un porción de secuencia puede presentarse una vez en una secuencia de oligonucleótidos, o puede ocurrir cualquier variedad de I veces. Por ejemplo, el oligonucleótido 5' -AUCAUCAUG-3 ' comprende tres ocurrencias del porción de secuencia 5'j-AU-3' i dos ocurrencias de los porciones de secuencia 5-UC-3' i y 5'- Í CA-3' , y una ocurrencia del porción de secuencia 5'-UG-3 .

I El término "factores epigenéticos" como se usa en este documento se refiere a cualquier proceso o tactor externo que, en operación, afecta la expresión de un gen o un conjunto de genes, y contrasta con los "factores genéticos" los cuales se refieren a cualquier proceso o factor interno que incluya factores internos tales como proteínas], 'ácidos nucleicos, etcétera.

Como se usa en este documento, el término pr'oteína del receptor TNFR : Fe" o "TNFR : Fe" se refiere a una proteina que tiene la secuencia de aminoácidos similar al dominio extracelular de la proteina TNFRII humana (p75) y la| cúal se puede enlazar a su ligando nativo del TNF-alfa inhibiendo a su vez el TNF-alfa del enlace a la membrana celular enlazada a TNFRI o TNFRII. De las dos formas distintas de TNFR conocidos que existen, el TNFR preferido de la ¡presente invención es el TNFRII (p75). Los constructos |de TNFR solubles carecen de la región transmembrana para facilitar la secreción fuera de la célula. La parte soluble del TNFRII el cual es el dominio extracelular se fusiona en la estructura a la región Fe de la IgGl humana. La proteina de fusión de la presente invención es biológicamente activa, es decir puede enlazarse a TNF en solución.

El término "biomolécula" como se usa e : este documento se refiere a una sustancia, un compuesto o un componente asociado con un entorno biológico que incluye, pero no se limite a, azúcares, aminoácidos, péptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos, polipéptidos , moléculas orgánicas, haptenos, epítopos, células biológicas, partes de células biológicas, vitaminas, hormonas y los similares .

El término "sistema de expresión" se refiere a cualquier sistema biológico vivo o in vitro que ¡usa para producir una o más proteínas codificadas por un polinucleótido .

El término recombinante" , como se usa |en este documento propone que una proteína se derive de sistemas dé expresión recombinantes, el cual en esta especificación es un sistema de expresión basado en células de mamífero.

El término "secuencia aislada de ADN", como se usa en este documento se refiere a un polímero de ADN en la forma de un fragmento separado o como una parte de un const|ructo de ADN más grande. Estas secuencias se clonarían en los Ivectores de expresión y habilitarían el aislamiento de la secu'encia en grandes cantidades para identificación, manipulación y recuperación del fragmento de ADN. Estas secuencias se proporcionarán en una forma de lectura abierta sin |ningunas interrupciones por las regiones de ADN no traducido o por intrones Como se usa en este documento, el término "secuencia de nucleótidos" se refiere a un heteropolímero de desoxirribonucleótidos . Las secuencias de ADN que codifican las proteínas proporcionadas por esta invención se pueden ensamblar de fragmentos de ADNc y enlazadores de oligonucleótidos cortos, o de una serie de oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético el cual es capaz de ser expresado en una unidad transcripcional recombinante.

'Cromosoma" es una estructura organizada de ADN y proteínas encontradas dentro de la célula.

Cromatina" es el complejo de ADN y pjroteína, encontrado dentro de los núcleos de células eucariótícás , la cual constituye el cromosoma. contienen la información genética. Está constituido de diferentes nucleótidos A, G, T o C.

Un "gen", como se usa en este documento se refiere a una secuencia de desoxirribonucleótidos (ADN) que codifican una proteína madura proporcionada. No incluye regiones de flanqueo no traducidas tal como señales de iniciación de transcripción de ARN, sitios de adición de poliadenilación, promotores o potenciadores .

Como se usa en este documento, el término "promotor transcripcional" se refiere a una secuencia de > ácido nucleicos que controla la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. Los promotores se pueden derivar de un gen nativo, o se componen de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos la cual muestra actividad transcripcional en la célula hospedera y se puede derivar de genes que codifican proteínas ya se homologas o heterólogas a la! célula hospedera. Ejemplos de promotores adecuados son el promotor SV40, el promotor MT-1 (gen de metalotioneína) , el promotor inmediato temprano de citomegalovirus humano etcétera "Potenciador transcripcional" se refiere ¡a la secuencia de genes que actúa para iniciar la transcripción del gen independiente de la posición u orientación del gen.

"Represor transcripcional" se refiere a la secuencia del gen que actúa para inhibir la transcripción del gen independiente de la posición u orientación del gen.

El término "péptido de señal" se refiere a un polipéptido amino-terminal que precede la proteína madura secretada. En la proteína madura no está presente, ya que se escisa Como se usa en este documento, el término "proteína" se refiere a cualquier polímero de dos ó más aminoácidos individuales (ya sea de origen natural o no) enlazado por la vía de enlaces de péptido, como ocurre cuando el átomo de carbono carboxilo del grupo ácido carboxílico enlazado al alfa-carbono de un aminoácido (o residuo de aminoácido) se enlaza covalentemente al átomo de amino-nitrógeno del grupo amino enlazado al alfa-carbono de un aminoácido adyacente. Estos enlaces de péptido y los átomos que los comprenden (es decir, átomos de alfa-carbono, átomos de carbono-carboxilo (y sus átomo de oxígeno sustituyenfe ) , y átomos de amino nitrógeno (y sus átomos de hidrógeno sustituidos)) forman la "cadena principal de polipéptido" de la proteina. Además, como se usa en este documento, el término "proteina" se entiende que incluye los términos "polipéptido" y "péptido" (los cuales, a veces, se pueden usar intercambiablemente en este documento) .

El término "vector" como se usa en este documento se refiere a una molécula . de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazadó. Los vectores, usualmente derivados de. plásmidos, funcionan1 como un "portador molecular", el cual llevará fragmentos de ADN dentro de una célula hospedera.

El vector puede ser cualquier vector el cuál se puede someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante , y la selección del vector dependerá frecuentemente de la célula hospedera dentro de la cual va a ser introducido. De esta manera, el vector puede ser un vector autónomamente de replicación, es decir, un vector el cual existe como ¦ una entidad cromosómica extra, la replicación de la cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce dentro de una célula hospedera, se integra dentro del genoma de la célula hospedera y se replica junto con el cromosoma (s) dentro del cual se ha integrado. El vector es preferiblemente un vector de expresión en el cual una secuencia de ADN de codificación se enlaza operablemente a segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión se deriva de ADN plásmido o viral, o puede contener elementos de ambos. El término, "operablemente enlazado" se indica que los segmentos están arreglados de modo que funcionan con untamente para sus propósitos propuestos, por ejemplo- inicia la transcripción en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifican el polipéptido.

El término "plásmidos", como se usa en , este documento se refiere a estructuras de polinucleótido de doble hebra circulares pequeñas de ADN encontradas en bacterias y en algunos otros organismos. Los plásmidos se pueden replicar independientemente del cromosoma de la célula hospedera El término "repl icación" se refiere a la síntesis de ADN de su hebra de plantilla de ADN.

El término "transcripción" se refiere a la síntesis de ARN de una plantilla de ARN.

El término "traducción" se . refiere a la sínjtesis de un polipéptido de ARN mensajero.

El término "cis" se- refiere a la colocación de dos o más elementos de ADN enlazados al mismo plásmido.

El término "trans" se refiere a la colación de dos o más elementos en dos o más plásmidos diferentes.

El término "Orientación" se refiere al orden de nucleótidos en la secuencia de ADN.

Como se usa en este documento, el termino "fragmento de ácido nucleico aislado" se refiere a un polímero de ADN o ARN que es de hebra individual o doble hebra. Un fragmento de ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

El término "amplificación génica" como se usa en este documento se refiere a la replicación repetida, selectiva de un cierto gen o genes sin el incremento proporcional en el número de copias de otros genes. Es un proceso de desarrollo y evolucionarlo extendido importante en muchos organismos. La amplificación génica . se .puede clasificar en dos categorías (i) expresión génica desarrolladamente regulada como se observa en los ovocitos de Xenopus y (ii) la expresión génica que ocurre espontáneamente como la amplificación de la región lac reportada en la Escherichia coli. La amplificación génica mejor conocida en las células de mamífero es la dihidrofolato reductasa (DHFR) .

El término "transformación" se refiere la transferencia de un fragmento de ácido nucleico dentro del genoma de un organismo hospedero, dando por resultado una herencia genéticamente estable. Los organismos hospederos que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados son referidos como organismos "transformados".

El término "célula eucariótica" se refiere cualquier célula de un organismo eucariótico cuyas células se organizan dentro de estructuras complejas por la membrana interna y el citoesqueleto . Cualquier célula eucariótica que se puede usar para la manipulación de genes-proteínas y también se puede mantener bajo condiciones de cultivo celular y se transfecta subsecuentemente se incluiría en . esta invención. Tipos de células especialmente preferibles incluyen células madre, células madre embriónicas, células de ovario de hámster chino (CHO) , COS, BHK21, NIH3T3, HeLa, C2C12, HEK, MDCK, células cancerosas, y células diferenciadas o no diferenciadas primarias. Las células de mamífero pueden incluir células CHO, células HeLa, células de r¡iñón de hámster bebe (BHK) , células COS, células HEK 293 |u ;'otras líneas de células inmortalizadas.

Como se usa en este documento, término transíección" se refiere a la introducción de material extraño como ADN dentro, de las células eucarióticas por cualquier medio de transferencia. Los diferentes métodos e transfección incluyen, pero no se limitan a, transfección de fosfato de calcio, electroporación, transíeccióri lipofectamina y transfección de DEAE-Dextrano.

El término "célula transíectada" se refiete célula eucariótica en la cual el ADN extraño s!e ha introducido en las células eucarióticas . Este ADN puede ser parte del cromosoma hospedero o se puede replicar | como un elemento extracromosomal .

El término "co-transfección" se refiere ai método de transfectar simultáneamente una célula eucariótica con mas de un gen exógeno extraño a la célula.

El término "expresión génica transitoria" se refiere a un método conveniente para la rápida producción e pequeñas cantidades de proteínas. Las células COS sé' usan I generalmente para la caracterización de la expresión transitoria .

El término "expresión génica estable" se refiere la preparación de líneas de células estables que expresan permanentemente el gen de interés dependiendo de la integración estable del plásmido dentro del cromosoma hospedero .

Se ha construido un vector de expresión eucar;iótico novedoso que comprende el ADN que codifica la actividad del receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TN;FR) , -proteína de fusión Fe de IgG Humana, y conduce la expresión actividad TNFR:Fc cuando se transfecta dentro de una linea de células apropiada. El vector de expresión novedoso se puede usar para producir el TNFR:Fc soluble. La actividad de TNFR:Fc recombinantemente producido es útil en el tratamiento y prevención de variedades de desórdenes que incluyen artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular, espondilitis anquilosante, artritis psoriática, y psoriasis.

La presente invención se refiere a un véctpr de expresión eucariótico novedoso usado para producir TNFR: Fe soluble en cantidad incrementada.

Los sistemas de expresión procarióticosl fueron parte del repertorio anterior de herramientas de investigación en la biología molecular. La síntesis de novo de las proteínas eucarióticas recombinantes en un sistema procariótico impuso una variedad de problemas en el producto de gen eucariótico. Los dos más críticos entre ellos fueron el plegamiento y ensamble de proteínas inapropiadas, y' a la t falta de modificación postraduccional , principalmente glicosilación y fosforilación. Los sistemas procarióticos no poseen toda la maquinaria sintetizadora de proteínas apropiada para reducir una proteína eucariótica estructural y/o catalíticamente funcional. Por lo tanto, los sistemas de expresión de mamíferos son preferidos generalmente para la manufactura de proteínas terapéuticas, por la simple razón de que las modificaciones postraduccionales requeridas se tratarán por el (los) sistema (s) celular (es) in situ. Una variedad de sistemas de expresión de mamífero ahora son disponibles para ya sea la expresión transitoria o estable de genes recombinantes . Generalmente, se usan los sistemas de expresión estables de células de ovario de hámster : chino (CHO) y (CHO SES) . Por otra parte, las células de riñon de hámster bebe (BHK) , células de riñon embriónico humano ; (HEK) 293, células L-ratón, y líneas de células de mieloma como J558L y Sp2/0, etcétera, también se emplean como hospederos para el establecimiento de los transíectantes estables.

Sin embargo, la integración del ADN extraño dentro del genoma de una célula hospedera es un proceso no predecible. Se ha documentado bien que la expresión transgénica es altamente variable entre las lineas de células, y que la integración pueda causar cambios inesperados en el fenotipo. La razón es que basan la gran variabilidad en los niveles de expresión clónales incluyen números de copias de plásmido diferentes y un fenómeno conocido como efecto de posición, el cual se describió inicialmente en la Drosophila melanogaster como la variegación de posición-efecto. La posición de integración puede afectar la expresión transgénica a través de p'or lo menos tres mecanismos: la actividad de los elementos reguladores locales, la estructura de cromatina local, y el estado local de la metilación del ADN. Los procedimientos comunes se pueden usar para proteger el ADN de los efectos de posición negativos o represión dependiente de integración. Un procedimiento implica la integración directa del transgen dentro de un sitio predeterminado que es transcripcionalmente activo usando métodos de recombinación específicos de sitio.

Otro método es incorporar elementos de secuencia de ADN encontrados en las regiones límite de cromatina dentro del vector de expresión, tal que sin considerar sito de integración, el gen se protegerá de las influencias de la cromatina circundante. Para la expresión de la proteína recombinante, las secuencias que se comportan como lílmites de cromatina y protegen los genes transfectados i de las influencias de la cromatina circundante incluyen secuencias aisladoras y regiones de fijación al andamiaje/a la matriz (S/MARs) .

Las S/MARs son secuencias de ADN que enlazan andamiajes nucleares aislados o matrices nucleares e in ; vitro con alta afinidad. Los estudios de expresión sugierei que el flanqueo de un transgen con un aislador podría reducir el efecto de posición, suprimiendo de esta manera la variabilidad' de expresión clonal. Las S/MARs son secuencias relativamente cortas (100-100O bp de largo) que anclan los bucles de cromatina a la matriz nuclear. Las S/MARs se han observado que flanquean los extremos de los dominios que abarcan varias unidades transcripcionales . También se ha observado que las S/MARs llevan conjuntamente las regiones transcripcionalmente activas de . la cromatina tal que la transcripción se inicia en la región del cromosoma que coincide de la superficie de la matriz nuclear.

Como tal, pueden definir limites de dominios de cromatina independientes, tal que solamente los elementos cis-reguladores integrales controlan la expresión dé los genes dentro del. dominio. Una variedad de posibles funciones se han planteado anteriormente para las S/MARs, las cuales incluyen formara limites de los dominios de cromatina, cambiar las conformaciones de la cromatina, participar ¡en la iniciación de la replicación de ADN y organizar la estructura de la cromatina de un cromosoma. Las S/MARs son comunes en el ADN centrómero asociado y arreglos teloméricos, y parece que son importantes en el ensamble de cromosoma mitótico : y el mantenimiento de la forma del cromosoma durante la metafase. De esta manera, las S/MARs se implican en múltiples procesos independientes durante las diferentes etapas del jciclo celular .

Los análisis de las S/MARs experimenjtalmente identificadas han revelado un elemento típico que es tan corto como 300 pares base (bp) y hasta varios kilobases (kb) de largo. Estas S/MARs. pueden contener varias porciones de secuencia, que incluyen porciones de nucleótido ricas en AT (> 70% A-T) . La mayoría de las MARs parece que contienen una secuencia específica, de MAR llamada "firma de reconocimiento i MAR", la cuales una secuencia bipartita que consiste de dos secuencias individuales AATAAYAA y AWWVRTAANNWWGNNNC dentro de 200 bp . Otras secuencias, propuestas por indicativas de las secuencia MAR, son la porción que desenrolla el ADN (??????????????) , sitios de proteínas iniciadoras de replicación (ATTA y ATTTA) , repeticiones de 'homo- ? oligonucleótidos (por ejemplo, las A-box AATAAAYAAA y la T-box TTWTWTTWTT) , sitios I-hipersensibles DNasa, estiramientos sin nucleosoma potencial, pistas de polipurina-polipirimidina y secuencias que pueden adoptar las conformaciones no-B-ADN o helicoidales tiples bajo condiciones de super-enrollamiento negativo. ¦ ,.

Se especuló que la S/MAR podría formar límites genéticos entre los dominios cromosómicos que se organizan independientemente dentro de las estructuras permisivas o no permisivas para la expresión génica, referidos como dominios de eucomatrina y heterocromatina, respectivamente.. Un transgen flanqueado por elementos S/MAR puede constituir' por lo tanto un dominio de cromatina autónomo cuya expresión permanecería independiente del entorno cromosómico adyacente, Recientemente, las S/MARs se han mostrado que incrementan la expresión de los transgenes adyacentes cuando se co-insertan en un entorno cromosómico. Alternativamente, las S/MARs pueden reconfigurar activamente la cromatina alrededor 'de su sitio de integración cromosómica y en consecuencia previenen el silenciamiento transgénico, por ejemplo al meciar las modificaciones de la histona o cambios en la ubicación' sub nuclear.

Un elemento MAR 3-kb bien caracterizado que limita el extremo 5' del sitio de lisosoma de pollo (cLys) , el elemento de límite de Drosophila Scs, MAR hspSAP, el receptor de células T de ratón TCRa, y la región de control de sitio LAP de rata, todos se han reportado que median; las estructuras de la cromatina permisivas en una variedad de sistemas. Estos elementos se introdujeron en los vectores de expresión y la expresión transgénica resultante se sometió a ensayo por la transfección estable de células CHO. La mayoría de estos elementos mostraron efectos modestos en los niveles de expresión del transgen en agrupamientos de células CHO. En contraste, los cLysMAR fueron seis veces más efectivos que el segundo mejor de estos elementos. Por otra parte1, un incremento de cuatro veces adicional en el nivel de expresión se observó cuando dos elementos cLysMAR flanquearon el cásete de expresión.

Múltiples copias de cLysMAR son grandes (6kb);, las cuales restringen en consecuencia el uso general de estos elementos de cromatina tomando en cuenta el tamaño de los vectores de expresión. Un procedimiento para me orar la versatilidad de MAR consiste de co-transfectar el cásete de expresión transgénica, y varias cantidades de cLysMAR en trans sobre un plásmido separado. Esto mostró que mejo'ra la expresión a niveles más altos que aquellos obtenidos con los plásmidos que llevan solamente un elemento cLysMAR. De esta manera, los plásmidos que llevan MAR se pueden agregar simplemente a los vectores de expresión actuales, en las cotransfecciones , para implementar significativamente los niveles de expresión. En otro procedimiento, los elementos funcionales cortos del cLysMAR se definieron por la mutagénesis de supresión. Estas porciones de MAR, cuando se multimerizan, descubrieron que son igualmente activas cómo el elemento de longitud completa, aunque de tamaño mucho más pequeño (P.-A. Girod and N. Mermod, datos no publicados):.

La producción de proteínas multiméricas enfrenta un problema mayor: tiene producción eficiente, todas las subunidades necesitan ser sintetizadas coordenadamente en niveles estequiométricos . Por lo tanto, las señales de expresión idénticas, tales como promotores y 3/-regiones se usaron en los diferentes casetes de expresión. Dos plásmidos linearizados que codifican el cásete de expresión de cadena pesada y ligera y que alojan elementos de cromatina adyacentes de varias clases se transfectaron simultáneamente dentro de las células CRO, en presencia o ausencia de elementos MAR. Nuevamente, la adición de elementos cLysMAR incrementó las productividades promedio y máximas de clones de células CRO aisladas por 5 a 10 veces.

Uno de los ajustes óptimos consistió en agr'egár los elementos MAR tanto en cis, sobre cada lado de los vectores de expresión de cadena pesada y ligera, como en trans, al agregar adicionalmente a la mezcla de transfección un plásmido que contiene MAR adicional. La co-transfección de cLysMAR en cis y trans incrementó el nivel de expresión medio en un agrupamiento de células establemente co-transfectadas . Por otra parte, redujo la variabilidad de expresión en diferentes clones, permitiendo de esta manera el aislamiento de los clones que exhiben altos niveles de secreción en una frecuencia más alta.

El 5' MAR de lisozima de pollo se identificó como una de las secuencias más activa en un estudio que comparó el efecto de varios elementos reguladores de estructura de cromatina sobre la expresión transgénica. También mostró el incremento de los niveles de la expresión tra'nsgénica regulada constitutiva en varias lineas de células de mamífero. La inclusión de la secuencia cLysMAR incrementó la expresión total de los transgenes cuando se co-trahsfectó dentro de la línea de células CHO.

Como se menciona previamente, los sistemas de expresión de mamíferos son preferidos generalmente 1 para manufacturar proteínas terapéuticas, ya que requieren modificaciones pos-traduccionales . Una variedad de sistemas i de expresión de células de mamífero ahora son disponibles para la expresión de proteínas. Sin embargo, el nivel de expresión de la proteína recombinante lograda .a partir de estos vectores/sistemas de expresión en células de mamífero no es comercialmente viable.

El ENBREL es una proteína de fusión diméric que consiste de la porción de enlace de ligando extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) de 75 kilodaltons humano (p75) enlazado a la porción Fe de la IgGl humana.. El componente Fe del Enbrel contiene el dominio CH2, el dominio CH3 y la región bisagra, pero no el domino CH1 de la IgGl. El ENBREL se produce por la tecnología de ADN recombinante en un sistema de expresión de células de mamífero de ovario de hámster chino (CHO) . Consiste de los 934 aminoácidos y tiene un peso molecular evidente de aproximadamente 150 kilodaltons.

El ENBREL es un avance científico importante que ha mostrado que reduce los signos y síntomas de la artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular , espondilitis anquilosante, artritis psoriática, y psoriasis.

El TNF es una citocina de origen natural qµe se implica en respuestas inflamatorias e inmunes normales Desempeña una función importante en los procesos inflamatorios de la artritis reumatoide (RA) , artritis reumatoide juvenil de cursó poliarticular (JRA) y la patología articular resultante. Los niveles elevados de TNF se encontraron en el fluido sinovial de pacientes con RA. Dos receptores distintos para TNF (TNFRs) , una proteína de 55 kilodaltons (p55) y una proteína de a 75 kilodaltons (p75) existe naturalmente como moléculas monoméricas sqbré las superficies celulares y en formas solubles La actividad biológica del TNF es dependiente del enlace a cualquiera de los receptores de TNF de superficie celular. Una proteína como el ENBREL podría inhibir la acción del TNF por la. inhibición competitiva volviendo |de: esta manera el TNF biológicamente inactivo al prevenir ejl enlace de TNF a sus receptores celulares La fusión del dominio extracelular del TNFR a la parte Fe de la IgGl humana permitiría la dimerización de la molécula que conduce a farmacocinética óptima de la proteína al incrementar el tiempo residente en el suero. Como ambos de los dominios de la proteína de fusión son de origen humano,, la proteína quimérica no induciría idealmente una respuesta inmune, haciéndola de esta manera una molécula adecuada para el uso humano.

La presente invención se refiere a un véctpr de expresión novedoso que usa la S/MAR mencionado anteriormente para producir el Enbrel en una cantidad más grande. En el aislamiento de los medios de cultivo, los productos de expresión de la secuencia de ADN muestran las actividades biológicas de TNFR.Fc. Se dan a conocer el desarrolló del vector, clonación y subclonación, transfección, fermentación y estrategias de purificación.

METODOLOGÍA Clonación y Construcción del Vector de Expresión En el vector pCDNA3.1, el gen de interés se regula por el promotor/potenciador temprano inmediato , del citomegalovirus humano (CMV) . Permite la expresión de alto nivel, eficiente de la proteína recombinante . El gen de interés, TNFR : Fe se clonó en el vector pCDNA3.1 usando él kit de expresión TOPO de dirección. Los transformantes positivos se verificaron inicialmente por la PCR de colonias y después usando enzimas de restricción apropiadas. Se digirió dos veces usando BamHl y Xhol que proporcionaron el patrón esperado. También se confirmó al usar las enzimas de restricción Apal y Sac II, las. cuales demostraron claramente el patrón esperado. Los insertos- fueron después secuencias verificadas .

Las regiones aisladas de fijación al andamiaje/a la matriz (S/MARs), marcadas aquí como secuencias S/ AR se clonaron inicialmente en el vector pGEMTeasy por la PCR y se confirmaron por el análisis y secuenciación de enzimas de restricción apropiadas. Subsecuentemente, las S/MARs clonadas se insertaron cadena arriba del promotor CMV en el vector pCDNA3.1 usando los sitios de restricción. La inserción se confirmó por el análisis de restricción.

Expresión del TNFR recombinante Los vectores de expresión recombinantes , en: este caso, pCDNA3.1, se usaron para expresar el gen que codifica proteina de fusión TNFR:.Fc. Los vectores de expresión recombinantes son constructos de ADN replicables en los cuales el ADN que codifica la proteina de interés se enlaza a ciertos elementos de genes que conducen su expresión. Un ensamble de esa unidad de transcripción comprende generalmente de-promotores o potenciadores transcripcionales, transcripción apropiada e iniciación traduccional y sitios de terminación, una secuencia de codificación que codifica la proteina de interés y un marcador de selección que puede ayudar a potenciar entre los clones de lineas de célul'as de mamífero transíectadas y no transíectadas .

La expresión de las proteínas recombinantes e¡n las células de mamíferos se prefiere particularmente como !parte I de esta invención puesto que estas proteínas son conocidas que se pliegan correctamente dando por resultado en consecuencia una conformación totalmente funcional. La línea de células que se usará para la expresión génica recombinante es la línea de células CHO-K1, y será una población homogénea de células. La colonia transfectada de CHO-K1 que contiéne la unidad transcripcional establemente integrada que codifica la proteína recombinante será un monocultivo, es decir las células serán la progenie de un solo transformante ancestral.

Las células hospederas transformadas ; se transíectarán con los vectores de expresión que contienen la unidad transcripcional completa. La proteína de fusión TNFR : Fe expresada se secretará dentro del sobrenadante de cultivo. Los niveles elevados del producto de expresión se logran al seleccionar la línea de células que usan un marcador de selección tal como un gen que codifica la resistencia a antibióticos (neomicina) .

Muchas variaciones de la presente invención se sugerirán a aquellas personas expertas en el campo en vista de la descripción anterior. Estas variaciones obvias están dentro del alcance propuesto completo de las reivindicaciones anexas. ,

Claims (51)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un ácido nucleico aislado, caracterizado i porque comprende una o más secuencias seleccionadas¦ del -grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, complementos, variantes, y fragmentos funcionales de las mjsmas y secuencias que son por lo menos 70% homologas a las mismas. 2. El ácido' nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1,. caracterizado porque la una o más secuencias comprenden secuencias S/MAR. 3. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la una o más secuencias S/MAR incrementan la expresión de una biomolécula cuando las secuencias se usan en un sistema de expresión. 4. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la un; o más secuencias S/MAR incrementan la expresión de la bicjmolécula independientemente de la orientación de las secuencias en el sistema de expresión. 5. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la biomolécuila es una proteina. 6. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la biomolécula es una proteina de fusión. 7. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proteina de fusión es un receptor del Factor de Necrosis Tumoral1 Alfa (TNFR) soluble recombinante - proteina de fusión Fe de IgG Humana . El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la una o más secuencias S/MAR contienen una o más porciones de secuéncias de nucleótidos. 9. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la una o más porciones de secuencia de nucleótidos incluye por lo menos una porción de nucleótidos rica en AT. 10. Un método para construir' un vector de expresión que tiene eficiencia de expresión incrementada, el método caracterizado porque comprende insertar el 'ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1 dentro de un vector de. expresión. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el vector de expresión es un vector de expresión de mamífero, 12. Un vector, caracterizado porque comprende el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1. 13. El- vector de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el vector es un plásmido bacteriano, un vector bacteriófago, un vector episomal de levadura, un vector cromosómico artificial o un vector viral. 14. El vector de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el vector es un vector de ' expresión de mamífero, 15. Un método para producir una célula hospedera recombinante , el método caracterizado porque comprende introducir el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación l o el vector de expresión | de la reivindicación 12 dentro de una célula hospedera. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el ácido nucleico aislado o el vector de expresión se introduce por medio de la transíección . 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el ácido nucleico aislado se integra con el genoma de la célula hospedera recombinanté en la transíección . 18. Una célula hospedera, caracterizada pc>rque se produce de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 15. 19. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación; 12. 20. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizada porque la célula hospedera es una célula eucariótica. 21. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de mamífero. 22. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico que comprende (a) una secuencia que codifica una proteína enlazada operablemente a uno o más¦ elementos de control de expresión y (b) y una o más secuencias S/MAR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 6, complementos, variantes, y fragmentos funcionales de las mismas y secuencias que son i por lo menos 70% homologas a las mismas. 23. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la protéína es una proteína de fusión. 24. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la proteína receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - soluble recombinante - proteína de fusión Fe de IgG humana. 25. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 22. 26. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la célula hospedera es una célula eucariótica. 27. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de mamífero. 28. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico que comprende (a) una secuencia que codifica el receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - proteína de fusión Fe de IgG Humana enlazada operablemente uno o más elementos de control de expresión y (b) una o más. secuencias S/MAR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 6, complementos, variantes, y fragmentos funcionales de las mismas y secuencias que son por lo menos 70% homologas a las mismas. 29. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el vector de ¦ expresión de conformidad con la reivindicación 28. 30. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la célula hospedera es una célula eucariótica. , 31. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de mamífero. 32. El vector de expresión de conformidad don la reivindicación 28, caracterizado porque el uno | o más elementos de control de expresión comprenden por lo menos uno de promotor transcripcional, potenciador transcripcional , represor transcripcional, sitio de poliadenilación, origen del sitio de replicación, señal de iniciación de traducción y señal de terminación de traducción. 33. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la una o más secuencias S/MAR se localizan cadena arriba del promotor transcripcional. 34. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la una | o más secuencias S/MAR se localizan cadena abajo del |prómotor transcripcional. 35. El vector de expresión de conformidad! con la reivindicación 32, caracterizado porque la una |.o más secuencias S/MAR se localizan cadena abajo de la señal de terminación de traducción. 36. El vector de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la una o más secuencias S/MAR se localizan cadena arriba del promotor transcripcional y cadena abajo de la señal de terminación de traducción. 37. El vector de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la una o más secuencias S/ ÁR se localizan cadena abajo del promotor transcripcional y de la señal de terminación de traducción. 38. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la una | o más secuencias S/MAR se localizan a una distancia de 0 a |10 KB de la secuencia de codifica el receptor de Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - proteina de fusión Fe de IgG humana. 39. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la una | o mas secuencias S/MAR se localizan a. una distancia de O la 10 KB del origen del sitio de replicación. 40. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el vector de expresión se usa para la expresión recombinante del receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - proteina de fusión Fe de IgG Humana. 41. Un método para producir una prote|iná, el método caracterizado porque comprende las etapas | dé transfectar una célula de mamífero con un vector de expresión que comprende (I) una secuencia que codifica la proteina y (II) una o más secuencias S/MAR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 6, complementos, variantes y fragmentos funcionales de las mismas y secuencias qu'e son por lo menos 70% homologas a las mismas; (b) cultivar la célula de mamífero transfectada bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína; y (c) aislar la proteína expresada . 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la .proteína es una proteina de fusión . 43. EL método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la proteína es el receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - soluble recombinante - proteína de fusión. Fe de IgG Humana. 44. Un método para producir el receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - proteína de fusión Fe de IgG Humana, el método caracterizado porque comprendé las etapas de (a) transfectar una célula de mamífero | con un vector de expresión que comprende (I) una secuericia que codifica el receptor del Factor de Necrosis Tumoral i Alfa (TNFR) - proteína de fusión Fe de IgG Humana y (II) una o más secuencias S/MAR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 6, complementos, variantes y fragmentos funcionales de las mismas y secuencias que son por lo menos 70% homologas a las mismas; (b) cultivar la célula de mamífero transfectada bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión; y (c) aislar la proteína de fusión expresada. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque además comprende la etapa de purificar la proteína de fusión aislada. 46. El receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - proteína de fusión Fe de IgG Humana, caracterizados porque se producen de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 44. 47. Un método para producir el receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - proteína de fusión :Fc de IgG Humana, el método caracterizado porque comprende las etapas de (a) transfectar una célula de mamífero| con un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica el receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) proteina de fusión Fe de IgG Humana; (b) co-transfectar la célula de mamífero con un plásmido que comprende una o más secuencias S/MAR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 6, complementos, variantes y fragmentos funcionales de las mismas y secuencias que son por lo menos 70% homologas a las mismas; (c) cultivar la célula de mamífero transfectada bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión; y (d) aislar la proteína de fusión expresada. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque además comprende la etapa de purificar la proteína de fusión aislada. 49. El receptor del Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFR) - proteína de fusión Fe de IgG Humana, caracterizado porque se produce de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 47. 50. Un. factor, caracterizado porque afecta la actividad de una o más de las secuencias S/MAR, donde la una o más secuencias S/MAR comprende una o más secuencias i i seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, complementos, variantes, y fragmentos funcionales de las mismas y secuencias que son por lo menos 70% homologas a las mismas. 51. El factor de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el factor es por lo menos uno de un factor genético, o un factor epigenético.